KR101409779B1 - 수분 흡수력이 향상된 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법 - Google Patents

수분 흡수력이 향상된 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조하는 단계; (b) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 용매에 혼합시켜 방사용액을 제조하는 단계; (c) 상기 방사용액을 방사용 바늘에 투입한 후 전압을 인가하여 상기 다공성 스캐폴드 상에서 전기방사를 실시하는 단계; (d) 진공 건조하여 잔류용매를 제거함으로써 나노섬유 복합체를 제조하는 단계; 및 (e) 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리하는 단계를 포함하는 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 천연 고분자나노섬유 복합체 제조 방법은, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 스펀지 또는 부직포 형태의 다공성 스캐폴드를 제조한 후, 상기 다공성 스캐폴드 위에 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자 나노섬유를 제조함으로써, 제조된 나노섬유 복합체는 수분 흡수성이 매우 우수한 효과가 있다. 또한, 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리함으로써 두께, 다공도 및 공극의 크기를 조절할 수 있어 배양하려는 세포의 특성에 따른 나노섬유 복합체를 제조하여 제공할 수 있다.

Description

수분 흡수력이 향상된 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법{MANUFACTURING METHOD OF NATURAL POLYMER NANOFIBER COMPOSITE HAVING IMPROVED WATER-ABSORPTION FORCE}
본 발명은 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법에 있어서, 보다 구체적으로는 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 스펀지 또는 부직포 형태의 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조하고, 상기 다공성 스캐폴드 위에 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자 방사용액을 전기방사하여 나노섬유를 제조함에 있어서, 초음파 처리함으로써 수분 흡수력이 향상된 나노섬유 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
인체의 조직재생 능력은 매우 복잡하고 미묘한 조직구조 때문에 자체적으로 재생하는 능력은 매우 한정적이다. 인체는 줄기세포 덕분에 조직손상 시 재생 가능성을 보유하고 있지만 사고, 질병, 노화 등의 이유로 인해 재생 기능의 한계를 벗어나는 일이 생기게 된다. 최근 고령화 사회로의 진입과 함께 다양한 질병 및 사고의 증가로 인해 생체의 장기 조직은 재생력의 한계에 부딪히게 되면서 장기 조직의 재생에 대한 필요성이 급증하고 있다.
또한 생체조직을 효과적으로 대체하거나 이식할 수 있는 기술 개발이 점점 요구되고 있으며 인체 조직과 기관을 복원하려는 노력은 오랫동안 크게 주목을 받아 왔다. 초기에는 인공적인 대용품에서 생체적합재료의 개발, 장기이식 등으로 시도되었으나, 최근에는 생명과학, 공학 그리고 의과학을 통합 응용하는 생체조직공학으로 발전하고 있다.
일반적으로, 조직공학(tissue engineering)이란 사람이나 동물의 조직을 치료나 산업 등의 목적으로 인공적으로 배양하거나 생물학적인 조절을 하는 학문으로서, 현재 조직이나 기관의 복원을 도울 수 있는 생체물질부터 재료에 이르는 생물학적, 공학적인 기술을 다루는 학문을 기반으로 미래의 생명과학과 의료분야의 중요한 기술의 하나로 인식되고 있다. 이러한 조직공학 기술의 기본 원리는 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고 그 조직으로부터 세포를 분리한 다음, 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후, 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것이다. 따라서 조직공학의 핵심 기술 중 하나는 세포가 붙어 자랄 수 있도록 지지역할을 하는 지주(support) 또는 지지체(scaffold)를 만들어내는 일이다.
이러한 지지체를 제작하는 현행 방법에는 염침출법(solvent casting particulate leaching), 염발포법(gasfoaming/salt leaching), 상분리법(phase separation), 전기방사법(electrospinning) 등이 있다. 그 중에서도 전기방사법은 고분자 용액에 정전기력(electrostatic force)을 부여하고, 정전기적 반발력이 고분자 용액의 표면장력보다 크게 될 경우 얇은 섬유형태로 방사되는 특성을 이용한 나노섬유의 제조 방법으로 가장 간단하며 효율적인 것으로 알려져 있다. 또한, 전기방사로 얻은 나노섬유의 가장 주목할 만한 특징은 생체 내 세포외기질(ECM; extracellular matrix)과 형상적으로 매우 유사한 구조를 가진다는 것이다. 이러한 특징 때문에 인공적으로 제조된 나노섬유 지지체는 세포들의 부착능력과 성장 및 분화될 수 있는 환경을 잘 갖추고 있다. 조직공학적 응용을 위한 세포외기질과 유사한 나노섬유 지지체는 다양한 소재를 이용해 제작할 수 있는데, 천연 고분자, 생분해성 고분자 또는 생체세라믹스 등을 사용하여 조직재생용 지지체를 개발하고자 하는 노력이 진행되고 있다(대한민국 공개번호 제10-2011-0040389호 등).
