KR101517295B1 - 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골 재생을 위한, 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트, 및 연골 재생을 위한, 미네랄화되지 않은 고분자 나노섬유 시트를 포함하며, 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트의 각 층에는 중간엽 줄기세포가 씨딩되고 미네랄화되지 않은 고분자 나노섬유 시트의 각 층에는 연골세포가 씨딩된, 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제공한다.

Description

골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드{Polymer Nanofiber scaffold for osteochondral regeneration}
본 발명은 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드에 관한 것으로, 구체적으로 골 재생을 위해 미네랄화되며 중간엽 줄기세포로 씨딩된 고분자 나노섬유 시트 및 연골 재생을 위해 연골세포로 씨딩된 고분자 나노섬유 시트를 포함하는 골연골 재생용 고분자 나노섬유 스캐폴드에 관한 것이다.
골-연골 계면(interface)을 포함하는 복잡한 조직의 재생은 정형외과 및 악안면 수술에 있어서 중대한 도전이 되어왔으며, 고무적인 결과들이 보고 되었음에도 불구하고, 계면을 조작하는 것과 관련된 연구는 많이 이루어지지 않았다. 이것은 계면 구조(interfacial structure)를 구성하는 조직 구성성분 및 세포가 아주 복잡하기 때문이다. 골연골 조직은 골과 연골 사이의 영구적인 계면 구조이다. 골연골 조직은 석회화되지 않은 유리질 연골과 연골하골 사이의 석회화된 연골의 얇은 층으로서 정의된다. 물리적인 특성에서의 점진적인 전이는 계면에서 스트레스 농도를 낮출 수 있으며, 손상을 예방한다. 이러한 기계적인 고려사항면에서, 계면은 높은 농도의 칼슘 염과 수직으로 움직이는 콜라겐 소섬유를 함유하는 독특한 생화학적 조성을 갖는다.
이와 같은 골과 연골 사이의 계면 결함 영역에 도입될 수 있으며 복잡한 조직 구조를 기능적으로 조화시킬 수 있는 적절한 생체재료의 개발이 필요하다. 달리 말하면, 개별의 조직 구조를 모방하고/하거나 각각의 세포 유형의 기능을 자극하도록 고안된 생체기능적 또는 다중기능적인 구조화된 생체재료가 필요하다. 골연골 영역에서 사용하기 위한 이상성(biphasic) 스캐폴드는 골 및 연골을 동시에 재생하도록 고안되며, 다수의 그룹이 골연골 결합 회복을 위한 이상성 스캐폴드를 제안하였다. 예를 들어, Schaefer 등은 폴리글리콜릭산 망상 조직 및 폴리락틱-코글리콜릭산/폴리-에틸렌 글리콜 폼을 기반으로 한 이상성 스캐폴드를 개발하였다. 또한, 연골 상을 위하여 히알루론산 및 아텔로칼라겐을 조합하고 골성 상을 위하여 하이드록시아파타이트 및 베타-삼칼슘 포스페이트를 조합하는 이상성 스캐폴드가 골연골 결함 회복을 위하여 효과적인 것으로 증명되었다.
한편, 동물 조직으로부터 분리된 연골세포, 조골세포 및 중간엽 줄기 세포(MSC)를 고안된 생체재료와 조합하여 사용하면 골-연골 복합 조직의 재생력을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, Mahmoudifar 등은 태아 연골세포 또는 태아 조골세포 중 하나를 분리된 폴리글리콜릭산과 함께 씨딩하여 골연골 복합 구조체를 생성하였으며, Gao 등은 히알루론산에 기반한 스펀지 및 다공성 세라믹 내로 MSC-유래된 연골세포 및 MSC-유래된 조골세포를 각각 씨딩함으로써 골연골 이식물을 생성하였다.
한편, 고분자 나노섬유 중합체는 혈관, 피부, 연골, 힘줄, 인대, 골 및 신경을 포함하는 조직의 회복 및 재생에서 굉장히 매력적인 것으로 밝혀졌다. 조골세포 및 연골세포를 포함하는 일련의 세포가 또한 중합체 또는 복합체로 만들어진 나노섬유 매트릭스 상에서 성공적으로 배양되었다. 나노섬유의 흥미로운 형태학적 양상은 주로 천연적인 세포외 매트릭스(ECM)를 모방하며, 세포 부착 및 스프레딩 과정에 우호적이다. 적절한 생화학적 지시에 의하여, 세포는 나노섬유 스캐폴드 상에서 조직 특이적 분화가 유도된다. 특히, 단순하며 용이한 방식인 전기방사가 다양한 조성 및 섬유 기하학(지름 및 정렬)을 갖는 나노섬유의 가공처리시 유리하다.
하지만, 지금까지 골 재생을 위한 나노섬유 스캐폴드와 연골 재생을 위한 나노섬유 스캐폴드가 통합되어 형성된 골연골 재생을 위한 나노섬유 스캐폴드는 개발된 적이 없었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 골연골 재생을 위한 효과적인 구조물을 찾기 위하여 예의노력한 결과, 골 재생을 위한, 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트, 및 연골 재생을 위한, 미네랄화되지 않은 고분자 나노섬유 시트를 포함하며, 나노섬유 시트에 조직 세포가 씨딩된, 골연골 재생을 위한 나노섬유 스캐폴드를 개발하였으며, 이와 같은 나노섬유 스캐폴드가 골연골 재생에 효과적임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드를 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 손상된 골연골을 재생하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 골 재생을 위한, 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트, 및 연골 재생을 위한, 미네랄화되지 않은 순수한(bare) 고분자 나노섬유 시트를 포함하며, 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트에는 중간엽 줄기세포가 씨딩되고 미네랄화되지 않은 고분자 나노섬유 시트에는 연골세포가 씨딩된, 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 "스캐폴드"는 생체내에서 손상된 장기나 조직의 일부를 대체하며 이들의 기능을 보완 또는 대체할 수 있는 구조체를 의미하며, 스캐폴드가 기능과 역할을 충분히 수행할 때까지 유지된 후 생체 내에서 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성 고분자 소재로 제조되는 것이 바람직하다.
