KR102364168B1 - 골조직 재생 지지체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

골조직 재생 지지체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골조직 재생 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 골조직 재생 지지체는 흑린(black phosphorus), 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 포함하는 나노 섬유들이 집적된 다공성 나노 섬유 매트릭스를 포함한다.
골조직 재생 지지체는 우수한 생체 적합성을 가지고, 초기 부착 및 증식뿐만 아니라, 골전구 세포 및 중간엽 줄기세포에 대한 골분화 유도 효과가 우수하다.

Description

골조직 재생 지지체 및 이의 제조 방법{SCAFFOLDS FOR BONE REGENERATION AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 골조직 재생 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 우수한 생체 적합성을 가지고, 초기 부착 및 증식뿐만 아니라, 골전구 세포 및 중간엽 줄기세포에 대한 골분화 유도 효과가 우수한 골조직 재생 지지체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
조직 공학(Tissue Engineering)은 세포에서부터 인공장기에 이르는 재생의료의 영역으로, 조직이나 기관의 복원을 도울 수 있는 생체 물질부터 재료에 이르는 생물학적, 공학적인 기술을 다루는 학문을 기반으로 미래의 생명 과학과 의료분야의 중요한 기술의 하나로 인식되고 있다. 생체 조직의 구조와 기능의 상관관계를 이해하고, 나아가서 생체 대용품을 만들어 이식함으로써 우리 몸의 기능을 복원, 유지, 향상시키려는 목적을 달성하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있다.
조직 공학의 핵심 기술 중 하나는 세포가 붙어 자랄 수 있도록 지지 역할을 하는 지주(support) 또는 지지체(scaffold)를 만들어내는 일이다. 2 차원 막이나 캡슐과 달리 지지체는 3 차원형으로, 3 차원 구조를 가진 모든 체내 세포가 부착되어 분화 및 증식을 할 수 있는 공간을 일컫는다.
지지체는 생체 조직 공학에서 매우 중요한 역할을 수행한다. 지지체는 다공성 구조 내에 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 거의 대부분의 인체 내 세포는 부착되어 성장되는 부착 세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸하게 된다. 따라서, 지지체는 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 대한 적합한 환경을 제공해야 한다.
또한, 이러한 지지체는 세포가 부착되고, 충분히 3 차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 틀의 역할을 하여야 하며 인공 생체 조직을 만드는데 가장 기본적인 요소인 바, 생체적합성, 생분해성, 독성, 기계적, 구조적 특성을 모두 고려하여야 한다. 최근에는 다공성 조직공학용 지지체로서 천연재료, 합성 고분자, 생체 세라믹스 및 고분자-세라믹 복합소재를 사용하여 조직재생용 지지체를 개발하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
한국등록특허 제1186093호(등록일: 2012.09.19)
본 발명의 목적은 우수한 생체 적합성을 가지고, 초기 부착 및 증식뿐만 아니라, 골전구 세포 및 중간엽 줄기세포에 대한 골분화 유도 효과가 우수한 골조직 재생 지지체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골조직 재생 지지체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 흑린(black phosphorus), 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 포함하는 나노 섬유들이 집적된 다공성 나노 섬유 매트릭스를 포함하는 골조직 재생 지지체를 제공한다.
흑린은 나노도트(nanodot) 형태일 수 있다.
흑린 나노도트의 직경은 10 nm 내지 500 nm일 수 있다.
생분해성 합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 이들의 혼합물 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
천연 고분자는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고, 생체적합성 무기질은 하이드록시 아파타이트, 불소화 아파타이트, 옥시 아파타이트, 트리칼슘 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트, 육인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트, 탈미네랄 동물뼈, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
나노 섬유는 나노 섬유 전체 중량에 대하여, 흑린을 0.1 중량% 내지 0.2 중량%, 생분해성 합성 고분자를 79.9 중량% 내지 95.9 중량%, 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 4 중량% 내지 20 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 나노도트(nanodot) 형태의 흑린을 제조하는 단계, 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계, 제1 혼합 용액에 흑린을 첨가하여 제2 혼합 용액을 제조하는 단계, 그리고 제2 혼합 용액을 전기 방사하여 나노 섬유들이 집적된 다공성 나노 섬유 매트릭스를 제조하는 단계를 포함하는 골조직 재생 지지체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 골조직 재생 지지체는 우수한 생체 적합성을 가지고, 초기 부착 및 증식뿐만 아니라, 골전구 세포 및 중간엽 줄기세포에 대한 골분화 유도 효과가 우수하다.