널리 상용되고 있는 생분해성 고분자로는 PLA, PGA, PLGA, PCL 등이 나노 부직포로 제조되고 있지만, 이 중 PCL은 유리전이온도(Tg)가 낮아 용해될 우려가 있으며, PLGA는 세포친화성이 약하고 생체이식 후 주변부 조직을 산성화(괴사) 시키는 문제가 발생하는 등 많은 문제점을 안고 있다.
한편, 키토산(chitosan)은 N-아세틸-D-글루코사민 단위체가 무수히 결합하여 이루어진 다당류 고분자 물질인 키틴(chitin)을 탈아세틸화(Deacetylate)한 단위체가 결합하여 이루어진 고분자 물질로서, N-아세틸-D-글루코사민 및 이의 탈아세틸화물은 생체적합성(Biocompatibility), 생분해성(Biodegradability), 무독성(Non-toxicity), 그리고 비면역성(Non-immunogenetics) 등 다양한 생리활성을 가지기 때문에 넓은 분야에서 응용되고 있다. 천연고분자인 N-아세틸-D-글루코사민 또는 이의 탈아세틸화물을 이용하여 전기방사함으로써 제조된 나노섬유 지지체에 대해, 세포들은 정상적인 세포활동 시 세포 자체의 크기보다 작은 직경의 나노섬유 주위에 구조체를 형성하게 된다. 또한, 나노섬유 표면에서의 세포 흡착, 성장, 분화, 배향 등의 세포활동이 활발히 이루어지는 것으로 알려져 있다.
이러한 나노섬유 지지체에서의 세포 성장 환경은 높은 밀도의 세포점착을 가능하게 하는 높은 다공도를 가져야 하고, 배양되는 조직의 특성에 따라 다공도 및 공극의 형상 조절이 가능해야 한다. 하지만 전기방사로 제조된 N-아세틸-D-글루코사민 또는 이의 탈아세틸화물(D-글루코사민) 나노섬유는 다공도가 높고, 생체 내 세포외기질(ECM)과 유사한 구조를 가지는 반면, 나노섬유들 간의 공극의 크기가 작아 세포들의 점착 및 이동에서 문제점이 발생하며, 특히 수분흡수력이 떨어지는 문제점이 발생하는 단점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, (a) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조하는 단계; (b) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 용매에 혼합시켜 방사용액을 제조하는 단계; (c) 상기 방사용액을 방사용 바늘에 투입한 후 전압을 인가하여 상기 다공성 스캐폴드 상에서 전기방사를 실시하는 단계; (d) 진공 건조하여 잔류용매를 제거함으로써 나노섬유 복합체를 제조하는 단계; 및 (e) 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리하는 단계를 포함하는 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 나노섬유 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 (a) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조하는 단계; (b) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 용매에 혼합시켜 방사용액을 제조하는 단계; (c) 상기 방사용액을 방사용 바늘에 투입한 후 전압을 인가하여 상기 다공성 스캐폴드 상에서 전기방사를 실시하는 단계; (d) 진공 건조하여 잔류용매를 제거함으로써 나노섬유 복합체를 제조하는 단계; 및 (e) 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리하는 단계를 포함하는 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 단계 (a)에서 상기 다공성 스캐폴드는 스펀지 또는 부직포 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 스펀지는,
N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물과 부탄올을 용매에 각각 용해시켜 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물 용액 및 부탄올 용액을 제조하는 단계;
상기 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물 용액 및 상기 부탄올 용액을 서로 혼합하는 단계; 및
상기 혼합된 용액으로부터 기포를 제거하고 동결 건조 시켜 스펀지를 제조하는 단계에 의하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물 용액 제조 단계에서의 용매는 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid), 트리플루오로아세트산(TFA; trifluoro acetic acid), 염산(hydrochloric acid) 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계에서의 용매는 물, 프로판올(propanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 트리플루오로에틸렌(TFE; trifluoro ethylene), 트리플루오로아세트산(TFA; trifluoro acetic acid), 테트라하이드로퓨란(THF; tetra hydro furan), 디클로로메탄(DCM; dichloro methane), 디메틸포름아마이드(DMF; dimethyl formamide), 디메틸아세트아마이드(DMA; dimethyl acetamide), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide), 헥사플루오로이소프로판올(HFIP; hexa fluoro isopropanol), 헥산(Hexane), 벤젠(benzene), 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid) 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (d) 단계 이후, 알칼리 용액을 이용하여 중화처리(neutralization) 하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 알칼리 용액은 탄산나트륨(sodium carbonate), 수산화암모늄(Ammonium hydroxide), 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 및 이들의 혼합 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (d) 단계에서 제조된 나노섬유 복합체를 가교제가 함유된 용액에 침지하여 나노섬유 내 천연 고분자를 가교 처리하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 가교제는 에틸디메틸아미노프로필카르보디이미드(EDC; 1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide), 하이드록시석신이미드(NHS; N-hydroxysuccinimide), 디메틸아미노프로필에틸카르보디이미드하이드로클로라이드(EDAC; dimethylaminopropyl ethylcarbodiimide hydrochloride), 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole), 