KR102361455B1 - 나노그래핀옥사이드가 함유된 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노그래핀옥사이드(nGO, nano graphine oxide)가 함유된 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드로서, 실란 커플링제가 첨가된 나노그래핀옥사이드 용액 및 폴리우레탄 용액을 혼합하여 전기방사하여 제조된 것인 스캐폴드에 관한 것이다.

Description

나노그래핀옥사이드가 함유된 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드 및 이의 제조 방법{nanofiber scaffold comprising cabon nanotube interfaced biopolymer nanofiber and preparation method thereof}

본 발명은 나노그래핀옥사이드(nGO, nano graphine oxide)가 함유된 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 나노그래핀옥사이드가 폴리우레탄에 도입되어 친수성, 탄성 및 응력 완화(stress relaxation) 능력과 같은 기계적 특성이 개선되고, 세포 독성 없이 근육 등의 연조직 재생 효과를 갖는 스캐폴드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

천연 및 공학 조직에서 세포와 세포외 기질(ECM) 간의 통신은 적절한 조직 기능에 중요하다(Torii R et al., J Tissue Eng, 2018). 인간 천연 조직에서, 특히 심장 근육 및 골격근과 같은 연조직은 매우 탄성적인 특성을 갖는다. 생체재료의 탄성은 근육 및 힘줄과 같은 탄성 조직에 적용될 때 생체 적합성과 밀접한 관련이 있을 수 있다(Chen J et al., ACS Appl Mater Interfaces, 2015). 따라서 이러한 연조직의 조직 공학은 주변 조직과 조화를 이루고 여러 변형주기를 견딜 수 있는 탄성 생체재료의 개발과 밀접한 관련이 있다(AR1 W et al., Expert Opinion Biological Therapy, 2004). 합성 생분해성 엘라스토머는 일반적으로 자연적으로 발생하는 탄성 물질의 구조를 시뮬레이션하는 3 차원 가교 네트워크, 생분해성, 근육 및 힘줄과 같은 연조직의 중요한 특성 중 하나인 스트레스 완화와 같은 기계적 특성 및 물리 화학적 특성을 포함하는 몇 가지 특징을 가지고 있다(Konow N et al., Proc Biol Sci, 2015). 따라서, 이들 엘라스토머는 지지 매트릭스의 기계적 특성을 재현할 수 있는 능력으로 인해 연성 조직 재생 영역에서 상당한 관심을 끌었다(Serrano MC et al., Advanced Functional Materials, 2010).

많은 연구에서 생체재료가 천연 세포 외 매트릭스(ECM)의 생물학적 및 기계적 특성을 모방하는 것이 중요하기 때문에, 많은 연구는 엘라스토머성 생체재료의 개발에 중점을 두고 있다(Bat E et al., regenerative medicine, 2014). ECM의 여러 속성을 모방하도록 다양한 생체재료가 설계되었다. 예를 들어, 전기방사된 나노섬유 스캐폴드 생체재료는 섬유 표면 구조를 갖는 ECM(Marelli B et al., Acta Biomater, 2010; Jiang T et al., Progress in Polymer Science, 2015)에 대한 넓은 표면적 및 유사한 물리적 구조로 인해 조직 공학 분야에서 상당한 관심을 끌고 있다(Lee JH et al., J Tissue Eng, 2018). 실제로 모든 생명체는 나노미터 스케일의 분자 거동과 분리할 수 없으며, ECM은 나노 스케일에서 센티미터 스케일까지 복잡한 계층적 3D 구조를 가지고 있다. 따라서, 많은 연구자들은 나노 스케일 생체재료에 관심이 있다(Dashnyam K et al., J Tissue Eng, 2018; Divakarla SK et al., J Tissue Eng 2018; Damiati L et al., J Tissue Eng, 2018; Levin A et al, J Tissue Eng 2018). 전기 방사된 나노섬유 스캐폴드의 기계적 특성은 생물학적 시스템에 적용하기 위한 요건을 충족시키는 것으로 보인다. 최근의 간행물은 시험관 내에서 지형 또는 전기 신호로 강화된 전기 방사된 섬유 피복에서 골격 근섬유 형성 및 세포 거동의 개선을 보여주었다(Aviss KJ et al., European Cells and Materials, 2010; Severt SY et al., J. Mater. Chem. B, 2017).

천연 및 합성 엘라스토머를 조직 복구 및 재생 분야에 적용하기 위한 많은 연구가 수행되었다(Chen Q et al., Progress in Polymer Science, 2013). 그 중에서도 폴리우레탄(PU)은 생분해성, 기계적 유연성, 생체 적합성 및 다양한 조성으로 인해 조직 공학 응용 분야에서 널리 연구된 합성 탄성 중합체 중 하나이다(Chen J et al., ACS Appl Mater Interfaces, 2015; Sears NA et al., J Tissue Eng, 2016). 폴리우레탄은 합성에 사용될 수 있는 다양한 유형의 마크로디올, 디이소시아네이트 및 사슬연장제로부터 단량체 물질의 다양한 선택이 있기 때문에 널리 적용될 수 있다(Chattopadhyay DK et al., Progress in Polymer Science, 2007). 더욱이, 사슬 연장제 뿐만 아니라 연질 및 경질 세그먼트에 대한 출발 물질을 변화시킴으로써 원하는 물리 화학적 특성을 합성된 폴리우레탄에 쉽게 도입할 수 있다(Castagna AM et al., Macromolecules, 2011). 폴리우레탄의 물리 화학적 특성은 어느 정도 변경될 수 있지만, 생체 적합성과 밀접한 관련이 있는 낮은 친수성은 염려되어 왔고, 연구자들이 여러 경로를 통해 개선하기 위한 초점이 되었다(Madbouly SA et al., Progress in Polymer Science, 2009).