도 1은 BP 나노도트를 TEM 및 라만분광법으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 2a는 나노 섬유 매트릭스의 거시적 이미지이고, 도 2b는 나노 섬유 매트릭스의 FE-SEM 이미지이고, 도 2c는 나노 섬유 표면의 AFM 토포그래피 이미지(topographic images)이고, 도 2d는 접촉각 분석을 통하여 나노 섬유 매트릭스의 표면 친수성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 각각 나노 섬유 매트릭스의 FT-IR 및 라만 분광법에 의한 측정 결과를 나타내고, 도 3c는 나노 섬유 매트릭스의 TGA 측정 결과를 나타낸다.
도 4는 나노 섬유 매트릭스에 MC3T3-E1 preosteoblasts의 초기 부착 및 증식 결과를 나타낸다.
도 5는 나노 섬유 매트릭스에서 MC3T3-E1 preosteoblasts의 골 분화를 ALP 활동 분석을 사용하여 검사한 결과를 나타낸다.
도 6은 나노 섬유 매트릭스에서 면역 블롯 분석(immunoblot analysis)에 의해 골 분화의 후기 마커 중 하나인 OCN의 발현을 정량적으로 평가한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 골조직 재생 지지체는 흑린(black phosphorus), 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 포함하는 나노 섬유들이 집적된 다공성 나노 섬유 매트릭스를 포함한다.
즉, 골조직 재생 지지체는 흑린, 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질이 나노 섬유 형태로 성형되어 다수의 기공을 포함하도록 부직포 형태로 집적되어 이루어진 다공성 나노 섬유 매트릭스를 포함한다.
나노 섬유를 이루는 주 성분인 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질의 선택에 있어 중요하게 고려되어야 할 사항은 조직 세포의 유착과 증식이 잘되어야 하고, 분화된 세포의 기능이 보전되어야 하며, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘 되어 염증 반응이 없을 뿐만 아니라 일정 기간이 지난 후 스스로 분해되어 이물질로 남지 않아야 한다.
이러한 생분해성 합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리(ε-카프로락톤)(ε-PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS), 폴리아닐린(PAN), 이들의 혼합물 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 구체적으로 폴리(ε-카프로락톤)(PCL)일 수 있다.
천연 고분자 또는 생체적합성 무기질은 생체적합성이 있다고 공지된 모든 천연 고분자, 무기물(또는 세라믹)이 가능하다. 다만, 생체적합성을 향상시키는 생체 외 기질 성분 및/또는 기계적 강도와 골조직 재생 효과를 향상시키기 위해 첨가하는 천연 고분자 또는 무기질 재료의 선택에 있어, 인체 내에 이식될 때 주위의 뼈나 조직과의 접합력 및 안정성이 보전되어야 하며, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘 되어 염증 반응이 없어야 함이 우선적으로 고려되어야 한다.
이러한 천연 고분자는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 생체적합성 무기질은 하이드록시 아파타이트, 불소화 아파타이트, 옥시 아파타이트, 트리칼슘 포스페이트, 모노칼슘 포스페이트, 육인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트, 탈미네랄 동물뼈, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 구체적으로 콜라겐일 수 있다.
구체적으로, PCL은 높은 생체적합성 및 생분해성을 갖는 합성 중합체이다. 우수한 물리적, 화학적 및 열적 특성으로 인해 인공 지지체(scaffold)의 적합한 후보가 된다. 특히, 천연 뼈 조직 지지체와 유사한 인장 강도는 조골세포의 생물학적 반응을 더 높여준다.
다만, 조직 공학 지지체로서 나노 섬유 매트릭스를 위한 PCL의 사용은 소수성 및 낮은 접착력에 의해 제한된다. PCL의 이러한 단점은 세포 배양의 초기 과정에서 낮은 세포 로딩을 유도하여 세포 부착, 증식 및 분화를 감소시킨다. PCL 나노 섬유 매트릭스의 생체 역학적 우수성에도 불구하고, 세포 부착 부위의 결여는 지지체로서의 이용을 제한한다.