글루타알데하이드(Glutaraldehyde) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (e) 단계의 초음파 처리는 1W 내지 250W의 전력 범위에서 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 나노섬유 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 나노섬유 복합체는 유착방지막, 차폐막, 지혈제, 창상치료용 피복재 및 조직공학용 지지체(scaffold)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용도를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법은, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 스펀지 또는 부직포 형태의 다공성 스캐폴드를 제조한 후, 상기 다공성 스캐폴드 위에 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자 나노섬유를 제조함으로써, 제조된 나노섬유 복합체는 수분 흡수성이 매우 우수한 효과가 있다. 또한, 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리함으로써 두께, 다공도 및 공극의 크기를 조절할 수 있어 배양하려는 세포의 특성에 따른 나노섬유 복합체를 제조하여 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1-1에서 제조된 키토산 스펀지의 전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1-3에서 제조된 키토산-콜라겐 스펀지의 전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 3는 실시예 2에서 천연고분자 나노섬유 복합체의 제조를 위한 전기방사 장치의 개략적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2-1에서 제조된 키토산 스펀지-키토산 나노섬유 복합체의 a) 표면 및 b) 단면의 전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2-2에서 제조된 키토산 부직포-키토산 나노섬유 복합체의 표면의 전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 3에서 천연고분자 나노섬유 복합체의 초음파 처리 장치의 개략적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 3에서 초음파 처리된 나노섬유 복합체의 a) 표면 및 b) 단면 전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 4에서 초음파 전, 후의 나노섬유 복합체에 혈액 첨가 후 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 4에서 거즈, 키토산 스펀지, 초음파 처리 전, 후 나노섬유 복합체의 혈액 응고율 산출 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 N-아세틸-D-글루코사민에서 아세틸기가 떨어져 나간 탈아세틸화 단위체가 β-(1, 4) 결합한 고분자 다당체인 키토산 등의 천연 고분자를 이용하여 스펀지(sponge) 또는 부직포 형태의 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조한 뒤, 제조된 상기 다공성 스캐폴드 상에 키토산, 키틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연고분자 방사용액을 전기방사함으로써, 수분 흡수성이 향상된 나노섬유 복합체를 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자로 제조된 스펀지 또는 부직포 형태의 다공성 스캐폴드 상에 나노섬유를 제조할 경우, 수분 흡수도 및 세포 친화성이 높아져 세포의 생존율과 부착능이 현저하게 높아진다는 사실을 규명하고 본 발명을 완성하였다.
천연 고분자를 이용하여 나노섬유를 제조할 경우, 독성이 없고 생체 안정성이 우수하기 때문에 독성으로 인한 각종 부작용을 유발할 염려가 없어서 활발한 연구가 진행되고 있다. 합성고분자를 이용한 지지체의 경우, 지지체 내부에 수 이상의 특정 다공도를 얻기 위하여 염/용매 분리법을 통해 스폰지를 제조하지만, 천연 물질인 N-아세틸-D-글루코사민의 경우, 특히 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물인 키토산은 희석된 산 수용액 등에 용해가 되기 때문에 냉각온도에 따른 용매 분리법으로만 제조가 가능하여 지지체 내부에 미세기공(submicron)을 조절할 수 없다. 또한, 생체 적합성, 생체 활성 및 생분해성이 좋은 특성이 있는 천연 고분자 물질인 N-아세틸-D-글루코사민 또는 이의 탈아세틸화물을 전기 방사하여 얻은 나노섬유는 세포외기질과 유사한 구조를 가지지만, 높은 다공도에 비해 공극의 크기가 작기 때문에 세포 배양에 어려움이 있다. 때문에 천연 고분자 물질인 N-아세틸-D-글루코사민 또는 이의 탈아세틸화물 등을 이용하여 미세기공을 가진 지지체를 제조할 경우 생체재료 및 조직공학 분야에서 핵심소재로 사용될 가능성이 있다.
조직 공학 분야에 응용가능한 지지체는 다공성 구조 내에 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 인체 내에 있는 대부분의 세포들은 부착세포로서 부착할 수 있는 지지체가 없을 경우 대부분 사멸하게 된다. 때문에 최적의 지지체는 생체 내 세포외기질과 유사한 구조를 가져야 하며, 우수한 세포의 성장, 분화 및 세포 이동에 대한 적합한 환경을 제공해야 한다. 또한, 최적의 생체적합성, 면역반응 및/또는 생분해성이 우수해야 하고 큰 표면적의 부피와 높은 다공도를 가져야 한다.
본 발명에서는 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 함유하는 스펀지 또는 부직포 형태의 다공성 스캐폴드를 제조하고, 상기 다공성 스캐폴드 상에 N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자 방사용액을 전기방사하여 나노섬유를 제조함으로써, 그 결과 수분 흡수력이 향상된 나노섬유 복합체를 제공할 수 있다.
본 발명의 수분 흡수력이 향상된 천연 고분자 나노섬유 복합체는 다음과 같은 단계를 포함하여 제조될 수 있다:
(a) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조하는 단계;
(b) N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 용매에 혼합시켜 방사용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 방사용액을 방사용 바늘에 투입한 후 전압을 인가하여 상기 다공성 스캐폴드 상에서 전기방사를 실시하는 단계;
(d) 진공 건조하여 잔류용매를 제거함으로써 나노섬유 복합체를 제조하는 단계; 및
(e) 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리하는 단계.
