WO2012134086A2 - 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

조직재생용 3차원 나노섬유 지지체 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2012134086A2
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Definitions

  • the present invention relates to a scaffold for tissue regeneration, and more particularly, a three-dimensional nanofiber scaffold for tissue regeneration and a method of manufacturing the same, which can increase thickness and porosity by a simple method through ultrasonic treatment (ultra-sonication). It is about.
  • the human body's ability to regenerate itself is very limited and its ability to regenerate itself is very limited because of its subtle tissue structure.
  • the human body retains the possibility of regeneration in case of tissue damage, thanks to stem cells, but it is possible to break the limits of regenerative function due to accidents, diseases, and aging.
  • organ tissues of living bodies face limitations of regeneration, and the necessity for regeneration of organ tissues is rapidly increasing.
  • Tissue engineering is the area of regenerative medicine, from cells to artificial organs, based on the study of biological and engineering technologies from biological materials to materials that can help restore tissues and organs. It is recognized as one of the important technologies in the field. Various methods have been researched to achieve the purpose of restoring, maintaining and improving the function of the human body by understanding the correlation between the structure and the function of living tissues and by making and transplanting the living substitutes.
  • the scaffold is three-dimensional and refers to a space in which all the cells of the three-dimensional structure are attached and differentiate and proliferate.
  • the support plays an important role in the growth of cells sown within the porous structure and cells migrated from around the tissue. Most of the cells in the human body are adherent cells that grow by attaching. If there is no place to attach, the cells cannot grow and die. Thus, the support must provide a suitable environment for cell attachment, differentiation, growth and cell migration.
  • the support may be made of various materials, and at present, studies are being actively conducted to develop supports for tissue regeneration using natural materials, synthetic polymers, bio ceramics, and polymer-ceramic composites.
  • the structure of the support requires high porosity for a large surface area that enables high density cell adhesion, and large pores that allow the formation of blood vessels and the transfer of nutrient growth factors, hormones, etc. It is necessary to have a continuous structure (open cell structure) interconnected to the air space, and to adjust the porosity and the shape of the pores according to the characteristics of the tissue to be cultured.
  • Particle leaching, emulsion freeze-drying, high pressure gas expansion, phase separation, and the like are known as techniques for preparing a porous support.
  • a conventional support production method has a limitation in making pores having an open structure, and there is a problem that cell culture is difficult because the pores are too small in size.
  • the present invention is to solve this problem, an object of the present invention is to provide a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration and a method of manufacturing the same to enable high density cell adhesion by increasing the surface area by increasing the porosity and thickness
  • an object of the present invention is to provide a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration and a method of manufacturing the same to enable high density cell adhesion by increasing the surface area by increasing the porosity and thickness
  • Method for producing a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration for achieving the above object, (a) making a polymer solution, (b) a plurality of nanofibers are entangled from the polymer solution using the electrospinning method A step of making a nanofiber matrix, (c) by placing the nanofiber matrix in a solution and ultrasonication (ultra-sonication) to increase the thickness and porosity of the nanofiber matrix.
  • the step of applying a natural polymer solution to the nanofiber matrix and freeze-dried to add a natural polymer to the nanofiber matrix It may further include.
  • the natural polymer may be selected from gelatin and chitosan.
  • step (c) it is preferable to apply ultrasonic waves while cooling the solution in which the nanofiber matrix is immersed.
  • the solution in which the nanofiber matrix is immersed may be cooled with ice.
  • ultrasonic waves may be applied.
  • the solution used in step (c) may be a natural polymer solution in which the natural polymer is dissolved.
  • the natural polymer solution may be selected from gelatin solution (aqueous gelatin solution) and chitosan solution (aqueous chitosan solution).
  • the polymer solution may be prepared by dissolving a synthetic polymer and a natural polymer together in an organic solvent.
  • the three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration according to the present invention for achieving the above object is characterized in that it is made by the manufacturing method described above.
  • the method for manufacturing a three-dimensional nanofiber support according to the present invention is made of a three-dimensional nanofiber improved in thickness and porosity by a simple and inexpensive method by making a nanofiber matrix by electrospinning and ultrasonic treatment of the nanofiber matrix in a solution.
  • Fiber supports may be provided.
  • the three-dimensional nanofiber support according to the present invention has a large pore size and high porosity, which is advantageous for cell culture because of excellent infiltration of cells.
  • the three-dimensional nanofiber support according to the present invention together with the excellent mechanical properties and flexibility of the synthetic polymer, has excellent biocompatibility and antibacterial properties of the natural polymer.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing a process for producing a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration according to the present invention by sonicating the nanofiber matrix made by the electrospinning method.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a process for producing a nanofiber matrix by the electrospinning method of manufacturing a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration according to the present invention.
  • Figure 3 shows the ultrasonic treatment method of the nanofiber matrix during the process of manufacturing a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration according to the present invention.
  • Figure 4 is a photograph showing the top and side cross-section of the nanofiber matrix and the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention, respectively.