따라서, 이러한 제한 사항을 해결하기 위해 본 발명에서는 콜라겐(Col) 등의 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 나노 섬유 매트릭스에 통합한 것이다. Col은 천연 세포외 기질(ECM)의 주요 성분이며, 고유한 친수성으로 인해 인공 지지체의 표면 친수성을 증가시킬 수 있다. 또한, Col은 우수한 생체 적합성, 생체 흡수성 및 세포 친화성과 같은 조직 공학 응용 분야에서 많은 장점을 가지고 있다. 특히, Col은 GPO(Gly-Pro-Hyp), GROGER(Gly-Arg-Hyp-Gly-Glu-Arg) 및 GLOGEN(Gly-Leu-Hyp-Gly-Glu-Asp)과 같은 풍부한 세포 접착 도메인을 가지고 있다.
따라서, PCL과 Col의 혼합은 지지체로서 필요로 하는 모든 재료 특성을 만족시키며, 세포 성장에 유리한 환경을 제공할 수 있다.
한편, 흑린(BP)은 인(P) 원소의 층상 구조로 인간 뼈의 무기 성분으로 구성되어 있다. 따라서, BP는 조직 공학 지지체의 뼈 형성 능력을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 탄소 나노 튜브, 그래핀, 금 나노 입자와 같은 다른 나노 물질과 비교하여, BP는 생리학적 환경에서 쉽게 산화되어 포스페이트 및 포스포네이트로 분해될 수 있기 때문에 우수한 생체 적합성, 우수한 생분해성 및 생체 기능성을 제공할 수 있다.
흑린은 나노도트(nanodot) 형태로 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질 내에 분산되어 있을 수 있다. 구체적으로 흑린 나노도트의 직경은 10 nm 내지 500 nm일 수 있고, 구체적으로 20 nm 내지 200 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로 50 nm 내지 100 nm일 수 있다. 흑린이 나노도트 형상을 가지는 경우 고르게 분산될 수 있고, 흑린 나노도트의 직경이 10 nm 미만인 경우 세포 독성을 유발할 수 있고, 500 nm를 초과하는 경우 입자 간 뭉침 현상이 발생할 수 있다.
나노 섬유는 나노 섬유 전체 중량에 대하여, 흑린을 0.1 중량% 내지 0.2 중량%, 생분해성 합성 고분자를 79.9 중량% 내지 95.9 중량%, 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 4 중량% 내지 20 중량%로 포함할 수 있고, 구체적으로 나노 섬유 전체 중량에 대하여, 흑린을 0.12 중량% 내지 0.15 중량%, 생분해성 합성 고분자를 89.88 중량% 내지 94.88 중량%, 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 5 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.
흑린의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우 골분화 유도 효과가 저하될 수 있고, 0.2 중량%를 초과하는 경우 전기 방사시 나노 섬유에 균일하게 분포되지 않거나 부분적으로 침적될 수 있다. 생분해성 합성 고분자의 함량이 79.9 중량% 미만인 경우 전기 방사시 나노 섬유가 잘 형성되지 않을 수 있고, 95.9 중량%를 초과하는 경우 점도가 증가되어 전기 방사시 나노 섬유가 잘 형성되지 않거나 나노 섬유가 지나치게 굵게 형성될 수 있다. 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질의 함량이 4 중량% 미만인 경우 친수성 표면의 형성 효과가 미미하여 세포 부착이 잘 이루어지지 않을 수 있고, 20 중량%를 초과하는 경우 점도가 증가되어 전기 방사시 나노 섬유가 잘 형성되지 않거나 나노 섬유가 지나치게 굵게 형성될 수 있다.