상기 (a) 단계에서는, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 이용하여 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조하며, 이 때 다공성 스캐폴드는 바람직하게는 스펀지 또는 부직포 형태일 수 있다.
보다 구체적으로, 키토산을 이용하여 스펀지 형태의 다공성 스캐폴드를 제조하는 경우, 상기 다공성 스캐폴드는 (i) N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물과 부탄올을 용매에 각각 용해시켜 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물 용액 및 부탄올 용액을 제조하는 단계; (ii) 상기 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물 용액 및 상기 부탄올 용액을 서로 혼합하는 단계; 및 (iii) 상기 혼합된 용액으로부터 기포를 제거하고 동결 건조시켜 스펀지를 제조하는 단계에 의하여 제조될 수 있다.
상기 (i) 단계에서는, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물과 부탄올을 용매에 각각 용해시켜 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물 용액 및 부탄올 용액을 제조하며, 이때 사용할 수 있는 용매의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid), 트리플루오로아세트산(TFA; trifluoro acetic acid), 염산(hydrochloric acid) 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.
상기 (ii) 단계에서는, 상기 (i) 단계에 의해 제조된 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물 용액과 부탄올 용액을 서로 혼합하며, 보다 구체적으로 전동 교반기를 사용하여 혼합하는 것이 바람직하며, 이를 통해 최적의 이온 결합력을 갖는 균일한 상태의 혼합용액을 제조할 수 있다.
상기 (iii) 단계에서는, 상기 (ii) 단계에 의해 제조된 혼합 용액으로부터 기포를 제거하고 동결 건조시켜 스펀지를 제조한다. 한편, 상기 (i) 단계에서 산 용매를 사용할 경우, 상기 (iii) 단계 후, 중화 처리 과정을 추가로 실시할 수도 있다.
상기 (b) 단계에서는, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 용매에 혼합시켜 방사용액을 제조하며, 이때 사용할 수 있는 용매의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 물, 프로판올(propanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 트리플루오로에틸렌(TFE; trifluoro ethylene), 트리플루오로아세트산(TFA; trifluoro acetic acid), 테트라하이드로퓨란(THF; tetra hydro furan), 디클로로메탄(DCM; dichloro methane), 디메틸포름아마이드(DMF; dimethyl formamide), 디메틸아세트아마이드(DMA; dimethyl acetamide), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide), 헥사플루오로이소프로판올(HFIP; hexa fluoro isopropanol), 헥산(Hexane), 벤젠(benzene), 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid) 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.
상기 (c) 단계에서는, 상기 (b) 단계에 의해 제조된 방사용액을 방사용 바늘에 투입한 후 전압을 인가하여 상기 (a) 단계 의해 제조된 다공성 스캐폴드 상에서 전기방사를 실시한다. 이를 위한 전기방사 장치의 구성요소는 고전압 발생기, 방사 용액을 담을 수 있는 주사기와 금속 바늘(needle), 주사기의 방사 용액을 일정하게 밀어내는 주사기 펌프 및 금속 수집기를 포함하며, 전기방사의 원리는 다음과 같다. 즉, 방사 용액을 주사기 펌프를 통해 금속바늘로 토출시키면 반구형의 방사액적이 형성되고, 여기에 방사 용액의 표면장력을 극복할 수 있는 임계전압 이상의 고전압이 가하면, 방사액적은 하전된 테일러 콘(Taylor cone) 형태로 변화한 후, 그 정점으로부터 수집기 쪽으로 방사 제트(jet) 형태로 방출되며, 수집기에 닿을 때까지 비행하는 동안 용매가 휘발하면서 고화되어 나노섬유가 얻어진다. 이때, 방사 제트가 매우 불안정하고 예측 불가능한 흐름 거동을 보임으로써, 생성된 나노섬유는 3차원적으로 서로 복잡하게 얽힌 부직포 형태가 된다. 전기방사에 영향을 미치는 인자는 크게 방사 용액 물성(분자량, 점도, 점탄성, 전기전도도, 표면장력), 조작인자(방사용액의 공급유속, 전기장의 세기, 금속바늘과 수집기 사이의 거리), 외부조건 인자(방사공간의 온도, 습도, 기체환경) 등이 있으며, 이러한 인자들을 조절하여 원하는 굵기 및 밀도를 가지는 나노섬유를 제조할 수 있다.
상기 단계 (d)에서는, 상기 (c) 단계에 의해 제조된 나노섬유를 진공 건조하여 잔류용매를 제거하며, 보다 구체적으로는 진공 건조 장치(vacuum dry oven)를 이용하여 나노섬유에 잔류하고 있는 용매를 강제로 휘발시킨다. 이때 진공 건조 시간은 바람직하게는 1시간 이상 수행한다.