  • Figure 5 is a SEM image showing the top and side cross-section of the nanofiber matrix and the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention, respectively.
  • Figure 6 shows the thickness of the nanofiber matrix and the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention, respectively.
  • FIG. 7 is a graph showing the porosity change according to the ultrasonic application time of the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 8 is a graph showing the porosity change according to the ultrasonic application energy of the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing a process for producing a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration according to the present invention by ultrasonic treatment (ultra-sonication) of the nanofiber matrix made by the electrospinning method.
  • the three-dimensional nanofiber support 15 for tissue regeneration is to form a three-dimensional structure having a plurality of nanofibers (nanofibers, 11) are randomly entangled.
  • the three-dimensional nanofiber support 15 for tissue regeneration creates a nanofiber matrix 10 by electrospinning, and sonicates the nanofiber matrix 10, thereby expanding the pores 12 and porosity. It can be made by increasing the thickness.
  • the nanofibers 11 constituting the three-dimensional nanofiber support 15 may be made of a synthetic polymer or a mixed polymer in which a natural polymer is mixed with the synthetic polymer.
  • Natural polymers have good biocompatibility and bioactivity, but are difficult to control mechanical strength and degradation rate, and are separated from plants, animals, and human tissues, and thus may be contaminated with viruses.
  • the synthetic polymer is easy to give the characteristics according to the purpose because it can control the chemical and physical properties of the monomer during the synthetic process.
  • the molecular structure and molecular weight it is possible to control the physical mechanical properties as a biotissue support according to the use.
  • Non-biodegradable polymers include polyvinyl alcohol (PVA), polyhydroxyethyl methacrylate (PHEMA), poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm), and polyglycolide (PGA).
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PHEMA polyhydroxyethyl methacrylate
  • PNIPAAm poly-N-isopropylacrylamide
  • PGA polyglycolide
  • PLA Polylactide
  • PVA polypropylene fumarate
  • polycaprolactone felicyanoacrylate
  • polydioxanone polyurethane
  • biodegradable synthetic polymers induce the regeneration of desired tissues and then are decomposed into metabolites and excreted in vitro, they do not cause serious toxicity and do not leave foreign substances in the tissue regeneration site.
  • PLGA a copolymer of PGA and PLA and two polymers, is a non-toxic polymer and is widely used as a scaffold for tissue regeneration because it is decomposed and removed by glycolic
  • FIGS. 2 and 3 are schematic diagram showing a process for producing a nanofiber matrix by the electrospinning method of manufacturing a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration according to the present invention
  • Figure 3 is a three-dimensional nanofiber support for tissue regeneration according to the present invention It shows the ultrasonic treatment method of the nanofiber matrix during the manufacturing process.
  • Electrospinning technology is a technology that can implement a one-dimensional nanostructure material at an efficient and low cost, and can easily and inexpensively manufacture nanofiber, nanorod, and nanotube-shaped materials by using an electrospinning method.
  • the basic principle of electrospinning is that continuous organic / inorganic nanofibers are drawn under a high electric field and formed on a grounded collector.
  • the electrospinning apparatus 20 is a syringe pump (21), a DC high voltage generator (power supply, 22), which can push out a liquid viscous precursor, to extract nanofibers Needle 23 and grounded collector 24.
  • a voltage is supplied to the DC high voltage generator 22 to form an electric field between the needle 23 and the collector 24.
  • a jet of charged polymer solution is released. The jet of the polymer solution is directed toward the collector 24 and the solvent evaporates while flying in the air.
  • the charged polymer continuous phase fibers are stacked on the collector 24 to form the nanofiber matrix 10.
  • the nanofiber matrix 10 is ultrasonicated, and a specific method thereof is as follows.
  • the nanofiber matrix 10 is immersed in a solution 30 such as distilled water, and ultrasonic waves are applied to the solution 30 in which the nanofiber matrix 10 is immersed using the ultrasonic transducer 32.
  • a solution 30 such as distilled water
  • ultrasonic waves are applied to the solution 30 in which the nanofiber matrix 10 is immersed
  • molecules of the solution 30 vibrate and penetrate into the spaces between the nanofibers 11, and the solution vibrates in the spaces between the nanofibers 11.
  • Molecule of (30) exerts a force on the nanofibers (11) to make the nanofibers (11) intertwined with each other.
  • the gaps 12 between the nanofibers 11 become larger, thereby swelling the nanofiber matrix 10, and through such ultrasonication, the porosity and thickness of the nanofiber matrix 10 can be increased.
  • the temperature of the solution 30 at the time of the ultrasonic treatment is preferably 0 °C ⁇ 4 °C.
  • the temperature of the solution 30 is below zero, the mobility of the solution molecules is reduced when the ultrasonic wave is applied, and the swelling degree of the nanofiber matrix 10 is decreased.
  • the temperature of the solution 30 exceeds 4 ° C. ) The effect of suppressing the temperature rise is reduced.