나노 섬유 매트릭스를 이루는 나노 섬유는 100 nm 내지 900 nm의 직경을 가지고, 나노 섬유 매트릭스는 50 ㎛ 내지 500 ㎛의 두께를 기질 수 있고, 구체적으로 나노 섬유 매트릭스를 이루는 나노 섬유는 400 nm 내지 500 nm의 직경을 가지고, 나노 섬유 매트릭스는 70 ㎛ 내지 100 ㎛의 두께를 기질 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 골조직 재생 지지체의 제조 방법은 나노도트(nanodot) 형태의 흑린을 제조하는 단계, 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계, 제1 혼합 용액에 흑린을 첨가하여 제2 혼합 용액을 제조하는 단계, 그리고 제2 혼합 용액을 전기 방사하여 나노 섬유들이 집적된 다공성 나노 섬유 매트릭스를 제조하는 단계를 포함한다.
나노도트 형태의 흑린을 제조하는 단계는 일 예로 고강도 초음파 보조 용액 방법(high-intensity ultrasonication-assisted solution method)을 사용하여 흑린을 박리(exfoliation)함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로, BP를 초음파 처리에 의해 탈이온수에 분산시켜 여러 층의 BP 나노 도트를 형성하고, 분산액으로부터 상청액을 수거하여 탈이온수에 용해시킨 후, 초음파를 가하여 흑린 나노도트를 형성시킬 수 있다.
제1 혼합 용액을 제조하는 단계는 생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질을 용매에 용해시켜 이루어질 수 있다.
생분해성 합성 고분자, 및 천연 고분자 또는 생체적합성 무기질에 대한 설명은 위에서 설명한 바와 동일하므로 반복적인 설명은 생략한다.
용매는 클로로포름, 헥사플루오로이소프로판, 헥사플루오로이소프로판올, 테트라히드로퓨란, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 아이소프로판올, 아이소부틸알콜, 테트라 부틸알콜, 아세톤, 디옥산, 트리플루오르에탄 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 용매로써 화학적으로 세포에 독성이 없는 생체 적합적 유기 용매인 소듐 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS), 소듐 도데실벤젠 술포네이트(sodium dodecylbenzene sulfonate; NaDDBS), Triton X-100, 인지질, 카로틴 등을 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있으며, 이 경우 나노 섬유 매트릭스의 세포 부착력, 생존력 등 조직 공학용 지지체로서 요구되는 물성을 고려하여 용매를 최적화하여 사용할 수 있다.
제2 혼합 용액을 제조하는 단계는 제1 혼합 용액에 흑린을 첨가한 후 혼합하여 이루어질 수 있다. 이때, 흑린은 탈이온수 중에 분산되어 있을 수 있고, 이를 제1 혼합 용액에 첨가할 수 있다.
다공성 나노 섬유 매트릭스를 제조하는 단계는 제2 혼합 용액을 전기 방사하여 이루어질 수 있다.
전기 방사는 통상의 나노 섬유 제조시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 즉, 제2 혼합 용액을 전기 방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 나노 섬유 매트릭스를 제조할 수 있다.
나노 섬유 매트릭스의 제조를 위해 사용되는 제2 혼합 용액의 제조시 사용되는 용매, 용액의 농도, 전기 방사에 사용되는 전압, 방사 거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 나노 섬유 매트릭스의 물성 등에 따라 통상의 기술자가 적절히 조절할 수 있다.
이와 같이 전기 방사에 의하여 나노 섬유 매트릭스를 제조하는 경우 나노 섬유의 직경 분포, 매트릭스의 표면/기계적 물성, 기공의 구조와 분포, 기공률 등을 정교하고 손쉽게 제어할 수 있다.
또한, 나노 섬유 매트릭스의 나노 섬유의 직경, 공극의 크기, 공극률 등은 필요에 따라 제2 혼합 용액의 농도, 전기 방사의 조건 등을 적절히 조절함으로써 제어할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예]
(제조예 1: 흑린 나노도트의 제조)
흑린(BP) 나노도트는 고강도 초음파 보조 용액 방법을 사용하여 박리에 의해 제조되었다. 구체적으로, BP(0.4 g, 12.8 mmol)를 초음파 처리에 의해 탈이온수에 30 분 동안 분산시켜 여러 층의 BP 나노도트를 형성하였다. 분산액으로부터 10 ml의 상청액을 수거하여 탈 이온수에 용해시키고, 초음파로 10 분간 조사했다. 이들 단계를 3 회 반복하여 BP 나노도트를 형성시켰다.
