KR101636778B1

KR101636778B1 - 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 나노섬유시트

Info

Publication number: KR101636778B1
Application number: KR1020150017862A
Authority: KR
Inventors: 한동욱; 홍석원; 이종호; 신용철; 김성은; 이태헌; 박지훈; 김진수
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2015-02-05
Publication date: 2016-07-06

Abstract

본 발명은 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 나노섬유시트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 생분해성 합성 고분자 및 천연 고분자를 유기용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 혼합 용액에 그래핀 옥사이드를 투입한 후, 초음파 처리하여 그래핀 옥사이드가 균질하게 분산된 제2 혼합용액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제2 혼합 용액을 전기방사하여 나노섬유 지지체를 제조하는 단계;를 포함하는 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법과 이에 의하여 제조되는 조직재생용 생분해성 나노섬유시트를 제공한다.

Description

조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 나노섬유시트{PREPARATION METHOD OF BIODEGRADABLE NANOFIBER SHEET FOR TISSUE REGENERATION, AND NANOFIBER SHEET PREPARED BY THE SAME}

본 발명은 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 나노섬유시트에 관한 것이다.

조직공학(Tissue Engineering)은 세포에서부터 인공장기에 이르는 재생의료의 영역으로, 조직이나 기관의 복원을 도울 수 있는 생체물질부터 재료에 이르는 생물학적, 공학적인 기술을 다루는 학문을 기반으로 미래의 생명과학과 의료분야의 중요한 기술의 하나로 인식되고 있다. 생체 조직의 구조와 기능의 상관관계를 이해하고, 나아가서 생체 대용품을 만들어 이식함으로써 우리 몸의 기능을 복원, 유지, 향상시키려는 목적을 달성하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있다.

조직공학의 핵심 기술 중 하나는 세포가 붙어 자랄 수 있도록 지지역할을 하는 지주(support) 또는 지지체(scaffold)를 만들어내는 일이다. 2차원 막이나 캡슐과 달리 지지체는 3차원 형으로, 3차원 구조를 가진 모든 체내 세포가 부착되어 분화 및 증식을 할 수 있는 공간을 일컫는다.

지지체는 생체조직공학에서 매우 중요한 역할을 수행한다. 지지체는 다공성 구조 내에 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 거의 대부분의 인체내 세포는 부착되어 성장되는 부착세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸하게 된다. 따라서 지지체는 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 대한 적합한 환경을 제공해야 한다.

또한 이러한 지지체는 세포가 부착되고, 충분히 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 틀의 역할을 하여야 하며 인공 생체 조직을 만드는데 가장 기본적인 요소인 바, 생체적합성, 생분해성, 독성, 기계적, 구조적 특성을 모두 고려하여야 한다. 최근에는 다공성 조직공학용 지지체로서 천연재료, 합성 고분자, 생체 세라믹스 및 고분자-세라믹 복합소재를 사용하여 조직재생용 지지체를 개발하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다. (한국등록특허 제 10-1186093호)

또한 나노섬유 및 나노입자 등의 나노구조체는 연질 조직의 세포 지지를 위한 효과적인 구조체 중 하나로써, 자체의 구조적 장점으로 인해 세포의 증식 및 생성, 분화에 긍정적인 영향을 준다는 많은 보고가 있다.

한편, 흑연(Graphite) 의 산화를 이용한 화학적 박리를 통해 얻을 수 있는 그래핀 옥사이드(Graphene Oxide, GO)는 뛰어난 수용성, 양친매성, 손쉬운 표면 기능화, surface enhanced Raman scattering (SERS) 및 형광 소광 능력 등의 독특한 특성을 가지고 있기 때문에 생물학적 응용에 적합하고, 유망한 물질로 평가되고 있다. 특히 그래핀의 소수성과 유연성은 세포 증식과 분화과정에서 중요한 역할을 한다. 이러한 GO의 흥미로운 특성들은 주로 sp3 탄소에 의해 둘러싸인 작은 부분의 sp2 탄소영역과 친수성 작용기를 포함한 산소로 구성된 화학 구조로부터 나타나는 것이다.(Acc. Chem. Res., 2013, 46 (10), pp 2211-2224의 Biomedical Applications of Graphene and Graphene Oxide)

이에 본 발명자들은 상기와 같은 기술에 착안하여, 조직재생용 지지체로서 합성고분자 및 천연고분자를 이용하면서 그래핀 옥사이드를 더 포함하도록 하여 전기방사법으로 나노섬유시트를 제조하여 조직재생용 나노섬유시트를 제조하고, 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조되는 조직재생용 생분해성 나노섬유시트를 제공하는 것을 다른 해결과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

(a) 생분해성 합성 고분자 및 천연 고분자를 유기용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계;