  • the water tank 34 containing the solution 30 is accommodated in the cooling vessel 38 containing the ice 36, and ultrasonic waves are applied to the solution 30 cooled by the ice 36.
  • the lower surface can suppress excessive temperature rise of the solution, and can prevent deformation or damage of the nanofibers 11.
  • the same cooling effect as using the ice can be obtained by accommodating the water tank 34 containing the solution 30 in a cooling vessel in which the temperature can be kept at a low temperature by a cooling device and sonicating. .
  • by cooling the water tank 34 itself with a cooling device it is possible to suppress the temperature rise of the solution 30 during the ultrasonic treatment.
  • a natural polymer solution such as gelatin or chitosan is applied to the three-dimensional nanofiber support and freeze-dried. Can be given characteristics.
  • a method for imparting the properties of the natural polymer to the three-dimensional nanofiber support a method other than the freeze-drying method described above may be used.
  • a method other than the freeze-drying method described above may be used.
  • electrospinning is performed by mixing a natural polymer with a synthetic polymer in an electrospinning process
  • a nanofiber support having both the properties of the natural polymer and the properties of the synthetic polymer can be obtained.
  • the nanofiber matrix is formed by electrospinning the synthetic polymer, and the nanofiber matrix is sonicated in a natural polymer solution such as gelatin solution or aqueous chitosan solution. It can give the characteristic of.
  • HFIP 1,1,1,3, 0.10 g / ml (10 wt.%)
  • TCI 1,3-hexafluoro-2-propanol
  • TOKYO KASEI Japan
  • the prepared polymer solution was placed in a 5 ml glass syringe having a metal needle (22G, Kovax-needle, Korea Vaccine co., Ltd., Korea), and 18kV was applied with a high voltage DC power supply (Nano NC, Korea).
  • Electrospinning was carried out on a mandrel covered with aluminum foil at a feed rate of 1 ml / hr for a period of time. At this time, the distance from the needle tip to the collector was 15cm, the needle was moved 10cm reciprocating at a speed of 2cm / sec along the horizontal direction. Through this electrospinning, a circular nanofiber matrix having a diameter of 15 mm and a thickness of 120 ⁇ m was prepared, and the prepared nanofiber matrix was placed in a vacuum at room temperature for one day to remove residual solution.
  • the nanofiber matrix was punched out with a 15 mm metal punch (TCK, Korea), soaked in 70% ethanol for 1 minute, and then placed in 10 ml of deionized distilled water, and a sonicator (VCX 750, Sonics) was added.
  • 3D nanofiber support was prepared by sonication at 4 ° C.
  • the ultrasonic application power was 150W
  • the ultrasonic application time was adjusted to 1, 2, 5, 10, 20 minutes
  • the ultrasonic application energy was 20, 30, 60 J ⁇ mL -1 .
  • Figure 4 is a photograph showing the top and side cross-section of the nanofiber matrix and the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention, respectively.
  • FIGS. 4 (a) and (d) show the top and side cross-sections of the nanofiber matrix before sonication, respectively
  • FIGS. 4 (b) and (f) show the three-dimensional nanofiber scaffolds sonicated for 1 minute.
  • the top and side cross-sectional views are respectively shown
  • FIGS. 4C and 4G show the top and side cross sections of the three-dimensional nanofiber support, which have been sonicated for 10 minutes, respectively.
  • the photo shown in Figure 4 it can be seen that there is a difference in thickness between the non-sonicated and the ultrasonic treatment of the nanofiber matrix, it can be seen that the thickness increases with increasing the ultrasonic treatment time.
  • FIG. 5 is a SEM image showing the top and side cross-section of the nanofiber matrix and the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention
  • Figure 6 is a nanofiber matrix and three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention The thickness of each is shown.
  • FIGS. 5 (a) and 5 (c) show the top and side cross-sections of the nanofiber matrix before sonication, respectively
  • FIGS. 5 (b) and 5 (d) show the top and side of the ultrasonically treated three-dimensional nanofiber supports.
  • the thickness (a) of the non-sonicated nanofiber support is 0.14 mm
  • the thickness (b) of the ultrasonicated nanofiber support is 5.32 mm
  • the thickness of the nanofiber support through ultrasonication is shown. It can be seen that can significantly increase.
  • FIG 7 is a graph showing the porosity change according to the ultrasonic application time of the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention
  • Figure 8 is a porosity according to the ultrasonic application energy of the three-dimensional nanofiber support according to an embodiment of the present invention. It is a graph showing the change.
  • the porosity can be obtained through the following equations (1) and (2).
  • the density of the three-dimensional nanofiber support can be obtained through Equation 1, and the porosity of the three-dimensional nanofiber support can be obtained through Equation 2.
  • the porosity increases from 92% to 96% even if only one minute of ultrasonic treatment. And when the ultrasonic treatment is performed for 5 minutes, the porosity is maximized, it can be seen that the porosity does not increase through further ultrasonic treatment.
  • the maximum porosity can be obtained when the ultrasonic application energy of the three-dimensional nanofiber support is 30 J ⁇ mL ⁇ 1 or more.