(제조예 2: PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스의 제조)
PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스는 전기 방사 방법을 사용하여 제조되었다. 구체적으로, PCL 수지(MW = 300 kDa, BMG Inc., 교토, 일본) 및 Col(Darim Tissen, 서울, 대한민국)을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올(HFIP, Sigma-Aldrich)에 용해시켰다. 탈이온수 중의 BP 용액을 PCL/Col 용액과 블렌딩하였다. PCL, Col 및 BP의 최종 농도는 각각 80 mg/mL, 8 mg/mL 및 0.125 mg/mL였다. PCL, Col 및 BP의 혼합물을 21G 바늘이 장착된 주사기에 넣고 바늘을 강철 콜렉터로부터 15 cm 떨어뜨렸다. 혼합액의 유량을 0.6 mL/h로 고정하고, 인가 전압을 16 kV로 조정했다. 이어서, BP 포함 PCL/Col 나노 섬유 매트릭스를 실온(RT)에서 진공하에 밤새 건조시켜 임의의 잔류 용매를 제거하였다.
[실험예]
(실험예 1: BP 나노도트의 물리, 화학적 특성)
BP 나노도트의 미세한 형태 및 정성적 특성을 TEM 및 라만 분광법으로 평가 하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, BP 나노도트의 TEM 이미지에서 BP의 균일한 구형 형태를 확인할 수 있으며, BP 나노도트의 평균 직경은 80 nm이고, 직경은 60 nm 내지 100 nm인 것을 알 수 있다(도 1a).
BP의 라만 스펙트럼은 도 1b에 제시되었으며, 여기서 날카로운 및 B2g 밴드가 관찰되었다. BP는 일반적으로 362 cm-1, 440 cm-1 및 469 cm-1에서 포스포렌을 나타내는 밴드인 B2g 모드를 나타낸다. 따라서, TEM 및 라만분광법 결과는 BP 나노도트가 벌크 BP로부터 성공적으로 제조되었음을 보여준다.
(실험예 2: PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스의 표면 물성)
4 종의 나노 섬유 매트릭스, PCL, PCL/BP, PCL/Col 및 PCL/BP/Col을 전기 방사에 의해 제조한 후, 세포에 대한 PCL/BP/Col 나노 섬유의 효과를 조사하였다.
도 2a는 나노 섬유 매트릭스의 거시적 이미지를 나타낸다. 4 개의 나노 섬유 모두 큰 결함 없이 균일하고 매끄러운 표면을 갖는 것으로 확인되었다. 나노 섬유 매트릭스의 표면 형태는 FE-SEM에 의해 측정되었다(도 2b). FE-SEM 이미지는 제조된 나노 섬유 매트릭스가 천연 세포외 기질(ECM)과 유사한 3 차원 다공성 구조를 가짐을 보여주었다. PCL, PCL/BP, PCL/Col 및 PCL/BP/Col의 섬유 직경은 각각 530±42 nm, 583±185 nm, 620±113 nm 및 683±41 nm인 것으로 관찰되었다.
나노 섬유 매트릭스가 BP 또는 Col을 함유하는 경우, 전기 방사 용액의 점도 변화로 인해 섬유의 직경이 약간 두껍게 되는 경향이 있었다. 일반적으로 전기 방사 용액의 점도는 전기 방사에서 나노 섬유의 형태와 직경을 결정하는데 중요한 요소이며, 용액의 중합체 농도를 조정하거나 다른 재료를 첨가하여 용액 점도를 조정할 수 있다. 중합체 사슬과 나노 물질 사이의 계면 상호 작용으로 인해 다른 중합체 또는 2D 나노 물질을 블렌딩함으로써 복합 중합체 용액의 점도를 증가시킬 수 있는데, BP와 Col의 혼합물에 의하여 전기 방사 용액의 점도가 증가함에 따라 PCL/BP/Col 나노 섬유의 직경이 증가했다. 그러나, PCL/BP/Col 전기 방사 섬유는 여전히 나노 스케일 직경 및 매우 큰 표면적을 유지하여 PCL/BP/Col 나노 섬유가 세포와 잘 상호 작용할 수 있음을 시사한다.