(b) 상기 제1 혼합 용액에 그래핀 옥사이드를 투입한 후, 초음파 처리하여 그래핀 옥사이드가 균질하게 분산된 제2 혼합용액을 제조하는 단계; 및

(c) 상기 제2 혼합 용액을 전기방사하여 나노섬유 지지체를 제조하는 단계;를 포함하는 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 생분해성 합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물이고;

상기 천연고분자는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는 상기 (b) 단계에서 제조되는 제2 혼합 용액은 전체 중량 대비, 20~40중량%의 생분해성 합성고분자와, 1~5중량%의 천연고분자, 0.1~5중량%의 그래핀 옥사이드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는 상기 나노섬유시트는 골격근 분화촉진용 생분해성 나노섬유시트인 것을 특징으로 한다.

상기 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 조직재생용 생분해성 나노섬유시트를 제공한다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면 전기방사에 의하여 조직재생용 생분해성 나노섬유시트를 제조할 수 있고, 상기 제조된 나노섬유시트는 천연고분자 및 그래핀 옥사이드에 의하여, 초기 세포 부착성, 세포의 분화, 세포와의 상호작용 등이 증가되는 등 우수한 생체적합성과 조직재생용 지지체로서의 적합성을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 그래핀 옥사이드에 의하여 조직재생용 지지체로서 우수한 기계적 특성을 나타낼 수 있는 효과가 있다.

이에 따라 본 발명의 방법에 의하여 제조되는 나노섬유시트는 효과적인 조직재생용, 특히 골격근분화용 지지체로서 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유시트의 표면 구조와 사진을 나타낸 것이다(FESEM(상단), AFM(하단) 사진).
도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유시트의 FT-IR 스팩트럼 결과를 나타내 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유시트의 물과의 접촉각과 표면에너지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유시트의 인장 강도를 측정하여 응력-변형 곡선으로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 제조된 나노섬유시트에서의 체외 세포 반응 측정결과를 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 실시예에서 제조된 나노섬유시트에서의 세포 부착력 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유시트에서 세포의 증식률을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유시트에서 세포의 분화를 면역형광염색으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유시트에서 분화된 세포의 발현면적 및 세포융합지수를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법을 상세히 설명하기로 한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면 본 발명은 (a) 생분해성 합성 고분자 및 천연 고분자를 유기용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 제1 혼합 용액에 그래핀 옥사이드를 투입한 후, 초음파 처리하여 그래핀 옥사이드가 균질하게 분산된 제2 혼합용액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제2 혼합 용액을 전기방사하여 나노섬유 지지체를 제조하는 단계;를 포함하는 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법에 관한 것이다.

이하 단계를 나누어 구체적으로 설명한다.

먼저 (a)단계는, 생분해성 합성 고분자 및 천연 고분자를 유기용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계이다.

이 때, 상기 생분해성 합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있고, 상기 천연고분자는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나 으나 이에 제한되지 않고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 생분해성 합성 고분자 및 천연 고분자를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 나노섬유시트에 포함되는 상기 생분해성 합성고분자는 가수 분해되며 분해 속도의 조절이 가능하고 이 특성으로 조직공학용 지지체를 제거하기 위한 재수술이 불필요하도록 하는 반면, 전기방사에 의하여 나노섬유시트를 형성할 때 소수성의 성질을 나타내게 되는데, 본 발명에서는 상기 천연고분자를 더 포함하도록 함으로써 천연 고분자가 가지는 친수성 작용기에 의하여 나노섬유시트의 표면이 친수성을 가지게 된다. 따라서 본 발명에 따라 제조되는 나노섬유시트는 세포 부착을 촉진 및 유도하여 세포 생존 확률을 높이고 안정화 시켜 세포의 분열, 분화를 도와줄 수 있어 조직재생용 지지체로서 유용하게 제공될 수 있다.

또한 상기 유기용매는 클로로포름, 헥사플루오로이소프로판, 헥사플루오로이소프로파놀, 테트라히드로퓨란, 디메틸포름아미드, 디클로로메탄, 아이소프로판올, 아이소부틸알콜, 테트라 부틸알콜, 아세톤, 디옥산, 트리플루오르에탄 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 유기 용매로써 화학적으로 세포에 독성이 없는 생체 적합적 유기 용매인 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate; SDS), 소듐 도데실벤젠 술포네이트(sodium dodecylbenzene sulfonate; NaDDBS), Triton X-100, 인지질, 카로틴 등을 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있으며, 이 경우 본 발명의 나노섬유시트의 세포 부착력, 생존력 등 조직공학용 지지체로서 요구되는 물성을 고려하여 지지체 및 용매를 최적화하여 사용하는 것이 바람직하다.

다음으로, (b)단계는 상기 제1 혼합 용액에 그래핀 옥사이드를 투입한 후, 초음파 처리하여 그래핀 옥사이드가 균질하게 분산된 제2 혼합용액을 제조하는 단계이다.

상기 그래핀 옥사이드는 뛰어난 수용성, 양친매성, 손쉬운 표면 기능화, surface enhanced Raman scattering (SERS) 및 형광 소광 능력 등의 독특한 특성을 가지고 있는바, 나노섬유시트의 제조시 세포의 부착성, 증식성, 기계적 강도 등 조직재생용 지지체로서 적합한 물성을 발현할 수 있게 한다.

그러나 상기 그래핀 옥사이드는 그 분산정도에 따라 전기방사법을 이용할 때 제조되는 나노섬유시트의 물리화학적 특성과 표면 에너지 값이 변하게 되므로 GO 용액을 반드시 초음파 처리하여 균질하게 분산되도록 하는 것이 중요하다.

이 경우, 상기 초음파는 특별히 한정하지 않는 것으로서, 상기 그래핀 분산 수지 용액 내에 초음파를 가할 수 있는 것이라면 어떠한 것도 사용할 수 있으나, 사용상의 편의 등을 이유로 호른(horn) 형태의 초음파 장치를 이용하여 초음파 처리를 수행할 수 있다. 이때, 상기 초음파 처리는 40 내지 100W로 1시간 내지 5시간 동안 수행할 수 있다. 1시간 미만으로 수행하는 경우에는 충분한 분산이 이루어지지 않는 문제가 있으며, 5시간을 초과하는 경우에는 더 이상의 초음파 처리에 의한 효과가 얻어지지 않는다. 보다 바람직하게는 50 내지 80W로 1시간 30분 내지 3시간 동안 처리할 수 있다.

이때, 1 내지 10초간 초음파 처리한 후에 1 내지 4초 동안 냉각을 반복할 수 있다. 상기 냉각은 상기 초음파 처리는 초음파 처리시에 발생되는 열을 제거하기 위한 것이다. 초음파 처리시에 발생하는 열은 유기용매의 휘발을 야기할 수 있고, 나아가, 열에 의해 고분자 등의 유기물의 손상을 유발할 수 있는바, 이를 억제하기 위한 것이다. 이를 위해, 가능한 한 낮은 온도를 유지하는 것이 바람직하다. 이와 같은 온도는 사용되는 용매에 따라 달라지는 것으로서, 일률적으로 정할 수 없으며, 본 기술분야의 통상의 기술자라면 사용되는 유기용매에 따라 적절하게 온도를 설정할 수 있을 것이다.

이러한 열의 제거를 위해서는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 얼음 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, 얼음 욕조에 상기 그래핀이 분산된 혼합 용액이 담긴 용기를 중탕하여 발생하는 열을 제거할 수 있다.

상기 (b) 단계에서 제조되는 제2 혼합 용액은 전체 중량 대비, 15~30중량%의 생분해성 합성고분자와, 1~5중량%의 천연고분자, 0.1~5중량%의 그래핀 옥사이드를 포함할 수 있다.

이 경우, 생분해성 합성 고분자가 상기 중량범위 미만으로 포함시 전기방사시 나노섬유가 형성되지 않고 나노입자 형태로 형성될 수 있으며, 상기 중량범위를 초과하는 경우 점도가 향상되어 전기방사시 나노섬유가 형성되지 않을 수 있거나 나노섬유가 지나치게 굵게 형성될 수 있다.

또한 상기 천연고분자가 상기 중량범위 미만으로 포함시 천연 고분자에 의한 친수성 표면의 형성 효과가 미미하여 세포의 부착이 잘 이루어지지 않을 수 있고, 상기 중량범위를 초과하는 경우, 점도가 향상되어 전기방사시 나노섬유가 형성되지 않을 수 있거나 나노섬유가 지나치게 굵게 형성될 수 있다.

또한 상기 그래핀 옥사이드는 상기 중량범위 미만으로 포함시 세포의 부착성, 증식성, 친수성, 기계적 강도 등의 물성을 만족할 수 없고, 상기 중량범위를 초과하는 경우, 점도가 향상되어 전기방사법을 사용시 노즐에서의 뭉침현상에 의해 나노섬유 형성이 용이하지 않을 수 있고, 세포독성을 나타낼 우려가 있다.

또한, 상기 그래핀 옥사이드는 표면에 에폭사이드기, 히드록시기, 카르보닐기, 카르복시기 등의 라디칼 등으로 기능화된 것을 사용하는 것도 가능하고, 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetramine)과 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)와 같은 아미노 기능화제(amino-functionalization agents)를 그라핀 산화물의 표면에 처리해 줌으로서 아민 라디칼 등으로 기능화된 것을 사용하는 것도 가능하다. 이 경우 기능화된 그래핀 옥사이드는 극성의 증가, 생체 작용기의 도입 등이 가능하여 세포의 부착성, 증식, 친수성 등의 기능을 유도할 수 있게 된다.

다음으로, 상기 (c)단계는 상기 제2 혼합 용액을 전기방사하여 나노섬유 지지체를 제조하는 단계이다.

이 때, 상기 전기방사법은 통상의 나노섬유 제조시 사용되는 방법으로 수행될 수 있다. 즉, 상기 생분해성 합성 고분자 및 천연 고분자를 용매에 용해시켜 고분자 혼합 용액을 제조한 후 그래핀 옥사이드를 투입하여 분산시킨 다음, 상기 혼합용액을 전기방사 장치에 주입하고 토출시켜 다공성 구조를 갖는 나노섬유시트를 제조한다. 상기 나노섬유시트의 제조를 위해 사용되는 혼합 용액의 제조시 사용되는 용매, 고분자 용액의 농도, 전기방사에 사용되는 전압, 방사거리, 유속 등은 사용되는 고분자의 종류나 목적하는 나노섬유시트의 물성 등에 따라 당업자가 적절히 조절할 수 있다. 이와같이 전기방사에 의한 경우 시트를 구성하는 나노섬유의 직경분포, 시트의 표면/기계적 물성, 기공의 구조와 분포, 기공률 등을 정교하고 손쉽게 제어할 수 있게 된다.

또한 본 발명에서 제조되는 나노섬유시트에 있어서, 나노섬유의 직경, 공극의 크기, 공극률 등은 필요에 따라 혼합용액의 농도, 전기방사의 조건 등을 적절히 조절함으로써 제어할 수 있는바, 본 발명에 있어서 상기 나노섬유시트는 100nm ~ 900nm의 직경을 가지고, 50~500㎛ 두께의 매트형상의 나노섬유인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 나노섬유시트는 400~500 nm의 평균 직경으로 70~100 μm의 두께를 가지는 매트형상으로 제작되도록 한다.

이와같이 본 발명의 방법에 따르면, 생분해성 합성 고분자와 천연 고분자 및 그래핀 옥사이드를 포함하는 조직재생용 생분해성 나노섬유시트를 제조할 수 있게 되고, 이 때 바람직하게는 골격근 분화촉진용 생분해성 나노섬유시트를 제조할 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상술한 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 생분해성 합성 고분자와 천연 고분자 및 그래핀 옥사이드를 포함하는 조직재생용 생분해성 나노섬유시트를 제공한다. 이 때 상기 나노섬유시트는 천연고분자에 의하여 초기 세포 부착성이 촉진되고, 그래핀 옥사이드에 의하여 세포의 분화가 촉진되는 등, 상기 천연고분자 및 그래핀 옥사이드에 의하여 세포와의 상호작용이 증가됨은 물론, 생체적합성을 가질 수 있고, 그래핀 옥사이드에 의하여 기계적 특성을 가질 수 있게 된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> GO-PLGA-Col 혼합 용액을 이용한 나노섬유시트의 제조

1-1 GO-PLGA-Col 혼합 용액의 제조

먼저, 헥사플루오로이소프로패놀 [1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP)] (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO)을 용매로 하여 생분해성 합성고분자로 poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA) (75:25 비율의 폴리락트산과 폴리글리콜산)를 20 wt%, 천연고분자로 콜라겐(Col)을 3 wt%, 그래핀 옥사이드(GO)를 1 wt% 첨가하여 제조하였다. 이 때, 상기 GO는 그래파이트 플라스크를 modified Hummers' 법에 의해 GO 분말로 제조한 뒤 탈이온수에 넣어 2시간 동안 초음파 처리하여 분산시켜 혼합용액을 제조하였다.

1-2 나노섬유시트의 제조

상기 실시예 1-1에서 제조된 혼합 용액을 이용하여 전기방사법으로 나노섬유시트를 제조하였다.

보다 구체적으로 상기 전기방사는, 21G 니들을 결합시킨 주사기 (syringe)에 제작된 혼합 용액을 담아 준비한 후, 전압 단자를 주사기 (needle tip)의 애노드 (anode)에, 집전판(collection plate)의 캐소드 (cathod)에 연결하고 그 사이의 거리는 14 cm로 하였으며, 14 kV의 전압을 인가하여 혼합 용액을 0.2 ml/h의 방사속도로 하여 수행하였다.

<비교예 1> PLGA 용액을 이용한 나노섬유시트의 제조

HFIP 용매에 PLGA 20 wt%를 첨가하여 혼합용액을 제조하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 나노섬유시트를 제조하였다.

<비교예 2> GO-PLGA 혼합 용액을 이용한 나노섬유시트의 제조

HFIP 용매에 PLGA 20 wt%와 GO 1 wt%를 첨가하여 혼합용액을 제조하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 나노섬유시트를 제조하였다.

<비교예 3> PLGA-Col 혼합 용액을 이용한 나노섬유시트의 제조

HFIP 용매에 PLGA 20 wt%와 콜라겐 3 wt%를 첨가하여 혼합용액을 제조하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 나노섬유시트를 제조하였다.

<시험예 1> 고분자/그래핀 옥사이드 나노섬유시트의 물리화학적 특성 측정

1-1 나노섬유시트의 표면 분석

상기 실시예 1 및 비교예 1-3에서 제조된 나노섬유시트의 표면 구조를 전계방사형 주사현미경(FESEM) (Hitachi S-4700, Tokyo, Japan)과 원자힘현미경법(AFM)(NX10, Park Systems Co., Suwon, Korea)을 사용하여 측정하였다.

1-2 나노섬유시트의 FT-IR 분석

상기 실시예 1 및 비교예 1-3에서 제조된 나노섬유시트의 성분을 확인하기 위하여 푸리에 변환 적외선 분광 분석법(FT-IR spectroscopy) (Nicolet 560, Nicolet Co., Madison, WI)을 사용하여 측정하였다.

1-3 나노섬유시트의 접촉각 및 표면에너지 분석

접촉각 측정 장치 (contact angle measurement system) (OCA10, Dataphysics, Filderstadt, Germany)를 사용하여, 상기 실시예 1 및 비교예 1-3에서 제조된 나노섬유시트의 극성, 분산도 및 표면에너지를 측정하였다.

<시험예 2> 고분자/그래핀 옥사이드 나노섬유시트의 체외 세포 반응 측정

2-1 세포 배양

상기 실시예 1 및 비교예 1-3에서 제조된 나노섬유시트의 체외 세포 반응을 측정하기 위해, 생쥐 유래 세포인 C2C12 마이오블라스트(myoblasts)를 이용하였다.

구체적으로, ATCC에서 구입한 C2C12 마이오블라스트를 10% 소태아혈청 [fetal bovine serum (FBS)](Welgene), 1% 안티바이오틱-안티마이코틱 [antibiotic-antimycotic (Abs)](Sigma-Aldrich) 용액을 포함한 둘베코 개질 이글 배지[Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)] (Welgene, Daegu, Korea)에서 37℃, 5%, CO₂ 조건 하에 배양하였다.

2-2 GO의 세포 독성 측정

GO의 세포 독성을 알아보기 위해, 탈이온수에서 2시간 동안 초음파 처리 (sonication)하여 GO를 분산시켜 각기 다른 농도의 GO 용액을 제조한 후, C2C12 마이오블라스트에 처리하기 위해 세포 배양에 사용한 배지에 상기 GO 용액을 섞어 GO-배지 용액을 제조하였다(0-500 μg/ml).

배양된 C2C12 마이오블라스트는 96 웰 플레이트 (96-well plate)에 1×10⁴ cell/ml로 분주하고, 이후 GO-배지 혼합용액을 넣고 24시간 동안 처리하였다.

2-3 나노섬유시트에의 세포 부착력 측정

세포 부착력은 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 시트, GO-PLGA 시트, PLGA-Col 시트, 및 대조군으로서 조직 배양 접시 (TCP)에 C2C12 마이오블라스트를 1×10⁴ cell/ml의 농도로 분주하고 6시간 동안 배양하였다. 둘베코 인산염 완충용액 [Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)] (Sigma-Aldrich)으로 세척한 뒤 배지를 500 μl 넣고 CCK-8 분석법에 따라 수용성 테트라졸리움 솔트-8 (WST-8) 50 μl를 세포가 분주된 용액에 넣고, 이후 암실에서 4시간 동안 세포를 배양한 후 450 nm의 흡광도를 엘라이저 리더 (ELISA reader) (SpectraMax 340, Molecular Device Co., Sunnyvale, CA)로 측정하였다.

2-4 나노섬유시트에서 세포의 분화 측정

실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 시트, GO-PLGA 시트, PLGA-Col 시트, 및 대조군으로서 조직 배양 접시 (TCP)에 C2C12 마이오블라스트를 분주하고 성장배지(DMEM)에서 2일간 배양한 후, 면역형광염색을 실시하고 myosin heavy chain (MHC)를 관찰하였다.

이후, 분화 배지(DMEM + 2% horse serum, 1% antibiotic-antimycotic 용액)에서 추가적으로 5일간 배양하여 면역형광염색을 실시하고 myosin heavy chain (MHC)를 관찰하였다.

상기 면역형광염색에서 세포핵은 DAPI (파랑), F-액틴은 TRITC-labelled phalloidin (빨강), myosin heavy chains (MHCs)는 FITC-labelled anti-MHC antibody (녹색)로 면역형광염색하였다.

이하, 도면을 참고하여 상기 실시예 및 시험예의 결과를 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트의 표면 구조와 사진을 나타낸 것이다.

도 1을 참고하면, 상기 실시예 1, 비교예 1 내지 3에서 제조된 나노섬유시트 모두 3차원의 다공성 네트워크 구조를 나타냄을 확인할 수 있는바, 이는 자연 ECM과 구조적으로 유사함을 확인할 수 있다.

또한 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트를 구성하는 나노섬유의 직경은 100 nm∼950 nm이며 평균 직경은 440 nm이다. 섬유의 직경이 불규칙적인 이유는 콜라겐과 PLGA 그리고 GO가 무작위로 섞여있기 때문이다. 또한 상기 섬유의 평균 직경은 비교예에서 제조된 섬유들에 비해 미세하게나마 실시예 1의 GO-PLGA-Col 섬유에서 더 작은 것을 확인할 수 있는바, 이는 GO와 콜라겐으로 인해 부분적으로 전기방사 용액의 점성이 감소하기 때문이다.

또한 도 1에 있어서 각각의 FESEM 사진과 표면구조를 살펴보면, 직경이 감소함에 따라 표면적과 부피의 비율이 증가하게 되는바, 다른 섬유보다 직경이 작은 GO-PLGA-Col 섬유가 표면적이 넓어 세포와 쉽게 상호작용 할 수 있음을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 나노섬유시트의 세포부착력이 향상될 수 있다.

또한 도 2는 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트의 FT-IR 스팩트럼 결과를 나타낸 것이다.

도 2를 참고하면, 실시예 1에 따른 GO-PLGA-Col 섬유에서는 1752 cm^-1부근에서 PLGA와 GO의 C=O 결합에 대한 밴드가 발견되었다. 1546 cm^-1에서는 콜라겐의 amide Ⅱ 그룹에 의한 밴드가 발견되었다. 이것은 N-H 결합과 C-N 결합이 존재함을 나타낸다. 또한 1632 cm^-1부근에서 발견되는 밴드는 GO의 C=C 결합을 나타낸다. 이 결과로 GO와 콜라겐이 GO-PLGA-Col 섬유에서 고루 분포한다는 것을 확인할 수 있다.

또한 도 3은 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트의 극성, 분산도 및 표면에너지 분석결과로서, 물과의 접촉각과 표면에너지를 나타낸 것이다.

도 3을 참고하면, 비교예 1에 따른 PLGA 나노섬유시트에서 135±0.7°의 초소수성을 나타내었고, 비교예 2에 따른 GO-PLGA 나노섬유시트에서 126.3±0.7°, 비교예 3에 따른 PLGA-Col 나노섬유시트에서 95.2±0.4°의 소수성을 나타냄을 확인할 수 있는 반면 실시예 1에 따른 GO-PLGA-Col 나노섬유시트의 경우에는 85.0±0.3°의 접촉각을 나타내어 친수성을 나타냄을 확인할 수 있다. 이를 통해 GO-PLGA 나노섬유시트의 접촉각은 표면에 하이드록시기를 가진 GO에 의해서 미세하게 감소하는 반면, 콜라겐이 포함된 나노섬유시트의 경우에는 친수성을 띄는 콜라겐에 의해 접촉각이 상당히 감소함을 확인할 수 있다.

또한 표면에너지 측정 결과, 비교예 1 내지 3의 나노섬유시트에 비하여 GO와 콜라겐을 모두 포함하는 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서 표면에너지가 32.35 mN/m로 가장 높은 값을 나타냄을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 나노섬유시트는 친수성 표면을 가지고 표면 에너지가 높아 조직재생용 지지체로 적용시 초기의 세포 부착, 세포의 증식 및 분화와 같은 세포 거동을 강화시킬 수 있어 세포와의 상호작용을 증가시키는 중요한 역할을 할 수 있게 된다.

또한 도 4는 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트의 인장 강도를 측정하여 응력-변형 곡선으로 나타낸 것이다.

도 4를 참고하면, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트와 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트는 각각 3.8, 27.4, 2.9, 16.8 MPa 정도의 인장 강도를 가지는 것으로 나타났다.

이러한 탄성률은 응력-변형 곡선에서 탄성 변형구간의 기울기가 최대일 때의 값으로서, 상기 결과는 PLGA 기질에 콜라겐을 첨가한 시트에서는 인장 강도, 탄성률과 같은 기계적 특성이 감소함을 나타낸다(도 4 A, 도 4 C). 반면 GO를 첨가한 시트의 경우에는 인장 강도와 탄성률이 상기 PLGA, PLGA-Col 시트보다 크게 증가하였다.

즉, 콜라겐의 첨가에 의하여 기계적 특성이 감소되는 것을 GO에 의하여 보완함으로써 본 발명에 따른 GO-PLGA-Col 나노섬유시트가 기계적으로 안정하여 세포가 성장하는데 필요한 지지체 역할을 충분히 할 수 있게 되는 것이다.

또한 도 5는 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서의 체외 세포 반응 측정결과로서, GO의 세포 독성 측정결과를 나타낸 것이다.

도 5를 참고하면, C2C12 마이오블라스트의 생존율은 GO의 농도가 증가함에 따라 감소한다. 세포 생존율은 62.5 μg/ml 보다 낮은 농도에서는 약간 감소했지만, 100 μg/ml 보다 더 높은 농도에서는 상당히 감소했다. 100 μg/ml 보다 더 높은 농도에서의 C2C12 마이오블라스트의 생존율은 대조군의 약 40%만큼 감소했다.

GO는 산화 스트레스에 의한 세포독성을 가지고, GO의 농도가 증가할수록 세포독성도 함께 증가한다는 선행연구들이 있으나, 상기 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 낮은 농도에서는 뚜렷한 세포독성을 보이지 않는다. 즉, 조직재생용 나노섬유시트에 있어서 GO는 C2C12 마이오블라스트에 해로운 영향이 없으며 10 μg/ml 농도 이하에서는 생체적합성을 가짐을 확인할 수 있다.

또한 도 6는 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서의 세포 부착력 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 6을 참고하면, 비교예 3의 PLGA-Col 나노섬유시트와 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서 높은 세포 부착력을 나타내었고, 특히 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서 상기 비교예 3의 시트에 비해서도 상당히 높은 부착력을 나타내었다. 이와같이 TCP와 PLGA, GO-PLGA 시트에 비해서 PLGA-Col, GO-PLGA-Col 시트가 더 높은 세포 초기 부착력을 가지는 것은, 나노섬유시트 표면의 친수성 혹은 소수성 특징에 의해 세포 초기 부착력이 영향을 받음을 의미하는 것이다.

또한 도 7는 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트 및 대조군인 TCP에서 C2C12 마이오블라스트를 1, 3, 5, 7일간 배양하여 측정한 C2C12 마이오블라스트의 증식률을 나타낸 것이다.

도 7을 참고하면, 모두 세포 증식률이 증가하는 것으로 나타났고, 특히 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와 비교예 3의 PLGA-Col 나노섬유시트에서 더 향상된 결과를 나타내었고, 상대적으로 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서 더 향상된 결과를 보여주었다. 이는 나노섬유시트에 포함된 콜라겐과 GO가 친수성을 향상시키고 세포 증식에 영향을 미친 것으로 분석된다.

즉, 본 발명에 따른 나노섬유시트는 콜라겐에 의하여 나노섬유시트의 생체적합성이 향상되고, GO에 의하여 세포의 부착, 증식, 분화를 포함한 세포 거동을 향상시킴으로써 초기 세포 부착과 증식을 효과적으로 촉진시킴을 확인할 수 있다.

또한 도 8은 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트 및 대조군인 TCP에서 C2C12 마이오블라스트를 배양하여, C2C12 마이오블라스트의 분화여부를 이광자 여기형광 (two-photon excitation fluorescence) 사진(Scale bar: 50 μm)을 나타낸 것이다.

도 8A을 참고하면, 비교예 1의 PLGA 나노섬유시트에서 배양한 C2C12 마이오블라스트는 제대로 부착하지 못하여 비정상적인 세포 모양을 나타내고, 비교예 3 및 실시예 1의 PLGA-Col 및 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서는 높은 세포 성장률을 보임을 확인할 수 있고, 나노섬유시트에 고루 분포하고 있음을 보여준다.

또한, C2C12 마이오블라스트를 PLGA, PLGA-Col 나노섬유시트에 배양하였을 경우엔 MHC의 녹색 형광이 관찰되지 않았지만 GO-PLGA, GO-PLGA-Col 나노섬유시트에 배양하였을 경우 MHC의 녹색 형광이 나타남을 확인할 수 있다. 또한, GO-PLGA와 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에 배양한 C2C12 마이오블라스트는 이웃한 세포끼리 융합되어 다핵성 근섬유 (multinucleate myotube)를 형성함을 확인할 수 있다.

상기 MHC는 분화한 근육세포에서 발현되는 단백질로서 GO-PLGA, GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서 확인되는 MHC의 녹색 형광과 다핵성 근섬유의 형성은 상기 C2C12 마이오블라스트가 충분히 증식하여 근육세포로 분화되었음을 의미하는 바, 즉, GO에 의하여 세포의 부착, 증식, 분화를 포함한 세포 거동을 향상시킴을 확인할 수 있다.

또한 도 8B를 참고하면, 분화배지에서 비교예 1의 PLGA 나노섬유시트를 제외하고 C2C12 마이오블라스트의 분화를 확인할 수 있는바, 상기 비교예 1의 PLGA 나노섬유시트에서는 세포가 충분히 증식하지 못해 근육세포로 분화되지 않은 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명에 따른 GO-PLGA-Col 나노섬유시트는 세포의 부착과 증식을 향상시킬 뿐만 아니라, 근육세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있다.

도 9는 실시예 1의 GO-PLGA-Col 나노섬유시트와, 비교예 1 내지 3의 PLGA 나노섬유시트, GO-PLGA 나노섬유시트, PLGA-Col 나노섬유시트 및 대조군인 TCP에서 C2C12 마이오블라스트를 배양하여, C2C12 마이오블라스트의 세포 면적, MHC가 발현된 면적 및 세포 융합 지수를 나타낸 것이다.

이 때, 상기 세포융합지수는 다음과 같이 계산하였다.

도 9를 참고하면, GO-PLGA-Col, PLGA-Col 나노섬유시트에서 성장 배지(GM)를 이용해 배양한 C2C12 마이오블라스트의 면적은 PLGA나 GO-PLGA 나노섬유시트에 비해 상당히 증가하였다. 이 결과는, 이전에 측정한 나노섬유시트의 세포 부착력, 증식 결과와 일치한다.

또한 분화 배지(DM)에서 배양한 경우, GO-PLGA 시트에서 배양한 C2C12 마이오블라스트의 세포 면적이 성장 배지에서 배양했을 때 보다 크게 증가하는 것을 확인 할 수 있었는데, 이는 GO가 분화에 더 효과적인 조건을 가지고 있기 때문이다.

특히 실시예 1에 따른 GO-PLGA-Col 나노섬유시트에서 C2C12 마이오블라스트는 가장 높은 MHC 발현 면적과 융합 지수를 보였다. 이는 시트에 존재하는 GO가 C2C12 마이오블라스트의 분화를 촉진했기 때문으로, 실시예 1에 따른 GO-PLGA-Col 시트는 근육세포의 융합을 촉진할 뿐만 아니라 융합된 근육세포를 근섬유로 성숙시킴을 의미한다.

이러한 결과로부터 상기 실시예 1에 따른 본 발명의 나노섬유시트가 GO에 의하여 세포의 분화를 촉진할 뿐만 아니라, 콜라겐에 의하여 초기 세포 부착성과 증식을 향상시켜 줌에 따라 C2C12 마이오블라스트의 분화를 자극하고, 부착 및 증식을 향상시키는 생체기능성을 갖춘 지지체임을 확인할 수 있다.

상기 결과로부터, 본 발명에 따라 제조된 나노섬유시트는 천연고분자에 의하여 초기 세포 부착성이 촉진되고, 그래핀 옥사이드에 의하여 세포의 분화가 촉진되는 등, 상기 천연고분자 및 그래핀 옥사이드에 의하여 세포와의 상호작용이 증가됨은 물론, 생체적합성을 가질 수 있고, 그래핀 옥사이드에 의하여 기계적 특성을 가질 수 있어 효과적인 조직재생용 지지체로서 사용될 수 있는 것으로 기대된다.

Claims

(a) 생분해성 합성 고분자 및 천연 고분자를 유기용매에 용해시켜 제1 혼합 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 제1 혼합 용액에 그래핀 옥사이드를 투입한 후, 40~100W로 1 내지 5 시간 동안 초음파 처리하여 그래핀 옥사이드가 균질하게 분산된 제2 혼합용액을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 제2 혼합 용액을 전기방사하여 나노섬유 지지체를 제조하는 단계;를 포함하고,
상기 (b) 단계에서 제조되는 제2 혼합 용액은 전체 중량 대비, 20~40중량%의 생분해성 합성고분자와, 1~5중량%의 천연고분자 및 0.1~5중량%의 그래핀 옥사이드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 생분해성 합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 고분자 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물이고;
상기 천연고분자는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐 및 셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 나노섬유시트는 골격근 분화촉진용 생분해성 나노섬유시트인 것을 특징으로 하는, 조직재생용 생분해성 나노섬유시트의 제조방법.
제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 조직재생용 생분해성 나노섬유시트.