  • the nanofiber matrix made by electrospinning is sonicated in a solution to obtain a three-dimensional nanofiber support having increased porosity and thickness.
  • the conventional support is too small pore size and porosity is difficult to cultivate the cell
  • the three-dimensional nanofiber support according to the present invention has a large pore size and high porosity is excellent in cell infiltration (excellent infiltration) is advantageous for cell culture. .
  • the present invention can implement a three-dimensional nanofiber support with improved thickness and porosity in a simple and inexpensive method.

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Abstract

본 발명은 조직재생용 지지체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초음파 처리(ultra-sonication)를 통해 간단한 방법으로 두께와 다공도(porosity)를 증가시킬 수 있는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

조직재생용 3차원 나노섬유 지지체 및 그 제조방법
본 발명은 조직재생용 지지체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 초음파 처리(ultra-sonication)를 통해 간단한 방법으로 두께와 다공도(porosity)를 증가시킬 수 있는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
인체의 조직재생 능력은 매우 복잡하고 미묘한 조직구조 때문에 자체적으로 재생하는 능력은 매우 한정적이다. 인체는 줄기세포 덕분에 조직손상시 재생 가능성을 보유하고 있지만 사고, 질병, 노화 등의 이유로 인해 재생 기능의 한계를 벗어나는 일이 생기게 된다. 최근 고령화 사회로의 진입과 함께 다양한 질병 및 사고의 증가로 인해 생체의 장기 조직은 재생력의 한계에 부딪히게 되면서 장기 조직의 재생에 대한 필요성이 급증하고 있다.
또한 생체조직을 효과적으로 대체하거나 이식할 수 있는 기술 개발이 점점 요구되고 있으며 인체 조직과 기관을 복원하려는 노력은 오랫동안 크게 주목을 받아 왔다. 초기에는 인공적인 대용품에서 생체적합재료의 개발, 장기이식 등으로 시도되었으나, 최근에는 생명과학, 공학 그리고 의과학을 통합 응용하는 생체조직공학으로 발전하고 있다.
조직공학(Tissue Engineering)은 세포에서부터 인공장기에 이르는 재생의료의 영역으로, 조직이나 기관의 복원을 도울 수 있는 생체물질부터 재료에 이르는 생물학적, 공학적인 기술을 다루는 학문을 기반으로 미래의 생명과학과 의료분야의 중요한 기술의 하나로 인식되고 있다. 생체 조직의 구조와 기능의 상관관계를 이해하고, 나아가서 생체 대용품을 만들어 이식함으로써 우리 몸의 기능을 복원, 유지, 향상시키려는 목적을 달성하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있다.
조직공학의 핵심 기술 중 하나는 세포가 붙어 자랄 수 있도록 지지역할을 하는 지주(support) 또는 지지체(scaffold)를 만들어내는 일이다. 2차원 막이나 캡슐과 달리 지지체는 3차원 형으로, 3차원 구조를 가진 모든 체내 세포가 부착되어 분화 및 증식을 할 수 있는 공간을 일컫는다.
지지체는 생체조직공학에서 매우 중요한 역할을 수행한다. 지지체는 다공성 구조 내에 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 거의 대부분의 인체내 세포는 부착되어 성장되는 부착세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸하게 된다. 따라서 지지체는 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 대한 적합한 환경을 제공해야 한다. 지지체는 다양한 소재로 제조될 수 있는데, 현재, 천연재료, 합성 고분자, 생체 세라믹스 및 고분자-세라믹 복합소재를 사용하여 조직재생용 지지체를 개발하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
지지체의 구조는 높은 밀도의 세포점착을 가능하게 하는 큰 표면적을 위하여 높은 다공도를 필요로 하며, 생체 내로의 이식 이후에 혈관의 형성 및 영양분 성장인자, 호르몬 등의 물질전달을 가능하게 하는 큰 기공과 기공간 상호 연결되어 있는 연속 구조(open cell structure)를 갖는 것을 필요로 하고, 배양되는 조직의 특성에 따라 다공도 및 기공의 형상 조절이 요구된다.
다공성 구조의 지지체를 제조하기 위한 기술로 입자 침출법(particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion), 상분리법(phase separation) 등이 알려져 있다. 그런데 이러한 종래의 지지체 제조방법은 열린 구조를 갖는 공극을 만드는데 한계가 있고, 공극의 크기가 너무 작아 세포 배양이 어려운 문제가 있다.