한편, 중합체 복합체는 중합체 단독과 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 하이드록시아파타이트(HA)(Mi H-Y et al., Journal of Materials Science, 2013), 키토산(Zhao J et al., Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2012) 및 탄소나노튜브(CNT)(Sharma Y et al., Int J Biol Macromol, 2012)와 같은 생체 적합성 첨가제의 첨가는 세포 및 스캐폴드 사이의 기계적 성능, 친수성 및 상호 작용을 변형시키기 위해 다양한 스캐폴드로서 널리 연구되었다. 또한, 그래핀과 그 유도체는 독특한 물리 화학적 특성으로 인해 최근 생체재료 분야에서 상당한 주목을 받고 있다(Geim AK et al., Science, 2009; Matthew J. Allen VCT et al., A Review of Graphene. chemical reviews, 2010). 그래핀의 가장 중요한 유도체 중 하나인 그래핀 옥사이드(GO)는 표면에 다수의 하이드록실 그룹을 가지고 있어, 그래핀 옥사이드에 친수성을 부여한다(Matthew J et al., A Review of Graphene. chemical reviews, 2010). 비록 그래핀 옥사이드가 전달시스템(Depan D et al., Materials Science and Engineering: C, 2011; Ren T et al., Polymer Chemistry, 2012) 및 세포 배양 시스템(Tu Q et al., Analyst, 2014; Dong X et al., Adv Mater, 2010)에 사용되었지만, 세포 독성에 대하여는 논쟁의 여지가 있다.

특허문헌: 국내 등록특허 제10-1517295호

본 발명자들은 폴리우레탄의 생분해성, 기계적 유연성을 활용하면서도 폴리우레탄이 갖는 낮은 친수성 문제를 개선하고, 높은 생체 적합성을 갖는 연조직 재생에 적합한 생체재료를 연구하던 중, 적절한 수준의 나노그래핀옥사이드를 함유하는 폴리우레탄 나노섬유는 인장 강도 및 친수성과 같은 골격근 공학에 적합한 개선된 기계적 특성뿐만 아니라, 최소의 세포 독성을 가져 조직에 적합하고, 근원성 단백질 분화 능력이 뛰어남을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 나노그래핀옥사이드가 함유된 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드로서, 실란 커플링제가 첨가된 나노그래핀옥사이드 용액 및 폴리우레탄 용액을 혼합하여 전기방사하여 제조된 스캐폴드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 실란 커플링제를 산화 그래핀 용액과 폴리우레탄 용액에 첨가하는 단계; (b) 상기 (a)의 실란 커플링제가 첨가된 각 용액을 초음파 처리하여 균질하게 분산시킨 후, 용액을 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 혼합용액을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계를 포함하는 상기 나노섬유 스캐폴드 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노섬유 스캐폴드를 연성 조직에 처리하는 단계를 포함하는 연성 조직 재생 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노섬유 스캐폴드를 유효성분으로 포함하는 연성 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명의 일 양태에 따르면 나노그래핀옥사이드가 함유된 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드로서, 실란 커플링제가 첨가된 나노그래핀옥사이드 용액 및 폴리우레탄 용액을 혼합하여 전기방사하여 제조된 것인 스캐폴드에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "폴리우레탄"은 효소적으로 분해가능하며, 생물부식성이며, 가수분해적으로 안정하며, 및/또는 생체흡수성인 것이 바람직하다. 그러므로 본원 발명의 재료로부터 형성된 스캐폴드가 분해할 때, 효소적 공정 또는 생물부식의 부산물은 생물적합성일 수 있으며, 세포 호흡, 해당, 발효, 또는 트리카르복실릭 애시드 사이클과 같은 세포적 물질대사 경로에서 이용될 수 있거나 물질대사될 수 있다. 폴리우레탄은 폴리머 골격에서 하나 이상의 우레탄 그룹(-NH-CO-O-)을 결합하는 모든 폴리머를 포함한다. 폴리우레탄은 통상적으로 디이소시아네이트와 같은 폴리이소시아네이트를 디올과 같은 폴리올과 반응시킴으로써 형성된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리우레탄은 중합체 구성 단위로서, 무수당 알코올, 폴리올 및 폴리이소시아네이트를 포함하는 것이다.

상기 무수당 알코올은 이소소르비드, 이소만니드, 이소이디드 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

상기 폴리올은 폴리카보네이트 디올, 폴리카프로락톤 디올, 폴리에테르 폴리올, 폴리에스테르 폴리올, 이들 폴리올과 비닐 화합물을 중합시켜서 얻어지는 폴리머 폴리올, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.

상기 폴리이소시아네이트는 리신 디이소시아네이트, 톨루엔 디이소시아네이트, 아르기닌 디이소시아네이트, 아스파라긴 디이소시아네이트, 글루타민 디이소시아네이트, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 헥산 디이소시아네이트, 메틸렌 bis-p- 페닐 디이소시아네이트, 이소시아뉴레이트 폴리이소시아네이트, 1,4-부탄 디이소시아네이트, 유렛디온 폴리이소시아네이트, 또는 지방족, 지환족, 방향족 폴리이소시아네이트, 또는 이들 중 2종 이상의 혼합물이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 폴리우레탄은 중합체 구성단위로서 이소소르비드, 폴리카보네이트 디올 및 헥사메틸렌 디이소시아네이트를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 실란 커플링제는 아미노실란, 에폭시실란, 아크릴실란, 비닐실란, 에폭시실란, 메타크릴록시실란, 아크릴록시실란, 우레이도실란, 클로로프로필실란, 메르캅토실란, 설파이도실란, 또는 이소시아네이토실란일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 실란 커플링제는 아미노실란이다. 상기 아미노실란은 APTES((3-aminopropyl)-triethoxysilane), APDEMS((3-aminopropyl)-diethoxy-methylsilane), APDMES((3-aminopropyl)-dimethyl-ethoxysilane) 또는 APTMS((3-aminopropyl)-trimethoxysilane)이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노그래핀옥사이드는 상기 폴리우레탄을 기준으로 1 내지 10중량% 포함된다. 상기 나노그래핀옥사이드는 상기 폴리우레탄을 기준으로 2 내지 10중량%, 3 내지 10중량%, 4 내지 10중량%, 5 내지 10중량%, 6 내지 10중량%, 7 내지 10중량%, 7 내지 9중량% 또는 8중량%로 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예에서 나노그래핀옥사이드 함량이 10중량%를 넘는 경우 폴리우레탄과 나노그래핀옥사이드의 혼합이 점도가 증가되어 문제가 되어 나노섬유 형성이 저해된다. 단, 상기 함량 범위에서 나노그래핀옥사이드 함량이 높을수록 근원성 세포의 분화와 관련된 유전자 또는 단백질의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 스캐폴드의 접촉각은 25 내지 65°이다.