골 조직 공학에 적용하기 위한 스캐폴드는 숙주 조직의 최적화된 조직 형성을 위해 핵심적인 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 이 조건은 세포 친화력, 영양분과 산소가 투과하기 위한 적절한 공극률, 세포 부착 및 분화를 촉진시키기 위한 계면 활성 등을 포함한다. 또한, 이상적으로 스캐폴드는 연속적으로 분해되어 숙주 세포에 의해 대체되어야 한다. 스캐폴드의 재료로서는 콜라겐과 같은 세포외 기질(ECM) 분자, 폴리락트산(PLA), 폴리카프로락톤(PCL) 및 이의 공중합체와 같은 합성 분해성 플라스틱이 이용될 수 있다.
본 발명의 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드의 재료는 바람직하게는 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL)이며, PLCL은 폴리락트산(PLA)과 폴리(카프로락톤)(PCL)의 블록 공중합체로서, 카프로락톤의 연질 매트릭스에 락티드의 경질 도메인이 복합된 형태로 고무와 같은 탄성을 가지며, 응력-변형률 곡선은 락티드와 카프로락톤의 조성비율에 따라 크게 차이가 나며, 탄성도의 조절을 가능하게 할 수 있다. 이러한 신축성 생분해성 고분자인 PLCL은 생체내에서 기계적인 활성을 필요로 하는 혈관이나 연골을 대체하는 생체재료로서 유용하다.
본 발명의 고분자 나노섬유 스캐폴드는 골의 재생을 위한 고분자 나노섬유 시트와 연골의 재생을 위한 고분자 나노섬유 시트를 포함하는바, 고분자 나노섬유 시트는 공지의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 예를 들어, PLCL 나노섬유 시트의 경우, 고분자 PLCL 용액을 전기방사(electrospinning)하여 금속 컬렉터 상에 나노섬유를 집적시킨 후 진공 건조시키고 나노섬유 시트 표면을 활성화시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 고분자 나노섬유 스캐폴드에서 골의 재생을 위한 고분자 나노섬유 시트는 골의 재생에 적합하도록 그 표면이 생체적합성 무기물인 인산칼슘계 세라믹으로 미네랄화되며, 그 결과, 세포 부착 및 증식이 촉진되어 골 조직의 재생을 효과적으로 도모할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "인산칼슘계 세라믹"은, 분말형 고체상의 인산칼슘 화합물 또는 칼슘 및/또는 인산염 화합물의 혼합물로 구성되는 세라믹을 의미하는 것으로, 칼슘과 인의 비율에 따라 다양하게 나뉠 수 있다. 상기 인산칼슘계 세라믹은 산소와 반응하여 화학적으로 안정하게 변한 세라믹으로서 생체불활성으로 체내에서 생화학적 반응이 없기 때문에 골조직의 손상부위 대체재로서 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.
이러한 인산칼슘계 세라믹은 이 분야에서 공지된 인산칼슘계 무기물일 수 있다. 예시적으로 모노칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 하이드록시 아파타이트 등일 수 있다. 인산칼슘계 세라믹의 종류는 표면 개질시 칼슘 이온 및 인산 이온의 농도, 처리조건 또는 처리시간을 조절하여 적절하게 결정할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 고분자 나노섬유 시트는 하이드록시아파타이트로 미네랄화된다. Ca10(PO4)6(OH)2 구조를 갖는 하이드록시아파타이트의 Ca/P 몰비는 1.67로 인체의 뼈와 가장 유사한 화학구조를 가지고 있다. 따라서, 하이드록시아파타이트 세라믹으로 인체 내 이식되는 고분자 스캐폴드를 미네랄화하여 표면 개질하는 경우, 이식 주위의 뼈나 조직과의 접착력 및 안정성이 우수한 이점이 있다.
상기 미네랄화는 고분자 나노섬유 시트의 구조를 손상시키지 않으면서, 인산칼슘계 세라믹으로 표면을 코팅하여 고분자의 표면에 세포가 잘 부착할 수 있도록 개질하는 것을 의미하며, 구체적으로는 고분자 나노섬유 시트 표면에 인산칼슘계 세라믹을 부착하거나 침투하도록 하는 것으로 이해될 수 있다.
상기 인산칼슘계 세라믹은 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며, 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않는 생체적합성 인산칼슘계 무기물이 형성되도록 한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, PLCL 나노섬유 시트의 미네랄화 는 본 기술 분야에 알려진 임의의 미네랄화 방법을 이용하여 이루어질 수 있으며, 예를 들어, 표면을 활성화시킨 PLCL 나노섬유를 150 mM Ca 용액 및 150 mM P 용액에 번갈아 담그는 과정을 반복한 후, 나노섬유를 모조 체액(simulated body fluid)에서 7일간 배양함으로써 이루어졌다.