본 발명은 이러한 문제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 다공도 및 두께를 증가시켜 표면적을 넓힘으로써 높은 밀도의 세포점착을 가능하게 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법은, (a) 고분자 용액을 만드는 단계, (b) 전기 방사법을 이용하여 상기 고분자 용액으로부터 다수의 나노섬유가 얽힌 나노섬유 매트릭스를 만드는 단계, (c) 상기 나노섬유 매트릭스를 용액에 넣고 초음파 처리(ultra-sonication)하여 상기 나노섬유 매트릭스의 두께 및 다공도(porosity)를 증가시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법은, 상기 (c) 단계 이후, 상기 나노섬유 매트릭스에 천연 고분자 용액을 도포하고 동결 건조시켜 상기 나노섬유 매트릭스에 천연 고분자를 부가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 천연 고분자는 젤라틴과 키토산 중에서 선택될 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 나노섬유 매트릭스가 잠긴 용액을 냉각시킨 상태에서 초음파를 인가하는 것이 좋다.
상기 (c) 단계에서 상기 나노섬유 매트릭스가 잠긴 용액을 얼음으로 냉각시킬 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 나노섬유 매트릭스가 잠긴 용액의 온도를 0℃ ~ 4℃로 맞춘 후 초음파를 인가할 수 있다.
상기 (c) 단계에 이용되는 상기 용액은 천연 고분자가 용해된 천연 고분자 용액일 수 있다.
상기 천연 고분자 용액은 젤라틴 용액(aqueous gelatin solution)과 키토산 용액(aqueous chitosan solution) 중에서 선택될 수 있다.
상기 (a) 단계는 합성 고분자와 천연 고분자를 함께 유기용매에 용해시켜 상기 고분자 용액을 만들 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체는 상술한 제조방법에 의해 만들어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법은 전기 방사법을 통해 나노섬유 매트릭스를 만들고 나노섬유 매트릭스를 용액 속에서 초음파 처리함으로써, 종래 기술에 비해 간단하고 저렴한 방법으로 두께와 다공도가 향상된 3차원 나노섬유 지지체를 제공할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 3차원 나노섬유 지지체는 공극의 크기가 크고 다공도가 높아 세포의 침투성(infiltration)이 우수하여 세포 배양에 유리하다.
또한 본 발명에 의한 3차원 나노섬유 지지체는 합성 고분자의 뛰어난 기계적 물성 및 유연성과 함께, 천연 고분자의 우수한 생체 적합성 및 항균성을 갖는다.
도 1은 전기 방사법으로 만들어진 나노섬유 매트릭스를 초음파 처리하여 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체를 제조하는 과정 중 전기 방사법으로 나노섬유 매트릭스를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체를 제조하는 과정 중 나노섬유 매트릭스의 초음파 처리방법을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 의한 나노섬유 매트릭스와 3차원 나노섬유 지지체의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 의한 나노섬유 매트릭스와 3차원 나노섬유 지지체의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 SEM 이미지이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 의한 나노섬유 매트릭스와 3차원 나노섬유 지지체의 두께를 각각 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 의한 3차원 나노섬유 지지체의 초음파 인가 시간에 따른 다공도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 의한 3차원 나노섬유 지지체의 초음파 인가 에너지에 따른 다공도 변화를 나타낸 그래프이다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체 및 그 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명을 설명함에 있어서, 도면에 도시된 구성요소의 크기나 형상 등은 설명의 명료성과 편의를 위해 과장되거나 단순화되어 나타날 수 있다. 또한, 본 발명의 구성 및 작용을 고려하여 특별히 정의된 용어들은 사용자, 운용자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있다. 이러한 용어들은 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
도 1은 전기 방사법으로 만들어진 나노섬유 매트릭스를 초음파 처리(ultra-sonication)하여 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체(15)는 다수의 나노섬유(nanofibers, 11)가 무작위적으로 얽혀 두께를 갖는 3차원 구조체를 형성한 것이다. 이러한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체(15)는 전기 방사법(electrospinning)으로 나노섬유 매트릭스(10)를 만들고, 만들어진 나노섬유 매트릭스(10)를 초음파 처리하여 공극(12)을 확장시키고 다공도(porosity)와 두께를 증가시켜 만들 수 있다. 3차원 나노섬유 지지체(15)를 구성하는 나노섬유(11)는 합성 고분자나, 합성 고분자에 천연 고분자가 혼합된 혼합 고분자로 이루어질 수 있다.
천연 고분자는 생체 적합성과 생체 활성이 좋지만, 기계적 강도와 분해 속도 조절이 어렵고, 식물, 동물, 인간조직으로부터 분리되므로 바이러스 등에 오염될 가능성이 있어 사용에 제한이 있다. 반면, 합성 고분자는 단량체가 가진 화학적, 물리적 성질을 합성 가공하는 과정에서 조절할 수 있기 때문에 목적에 맞는 특성을 부여하기 용이하다. 또한 분자구조와 분자량을 조절하여 용도에 따른 생체 조직공학적 지지체로써의 물리적 기계적 특성을 조절할 수 있다.