한편, N-아세틸-D-글루코사민, N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 고분자를 함유하는 방사용액을 만들기 위한 용매로 산(acid) 용매를 이용할 경우, 알칼리(alkali) 용액으로 중화 처리하는 단계를 추가로 실시할 수 있다. 알칼리 용액의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 탄산나트륨(sodium carbonate), 수산화암모늄(Ammonium hydroxide), 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 및 이들의 혼합 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.
또한, 방사용액에 함유되는 천연 고분자로 콜라겐이나 젤라틴 등을 이용하는 경우에는 잔류 용매 제거 후 가교제가 함유된 용액에 침지함으로써, 나노섬유 내 천연 고분자를 가교 처리하는 단계를 추가로 실시할 수 있다.
상기 가교제로는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 에틸디메틸아미노프로필카르보디이미드(EDC; 1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide), 하이드록시석신이미드(NHS; N-hydroxysuccinimide), 디메틸아미노프로필에틸카르보디이미드하이드로클로라이드(EDAC; dimethylaminopropyl ethylcarbodiimide hydrochloride), 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole), 글루타알데하이드(Glutaraldehyde) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.
상기 단계 (e)에서는, 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리한다. 즉, 전기방사로 제조된 나노섬유 복합체의 다공도 및 두께를 조절하기 위하여 초음파(ultra-sonicator) 처리하며, 보다 구체적으로, 천연고분자 나노섬유 복합체에 초음파를 인가하면 증류수가 진동을 하게 되고 증류수를 머금고 있는 복합체는 그 진동에 의해 나노섬유 가닥들이 서서히 풀어져 공극의 크기가 커지고 다공도가 높아지며 이로 인해 나노섬유 복합체의 두께가 증가하게 된다. 이때, 초음파 처리에 따라 발생하는 온도 상승을 막기 위해 바깥쪽을 얼음물로 냉각 시키며, 온도 상승이 천연고분자 고유의 특성 또는 스펀지-나노섬유의 형태 변화를 일으킬 수 있기 때문에 초음파 처리를 하는 동안 계속해서 온도를 4℃로 유지시켜야 한다(도 6 참조). 또한, 초음파의 세기와 시간을 조절하게 되면 원하는 나노섬유 복합체의 공극 크기 및 다공도 그리고 두께를 얻을 수 있고 수은침투법을 통해 공극의 크기 및 다공도를 정량화 할 수 있다.
상기 초음파 처리 진행시 수행온도, 처리시간, 인가 전력의 범위는 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 1W 내지 250W의 전력 범위에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 초음파 처리 전후의 천연고분자 나노섬유 복합체의 다공도 및 공극 크기를 비교한 결과, 초음파 처리 시 다공도 및 공극의 크기가 증가하는 것으로 나타났다(실시예 3 참조).
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 초음파 처리 전후의 천연고분자 나노 복합체에 혈액을 첨가하고 혈액 흡수시간 및 혈액 응고율을 비교한 결과, 초음파 처리 시 흡수 시간이 줄어들고, 낮은 혈액 응고율을 나타내는 것으로 확인하였다(실시예 4 참조)
상기로부터, 본 발명의 천연 고분자 나노섬유 복합체는 수분 흡수 시간이 단축되는 우수한 특성이 있으므로, 유착방지막, 차폐막, 지혈제, 창상치료용 피복재 또는 조직공학용 지지체(scaffold) 등으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 키토산 다공성 스캐폴드 제조
1-1. 키토산 스펀지 제조
N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물과 부탄올을 각각 1v/v% 아세트산에 용해시켜 2w/v% 키토산 용액 및 16w/v% 부탄올 용액을 제조하였다. 키토산 용액을 mechanical stirrer (glass)를 이용하여 4℃(ice bath) 500 rpm으로 교반하면서 부탄올 용액을 첨가하여 균일(homogeneous)하게 두 용액을 혼합하였으며, 두 용액의 비율을 1:1(v/v)로 하였다. 제조된 혼합용액을 준비된 100 petri-dish에 10ml 넣고 기포 제거를 위해 4℃에서 4시간 이상 보관한 후, -80℃ deep freezer에서 24시간 동결 후 동결 건조시켜 키토산 스펀지를 제조하였다. 이 후, 제조된 키토산 스펀지를 100% 에탄올에 여러 번 세척한 후 에탄올에 0.5 M NaOH 녹여 세척을 하였다. 그리고 50% 에탄올에 여러 번 세척 후 마지막으로 증류수를 이용하여 세척하는 중화처리 과정을 수행한 후 동결 건조하여 최종적으로 키토산 스펀지를 제조하였다.
도 1은 실시예 1-1에서 제조된 키토산 스펀지의 전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1-1에서 제조된 키토산 스펀지는 다공성 키토산 스펀지임을 확인할 수 있었다.
1-2. 키토산 부직포 제조
4%(v/v) 아세트산에 N-아세틸-D-글루코사민의 탈아세틸화물을 10%(w/v)를 녹인 후, 나일론 필터 (nylon mesh)로 여과하고, 자체 제작한 방사기(노즐 0.1 mm, N2 gas 압력 20 kg/mm2)를 통해 습식방사를 한 후 1차 응고액(ethylene glycol 2L, KOH 200g, 증류수 200mL, ICE 200g)과 2차 응고액(methyl alcohol + 증류수 = 1:1)을 통과시켜 섬유를 제조하였다. 그 후 1 N 수산화나트륨(NaOH) 용액으로 중화처리 시킨 다음 증류수로 충분히 세척한 후 진공오븐에서 건조하여 키토산 섬유를 제조하였다.