본 발명에서 사용된 용어 "접촉각"은 친수성을 나타내는 인자로 사용될 수 있다. 나노그래핀옥사이드의 함량이 증가될수록 스캐폴드의 친수성이 증가하여 접촉각이 감소될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 나노그래핀옥사이드의 함량이 폴리우레탄을 기준으로 1 내지 8중량%로 증가됨에 따라 접촉각은 25 내지 65°의 범위를 가질수 있으며, 접촉 시간이 짧을수록 접촉각은 증가될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 스캐폴드의 인장 응력은 12 내지 20MPa이다.

본 발명에서 사용된 용어 "인장 응력"은 재료가 외력을 받아서 늘어날 때, 이 힘에 대응하여 내부에서 발생하는 저항력을 의미하며, 본 발명의 일 실시예에서 나노그래핀옥사이드 함유 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드의 인장 응력은 12 내지 20MPa로 폴리우레탄의 유연성을 유지하였다.

본 발명의 일 구현예에서, 스캐폴드의 비례한계는 40 내지 60%이다.

본 발명에서 사용된 용어 "비례한계"는 재료에 외력이 가해지는 경우, 재료의 내력과 변형의 비례가 깨어지는 경계가 되는 점을 의미하며, 본 발명의 일 실시예에서 나노그래핀옥사이드 함유 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드의 비례한계는 40 내지 60%로 폴리우레탄의 비례한계와 유사하였다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 스캐폴드는 응력 완화 효과가 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "응력 완화"는 재료에 힘을 가하여 그 상태를 유지하고 있더라도 재료 내부의 응력이 시간과 더불어 감소하는 거동을 의미하며, 본 발명의 일 실시예에서 나노그래핀옥사이드의 함량이 폴리우레탄을 기준으로 1 내지 8중량%로 증가됨에 따라 우수한 응력 완화 효과를 나타내고, 이는 세포배양시 세포 성장 및 분화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 스캐폴드는 동적 장력 자극(dynamic tensional stimuli) 하에서 근성 유전자, 단백질 발현 및/또는 근관 형성이 증가한다.

본 발명에서 동적 장력 자극 실험은 스캐폴드가 근육, 힘줄과 같은 연성 조직에 이식되는 경우 근육의 움직임에 의해 받는 힘에 의해 스캐폴드 위의 근원성 세포의 분화 특성을 확인하기 위한 것으로, 동적 장력 자극 시, 자극을 하지 않은 군에 비해 스캐폴드 위의 세포의 근원성 유전자, 단백질의 발현 및 정렬된 근관 형성 증가를 확인하였다. 이에 개발된 스캐폴드와 생체모방적인 동적 장력을 가할 시 근육 조직 재생에 시너지 효과가 있음을 확인할 수 있다.

상기 근원성 유전자, 단백질은 PAX3, c-Met, Mox2,　MSX1, Myf5,　MyoD, Myogenin,　MCF2, Six1/4, Myf6, Lbx1, Meox2, PAX7, 액틴, 액티닌, MHC 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서 동적 장력 자극에 대해 액틴, 미오게닌, MyoD의 유전자 발현의 상향 조절, MHC 단백질 발현의 상향 조절을 확인하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 실란 커플링제를 산화 그래핀 용액과 폴리우레탄 용액에 첨가하는 단계; (b) 상기 (a)의 실란 커플링제가 첨가된 각 용액을 초음파 처리하여 균질하게 분산시킨 후, 용액을 혼합하는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 혼합용액을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계를 포함하는 상기 나노섬유 스캐폴드 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 실란 커플링제는 APTES이다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 (c) 전기방사의 유속은 1 내지 3ml/hr이다. 본 발명의 일 실시예에서 전기방사는 12.5kV에서 주입 속도 2ml/hr로 수집 드럼으로부터 바늘 팁은 10cm 거리로 고정되며, 500rpm로 회전하는 드럼으로 전기방사한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노섬유 스캐폴드를 연조직에 처리하는 단계를 포함하는 연성 조직 재생 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 나노섬유 스캐폴드를 유효성분으로 포함하는 연성 조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 나노그래핀옥사이드가 함유된 폴리우레탄 유래 나노섬유 스캐폴드는 근육모세포주로 알려진 C2C12 세포와 함께 배양 시 세포의 초기 부착 및 확산 및 추가 증식을 향상시켰으며, 근원성 유전자 또는 단백질의 발현을 유의하게 상향 조절하고, 기계적으로도 우수한 유연성, 응력 완화 특성 및 동적 자극 조건에서 유의하게 높은 근육 분화 마커를 발현하고, 정렬된 근관 형성을 나타내어 연성 조직 재생에 효과적임을 확인하였다.

본 발명은 나노그래핀옥사이드가 폴리우레탄에 도입되어 친수성, 탄성 및 응력 완화(stress relaxation) 능력과 같은 기계적 특성이 개선되고, 세포 독성 없이 근육 등의 연조직 재생 효과를 갖는 스캐폴드 및 이의 제조 방법을 제공한다.