상기와 같이 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트는 중간엽 줄기세포로 씨딩(seeding)되며, 세포의 씨딩은 나노섬유 시트를 96-웰 플레이트에 두고 세포를 적정 밀도로 플레이팅하여 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 성체 골수에 있는 다능성 비조혈 전구 세포로서, 지방, 연골, 뼈, 근육, 피부, 신경 등 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 줄기세포를 의미하며, 골수, 근육, 지방, 제대, 양막 및 양수 중의 어느 하나로부터 분리될 수 있다.
본 발명에서 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트는 상기와 같이 제조된, 세포가 씨딩된 고분자 나노섬유 시트를 다수 적층시킴으로써 형성된 다중층일 수 있다.
한편, 연골 재생을 위한 미네랄화되지 않은 고분자 나노섬유 시트는 나노섬유 시트가 미네랄화되지 않으며, 중간엽 줄기세포 대신 연골세포가 고분자 나노섬유 시트 상에 씨딩되는 것을 제외하고는, 상기한 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트의 제조 과정과 동일하게 제조될 수 있으며, 연골 재생용 고분자 나노섬유 시트 또한 다수의 시트가 적층되어 형성된 다중층일 수 있다.
상기와 같이 제조된 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트와 미네랄화되지 않은 고분자 나노섬유 시트는 조합되어(적층되어) 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드를 형성한다.
골 재생을 위한 나노섬유 시트와 연골 재생을 위한 나노섬유 시트를 연결하는 일반적인 방법으로는 재료만을 고려할 때 연결하는 방법으로는 가교제를 이용하는 방법, 생체적합성 글루(glue)로 연결하는 방법 등이 있지만, 본 발명의 경우에는 세포를 함유하기 때문에 세포-세포간의 연결 및 세포가 분비하는 세포외기질 간의 상호연결을 위해 이용될 수 있는 일반적인 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기와 같이 제조된 본 발명의 미네랄화되고 중간엽 줄기세포로 씨딩된 PLCL 나노섬유 시트 다중층과 연골세포로 씨딩된 미네랄화되지 않은 PLCL 나노섬유 시트 다중층은 각각 시험관내 배양 후, 초기 단계의 골형성 분화 및 연골 분화가 이루어지는 것으로 확인되었다(도 3 및 도 4).
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명의 미네랄화되고 중간엽 줄기세포로 씨딩된 PLCL 나노섬유 시트 다중층과 연골세포로 씨딩되고 미네랄화되지 않은 PLCL 나노섬유 시트 다중층으로 이루어진 나노섬유 스캐폴드를 랫트 피하 조직에 이식한 후 4주째에 확인한 결과, 세포와 ECM이 무세포 스캐폴드에 비하여 연골층과 골층 모두에서 증가하였으며, 연골세포 씨딩된 스캐폴드에 의해 전형적인 연골 ECM인 황화 GAG가 풍부하게 축적되고, MSC-씨딩된 스캐폴드 영역에서 비세포 스캐폴드보다 더 많은 인산칼슘 미네랄이 축적되었음이 확인되어, 본 발명의 고분자 나노섬유 스캐폴드가 골연골 재생을 위해 유용함이 확인되었다(도 5).
또 다른 양태로서, 본 발명은 1) 중간엽 줄기세포가 씨딩된, 미네랄화된 골 재생용 고분자 나노섬유 시트 및 연골세포가 씨딩된 연골 재생용 고분자 나노섬유 시트를 제조하는 단계; 2) 골 재생용 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트 및 연골 재생용 고분자 나노섬유 시트를 적층하여 골연골 재생용 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 골연골 재생용 고분자 나노섬유 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다.
상기 1) 단계는 세포가 씨딩된 고분자 나노섬유 시트를 제조하는 단계로서, 고분자 소재는 상기한 바와 같으며, 바람직하게는 PLCL을 사용할 수 있다.
1) 단계에서 골 재생을 위한 고분자 나노섬유 시트 표면은 인산칼슘계 세라믹에 의한 미네랄화에 의해 시트의 표면이 개질됨으로써, 이를 포함하는 스캐폴드의 생리활성이 더욱 증가한다.
상기 미네랄화는 나노섬유 시트를 칼슘 및 인산염의 이온 용액 중에 침지시켜 미네랄 핵을 형성 및 성장시킴으로써 이루어진다.
상기 칼슘 및 인산염의 이온 용액은 나노섬유 시트를 미네랄화시킬 목적으로 사용하는 미네랄화 용액으로서, CaCl2 및 NaHPO4 용액을 사용할 수 있으며, Na+, K+, Mg2 +, Ca2 +, Cl-, HCO3 -, HPO4 2 -, SO4 2 -를 포함하는 모조 체액을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 미네랄 핵의 형성은 1 내지 10℃에서 촉진시키고, 미네랄 핵의 성장은 온도를 35 내지 40℃까지 증가시켜 유도할 수 있다. 바람직하게, 미네랄 핵의 형성은 4℃에서 촉진시킬 수 있으며, 핵의 성장은 37℃에서 유도할 수 있다. 또한, 바람직하게, 상기 칼슘 및 인산염 이온 용액 중의 침지시간은 12시간 내지 36시간일 수 있으며, 보다 바람직하게는 24시간일 수 있다.
본 발명의 스캐폴드에 있어서 골 재생을 위한 나노섬유 시트와 연골 재생을 위한 나노섬유 시트는 상이한 분화단계의 세포로 씨딩됨으로써, 동일한 분화 단계의 세포를 씨딩한 경우에 비하여 우수한 재생 효과를 얻을 수 있다.