이후 제조된 키토산 섬유를 5mm 정도 길이로 자르고, 0.1% 아세트산에 분산시켜 스크린(screen)으로 뜬 뒤 -70℃에서 하루 동안 동결시켰다. 이를 1N 수산화나트륨 용액으로 중화처리 시킨 다음, 증류수로 충분히 세척하고 다시 동결 건조하여 부직포형의 스캐폴드를 제조하였다.
1-3. 키토산-콜라겐 스펀지 제조
1%(v/v) 염산 용액에 키토산을 2%(w/v)가 되도록 첨가하고 상온에서 24 시간 동안 교반하여 균질한 상태의 키토산 수용액을 얻고, 여기에 0.1%(w/v)의 콜라겐 (Type I 콜라겐)을 천천히 가하면서 교반하여 균질한 키토산-콜라겐 수용액을 얻었다. 다음으로, 1% 염산 수용액에 이소-헥산올을 20% (w/v)가 되도록 가하였다. 키토산-콜라겐 수용액 2g을 3개의 주형에 각각 분취한 후 다시 이소-헥산올 용액 2ml를 각각의 주형에 가하였다. 5℃에서 5시간 동안 방치한 다음, -60℃의 냉동기에서 72시간 동안 정치한 후, -70℃에서 24 시간 동안 동결건조시켜 키토산-콜라겐 스펀지를 제작하였다. 이후, 0.1 N 탄산나트륨 용액 중에 3시간 동안 중화시켜 과잉의 용매를 제거하고, 과잉의 증류수로 여액이 중성이 될 때까지 충분히 세척한 후 -70℃에서 동결건조시켜 최종적으로 완성된 키토산-콜라겐 스펀지를 얻었다.
도 2는 실시예 1-3에서 제조된 키토산-콜라겐 스펀지의 전자현미경(SEM) 이미지를 나타낸 것이이며, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1-3에서 제조된 키토산-콜라겐 스펀지는 다공성 스펀지임을 확인할 수 있었다.
1-4. 키토산-피브린 스펀지 제조
0.1N 포름산 용액에 키토산을 1.5%가 되도록 가하여 5℃에서 24시간 동안 교반하여, 균질한 키토산 수용액을 얻었다. 여기에 피브린을 1% 첨가하여 균일한 키토산-피브린 수용액을 얻었다. 그리고, 0.1N 포름산 용액에 에틸렌글리콜모노에테르를 10%(w/v)가 되도록 가하였다. 키토산-피브린 용액 2g을 3개의 주형에 각각 분취한 후 다시 에틸렌글리콜모노에테르 용액 2ml를 각각의 주형에 가하였다. 5℃에서 5시간 동안 방치한 다음, -60℃의 냉동기에서 72시간 동안 정치한 후, -70℃에서 24시간 동안 동결건조시켜 키토산-피브린 스펀지를 제작하였다. 이후 0.1N 수산화암모늄 용액 중에 3시간 동안 중화시켜 과잉의 용매를 제거하고, 과잉의 증류수로 여액이 중성이 될 때까지 충분히 세척한 후 -70℃에서 동결건조하여 최종적으로 완성된 키토산-피브린 스펀지를 얻었다.
실시예 2. 나노섬유 복합체의 제조
2-1. 키토산 스펀지-키토산 나노섬유 복합체의 제조
트리플루오로아세트산(TFA; trifluoro acetic acid)과 디클로로메탄(DCM; dichloro methane)을 7:3으로 혼합한 용매에 키토산을 용해시켜 5w/v% 키토산 용액을 제조한 후, 드럼 수집기(drum collector)에 실시예 1-1에서 제조된 키토산 스펀지를 위치시키고 키토산 용액을 21G 금속바늘(노즐)이 있는 10ml 주사기에 넣은 후 25kV의 전압을 인가하여 전기방사함으로써 키토산 스펀지 위에서 키토산 나노섬유를 제조하였고, 드럼 수집기 장치의 개략적인 모식도를 도 3에 나타내었다. 이때, 금속바늘(노즐)과 수집기 사이의 거리는 15㎝로 하였으며, 용액 방출 속도는 0.5ml/h, 드럼 수집기 회전 속도는 200rpm, 온도는 24℃, 습도는 30%로 유지하며 진행하였다. 방사 후 제조된 키토산 스펀지-키토산 나노섬유 복합체는 즉시 진공 건조 장치를 이용하여 나노섬유에 잔류하고 있는 용매를 제거하였다. 잔류용매가 제거된 키토산 스펀지-키토산나노섬유 복합체는 산에 의해 제조되었기 때문에 메탄올에 녹아있는 3M 수산화나트륨 알칼리 용액을 이용하여 10분 동안 중화처리(neutralization) 하였다.