도 1은 PU-nGO 나노섬유의 제조 및 물리 화학적 특성을 나타낸다 (a)는 폴리카보네이트 디올(PCD) 및 이소소르비드(isosorbide)로부터 원샷 벌크 중합 후 제조된 폴리우레탄의 화학 구조 및 전기방사에 의해 나노섬유 스캐폴드를 제조하기 위한 폴리우레탄에의 nGO 컨쥬게이션을 나타낸다. (b)는 폴리우레탄 활성화를 위한 APTES 처리 후 nGO의 XRD 및 FTIR을 나타낸다. 활성화되면 피크가 10에서 20˚(B, 왼쪽 패널)로 이동하고 3200cm^-1로 표시된 OH 피크, 1600cm^-1에서 C=O 피크가 변경되었다(b, 오른쪽 패널), (c)는 nGO 컨쥬게이트된 폴리우레탄 나노복합체의 FT-IR을 나타낸다. 1220cm^-1의 강렬한 피크는 에스테르 또는 하이드록실기를 나타내며 섬유의 nGO 함량에 따라 강해진다. (d)는 PU-nGO의 SEM 및 TEM 이미지 및 섬유의 전기전도도를 나타낸다. 섬유는 미세하게 제조되었고 nGO는 잘 분포되어 있었다. 습한 조건 하에서, 8% PU-nGO만이 전기 전도성을 나타냈다. (e)는 0~10분의 시간에서 섬유 스캐폴드의 친수성을 결정하기위한 물 접촉각(WCA) 분석을 나타낸다. 더 많은 nGO를 갖는 섬유는 더 높은 친수성을 나타냈다.
도 2는 PU-nGO 나노섬유의 기계적 특성을 나타낸다. (a)는 인스트론 기계 및 (b) 내지 (d) 데이터의 분석에 의한 모든 PU-nGO 나노섬유 막 실험군의 응력-변형 곡선을 나타낸다. (b)는 나노섬유의 최대 인장 응력(12 내지 20MPa)을 나타낸다. PU-nGO 섬유는 PU의 유연성을 유지했다. (c)는 나노섬유의 인장 탄성률을 나타낸다. 모든 PU-nGO 나노섬유는 순수한 PU에 비해 향상된 탄성률을 나타냈다. (d)는 나노섬유의 비례 한계(40 내지 60%)를 나타낸다. 8% PU-nGO는 PU의 비례 한계와 비슷한 수준을 나타냈다. (e) 및 (f)는 100% 변형(strain)에서 응력 완화를 나타낸다. (e)는 스트레스 완화 곡선을 나타낸다. 모든 나노섬유는 응력 완화 경향을 나타냈다. (f)는 응력 완화 곡선에 기초한 모든 실험군의 tau 1/2을 나타낸다. 4% 및 8% PU-nGO 그룹은 최고의 응력 소산 능력을 나타내는 가장 짧은 tau 1/2 값을 나타냈다.
도 3은 PU-nGO 나노섬유에 대한 C2C12의 초기 세포 부착 및 증식을 나타낸다. (a)는 나노섬유 상에 부착성 C2C12의 초기 세포 수를 나타내고, (b)는 4시간 배양에서 필드 당 세포 확산 영역을 나타낸다. (c)는 4시간에 빈쿨린 및 액틴 면역세포 화학 분석을 나타낸다. nGO 함량과 함께 형광 강도가 증가하여, 세포가 보다 높은 nGO 함량을 갖는 막에 더 잘 부착되고 확산됨을 나타낸다. (d)는 세포 증식을 식별하기 위해 부착성 세포의 DNA 함량을 나타낸다. 8% PU-nGO는 가장 높은 증식 능력을 나타냈다.
도 4는 PU-nGO 나노섬유의 근육 분화 효과를 나타낸다. PU-nGO 나노섬유상에서 3일의 분화 후, (a)는 SEM을 나타낸다. 두꺼운 섬유를 갖는 확산된 C2C12 세포가 SEM에 의해 PU-nGO에서 관찰되었다. (a) 및 (c)는 액틴 필라멘트 및 미오신 중쇄(MHC) 이미지를 이용한 면역 세포 화학 분석을 수행한 결과이다. MHC 발현 및 액틴 발현은 다른 것에 비해 8% PU-nGO에서 고도로 상향 조절되었다. 8% PU-nGO 나노섬유 막은 C2C12 세포에서 가장 근원성(myogenic) 잠재력을 보여주었다. (d)는 근원성 유전자 발현 결과(alpha-actinin, myogenin 및 MyoD)를 나타낸다. PU 나노섬유에서 nGO 양의 증가에 따라, 근원성 유전자 유전자 발현의 상향 조절이 확인되었다. 8% PU-nGO 나노섬유 막은 근원성 유전자 발현을 상향조절하였다.
도 5는 동적 장력(dynamic mechanical tension)에 의한 PU-nGO 나노섬유의 근원성 분화를 확인하였다. Flexcell 기계(10% 변형률, 0.5Hz, 1시간/일)를 사용한 동적 장력 하에서 8% PU-nGO 나노섬유상에서 3일 분화 후 촬영한 (a) SEM, (b)는 면역 세포 화학 분석을 이용한 미오신 중쇄(MHC)이미지를 나타낸다. 8% PU-nGO 나노 복합체 상에 완전히 덮인 C2C12 세포가 SEM에 의해 관찰되었다. MHC 발현 및 정렬된 근관 형성은 정적 배양과 비교하여 동적 장력 하에서 8% PU-nGO에서 고도로 상향 조절되었다. 동적 장력과 nGO는 C2C12 세포의 근육발생을 향상시키기 위해 시너지 효과를 나타냈다. (c)는 근원성 유전자(alpha-actinin, myogenin 및 MyoD) 발현 결과를 나타낸다. 동적 장력은 nGO와 상승적으로 근원성 유전자 발현을 향상시켰다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다,

실시예 1. PU-nGO 나노섬유의 제조

1-1. 재료

분석용 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입했다. 시약은 2,2,2 트리 플루오로 에탄올(TFE, C₂H₃F₃O, ≥99 %), 클로로포름(CHCl₃, 99.0%), (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES, H₂N(CH₂)₃Si(OC₂H₅)398%), N,N-디메틸포름아미드((DMF), HCON(CH₃)₂, 99.8%), 헥사메틸렌디이소시아네이트(HDI, OCN(CH₂)₆NCO), 이소프로필 알코올(IPA, (CH₃)₂CHOH, 99.5%, 덕산 케미칼, 한국), 디언하이드로-D-글루시톨(이소소르비드, C₆H₁₀O_4, 98%), 지방족 폴리카보네이트 디올 2000(PCD diol, T4672, Asahi Kasei chemical corporation)를 포함한다. 나노 그래핀 옥사이드 분말은 Calverton(NY, 11933, USA)에서 구입하였다. nGO의 직경은 약 90nm~200nm이고, 두께는 약 1nm이었다. 단일 층 비율은 >99%이었고, 입자의 순도는 >99%이었다.

1-2. 폴리우레탄의 제조

폴리우레탄을 폴리카보네이트 디올(PCD) 및 이소소르비드로부터 원샷 벌크(one-shot bulk) 중합에 의해 제조하였다. PCD 디올(23.78g, 11.89mmol) 및 이소소르비드(6.95g, 47.57mmol)를 기계적 교반기, 온도계 및 응축기가 있는 4구 둥근바닥 플라스크(250mL)에 넣었다. 두 디올의 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 N₂ 하에 교반하였다. HDI 10g, 59.46mmol)를 혼합물에 더하여 120℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 합성된 PU를 DMF에 분산시키고 IPA(4L)에서 침전시켰다. 석출된 PU를 IPA로 세정하고 60℃에서 24시간 동안 진공 건조하여 고순도 PU를 제조하였다.

1-3. PU-nGO 나노섬유 스캐폴드의 제조

폴리우레탄을 클로로포름에 10wt%로 용해시켰다. 한편, 0, 1, 2, 4 및 8% 나노그래핀옥사이드(용해된 폴리우레탄을 기준으로 계산)를 TFE에 용해시키고, 균일하게 분산시키기 위해 80℃에서 5분 동안 초음파 처리하였다. 이어서, APTES를 각 용액에 첨가하고, 추가로 5분 동안 초음파 처리하였다. 각 용액을 혼합하여 실온에서 교반하면서 균질화시켰다.

이어서, 상기 혼합된 10ml 용액을 23-게이지 바늘 팁을 갖는 10ml 플라스틱 주사기에 삽입하고 전기방사 장치의 주입 펌프 상에 놓았다. 전기 방사 장치의 주입 속도는 12.5kV로 2ml/hr로 설정되었고 바늘 팁은 수집 드럼으로부터 10cm 거리로 고정되었다. 드럼을 500rpm으로 설정하고 알루미늄-포일 시트 상에 섬유를 수집하였다. 결과적으로, 수득된 전기방사된 나노섬유 시트를 에어후드에 배치하여 유기 용매를 증발시켰다.

실시예 2. PU-nGO 나노섬유의 물리 화학적 특성

2-1. 실험 방법

섬유는 고해상도 주사 전자 현미경(SEM, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 관찰하기 전에, 섬유 시트를 자동 마그네트론 스퍼터 코터(Cressington 108 Auto sputter coater, UK)에 의해 80초 동안 백금으로 완전히 덮었다. PU-nGO 섬유는 또한 고분해능 투과 전자 현미경(HR-TEM, JEM-3-1-, JEOL, Japan)에 의해 관찰되었다. nGO 입자에 대한 APTES의 효과는 CuKα 방사선(λ=1.5418Å)을 사용하여 x-선 회절(XRD, Rigaku, Ultima IV, Japan)에 의해 관찰되었다. 전기 방사된 섬유는 또한 GladiATR 다이아몬드 결정 성분(PIKE Technologies, USA)을 갖는 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)에 의해 분석되었다.

PU-nGO 전기방사 복합 나노섬유의 전기 전도도는 습식 조건 하에서 Keithley 6514 전위계를 사용하는 4-프로브 방법에 의해 결정되었다. 실험은 실온에서 수행되었고 샘플의 저항은 다음 식으로 분석되었다.

여기서 R=V/I는 저항, V=전압, I=전류, w=나노섬유의 폭, t=필름의 두께, d=두 프로브 사이의 거리다. 얻어진 저항률의 역수는 나노섬유의 전도성이다. 각 조건에 대해 5 개의 샘플을 분석했다.

섬유의 친수성은 벤치탑 피닉스 접촉각 측정 시스템(benchtop phoenix contact angle measurement system)(PHX300, SEO, korea)을 적용한 세실 드롭(Sessile drop) 방법에 의해 물 접촉각(WCA) 측정을 통해 결정되었다. 추가 스캐닝을 위해 섬유상 시트를 카메라 스테이지에 놓고 시린지 펌프로부터의 대략 2μL의 증류수를 샘플의 표면에 비딩하였다. 섬유상 물질 상에 각각의 액적을 각각 0.1, 5, 10분 측정하고 비디오 카메라 시스템(CCD 카메라)을 사용하여 15초마다 자동으로 기록하고 표면 접촉각을 XP 소프트웨어에 의해 결정하였다.

열 중량 분석(TGA)은 Advantage for Q Series 소프트웨어에 의해 제어되는 SDT Q600 (TA 인스트루먼트), 동시 Thermal Analysis Modulus을 사용하여, 각각의 중합체에 대해 5mg 샘플을 갖는 알루미늄 도가니(alumina crucible)에서 수행되었다. 실험은 10℃/분 및 가열 속도(heating rate)에서 24 내지 700℃의 N₂ 분위기(100mL/분의 flow)에서 수행되었다.

2-2. 실험 결과

그래핀으로부터 합성된 nGO 입자의 XRD 패턴은 약 10°에서 넓은 반사를 나타내었지만, APTES가 nGO 용액에 첨가되면, 20°에서 피크가 나타났다(도 1b, 왼쪽 패널). nGO 샘플의 FT-IR 스펙트럼은 3200cm^-1로 표시된 강렬한 OH 피크와 1600cm^-1에서 뚜렷한 C=O 피크를 나타내었으며, 이는 카르복실산 및 카르보닐 작용기와 관련이 있다(도 1b, 오른쪽 패널). 활성화된 nGO 입자를 PU 용액에 혼입하고, 전기방사에 의해 PU 또는 PU-nGO 섬유를 제조하였다(도 1a). PU 또는 PU-nGO 섬유의 FT-IR 스펙트럼은 하이드록실 및 에테르 기의 피크가 1220cm^-1에 존재하고(도 1c), nGO 함량이 증가함에 따라 피크 강도가 더 강함을 나타냈다. 또한, nGO, PU 섬유 및 nGO-PU 섬유의 TGA 분석이 수행되었다. 단일 이벤트를 보여준 순수한 PU와 달리 nGO가 포함된 PU는 2 개의 무게 감소 이벤트를 나타내 nGO가 PU 섬유에 잘 통합되었음을 입증하였다.

GO 혼입된 전기방사 PU 섬유의 SEM 이미지는 섬유 표면 형태를 나타냈다(도 1d). 나노그래핀옥사이드 입자를 다양한 양(0~8 wt%)으로 PU 용액에 포함시켜 전기방사된 섬유 매트릭스를 제조하였다. 섬유는 순수한 PU 섬유뿐만 아니라 1~8% nGO 첨가로 제조될 때 부드럽고 비교적 균일한 표면으로 쉽게 제조되었다. PU-nGO 샘플의 TEM 이미지는 또한 섬유의 내부 나노 구조를 조사하기 위해 촬영되었다. PU에 내장된 8% nGO를 제외하고, nGO 입자가 중합체 섬유 내에 잘 분포되어 있는데, nGO는 섬유내에서 응집되기 시작했다. TEM 이미지는 순수한 PU 섬유에 비해 PU-nGO 섬유 크기가 약간 증가한 것으로 나타났지만, 측정된 모든 섬유 직경은 1μm 미만이었다. 탄소계 물질의 혼입이 근육 세포 기능에 영향을 미치는 전기 전도 특성을 변화시킬 수 있기 때문에 섬유의 전기 전도도를 측정했다(도 1d). 습한 조건 하에서, 단지 8% PU-nGO 섬유만이 전도성 거동을 나타냈다. 1 내지 4% nGO가 첨가된 PU-nGO 섬유는 측정할 수 없는 전기 전도성을 나타냈다. GO 자체는 비전도성 물질로 알려져 있지만, 전기 전도성은 여러 가지 방법으로 흑연(graphitic) 네트워크에 의해 복원될 수 있다(Matthew J. Allen VCT et al., A Review of Graphene. chemical reviews, 2010).

중합체 스캐폴드의 열악한 습윤성은 종종 세포 부착 및 후속 분화와 같은 세포 상호 작용을 제한한다(Damiati L et al., J Tissue Eng, 2018; Menzies KL et al., Optom Vis Sci, 2010). PU 및 PU-nGO 나노섬유의 물 접촉각은 시간에 따라 기록되었다(도 1e). nGO의 함유는 습윤성을 상당히 향상시켰다(0%<1%<2~4%<<8% PU-nGO). 결과는 nGO의 하이드록실 및 카르복실 작용기와 관련하여 FT-IR 데이터와 일치하였다(도 1b 및 c).

실시예 3: PU-nGO 나노섬유의 기계적 특성

3-1. 실험 방법

일축 인장 시험(Uniaxial tensile test) 및 응력 완화 시험(stress relaxation test)은 범용 시험기(Instron, Norwood, MA, USA)를 사용하여 수행되었으며, 교차-루프 PC 소프트웨어(crossed-loop PC software)(Bluehill 2, Instron)에 결과를 기록하였다. 재료를 0.04mm 두께의 40x10.0mm 직사각형 형태로 절단한 다음 샘플이 파단(broke)될 때까지 10mm/분의 속도로 신장시켰다. 소프트웨어에 기초하여, 기계적 값은 응력-시간 곡선 및 최대 인장 응력이 계산되는 응력-변형 곡선으로 변환되었다. 응력 완화 특성의 경우, 변형률(deformation rate) 600초와 100%의 일정 변형률(constant strain)로 각 시편(직경 40mm x 높이 10mm)에 인장 하중(tension loads)을 가했다. 상응하는 응력을 시간과 함께 기록하고, 응력 완화(tau 1/2) 동안 재료의 초기 응력이 그 값의 절반으로 완화되는 시간도 측정하였다.

3-2. 실험 결과

인장 강도 및 탄성 계수(elastic modulus)는 중요한 기계적 특성이며, 조성물의 변형, 특히 나노섬유 매트릭스 내로의 nGO 혼입을 통해 변경될 수 있다. PU-nGO 나노섬유의 탄성률은 nGO 혼입에 의해 크게 증가하였고(도 2a, c), 최대 인장 응력 값은 순수한 PU 섬유와 유사한 12 내지 20MPa의 범위에 있었다(도 2b). 또한, 나노섬유의 비례 한계는 약 40 내지 60%였으며, 이는 nGO의 혼입이 PU의 유연성을 완화시키지 않는 것으로 나타났다(도 2d). 응력 완화 또는 에너지 소산(energy dissipation)은 근육 및 힘줄과 같은 연조직의 중요한 특성 중 하나이다. PU-nGO 나노섬유의 응력 완화 실험은 100% 일정 변형률로 수행된다(도 2e, f). 모든 시편은 명확한 응력 완화 경향을 보였으며(도 2e), 4~8% PU-nGO 섬유는 가장 낮은 타우(tau) 1/2 값을 보여(도 2f), 이러한 PU-nGO 섬유는 우수한 응력 완화 특성을 나타내는 것을 암시한다.

실시예 4: PU 또는 PU-nGO 나노섬유의 세포 적합성

4-1. 실험 방법

PU 또는 PU-nGO 나노섬유 매트릭스에 대한 세포 거동을 쥐 골격 근아세포 세포주인 C2C12 세포주로 평가하였다. C2C12 근아세포를 각 섬유 막에 분주하고 배양하여 증식 및 세포 독성 효과를 확인하고, 초기 부착 및 확산 능력을 확인하였다.

5% CO₂, 37℃에서 10% FBS 우태아혈청(Gibco, USA), 1% Pen/Strep(Invitrogen, USA)이 보충된 DMEM으로 low passage(10 미만) C2C12 세포를 배양하였다. 간접 세포 독성 시험을 위해, 각 시편의 추출물을 37℃에서 24시간 동안 보충 배지(6cm²/ml)로 제조하고, 이를 24시간 동안 96 웰 플레이트의 C2C12 세포에 첨가하였다. 이후 세포 생존력을 결정하기 위해 제조사의 프로토콜에 따라 CCK-8 분석을 수행했다. 세포 부착 및 확산 분석을 위해, 전기방사된 시편을 8mm 직경의 원형 막으로 제조하였다. 모든 막을 37℃에서 4시간 동안 300μL의 배지와 함께 배양하였다. 1.0x10⁴ 세포를 각각 PU 또는 PU-nGO 섬유막 상에 분주하고, 이들 막을 37℃에서 2시간 또는 4시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 4℃에서 20분 동안 고정시킨 후, PBS로 3회 세척한 다음, 10분 동안 0.2% 트리톤 X-100(Sigma)으로 처리한 후 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 각각 30분 동안 처리하였다. 마우스 항-빈쿨린 항체(ab18058, Abcam)를 1% BSA에서 1:200으로 희석하고 4℃에서 밤새 세포에 처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 실온에서 2시간 동안 FITC-접합된 이차 항체(F0257, Sigma)로 처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포는 Alexa Flour 555로 표지된(빨간색) Phalloidin (A34055, Invitrogen) 및 이후 DAPI(A12379, Invitrogen)에 의해 대조 염색되었다. 세포의 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM; Zeiss LSM 700, Germany)에 의해 촬영되었다.

세포 증식은 형광 Fluorescence Hoechst DNA Quantification Kit(Sigma)를 사용하여 결정되었다. C2C12 세포는 24 시간 동안 각각의 웰당 10,000 개의 세포가 있는 96-웰 플레이트에서 5mm 직경의 전기방사된 시편 상에서 배양하고, 시편은 1, 3, 5일 후 증식 분석을 위해 수확하였다. 200μL의 탈이온수를 각 시점에서 스캐폴드에 첨가한 후, 스캐폴드로부터 DNA를 추출하기 위해 3회의 동결-해동 사이클을 수행하였다. 제공된 DNA 표준을 사용하여 Hoechst 33258 용액으로 DNA를 염색함으로써 DNA 표준곡선을 계산하였다. 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, US)를 사용하여 360nm 및 460nm의 여기 및 방출 파장으로 형광을 측정하였다.

4-2. 실험 결과

빈쿨린(Vinculin)은 ECM과 세포 내 액틴 세포 골격 사이의 물리적 연결로 알려져 있으며, 이들 빈쿨린과 액틴 세포 골격은 세포 부착과 확산에 결정적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 세포를 나노섬유에 분주하고 4시간 동안 배양한 후, C2C12 세포의 초기 부착 수 및 확산 면적을 액틴, 빈쿨린 및 DAPI 염색으로 확인하였다. 모든 C2C12 세포는 정상적인 스핀들(spindle) 형상을 나타냈으며(도 3c), 이는 세포가 기질에 안정적으로 접착되었음을 나타낸다. PU 나노섬유와 비교하여, 모든 PU-nGO 나노섬유는 증가된 세포 부착 능력을 나타냈다(도 3a). 또한, 세포 확산 영역은 nGO 혼입과 함께 크게 개선되었다(0 % <1~2% <4~8% PU-nGO, 도 3b). PU-nGO 나노섬유는 C2C12 세포에 대해 세포 독성 효과를 나타내지 않았으며, nGO 함량이 증가함에 따라 세포가 더욱 증식하였고, 특히 8% PU-nGO는 다른 것에 비해 5일째에 가장 큰 증식 능력을 나타냈다(도 3d).

실시예 5. PU 또는 PU-nGO 나노섬유 막의 근육 분화 능력

5-1. 실험 방법

근원성 유전자 발현 분석

실시간 RT-PCR을 사용하여 액틴, 미오게닌, MyoD의 발현 수준을 분석하였다. cDNA는 iScript^TM DNA 합성 키트(BioRad, US)를 사용하여 배양된 세포로부터 직접 합성되었다. SensiMix^TM SYBR® Hi-ROX 키트(미국 바이오 카인)를 사용한 실시간 RT-PCR을 AB 7500 Real-Time PCR 시스템(Life Technologies, US)으로 수행하였다. 열 순환 조건은 다음과 같았다: 5 분 동안 95℃, 40 사이클의 변성 (15초, 90 ℃), 어닐링 (15초, 55℃) 및 연장 (15초, 72℃). 프라이머 서열은 표 1에 기재되있다. 하우스 키핑 유전자 GAPDH를 사용하여 2-△ΔCt 방법을 사용하여 데이터를 정규화 하였다.

Gene	Forward sequence	Reverse sequence
α-Actinin	5'-GGACTACACTGCCTTCTC-3'	5'-CAGCCTATACTTCAGCCTTTA-3'
Myogenin	5'-TGTCTGTCAGGCTGGGTGTG-3'	5'-TCGCTGGGCTGGGTGTTAG-3'
MyoD	5'-GGAGTGGCAGAAAGTTAAG-3'	5'-ACGGGTCATCATAGAAGTC-3'
GAPDH	5'-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3'	5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'

근관 형성 및 면역 세포 화학 분석

C2C12를 3x10⁴ 세포/웰의 밀도로 분주하였다. 1일 후, 세포를 추가 3일 동안 분화 배지(DM; 2% horse serum 및 1% Pen Strep (Invitrogen, Carlsbad, CA))를 함유하는 DMEM)에서 배양하여 근관 형성을 유도하였다. DM은 격일로 변경되었다. 동적 배양의 경우, 배양된 세포가 있는 시편은 10% 변형률, 0.5Hz 및 각 일에 0, 1, 4 또는 16 시간의 장력 자극으로 Flexcell 기계(Dunn Labortechnik, Asbach, Germany)를 사용한 동적 장력 하의 동일한 분화 조건을 적용했다. 분화 3일째에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.2 % Triton X-100으로 투과시키고, 1% BSA 용액으로 차단(blocked)하고, 4℃에서 1차 항체(MHC : 1 : 200, 산타 크루즈)와 함께 배양하고, 밤새 실온에서 2시간 동안 2차 항체(Dylight 488-conjugated goat anti-mouse IgG; 1:100; Abcam)와 함께 배양하고, Vectashield 용액을 장착하였다. 다핵 근관은 형광 현미경을 사용하여 관찰되었다.