상기 2) 단계는 골 재생용 나노섬유 시트와 연골 재생용 나노섬유 시트를 연결시켜 골연골 재생용 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제조하는 단계로서, 골 재생용 나노섬유 시트 단층 또는 다중층과 연골 재생용 나노섬유 시트 단층 또는 다중층을 연결하여 스캐폴드를 제조할 수 있다.
상기 제조방법에 의해 제조된 골연골 재생용 나노섬유 스캐폴드는 골의 재생과 연골의 재생을 동시에 가능하게 하여 골연골 재생에 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 골연골 재생을 위한 고분자 나노섬유 스캐폴드를 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 손상된 골연골을 재생하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개체"란 골연골이 손상된 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고 본 발명의 스캐폴드를 개체에게 투여함으로써, 손상된 골연골을 효과적으로 재생시킬 수 있다.
본 발명은 생체적합성 고분자에 기반하여 생체에 이식하기에 적합함과 동시에 골 재생에 적합하도록 미네랄화된 고분자 나노섬유 시트 에 중간엽 줄기세포를 씨딩하고, 연골 재생에 적합한 고분자 나노섬유 시트에 연골 세포를 씨딩하고, 상기 두 가지의 상이한 고분자 나노섬유 시트 를 조합하여 나노섬유 스캐폴드를 제조함으로써 골연골 재생을 위해 효과적으로 사용될 수 있는 스캐폴드를 제공한다.
도 1은 본 발명의 전체적인 실험 과정을 보여주는 도식으로서, (A) 연골세포를 PLCL 나노섬유 시트 상에 플레이팅하는 단계; (B) 연골세포-PLCL 구조체를 7일 동안 층-대-층 조립법으로 연골원 배지에서 배양시키는 단계; (C) PLCL 나노섬유를 SBF 중에 3일 동안 인큐베이션시킨 후 미네랄화시키는 단계; (D) 중간엽 줄기세포를 mPLCL 시트에 씨딩하는 단계; (E) MSC-mPLCL 구조체를 7일 동안 층-대-층 조립법으로 골형성 배지에서 배양시키는 단계; (F) 연골세포-씨딩된 나노섬유 층과 골형성 MSC-씨딩된 나노섬유 층을 대면시켜(interfacing) 이상성(biphasic) 스캐폴드를 만드는 단계; (G) 이상성 스캐폴드를 무흉선 마우스의 배면 피하 부위로 이식시키는 단계로 이루어진다.

도 2는 (A) 전기방사에 의해 제조된 순수한 PLCL 나노섬유 시트의 나노섬유 형태, (B) 전기방사에 의해 제조된 미네랄화된 PLCL(mPLCL) 나노섬유 시트의 나노섬유 형태, (C) 두 나노섬유의 크기 분포, (D) EDS, (E) FT-IR 및 (F) XRD 스펙트럼에 의해 분석된 mPLCL 나노섬유의 표면상의 미네랄화 및 mPLCL 나노섬유의 특성을 보여주는 도면이다.
도 3은 (A) 7일째에 PLCL 나노섬유 상에서의 연골세포 성장 형태의 SEM 이미지, (B) 7일 동안 순수한 PLCL 나노섬유 상에 배양된 연골세포의 형광 이미지(옐로우, 알렉사 플루오르 546-접합된 팔로이딘으로 염색된 액틴 세포골격; 블루, DAPI로 대비염색된 핵), (C) 배양 시간에 따라 계속적으로 증가함을 보이는, 최대 7일까지 배양 동안에 순수한 PLCL 나노섬유 상에서의 연골세포 성장 동역학, (D, E) 분화 조건하에서 나노섬유 상에서 7일 동안의 연골세포 배양에서 황산염화된 글리코사미노글리칸에 대한 면역세포화학 염색 결과, ((D)사프라닌-O(적색)와 (E) 알시안 블루(청색)는 무세포 나노섬유(PLCL)와 대조적으로, 순수한 PLCL 나노섬유에서 배양된 세포를 양성으로 염색함), (F) 연골원 배지 및 정상 배지에서 연골세포 배양 7일째에 유전자 발현 수준의 정량적 실시간 PCR 분석 결과를 보여주는 도면이다. SOX9, 콜라겐 타입 II 및 아그레칸을 포함하는 연골 관련된 유전자는 연골원 배지 조건 하에서 상향-조절되었다. Student's t-test에 의한, *P < 0.05 및 *P <0.01.
도 4는 (A) 7일 동안 미네랄화된 PLCL 나노섬유 상에서 자란 MSC의 SEM 형태, (B) 7일 동안 미네랄화된 PLCL 나노섬유 상에 배양된 MSC의 형광 이미지를 보여준다. 옐로우는 알렉사 플루오르 546-접합된 팔로이딘으로 염색된 액틴 세포골격을 나타내며, 블루는 DAPI로 대비염색된 핵을 나타낸다. 또한, (C)는 배양 시간에 따라 계속적으로 증가함을 보이는, 최대 7일까지 배양 동안에 미네랄화된 PLCL 나노섬유 상에서의 세포 성장 동역학을, (D)는 mPLCL 나노섬유와 비교시, 골형성 배지에서 7일 동안 MSC-mPLCL 나노섬유 배양에서 ALP 염색으로 초기 골형성 분화를 보여주는 도면이다. 또한, 도 4(E)는 골형성 배지 및 정상 배지에서 MSC 배양 7일째에 ALP 유전자 발현 수준의 정량적 실시간 PCR 분석을 보여준다. Student's t-test에 의한, *P < 0.05.
도 5는 무흉선 누드 마우스의 배면 부분에 피하적으로 이식된 본 발명의 PLCL 나노섬유 스캐폴드의 조직학 분석을 보여주는 도면이다. 이식 후 28일 후, 무세포 스캐폴드와 비교 시 생체내 스캐폴드는 ECM 생산의 측면에서 유의미한 골 및 연골의 조직학적 특성을 증명하였다(A-C, 세포/스캐폴드 대. D-F, 무세포 스캐폴드). (A,D) H & E 염색. 화살표는 세포의 존재를 나타낸다; (B,E) 사프라닌-O 염색; (C,F) 알리자린 레드 S 염색.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 나노섬유의 제조 및 표면 미네랄화
PLCL 나노섬유 시트를 기존의 공지된 방법으로 제조하였다. 구체적으로, PLCL(12.5% w/v)를 공용매(20% 에탄올 + 80% 디클로로메탄)에 용해시켰다. 상기 고분자 PLCL 용액을 주입률: 0.4 ㎖/h, 13 kV 전압 및 거리 15 cm 조건으로 전기방사(electrospinning) 하였다. 금속 컬렉터 상에 섬유가 집적된 후, 섬유를 밤새 진공 건조시켜 남아있는 용매를 증발시킴으로써 나노섬유 시트를 제조하였다.
상기와 같이 제조된 PLCL 나노섬유 시트의 미네랄화(mineralization)는 공지된 방법으로 수행하였다. 우선, 나노섬유를 2N NaOH 용액에 담그고, 상온에서 6시간동안 배양함으로써, 나노섬유의 표면을 활성화시켜 친수성 및 세포 적합성을 증진시켰다. 이어서, 샘플을 CaCl2 및 Na2HPO4로부터 각각 만들어진 150 mM Ca 용액 및 150 mM P 용액에 번갈아 담그는 과정을 6회 반복하였다. 마지막으로 나노섬유를 모조 체액(simulated body fluid; SBF)에서 37℃로 7일간 배양시켰다. SBF의 조성은 다음과 같다: Na+ 142.0 mM, K+ 5.0 mM, Mg2 + 1.5 mM, Ca2 + 2.5 mM, Cl- 125.0 mM, HCO3 - 27.0 mM, HPO4 2 - 1.0 mM, 및 SO4 2 - 0.5 mM.
미네랄화된 나노섬유의 형태 및 상(phase)을 주사전자현미경(SEM, Hitachi S-3000H) 및 X-선 회절(XRD; Ragaku)에 의해 각각 평가하였다. 미네랄화된 나노섬유의 원자 원소 및 화학 상태는 SEM과 함께 energy dispersive spectroscopy(EDS)에 의해 그리고 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR, Perkin-Elmer)에 의해 분석하였다.
도 2는 전기방사된 순수한 미네랄화되지 않은 PLCL(도 2A)와 mPLCL(도 2B) 나노섬유의 형태를 보여준다. 순수한 PLCL 나노섬유는 매끈한 표면을 나타내는 반면, mPLCL 나노섬유에서는 비드 형상이 부착된 나노섬유 형태가 관찰되었다. 나노섬유 형태의 특징은 고도로 상호연결된 기공의 존재와 함께 잘 보존되었다. 순수한 PLCL의 섬유 직경은 400 내지 600 nm였으나, mPLCL 나노섬유는 mPLCL 나노섬유 상에 균질하게 침착된 미네랄 결정으로 인하여 순수한 PLCL 나노섬유보다 대략 2배 더 두꺼웠다 (도 2C). 도 2D는 순수한 PLCL 및 mPLCL 나노섬유에서 주요 원자 원소의 EDS 분석을 보여준다. 순수한 PLCL에서의 스펙트럼과 대조적으로, mPLCL 나노섬유에서의 EDS 스펙트럼은 칼슘 및 인 원자의 추가적인 피크를 보여준다.
또한, PLCL 및 mPLCL의 물리화학적 특성을 FT-IR(도 2E) 및 XRD(도 2F) 분석에 의해 추가적으로 특성화하였다. mPLCL 나노섬유의 FT-IR 스펙트럼은 포스페이트 기에 관련된 진동 밴드가 1029 및 563 cm-1의 파상수에서 나타남을 밝혔으며, PLCL 분자에 해당하는 다른 독특한 밴드는 순수한 PLCL을 나타내는 스펙트럼과 비교하여, 덮인 미네랄 분자로 인해 숨겨졌다. mPLCL의 XRD 패턴은 하이드록시아파타이트에 해당하는 26o 및 32o에서 피크를 나타내며, 순수한 PLCL에서는 무정형 XRD 패턴이 관찰되었다. 이러한 결과는 골 미네랄-유사 HA를 구성하는 작은 결정(crystallite)이 PLCL 나노섬유 표면을 완전히 뒤덮었음을 나타낸다.
이러한 결과들은 생성된 미네랄 상이 천연 골 미네랄 상을 모방함을 보여주며, 이것은 골생성 분화 및 골 형성에 주로 관련된 세포 반응에 우호적임을 보여주는 것이다.
실시예 2. 세포 분리 및 증식
동물과 관련된 모든 프로토콜은 단국의과대학교 동물 윤리 위원회에 승인을 받았으며, 일차 관절 연골세포 및 골수 유래 중간엽 줄기세포를 본 발명에 사용하였으며, 일차 연골세포는 스프래스 다우리(sprague-dawley) 랫트 무릎의 관절 연골에서 수득하였고, 중간엽 줄기세포는 래트의 대퇴골 및 경골의 절개된 근위 및 말단 골단으로부터 수득하였다. 이들 세포를 10% (v/v) 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS; Gibco-BRL, USA), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's high glucose medium (DMEM, 4.5 g/ℓ 글루코즈; Gibco-BRL, USA)로 37℃에서 5% CO2가 포함된 습식 배양기 내에서 유지시켰다. 4계대수의 이들 세포를 다음 실험에 사용하였다.
실시예 3. 스캐폴드 상에서 성장하는 연골세포 및 MSC 의 인비트로 세포 분화 연구
3-1. 세포 배양
연골세포와 줄기세포를 PLCL 및 mPLCL 나노섬유 상에서 배양하고, 이를 상기한 보충제를 함유한 DMEM 배지에서 스캐폴드 당 2 X 104 세포수의 밀도로 24시간 동안 96-웰 플레이트에 두었다. 그 후, 각 배지를 연골형성 배지(DMEM + 1% 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (PAA Laboratories, Inc.) + 37.5 ㎍/ml 아스코르브산 + 100 nM 덱사메타손 + 10 ng/ml TGF-β1(PeproTech) + 10% FBS) 및 골형성 배지(최소 필수배지(α-MEM; Gibco) + 50 ㎍ 아스코르브산 + 10 mM β-글리세로포스페이트 + 100 nM 덱사메타손)로 교환하고 인비트로에서 7일간 배양하였다.
3-2. 주사전자 현미경( SEM ) 관찰
상기 인비트로 배양 후, 세포가 적층된 나노섬유 시트를 실온에서 10분 동안 2.5% 글루타르알데하이드에서 고정시켰다. 그 후, 고정된 샘플을 증가하는 농도의 에탄올(75%, 95% 및 100%)에서 5분 동안 탈수시키고 임계점 건조시켰다. 마지막으로, SEM 관찰 전에 금 박층으로 샘플을 코팅한 후, 15-20 Kv의 가속 전압에서 SEM을 이용하여 나노섬유 시트의 형태를 관찰하였다.
3-3. 액틴 관찰
또한, 4% 파라포름알데히드로 고정된 세포-적층된 나노섬유 시트를 20nM 알렉사 플루오르 546-접합된 팔로이딘과 항온처리하고, 이미지 프로세싱을 위해서는 역상 현미경((IX-71; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여, 액틴을 관찰하였다.
3-4. 세포 증식 분석
세포 증식은 제조사의 설명서에 따라 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Japan) 세포 계수 키트-8(CCK-8)을 이용하여 평가하였다. 각 배양 시간 종점에, 10 ㎕의 CCK-8 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 3시간 동안 37 ℃에서 항온처리하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm 파장에서 측정하였다.
3-5. 인비트로 ( in vitro ) 시료의 조직학적 분석
인비트로 배양 7일째에, 연골세포-적층된 나노섬유 시트를 적색으로 가시화되는 글리코스아미노글리칸(GAG)을 위해 사프라닌-O로 염색하고 청색으로 가시화되는 세포외 GAG를 위해 알시안 블루로 염색하여 연골세포 분화를 분석하였다. 동일한 조건하에서, MSC-적층된 나노섬유 시트를 또한 알카라인 포스파타제(ALP)로 염색하여 골생성 분화를 분석하였다. ALP 발현 수준은 세포-적층된 나노섬유 시트를 화학 시약 (Cat.# MK300, Takara)으로 염색하여 관찰하였다. 퍼플-블루 컬러로 염색된 샘플을 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.
3-6. 실시간 PCR 에 의한 유전자 발현
7일에, 세포를 트리졸(TRIzol)로 용해시키고, 표준 페놀/클로로포름 방법을 통해 RNA를 추출하고 제조사의 설명서에 따라 RT-PCR을 위한 수퍼스크립트(SuperScript) 제1 가닥 합성 시스템을 이용하여 총 RNA (1 ㎍) 로부터 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR은 SYBR GreenER qPCR SuperMix 시약(Invitrogen)을 이용하여 실시하였다. 내인성 기준으로서 β-액틴을 이용하여 △△Ct 방법을 이용하여 상대적인 전사체 양을 계산하였다. 실시간 PCR에서 이용된 골- 및 연골-관련 유전자의 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타난다.
유전자 프라이머 서열
ALP
 (F) 5'-ACTGGTACTCGGACAATGAG-3' (서열번호 1)
(R) 5'-ATCGATGTCCTTGATGTTGT-3' (서열번호 2)

Sox9		 (F) 5'-CGTCAACGGCTCCAGCA-3' (서열번호 3)
(R) 5'-TGCGCCCACACCATGA-3' (서열번호 4)

콜라겐 II		 (F)5'-GAGTGGAAGAGCGGAGACTACTG-3' (서열번호 5)
(R)5'-CTCCATGTTGCAGAAGACTTTCA-3' (서열번호 6)

아그레칸		 (F)5'-CTAGCTGCTTAGCAGGGATAACG-3' (서열번호 7)
(R) 5'-TGACCCGCAGAGTCACAAAG-3' (서열번호 8)

β-액틴		 (F) 5'-ACGTTGACATCCGTAAAGAC-3' (서열번호 9)
(R) 5'-TAATCTCCTTCTGCATCCTG-3' (서열번호 10)
3-7. 결과
각각의 나노섬유 시트의 7일째에, 배양된 일차 세포를 인비트로 연구를 위하여 수집하였다.
도 3A는 순수한 PLCL 나노섬유 상에서 성장한 연골세포의 형태를 보여준다. 연골세포는 고도로 신장된 세포골격 프로세스로 순수한 PLCL 나노섬유를 거의 완전히 덮었다. 세포의 세포골격 형태를 이해하기 위하여, F-액틴 세포골격을 알렉사 플루오르 546-접합된 팔로이딘으로 옐로우로 염색하였으며, 핵은 DAPI로 블루로 대조염색하였다 (도 3B). 세포 내의 F-액틴 분자는 순수한 PLCL 나노섬유를 따라 고도로 신장된 것으로 나타난다. 도 3C는 배양 기간 동안 측정된 순수한 PLCL 나노섬유 상의 연골세포 성장 역학을 보여준다. CCK-8 분석에 의해 모니터할 때 세포 성장은 배양 기간동안 진행형이었다. 흡광도는 최대 7일까지 배양 시간에 따라 증가하여, 생존 연골세포가 최대 배양 기간 까지 나노섬유상에서 연속적으로 작동할 수 있음을 나타낸다.
연골세포의 연골원 분화 마커 염색을 연골원 분화 배지하에서 순수한 PLCL 나노섬유상의 배양 7일에 추가로 실시하였다. 사프라닌-O(적색으로, 도 3D) 및 알시안 블루(청색으로, 도 3E)의 처리는 순수한 PLCL 나노섬유상에서 배양된 연골세포를 양성으로 염색하여, 음성 대조군으로서 비세포성 PLCL 나노섬유와 비교하여 풍부한 수준의 황화된 GAG 및 연골의 특징적인 ECM을 입증하였다. 이러한 결과는 순수한 PLCL 나노섬유에서 성장한 연골세포가 사프라닌-O 및 알시안 블루 염색에 의해 입증되는 바와 같이 연골원 ECM을 생성할 수 있음을 나타낸다. 7일째에 발현된 연골세포-관련된 유전자(SOX9, 콜라겐 II 및 아그레칸)의 정량적 실시간 PCR 분석 또한 현저한 연골원 효과가 발생하였음을 증명하였다. (도 3F). 7일 배양시에 대조군보다 훨씬 강한 SOX9, 콜라겐 II 및 아그레칸의 유전자 발현은 이들 유전자의 상향조절된 mRNA가 세포가 성장한 동적인 생리학적 환경에 반응하였음을 나타낸다.
mPLCL 나노섬유 상에서 자란 MSC 또한 검사하였다. 도 4A는 7일동안 mPLCL 나노섬유에서 배양된 MSC의 SEM 이미지를 보여준다. 세포는 mPLCL 나노섬유를 따라 고도로 신장되었으며, 이는 하부 기질 조건에 호의적이었다. mPLCL 나노섬유의 전체 표면을 덮지는 않았지만, 많은 MSC가 서로 접촉하였다. SEM 분석에 의해 지지되는 바와 같이, 형광 이미지 또한 나노섬유를 따른 F-액틴(옐로우) 분포에 의해 분석할 때 많은 수에서 신장된 성장 형태를 보여주었다(도 4B). mPLCL 나노섬유 시트 상에서의 MSC 성장 동역학을 또한 모니터하였으며, 도 4C에 나타난 대로 세포 성장의 증가는 최대 7일까지 배양시간에 따라 계속적으로 증가하였다. mPLCL 나노섬유 시트 상에서의 MSC의 성장 거동은 PLCL 나노섬유 시트 상의 연골세포의 결과와 유사하였다. 연골세포 성장의 분석에서처럼, MSC는 최대 7일 동안 생존가능하며, 그 동안 MSC는 비교적 초기 단계의 골형성적 분화를 겪는 것으로 생각된다. 이에 본 발명자들은 이 초기 골형성을 세포의 ALP 수준을 측정함으로써 확인하였다(도 4D). 진한 바이올렛 색 이미지는 7일 배양에서 mPLCL 나노섬유상에서 배양된 ALP-염색된 MSC에서만 나타나, 비세포 mPLCL 나노섬유에 비하여, 골형성 분화를 나타내었다. 또한, 실시간 PCR에 의해 정량화된 ALP 유전자 발현은 또한 대조군에 비하여 MSC-층화된 mPLCL 나노섬유에서 유의한 상향조절이 관찰되었음을 보여주어, 골형성 분화가 진행중임을 나타냈다(도 4E).
이들 결과는, PLCL과 mPLCL 나노섬유는 효과적으로 연골세포와 MSC와 반응이 허용되어, 각각 연골과 골의 ECM 분비에 우호적임을 보여준다.
결과적으로, 본 발명자들은 2가지 유형의 세포-적층된 나노섬유 시트를 제조하였으며, 하나는 순수한 PLCL 나노섬유의 관절 연골세포-층이고 다른 하나는 mPLCL 나노섬유의 초기-분화된 MSC 층이다. 각 시트를 층화시켜 5층의 연골세포/PLCL 및 5층의 MSC/mPLCL를 형성하고 이들을 조합하여, 총 10층의 세포/나노섬유 스캐폴드를 생성하였다.
실시예 4. 인비보 이식
8주령의 수컷 무흉선 마우스를 2개의 그룹으로 무작위 분류하였다(그룹당 3마리). 각각의 세포-적층된 나노섬유 시트를 연골원 배지 및 골형성 배지에서 7일 동안 각각 유지시켰다. 연골세포와 MSC를 순수한 PLCL과 mPLCL의 각 층상에서 배양하였으며, 각각의 5층 나노섬유를 인비보 연구를 위해 조합하여 스캐폴드를 형성하였다. 동물은 자일라진(10 mg/kg; Rompun® Bayer Korea, Ltd., Seoul, Korea) 및 케타민(70 mg/kg; Ketara® Yuhan Corp., Seoul, Korea)의 혼합물을 복강내 주사함으로써 마취시켰다. 배면 피부에 작은 절개를 만들었다. 동물당 주머니 두개를 피하 부위의 비절개 박리를 통해 만들었다. 세포-적층된 스캐폴드를 각각의 주머니내로 즉시 이식하였다. 4주 후에 이식물을 수집하여 포르말린에 고정시키고 파라핀에 포매하고, 약 5 ㎛ 두께의 조각으로 절단한 후, 헤마톡실린 & 에오신(H&E)(도 5A, D), 사프라닌-O(도 5B, E) 및 알리자린 레드 S(도 5C, F)로 염색하였다.
염색 결과는 도 5에 나타난다. 도 5의 A 내지 C는 비세포 대조군이며 D 내지 F는 세포-적층된 스캐폴드군이다. 세포-적층된 스캐폴드는 비세포 대조군보다 훨씬 생생한 색상을 명확히 보여주었다. 횡단면 절단된 세포-적층된 스캐폴드의 H&E 염색된 조직학적 사진은 세포와 ECM이 무세포 스캐폴드에 비하여 연골과 골 층 둘 모두에서 증가하였음을 명확히 밝혔다. 비세포 PLCL 층에서보다 연골세포-PLCL 층에서의 더 어두운 핑크색 사프라닌-O 염색은 무세포 스캐폴드에 의해서보다 연골세포-적층된 스캐폴드에 의해 전형적인 연골 ECM으로서 황화된 GAG의 보다 풍부한 축적이 생성되었음을 나타냈다. MSC-mPLCL 층의 이식된 영역의 알리자린 레드 S 염색 이미지는 비세포 스캐폴드보다 더 진한 적색 염색을 나타내어, 비세포 스캐폴드에서보다 MSC-적층된 스캐폴드의 이식된 영역에서 더 많은 인산칼슘 미네랄이 축적되었음을 나타냈다. 이러한 결과는 세포-PLCL 또는 -mPLCL 층이 이식 기간에 걸쳐 우호적인 조직 반응을 나타냈음을 보여준다. 더욱이 각각의 세포가 적층된 골-연골 쪽의 나노섬유 스캐폴드는 어떠한 층간 분리가 없이 세포들과 세포들이 분비하는 각각의 세포외기질들 간에 잘 연결된 (통합(integration)된) 구조체를 형성함을 확인할 수 있었다. 따라서 세포로 구성된 PLCL 나노섬유는 연골 및 골 조직의 효과적인 재생을 위한 적절한 스캐폴드임을 잘 알 수 있다.
통계 분석
관심 그룹 사이의 평균의 비료를 위하여, Student's t- test를 수행하였다. P< 0.05는 통계적으로 유의미한 것으로서 간주하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> Polymer Nanofiber scaffold for osteochondral regeneration <130> PA121100KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP forward primer <400> 1 actggtactc ggacaatgag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP reverse primer <400> 2 atcgatgtcc ttgatgttgt 20 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9 forward primer <400> 3 cgtcaacggc tccagca 17 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9 reverse primer <400> 4 tgcgcccaca ccatga 16 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> collagen II forward primer <400> 5 gagtggaaga gcggagacta ctg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> collagen II reverse primer <400> 6 ctccatgttg cagaagactt tca 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agrecan forward primer <400> 7 ctagctgctt agcagggata acg 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Agrecan reverse primer <400> 8 tgacccgcag agtcacaaag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 9 acgttgacat ccgtaaagac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 10 taatctcctt ctgcatcctg 20

Claims (9)

  1. 골 재생을 위한, 인산칼슘계 세라믹으로 미네랄화된 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 다중층, 및 연골 재생을 위한, 미네랄화되지 않은 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 다중층을 포함하며, 미네랄화된 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 다중층의 각 층에는 중간엽 줄기세포가 씨딩되고, 미네랄화되지 않은 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 다중층의 각 층에는 연골세포가 씨딩된, 골연골 재생을 위한 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 스캐폴드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 골 재생을 위한 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 다중층은 모노칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 하이드록시 아파타이트 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 인산칼슘계 세라믹으로 미네랄화되는 것인 나노섬유 스캐폴드.
  4. 제3항에 있어서, 인산칼슘계 세라믹은 하이드록시 아파타이트인 나노섬유 스캐폴드.
  5. 1) 중간엽 줄기세포가 씨딩된, 인산칼슘계 세라믹으로 미네랄화된 골 재생용 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 및 연골세포가 씨딩된 연골 재생용 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트를 제조하는 단계; 2) 인산칼슘계 세라믹으로 미네랄화된 골 재생용 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 다중층 및 연골 재생용 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트 다중층을 적층하여 골연골 재생용 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 스캐폴드를 제조하는 단계를 포함하는, 골연골 재생용 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 스캐폴드의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인산칼슘계 세라믹으로 미네랄화된 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트는 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 시트를 칼슘 및 인산염의 이온 용액 중에 침지시켜 미네랄 핵을 형성 및 성장시켜 제조되는 것인 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미네랄 핵의 형성은 1℃ 내지 10℃에서 촉진되고, 미네랄 핵의 성장은 온도를 35℃ 내지 40℃까지 증가시켜 유도되는 것인 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 인산칼슘계 세라믹은 하이드록시 아파타이트인 것인 제조방법.
  9. 제1항의 골연골 재생을 위한 폴리(락트산-코-카프로락톤)(PLCL) 고분자 나노섬유 스캐폴드를 인간을 제외한 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 손상된 골연골을 재생하는 방법.
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