알칼리 용액으로 중화처리 후 증류수로 세척하고 중성상태(pH 7)로 맞추어 동결건조 함으로써, 최종적으로 키토산 스펀지-키토산 나노섬유 복합체를 제조하였고, 이의 표면 및 단면 이미지를 전자 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 전기방사한 키토산 나노섬유가 복잡하게 얽혀 있는 부직포 형태로 되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 키토산 부직포-키토산 나노섬유 복합체의 제조
다공성 스캐폴드로 실시예 1-2에서 제조된 키토산 부직포를 사용한 것을 제외하곤, 실시예 2-1과 동일한 방법을 통해 키토산 부직포-키토산 나노섬유 복합체를 제조하였다. 이 후 제조된 키토산 부직포-키토산 나노섬유 복합체의 단면 이미지를 전자 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
2-3. 키토산 스펀지-키틴 나노섬유 복합체의 제조
순수 키틴(Mw: 612,000, Degree of deacetylation: 32.3%, Ara bio, Korea)을 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP, Tokyo Chemical Industry, CO. LTD., Japan)에 0.5wt%의 농도로 용해시켜 용액을 준비하였다. 용해된 키틴 용액은 점도가 높아서 초음파 장치(Sonoplus, HD2070, Bandelin electronic, Germany)를 이용하여 70W의 에너지로 한 시간 동안 초음파 처리하여 전기방사 가능한 점도로 낮추었다. 점도를 낮춘 키틴 용액을 금속바늘(18G, Kovax-needle, Korea)이 있는 10ml 주사기에 넣고, 고전압 전원발생기(Wookyung Tech, Korea)로 13kV를 인가하여 키토산 스펀지 위에 전기방사하였는데, 이때, 키틴 용액의 공급유속은 1.8 ml/h으로 하였으며, 용액이 토출되는 금속바늘과 수집기사이의 거리는 15㎝로 하였다. 제조된 키토산 스펀지/키틴 나노섬유는 하루 동안 진공 건조하여 남아 있는 잔류용매를 제거하였다.
2-4. 키토산 스펀지-젤라틴 나노섬유 복합체의 제조
전기방사 시 순수 키틴 또는 키토산 용액에 젤라틴 용액 등을 섞어 함께 방사 하면 각각의 취약한 물성이 상호 보완된 나노섬유 지지체를 제조할 수 있다. 이에 따라 본 발명자들은 키토산에 젤라틴을 혼합한 나노섬유를 제조하기 위해, Trifluoroacetic acid와 Dichloromethan을 7:3의 비율로 혼합한 용매에 키토산을 5wt%로 녹이고, 젤라틴 type B를 같은 용매에 10wt% 녹인 다음 두 용액을 1:1(v/v)로 섞어 키토산 스펀지 위에 전기방사하였다. 전기방사 시 전압은 17kV를 인가하였고, 용액의 공급유속은 1ml/h으로 하였으며, 금속바늘과 드럼 수집기 사이의 거리는 15㎝로 고정하였다. 전기방사 후 진공오븐에서 용매를 강제 증발시키고, 1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS)로 가교(cross-linking) 처리하여 키토산-젤라틴 나노섬유를 제조하였다.
실시예 3. 초음파을 이용한 천연고분자 나노섬유 복합체의 다공성 조절
실시예 2에서 제작된 키토산 스펀지-나노섬유 복합체를 증류수가 담긴 유리초자에 넣고 충분히 적셔질 수 있도록 약 1분 정도 기다린 후, 초음파 발생기(VCX 750, Sonics, USA)를 이용하여 4℃에서 초음파 처리하여 다공도를 조절하였으며, 장치의 개략적인 모식도를 도 6에 나타내었다. 이때, 초음파 처리 시간은 1분으로 하였으며 250W의 에너지 범위에서 진행하였다. 초음파 처리된 나노섬유 복합체의 표면 및 단면 이미지를 전자 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 초음파 처리를 하였을 경우, 공극의 크기가 커지고 다공도가 높아지며 이로 인해 나노섬유 복합체의 두께가 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 초음파 처리 전후 천연고분자 나노섬유 복합체의 혈액응고 실험
혈액응고 실험을 위한 혈액으로는 토끼 혈액을 이용하였다. 즉, 토끼 혈액을 채혈하여 항응고제(anticoagulant)인 덱스트로오스-시트르산(acid citrate dextrose) 용액을 9:1로 섞어 주었다. 50ml 튜브에 초음파 처리 전, 후의 나노섬유 복합체를 넣고 200㎕의 토끼 혈액을 첨가하였다. 혈액응고가 일어나도록 0.4M 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액 20㎕을 넣어 준 후, 37℃ 인큐베이터(incubator)에 3분간 보관하고, 혈병이 흩어지지 않도록 증류수 25ml을 천천히 첨가하였다. 이 후 15ml을 채취한 후 원심분리기(centrifugal)에서 1000rpm으로 1분 동안 원심분리하고, 상층액을 모아 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 200㎕를 채취하여 효소면역측정장치(ELISA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 한편, 혈액응고 실험의 비교군으로 일반적인 거즈와 키토산 스펀지를 사용하였다.