도 2c는 섬유 표면의 AFM 토포그래피 이미지(topographic images)를 도시한다. 모든 섬유는 불규칙한 형태와 부분적으로 적층된 구조를 보여 주었지만 첨가제(즉, BP, Col 또는 이들의 혼합물)에 따라 나노 섬유 표면의 형태는 다른 하부 구조를 나타냈다. Col이 없는 PCL 및 PCL/BP 나노 섬유는 소량의 BP가 PCL과 블렌딩 되었기 때문에 유사한 형태를 가졌다. 그러나, Col이 함유된 PCL/Col 및 PCL/BP/Col 나노 섬유에서 상당히 다른 형태가 관찰되었으며, Col이 PCL 섬유의 표면에 직접 흡착되어 섬유의 평균 표면 거칠기(Ra)가 감소되었다. Col과 혼합 된 나노 섬유에서 Col은 소수성의 증가로 인해 PCL 나노 섬유 표면에 직접 고정되어 있다고 생각된다.
조직 공학에 대한 지지체의 표면 친수성은 세포 거동에 큰 영향을 미친다. 따라서 접촉각 분석을 수행하여 나노 섬유 매트릭스의 표면 친수성을 확인하였다(도 2d). PCL, PCL/BP, PCL/Col 및 PCL/BP/Col 매트릭스의 접촉각은 각각 105.2±4.7 도, 122.2±1.2 도, 45.7±3.4 도 및 73.8±14.8 도였다. PCL/Col 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스는 접촉각이 현저히 낮으며, 이는 Col 함유 매트릭스(즉, PCL/Col 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스)가 다른 매트릭스에 비해 표면 친수성이 상당히 높다는 것을 나타낸다. 매트릭스의 이러한 증가된 표면 친수성은 세포-매트릭스 상호 작용뿐만 아니라 초기 세포 접착을 용이하게 할 수 있다.
(실험예 3: PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스의 화학적 및 열적 특성)
각 나노 섬유 매트릭스의 조성을 확인하기 위해, FT-IR 및 라만 분광법을 수행하였다(도 3a 및 도 3b).
PCL의 C-H, C=O, O-H 및 C-O-C 그룹의 밴드는 PCL/BP/Col 매트릭스의 FT-IR 스펙트럼에서 2945 cm-1, 1724 cm-1, 1471 cm-1 및 1169 cm-1에서 관찰되었다. 또한, Col의 아미드 I 및 아미드 II 밴드도 1657 cm-1과 1552 cm-1 부근에서 관찰되었다. 나노 섬유 매트릭스에서 BP의 함량이 너무 작아서 FTIR 분광법으로 분석하기가 어려웠다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 362 cm-1, 440 cm-1 및 469 cm-1에서 PCL/BP/Col 매트릭스의 라만 스펙트럼에서, 및 B2g 밴드를 포함한 BP의 특성 밴드가 각각 관찰되었다. 이러한 결과는 나노 섬유 매트릭스가 성공적으로 제조되었으며 BP 및 Col이 매트릭스에 잘 분포되어 있음을 시사한다.
나노 섬유 매트릭스의 분해 온도 및 열 안정성은 TGA에 의해 조사되었다(도 3c). TGA 곡선은 분해 개시 온도와 잔류 질량이 Col의 존재 유무에 따라 크게 다르다는 것을 보여 주었다. Col이 없는 PCL 및 PCL/BP 나노 섬유 매트릭스의 경우, 열분해가 330 ℃ 이상에서 개시되었고 질량 손실은 430 ℃ 이상에서 95 % 이상이었다. 반대로, Col을 함유한 PCL/Col 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스의 경우, 열분해가 300 ℃ 이상에서 개시되었고, 열 손실은 430 ℃ 이상에서 85 % 이상이었다. Col을 함유한 나노 섬유 매트릭스의 열적 특성은 Col과 다른 폴리머의 상호 작용으로 인해 전기 방사 용액의 블렌드 제조 중에 변경될 수 있다. Col과 PCL의 상호 작용은 Col-PCL과 Col-Col 사이의 수소 결합 형성의 경쟁으로 이어질 수 있으며, 그 결과 PCL/Col 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 약간의 열적 특성 변화가 발생한다. 따라서, Col을 함유 한 PCL/Col 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스는 Col이 없는 PCL 및 PCL/BP 나노 섬유 매트릭스보다 잔류 질량이 더 높았기 때문에, 생성된 모든 나노 섬유 매트릭스는 300 ℃ 이하의 열에 의해 분해되지 않았다. 잔류 질량의 차이는 함유된 물질의 양에 기인한 것으로, 제작된 나노 섬유 매트릭스가 세포 배양 조건(
Figure 112019125661870-pat00001
37 ℃) 하에서 열적으로 안정한 환경을 제공할 수 있음을 나타낸다.