합성 고분자는 크게 생분해성과 비생분해성 두 가지로 분류된다. 비생분해성 고분자는 폴리비닐알코올(PVA), 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PHEMA), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(PNIPAAm) 등이 있고, 생분해성 합성 고분자로는 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리락타이드(PLA), 폴리프로필렌푸마레이트, 폴리카프로락톤, 펠리시아노아크릴레이트, 폴리다이옥사논, 폴리우레탄 등이 있다. 생분해성 합성 고분자는 원하는 조직의 재생을 유도한 후 생체대사 물질로 분해되어 체외로 배설되기 때문에 심각한 독성을 유발하지 않고, 조직 재생 부위에 조직 외의 이물질을 남기지 않는 장점이 있다. 특히, PGA 및 PLA와 두 고분자의 공중합체인 PLGA는 무독성 고분자로서 체내에서 glycolic acid, lactic acid 등으로 분해되어 제거되므로 조직재생용 지지체로서 광범위하게 사용되고 있다.
이하, 본 발명에 의한 나노체를 제조하는 과정을 도 2 및 도 3을 참조하여 설명한다. 도 2는 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체를 제조하는 과정 중 전기 방사법으로 나노섬유 매트릭스를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이고, 도 3은 본 발명에 의한 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체를 제조하는 과정 중 나노섬유 매트릭스의 초음파 처리방법을 나타낸 것이다.
먼저, 합성 고분자, 또는 합성 고분자와 천연 고분자를 유기용매에 용해시켜 고분자 용액을 만들고, 제조된 고분자 용액을 전기 방사법을 이용하여 방사하여 나노섬유 매트릭스(10)를 제조한다. 전기 방사 기술은 1차원 나노구조 소재를 효율적이면서도, 저렴한 비용으로 구현할 수 있는 기술로, 전기 방사법을 이용하여 나노섬유, 나노로드, 나노튜브 형상의 소재를 손쉽고, 저렴하게 제조할 수 있다. 전기 방사법은 연속적인 유기/무기(organic/inorganic) 나노섬유가 높은 전기장 하에서 연신이 되어 접지된 컬렉터 위에 형성이 되는 것이 기본 원리이다.
도 2를 참조하면, 전기 방사장치(20)는 액상의 점성을 지닌 전구체를 밀어낼 수 있는 실린지 펌프(syringe pump, 21), DC 고전압 발생기(power supply, 22), 나노섬유를 뽑아내기 위한 바늘(needle, 23) 및 접지된 컬렉터(collector, 24)를 포함한다. 고분자 용액을 실린지 펌프(21)를 이용하여 바늘(23) 쪽으로 이송시키면서 DC 고전압 발생기(22)로 전압을 공급하여 바늘(23)과 컬렉터(24) 사이에 전기장을 형성시키면, 바늘(23) 끝에 매달린 고분자 용액의 원추형 표면 끝에서 하전된 고분자 용액의 제트(jet)가 방출된다. 고분자 용액의 제트는 컬렉터(24)를 향하며 공기 중을 날아가면서 용매가 증발되고, 컬렉터(24)에는 하전된 고분자 연속상 섬유가 쌓여 나노섬유 매트릭스(10)가 형성된다.
이러한 전기 방사 공정에 있어서, 고분자 용액의 농도, 점도, 표면장력, 바늘(23) 끝에서 컬렉터(24)까지의 거리, 전기장의 세기, 방사 시간, 방사 환경 등을 조절하면 원하는 굵기 및 형태의 나노섬유를 만들 수 있다.
이렇게 나노섬유 매트릭스(10)를 만든 후, 나노섬유 매트릭스(10)를 초음파 처리하며, 그 구체적은 방법은 다음과 같다. 도 3을 참조하면, 나노섬유 매트릭스(10)를 증류수 등의 용액(30)에 담그고, 초음파 변환기(32)를 이용하여 나노섬유 매트릭스(10)가 잠긴 용액(30)에 초음파를 인가한다. 나노섬유 매트릭스(10)가 잠긴 용액(30)에 초음파를 인가하면 용액(30)의 분자가 진동하여 나노섬유(11) 사이의 공간으로 침투하고, 나노섬유(11) 사이의 공간에서 진동하는 용액(30)의 분자는 나노섬유(11)에 힘을 가하여 서로 엉켜있는 나노섬유(11)를 성기게 한다. 이에 의해 나노섬유(11) 사이의 공극(12)이 커지면서 나노섬유 매트릭스(10)가 부풀게 되며, 이러한 초음파 처리를 통해 나노섬유 매트릭스(10)의 다공도 및 두께를 증가시킬 수 있다.
용액(30)에 담긴 나노섬유 매트릭스(10)에 초음파를 인가할 때, 나노섬유(11)와 용액(30)의 분자 사이의 마찰, 나노섬유(11)와 나노섬유(11) 사이의 마찰, 용액(30)의 분자 간의 마찰로 용액(30)의 온도가 상승하게 되는데, 용액(30)의 온도가 일정 수준 이상으로 상승하면 나노섬유(11)의 변형이나 손상을 유발할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 나노섬유 매트릭스(10)가 잠긴 용액(30)을 냉각시킨 상태에서 초음파를 인가하는 것이 좋다.