5-2. 실험 결과

PU 또는 PU-nGO 나노섬유의 근육 분화 능력은 분화 조건에서 C2C12 세포에 의해 확인하였다(도 4). SEM 이미지와 형광 현미경 이미지는 PU-nGO 나노섬유 막에서 뚜렷한 줄무늬 모양의 근관 구조와 잘 배열된 액틴 필라멘트를 나타냈다(도 4a, b). 또한, 미오신 중쇄(MHC)를 사용한 면역세포화학 데이터는 nGO 함량이 증가함에 따라 증가된 MHC 발현 경향을 나타냈다(0%<1%<2~4%<8% PU-nGO, 도 4c). 일관되게, RT-PCR 데이터는 Myogenin(MyoG), 알파-액티닌(alpha-actinin) 및 MyoD와 같은 근원성 마커의 mRNA 발현 수준이 nGO 함량에 비례하여 상향 조절됨을 나타냈다(0% <1%~2%<4%<8% PU-nGO, 도 4d). 이러한 결과는 PU-nGO 매트릭스의 ECM 모방 나노섬유 형태에 의한 개선된 세포 부착 능력에 기인한다. 엘라스토머에 분주된 세포는 기계적으로 신축되어 근 전위를 향상시킬 수 있는 주기적 변형(strain)을 경험할 수 있다(Dugan JM et al., J Tissue Eng, 2014). 동적 장력 자극 하에서 PU-nGO 나노섬유의 근육 분화 능력은 또한 C2C12 세포로 검증되었다(도 5). 동적 장력 조건은 세포의 알파-액틴 발현에 기반하여 최적화하였으며, 장력 자극이 없는 8% PU-nGO 막과 비교하여, 장력 자극이 있는 8% PU-nGO 막은 근성 유전자 발현, MHC 단백질 발현 및 정렬된 근관 형성을 증가시킨다(도 5).

Claims (17)

1. 나노그래핀옥사이드(nGO, nano graphine oxide)가 함유된 폴리우레탄 나노섬유 스캐폴드로서, 실란 커플링제가 첨가된 나노그래핀옥사이드 용액 및 폴리우레탄 용액을 혼합하여 전기방사하여 제조되고,
   상기 제조된 스캐폴드는 접촉각이 25 내지 65°이고,
   인장 응력이 12 내지 20MPa이고,
   비례 한계는 40 내지 60%인 것을 특징으로 하는
   연성 조직 재생용 스캐폴드.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리우레탄은 중합체 구성 단위로서, 무수당 알코올, 폴리올 및 폴리이소시아네이트를 포함하는 것인 스캐폴드.
3. 제2항에 있어서, 상기 무수당 알코올은 이소소르비드, 이소만니드, 이소이디드 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 스캐폴드.
4. 제2항에 있어서, 폴리카보네이트 디올, 폴리카프로락톤 디올, 폴리에테르 폴리올, 폴리에스테르 폴리올, 이들 폴리올과 비닐 화합물을 중합시켜서 얻어지는 폴리머 폴리올, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 스캐폴드.
5. 제2항에 있어서, 상기 폴리이소시아네이트는 리신 디이소시아네이트, 톨루엔 디이소시아네이트, 아르기닌 디이소시아네이트, 아스파라긴 디이소시아네이트, 글루타민 디이소시아네이트, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 헥산 디이소시아네이트, 메틸렌 bis-p-페닐 디이소시아네이트, 이소시아뉴레이트 폴리이소시아네이트, 1,4-부탄 디이소시아네이트, 유렛디온 폴리이소시아네이트, 또는 지방족, 지환족, 방향족 폴리이소시아네이트, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 스캐폴드.
6. 제1항에 있어서, 상기 폴리우레탄은 중합체 구성단위로서 이소소르비드, 폴리카프로락톤 디올 및 헥사메틸렌 디이소시아네이트를 포함하는 것인 스캐폴드.
7. 제1항에 있어서, 상기 나노그래핀옥사이드는 상기 폴리우레탄을 기준으로 1 내지 10 중량% 포함된 것인 스캐폴드.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제1항에 있어서, 동적 장력 자극에서 근원성 유전자, 근원성 단백질의 발현 또는 근관 형성이 증가하는 것인, 나노섬유 스캐폴드.
12. 제11항에 있어서, 상기 근원성 유전자, 근원성 단백질은 액틴, 미오게닌, MyoD, 미오신 또는 이들의 조합인 것인 스캐폴드.
13. 제1항에 있어서, 상기 실란 커플링제는 아미노실란인 것인 스캐폴드.
14. 다음의 단계를 포함하는 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노섬유 스캐폴드 제조 방법:
    (a) 실란 커플링제를 산화 그래핀 용액과 폴리우레탄 용액에 첨가하는 단계;
    (b) 상기 (a)의 실란 커플링제가 첨가된 각 용액을 초음파 처리하여 균질하게 분산시킨 후, 용액을 혼합하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)의 혼합용액을 전기방사하여 얻어진 섬유를 수집하는 단계
15. 제14항의 상기 (c) 전기방사의 유속은 1 내지 3ml/hr인 것인 제조 방법.
16. 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노섬유 스캐폴드를 인간을 제외한 동물의 연성 조직에 처리하는 단계를 포함하는 연성 조직 재생 방법.
17. 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 나노섬유 스캐폴드를 유효성분으로 포함하는 연성 조직 재생용 조성물.

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