(실험예 4: PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 MC3T3-E1 preosteoblasts의 세포 활동)
MC3T3-E1 preosteoblasts를 PCL, PCL/BP, PCL/Col 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 배양하고 각 세포에서 preosteoblasts의 초기 세포 부착 및 증식을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4a에 도시된 바와 같이, PCL/Col, PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스 상의 MC3T3-E1 preosteoblasts의 초기 세포 부착은 Col이 없는 나노 섬유 매트릭스(즉, PCL 및 PCL/BP 나노 섬유 매트릭스) 보다 높았다. 그 중에서도 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스의 초기 세포 부착은 대조군(TCP)과 유사할 정도로 충분히 높았다. Col에 기인한 나노 섬유 표면의 높은 친수성은 초기 세포 부착 및 세포와의 상호 작용을 효과적으로 촉진 시켰으며 PCL 나노 섬유 매트릭스에서의 세포 부착은 PCL의 고유한 표면 소수성으로 인해 낮았다. Col 함유 매트릭스의 높은 표면 친수성은 세포와의 상호 작용을 향상시켜 초기 부착을 향상시킨다.
한편, PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스는 BP가 함유된 경우에도 세포 부착 수준이 감소되지 않았다. BP 나노도트는 용량-의존적 세포 독성을 나타내는 것으로 입증되었지만, 저농도에서 세포에 대한 현저한 세포 독성 효과는 없었다. 또한, BP 나노도트는 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스로부터 직접 방출되지 않았으며, PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스 상의 세포는 BP 나노도트의 용량 의존적 세포 독성의 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스가 초기 세포 부착을 방해하지 않으면서 세포 부착에 유리한 환경을 제공할 수 있음을 시사한다.
한편, PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 MC3T3-E1 세포의 증식은 다른 나노 섬유 매트릭스보다 높았다. 나노 섬유 매트릭스 상의 높은 세포 부착은 세포 증식을 촉진한다는 것이 널리 인식되어왔다. 이 연구에서, PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스는 다른 나노 섬유 매트릭스와 비교하여 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 세포 부착이 증가하였고(도 4a), PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스는 세포 증식을 향상시킬 수 있음을 암시한다(도 4b). 또한, 소형 BP(<~ 210nm)는 세포 증식을 촉진할 수 있다.
(실험예 5: PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 MC3T3-E1 preosteoblasts의 골 분화)
PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 MC3T3-E1 preosteoblasts의 골 분화를 ALP 활동 분석을 사용하여 검사했다.
도 5a는 매트릭스 상에서 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성을 나타낸다. ALP 활성은 초기 골 분화 마커로 광범위하게 사용되었다. 14 일 동안 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스 상에서 배양된 세포는 다른 매트릭스 상에서 배양된 세포와 비교하여 ALP 활성이 유의적으로 증가하였다(p <0.05). 이것은 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스가 어떠한 골 형성제 없이도 초기 골 형성 분화 마커를 향상시킬 수 있음을 나타낸다(도 5a). 흥미롭게도, BP를 함유하는 나노 섬유 매트릭스(즉, PCL/BP 나노 섬유 매트릭스)의 ALP 활성은 다른 나노 섬유 매트릭스의 ALP 활성보다 약간 더 높았다. ALP 활성 분석에 더하여, 폰 코사 염색(von Kossa staining)을 수행하여 후기 골 감소화를 평가하였다. 폰 코사 염색은 골다공증의 후기 마커로서 미네랄화된 뼈 결절을 평가하는데 널리 사용된다. BP(즉, PCL/BP 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스)를 함유하는 나노 섬유 매트릭스 상에서 인큐베이션된 MC3T3-E1 세포에서 갈색-검은색으로 염색된 광물화된 뼈 결절이 분명히 관찰되었다. 대조적으로, BP가 없는 나노 섬유 매트릭스는 특히 PCL 나노 섬유 매트릭스에서 비교적 갈색을 띤 검은색 얼룩을 나타내었다. 이러한 결과는 PCL/BP 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스가 골 형성제가 없는 경우에도 MC3T3-E1 preosteoblast에 의해 광물화된 뼈 결절의 생성에 의해 상당한 골다공증을 유도할 수 있음을 시사한다. 이것은 부분적으로 BP가 생체 적합성이며 인간 뼈의 무기 성분과 유사한 인(P) 성분으로 구성되어 있다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. 나노 섬유 매트릭스에 포함된 BP는 세포에 인을 공급할 수 있어 골감소화를 위한 최적의 환경을 제공한다.