초음파 처리시 용액(30)의 온도는 0℃ ~ 4℃인 것이 좋다. 용액(30)의 온도가 영하로 되면 초음파 인가시 용액 분자의 운동성이 떨어져 나노섬유 매트릭스(10)의 팽창도가 떨어지고, 용액(30)의 온도가 4℃를 초과하면 초음파 인가에 따른 용액(30)의 온도 상승 억제 효과가 떨어지게 된다.
용액(30)을 냉각시키기 위해 용액(30)이 담긴 수조(34)를 얼음(36)이 담긴 냉각 용기(38) 내에 수용하고, 얼음(36)에 의해 냉각된 용액(30)에 초음파를 인가하면 용액의 과도한 온도 상승을 억제시킬 수 있고, 나노섬유(11)의 변형이나 손상을 막을 수 있다. 얼음을 이용하는 방법 이외에, 냉각 장치 등에 의해 온도가 저온으로 유지될 수 있는 냉각 용기에 용액(30)이 담긴 수조(34)를 수용하고 초음파 처리를 진행하면 얼음을 이용하는 것과 동일한 냉각 효과를 얻을 수 있다. 또한 수조(34) 자체를 냉각 장치로 냉각시키면 초음파 처리시 용액(30)의 온도 상승을 억제시킬 수 있다.
초음파 처리후, 3차원 나노섬유 지지체에 젤라틴(gelatin)이나 키토산(chitosan) 등의 천연 고분자 용액을 도포하고 이를 동결 건조시키면, 3차원 나노섬유 지지체에 우수한 생체 적합성과 생체 활성, 항균성 등 천연 고분자의 특성을 부여할 수 있다.
3차원 나노섬유 지지체에 천연 고분자의 특성을 부여하기 위한 방법으로 상술한 동결 건조법 이외의 방법이 이용될 수 있다. 예컨대, 전기 방사 공정에서 합성 고분자에 천연 고분자를 섞어 전기 방사를 수행하면 천연 고분자의 특성과 합성 고분자의 특성을 모두 갖는 나노섬유 지지체를 얻을 수 있다. 또한 합성 고분자를 전기 방사하여 나노섬유 매트릭스를 만든 후, 나노섬유 매트릭스를 젤라틴 용액(aqueous gelatin solution)이나 키토산 용액(aqueous chitosan solution) 등 천연 고분자 용액 속에서 초음파 처리하면 3차원 나노섬유 지지체에 천연 고분자의 특성을 부여할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 실시예에 의거하여 설명한다.
아래의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조
먼저, PLLA 고분자(Poly(L-lactic acid), RESOMER® L207 S,i.v.=1.5-2.0dl/g, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. Fine Chemical, Germany)를 HFIP(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, TCI, TOKYO KASEI, Japan)에 용해시킨 0.10g/ml(10wt.%)의 PLLA/HFIP 고분자 용액을 준비하였다.
다음으로, 준비된 고분자 용액을 금속 바늘(22G, Kovax-needle, Korea Vaccine co., ltd., Korea)을 갖는 5ml 글래스 실린지에 넣고, 고전압 DC 전원 공급기(Nano NC, Korea)로 18kV를 인가하면서 10시간 동안 1ml/hr의 주입속도(feed rate)로 알루미늄 포일로 덮인 맨드럴(mandrel) 위에서 전기 방사하였다. 이때, 바늘 끝에서 컬렉터 사이의 거리는 15cm로 하였고, 바늘을 수평방향을 따라 2cm/sec의 속도로 10cm 왕복이동시켰다. 이러한 전기 방사를 통해 15mm의 지름과 120㎛의 두께를 갖는 원형 나노섬유 매트릭스를 제조하였고, 제조된 나노섬유 매트릭스를 하루동안 상온의 진공 상태에 두어 잔여 용액을 제거하였다.
다음으로, 나노섬유 매트릭스를 15mm 금속 펀치(TCK, Korea)로 펀칭하고, 70% 에탄올에 1분 동안 담가 두었다가, 10ml의 이온제거 증류수(deionized distilled water)에 넣고 초음파 처리기(VCX 750, Sonics)를 이용하여 4℃에서 초음파 처리하여 3차원 나노섬유 지지체를 제조하였다. 이때, 초음파 인가 전력은 150W, 초음파 인가 시간은 1, 2, 5, 10, 20분, 초음파 인가 에너지는 20, 30, 60 J·mL-1로 조절하였다.
제조된 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 분석
도 4는 본 발명의 실시예에 의한 나노섬유 매트릭스와 3차원 나노섬유 지지체의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 사진이다.
도 4의 (a) 및 (d)는 초음파 처리전 나노섬유 매트릭스의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 것이고, 도 4의 (b) 및 (f)는 1분 동안 초음파 처리된 3차원 나노섬유 지지체의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 것이며, 도 4의 (c) 및 (g)는 10분 동안 초음파 처리된 3차원 나노섬유 지지체의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 것이다. 도 4에 나타낸 사진을 보면, 나노섬유 매트릭스를 초음파 처리하지 않은 것과 초음파 처리 한 것 사이에 두께의 차이가 있음을 알 수 있고, 초음파 처리 시간을 늘림에 따라 그 두께가 증가함을 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명의 실시예에 의한 나노섬유 매트릭스와 3차원 나노섬유 지지체의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 SEM 이미지이며, 도 6은 본 발명의 실시예에 의한 나노섬유 매트릭스와 3차원 나노섬유 지지체의 두께를 각각 나타낸 것이다.
도 5의 (a) 및 (c)는 초음파 처리전 나노섬유 매트릭스의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 것이고, 도 5의 (b) 및 (d)는 초음파 처리된 3차원 나노섬유 지지체의 상면 및 측단면을 각각 나타낸 것으로, 도 5를 보면 초음파 처리후 나노섬유 사이의 공극 크기가 증가함을 확인할 수 있다. 또한 도 6을 보면, 초음파 처리되지 않은 나노섬유 지지체의 두께 (a)가 0.14mm인 반면, 초음파 처리된 나노섬유 지지체의 그 두께 (b)는 5.32mm로, 초음파 처리를 통해 나노섬유 지지체의 두께를 크게 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
도 7은 본 발명의 실시예에 의한 3차원 나노섬유 지지체의 초음파 인가 시간에 따른 다공도 변화를 나타낸 그래프이고, 도 8은 본 발명의 실시예에 의한 3차원 나노섬유 지지체의 초음파 인가 에너지에 따른 다공도 변화를 나타낸 그래프이다.
여기에서, 다공도는 다음의 수학식 1 및 수학식 2를 통해 구할 수 있다.
수학식 1
Figure PCTKR2012001925-appb-M000001
수학식 2
Figure PCTKR2012001925-appb-M000002
먼저, 수학식 1을 통해 3차원 나노섬유 지지체의 밀도를 구하고, 수학식 2를 통해 3차원 나노섬유 지지체의 다공도를 구할 수 있다.
도 7을 보면, 초음파 처리를 1분만 수행하더라도 다공도가 92%에서 96%까지 증가함을 알 수 있다. 그리고 초음파 처리를 5분 동안 수행할 때 다공도가 최대로 되고, 그 이상의 초음파 처리를 통해서는 다공도가 증가하지 않는 것을 알 수 있다. 또한 도 8을 보면 3차원 나노섬유 지지체의 초음파 인가 에너지를 30J·mL-1 이상으로 할 때 최대 다공도를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.
상술한 것과 같이, 본 발명에 의하면 전기 방사법을 통해 만들어진 나노섬유 매트릭스를 용액 속에서 초음파 처리함으로써, 다공도 및 두께가 증가된 3차원 나노섬유 지지체를 얻을 수 있다. 종래 지지체가 공극의 크기가 너무 작고 다공도가 떨어져 세포 배양이 어려운데 반해, 본 발명에 의한 3차원 나노섬유 지지체는 공극의 크기가 크고 다공도가 높아 세포의 침투성(infiltration)이 우수하여 세포 배양에 유리하다.
또한 전기 방사의 공정 조건 조절 등 종래 기술로 나노섬유 매트릭스의 다공도 및 두께를 조절하는 것은 매우 어려운데 반해, 본 발명은 간단하고 저렴한 방법으로 두께와 다공도가 향상된 3차원 나노섬유 지지체를 구현할 수 있다.
앞에서 설명되고, 도면에 도시된 본 발명의 실시예는, 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 사항에 의해서만 제한되고, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 및 변경하는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 개량 및 변경은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.

Claims (10)

  1. (a) 고분자 용액을 만드는 단계;
    (b) 전기 방사법을 이용하여 상기 고분자 용액으로부터 다수의 나노섬유가 얽힌 나노섬유 매트릭스를 만드는 단계; 및
    (c) 상기 나노섬유 매트릭스를 용액에 넣고 초음파 처리(ultra-sonication)하여 상기 나노섬유 매트릭스의 두께 및 다공도(porosity)를 증가시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계 이후,
    상기 나노섬유 매트릭스에 천연 고분자 용액을 도포하고 동결 건조시켜 상기 나노섬유 매트릭스에 천연 고분자를 부가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 천연 고분자는 젤라틴과 키토산 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 나노섬유 매트릭스가 잠긴 용액을 냉각시킨 상태에서 초음파를 인가하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 나노섬유 매트릭스가 잠긴 용액을 얼음으로 냉각시키는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 상기 나노섬유 매트릭스가 잠긴 용액의 온도를 0℃ ~ 4℃로 맞춘 후 초음파를 인가하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계에 이용되는 상기 용액은 천연 고분자가 용해된 천연 고분자 용액인 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 천연 고분자 용액은 젤라틴 용액(aqueous gelatin solution)과 키토산 용액(aqueous chitosan solution) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 합성 고분자와 천연 고분자를 함께 유기용매에 용해시켜 상기 고분자 용액을 만드는 것을 특징으로 하는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체의 제조방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 의한 제조방법에 의해 만들어지는 조직재생용 3차원 나노섬유 지지체.
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