도 8은 초음파 전, 후의 나노섬유 복합체에 혈액 첨가 후 이미지를 나타낸 것으로, 보다 구체적으로, a)는 초음파 처리 전 나노섬유 영역의 혈액 흡수 부분, b)는 초음파 처리 전 스펀지 영역의 혈액 흡수 부분, c)는 초음파 처리 후 나노섬유 영역의 혈액 흡수 부분 및 d)는 초음파 처리 후 스펀지 영역의 혈액 흡수 부분 이미지를 나타내 것이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 혈액을 초음파 처리 전, 후 키토산 스펀지-나노섬유 복합체에 첨가하였을 때, 위쪽 나노섬유 부분에서 좁은 영역으로 흡수되어 아래의 스펀지 부분에 모두 흡수되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 이 때 혈액의 흡수시간도 측정하였으며, 그 결과 초음파 처리 전 보다 초음파 처리 후의 경우에 100초에서 10초로 감소됨을 확인 할 수 있었다.
또한, 하기의 수학식 1을 통해 혈액 응고율 (Blood clot index)을 계산하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
Figure 112013020237484-pat00001
여기서, AbsSample은 각 샘플 혈액의 흡광도이고, AbsWhole blood는 전혈(Whole blood)의 흡광도이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 전혈(whole blood)을 기준으로 거즈 53.3%, 키토산 스펀지 18.1% 그리고 초음파 처리 전, 후 나노섬유 복합체가 각각 13.3%, 9.8%의 혈액 응고율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 초음파 처리 후 나노섬유 복합체에서의 혈액 응고가 초음파 처리 전 나노섬유 복합체 보다 우수할 뿐만 아니라, 다른 비교군보다 월등히 우수하다는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. (a) 폴리(N-아세틸-D-글루코사민)의 탈아세틸화물을 이용하여 다공성 스캐폴드(scaffold)를 제조하는 단계;
    (b) 폴리(N-아세틸-D-글루코사민), 폴리(N-아세틸-D-글루코사민)의 탈아세틸화물 및 젤라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고분자를 용매에 혼합시켜 방사용액을 제조하는 단계;
    (c) 상기 방사용액을 방사용 바늘에 투입한 후 전압을 인가하여 상기 다공성 스캐폴드 위에 전기방사를 실시하는 단계;
    (d) 진공 건조하여 잔류용매를 제거함으로써 나노섬유 복합체를 제조하는 단계; 및
    (e) 제조된 나노섬유 복합체를 초음파 처리하는 단계를 포함하는, 천연 고분자 나노섬유 복합체 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 다공성 스캐폴드는 스펀지 또는 부직포 형태인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 스펀지는,
    폴리(N-아세틸-D-글루코사민)의 탈아세틸화물과 부탄올을 용매에 각각 용해시켜 폴리(N-아세틸-D-글루코사민)의 탈아세틸화물 용액 및 부탄올 용액을 제조하는 단계;
    상기 폴리(N-아세틸-D-글루코사민)의 탈아세틸화물 용액 및 상기 부탄올 용액을 서로 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합된 용액으로부터 기포를 제거하고 동결 건조 시켜 스펀지를 제조하는 단계에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리(N-아세틸-D-글루코사민)의 탈아세틸화물 용액 제조 단계에서의 용매는 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid), 트리플루오로아세트산(TFA; trifluoro acetic acid), 염산(hydrochloric acid) 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 용매는 물, 프로판올(propanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 트리플루오로에틸렌(TFE; trifluoro ethylene), 트리플루오로아세트산(TFA; trifluoro acetic acid), 테트라하이드로퓨란(THF; tetra hydro furan), 디클로로메탄(DCM; dichloro methane), 디메틸포름아마이드(DMF; dimethyl formamide), 디메틸아세트아마이드(DMA; dimethyl acetamide), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide), 헥사플루오로이소프로판올(HFIP; hexa fluoro isopropanol), 헥산(Hexane), 벤젠(benzene), 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid) 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계 이후, 알칼리 용액을 이용하여 중화처리(neutralization) 하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 알칼리 용액은 탄산나트륨(sodium carbonate), 수산화암모늄(Ammonium hydroxide), 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 및 이들의 혼합 용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 제조된 나노섬유 복합체를 가교제가 함유된 용액에 침지시키는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 가교제는 에틸디메틸아미노프로필카르보디이미드(EDC; 1-ethyl-3(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide), 하이드록시석신이미드(NHS; N-hydroxysuccinimide), 디메틸아미노프로필에틸카르보디이미드하이드로클로라이드(EDAC; dimethylaminopropyl ethylcarbodiimide hydrochloride), 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole), 글루타알데하이드(Glutaraldehyde) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (e) 단계의 초음파 처리는 1W 내지 250W의 전력 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 나노섬유 복합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 나노섬유 복합체는 유착방지막, 차폐막, 지혈제, 창상치료용 피복재 및 조직공학용 지지체(scaffold)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용도를 갖는 것을 특징으로 하는, 나노섬유 복합체.
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