한편, MC3T3-E1 세포가 14 일 동안 골 형성 조건에서 배양되었을 때, 세포는 골 형성 인자가 없는 기초 배지에서 배양된 세포보다 현저히 높은 ALP 활성 및 갈색-흑색으로 염색된 무기질 뼈 결절을 나타냈다.
또한, 본 발명자들은 면역 블롯 분석(immunoblot analysis)에 의해 골 분화의 후기 마커 중 하나인 OCN의 발현을 정량적으로 평가하였다(도 6). 인큐베이션 21 일 후, MC3T3-E1 preosteoblasts에서 OCN의 발현 수준은 BP 함유 나노 섬유 매트릭스(즉, PCL/BP 및 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스)에서 유의하게(p < 0.05) 증가하였다. 특히, PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 OCN 발현 수준이 급격히 증가하여 PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스에서 MC3T3-E1 preosteoblasts의 골분화가 크게 가속화되었음을 나타낸다. 이 결과는 강화된 ALP 활성 및 뼈 결절의 미네랄화와 완전히 일치했다(도 5).
결과적으로, PCL/BP/Col 나노 섬유 매트릭스는 초기 세포 부착, 증식, ALP 활성, 미네랄화 된 뼈 결절 생성 및 골 형성 단백질(OCN) 발현을 포함하여 향상된 세포 거동을 고려할 때, 세포 성장을 성공적으로 지원할 뿐만 아니라, 골 분화를 효과적으로 촉진할 수 있는 유망한 뼈 조직 공학 지지체로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (7)

  1. 나노도트 형태의 흑린(black phosphorus), 폴리카프로락톤(PCL), 및 콜라겐을 포함하는 나노 섬유들이 집적된 다공성 나노 섬유 매트릭스를 포함하는 골조직 재생 지지체로서,
    상기 나노 섬유는 흑린, 폴리카프로락톤(PCL), 및 콜라겐을 포함하는 혼합 용액을 전기방사하여 제조된 것이고,
    상기 나노 섬유는 상기 나노 섬유 전체 중량에 대하여, 상기 흑린을 0.1 중량% 내지 0.2 중량%, 상기 폴리카프로락톤(PCL)을 79.9 중량% 내지 95.9 중량%, 상기 콜라겐을 4 중량% 내지 20 중량%로 포함하는,
    골조직 재생 지지체.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 흑린 나노도트의 직경은 10 nm 내지 500 nm인 것인 골조직 재생 지지체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리카프로락톤의 평균 분자량은 300kDa인,
    골조직 재생 지지체.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 나노도트(nanodot) 형태의 흑린을 제조하는 단계,
    폴리카프로락톤(PCL), 및 콜라겐을 용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계,
    상기 제1 혼합 용액에 흑린을 첨가하여 제2 혼합 용액을 제조하는 단계,
    그리고 상기 제2 혼합 용액을 전기 방사하여 나노 섬유들이 집적된 다공성 나노 섬유 매트릭스를 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 나노 섬유는 상기 나노 섬유 전체 중량에 대하여, 상기 흑린을 0.1 중량% 내지 0.2 중량%, 상기 폴리카프로락톤(PCL)을 79.9 중량% 내지 95.9 중량%, 상기 콜라겐을 4 중량% 내지 20 중량%로 포함하는,
    골조직 재생 지지체의 제조 방법.
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X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant