KR20050040187A

KR20050040187A - 조직 재생을 유도하기 위한 생체 모방형태의 나노섬유와마이크로 섬유의 복합지지체 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20050040187A
Application number: KR1020030075317A
Authority: KR
Inventors: 이승진; 심인경; 이명철
Original assignee: 이승진
Priority date: 2003-10-28
Filing date: 2003-10-28
Publication date: 2005-05-03
Also published as: KR100621569B1

Abstract

본 발명은 손상된 조직을 효과적으로 재생하기 위한 나노섬유와 마이크로 섬유로 이루어진 생체 모방형태의 다공성 복합지지체와 그의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 다공성 복합지지체는 마이크로섬유를 기본골격으로 하고, 생리활성 고분자로부터 얻어진 나노섬유가 이차원 구조 또는 삼차원 구조의 네트워크 형태로 이루어진 것으로, 마이크로섬유를 사용함으로써 일정 형태와 강도를 갖아서 생체조직이 삼차원적으로 재생되도록 함과 동시에 나노섬유를 복합함으로써 공극률을 향상시켜 세포와 관계되는 표면적을 크게하며 세포가 잘 부착 및 증식되는 구조를 제공한다. 특히, 나노섬유는 생리 활성을 부여하는 고분자나 기존의 고분자에 생체적합성을 증가할 수 있는 고분자를 사용함으로써 조직 재생능을 높일 수 있는 특징이 있다.

Description

조직 재생을 유도하기 위한 생체 모방형태의 나노섬유와 마이크로 섬유의 복합지지체 및 그의 제조방법{NANO-MICROFIBROUS SCAFFOLD FOR ENHANCED TISSUE REGENERATION AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 손상된 조직을 재생하기 위한 다공성 복합지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

조직재생은 인체내 기관이나 조직이 기능을 잃거나 유실시에 세포, 약물 지지체 등을 제공하여 효과적으로 조직을 재생하는 것으로, 이때, 조직 재생용 지지체는 임플란트 부위에서 물리적으로 안정하고 재생 효능을 조절할 수 있는 생리활성을 갖아야 하며, 또한 새로운 조직을 형성한 후에는 생체내에서 분해되어야 하고 이때, 분해산물이 독성을 갖지 않아야 한다.

이러한 조직 재생용 지지체는 종래 일정한 강도와 형태를 갖는 고분자를 이용한 다공성 지지체가 제조되었으며, 이러한 고분자를 이용하여 스폰지 타입이나 섬유형 매트릭스 도는 젤타입의 세포배양지지체로 제조 및 이용되고 있다.

이 중 섬유형 메트릭스의 지지체는 열린 공극을 갖고 있으며 공극의 크기가 커서 세포가 잘 부착 증식되는 구조를 갖는다. 그러나 현재 많이 사용되지 않는데 이는 지지체가 천연고분자로 이루어진 경우 수상에서 강도가 매우 약하여 붕해되거나 수축되어 형태를 유지하지 못하고 합성 고분자를 사용하더라도 섬유형태만으로는 일정 공간을 확보하기 어려워서 주로 삼차원 구조 보다는 막형태의 2 차원 구조로 형성되는 문제점을 가지고 있다. 참고로, 조직을 재생함에 있어 3 차원 구조는 세포의 활성과 재생능에 매우 중요한 구조이다.

또한, 이러한 지지체만으로는 약물을 봉입하여 조절 방출하거나 생리 활성을 갖는 천연 고분자들을 다 적용시키는 데는 한계가 있다.

한편, 생체내 세포외 기질(extracellular matrix)은 글리코스아미노글리칸과 같은 기본 물질과 콜라겐 나노섬유의 네트워크 구조를 유지하고 이 사이에 세포가 부착 증식하여 조직을 형성하게 된다. 본 발명에서는 이러한 세포외기질의 형태를 모방한 구조를 착안하여 구조적 유사성을 갖으며 동시에 조직 재생을 유도할 수 있는 인자를 포함하거나 생체 적합성을 높일 수 있는 넥트워크 구조를 형성하기 위하여 나노섬유와 마이크로 섬유를 포함하는 복합지지체를 제조하였다.

종래 재생 조직용 지지체의 제조방법은 스폰지 타입의 지지체를 제조하는 방법이 일반적인 것으로서, 입자침출법(particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion) 및 상분리법(phase separation) 등이 이용되고 있다.

입자침출법은 생분해성 고분자의 유기용매 용액에 녹지 않는 소금 등의 입자를 혼합하여 주물을 제조한후에 용매를 제거하고 물로소금 입자를 용출 제거하는방법으로, 염 입자의 크기와혼합 비율을 조절함으로써 다양한 공극의 크기와 공극률을 갖는 다공성 구조를 얻을 수 있지만, 잔존하는 소금염이나 거친 형상에 의하여 세포가 손상되는 문제점이 있다(A. G. Mikos, G. Sarakinos, S. M. Leite, J. P. Vacant i, and R. Langer, Biomaterials (1993) 14, 5, 323-330; A. G. Mikos, A. J . Thorsen, L. A. Czerwonka, Y. Bao, R, Langer, D. N. Winslow, and J. P. Vacan ti, Polymer (1994) 35, 5, 1068-1077).

또한, 유화동결 건조법은 고분자의 유기용매 용액/ 물의 유화액을 동결건조하여 유기용매와 물을 제거하는 방법이고, 고압기체 팽창법은 유기용매를 사용하지 않고 생분해성 고분자를 주형에 넣어 압력을 가해 펠렛을 만들고 적당한 온도에서 고압의 탄산가스를 생분해성 고분자에 주입한 후 서서히 압력을 낮추어서 매트릭스 내의 탄산 가스가 방출되어 공극을 형성하는 방법이다. 그러나 상기 방법들은열린구조를 갖는 공극(open cellular pores)을 만들기 어려운 한계를 가지고 있다(참조: K. Whang, C. H. Thomas, K. E. Healy, G. Nuber, Polymer(1995) 36, 4, 837-842; D. J. Mooney, D. F. Baldwin, N. P. Suh, J. P. Vacanti, R. Langer, Biomat erials (1996) 17, 1417-1422).

최근에는 고분자의 유기용매 용액에 승화성 물질 또는 용해도가 다른 용매를 추가하고 승화 또는 온도 변화에 따른 용액의 상분리에 의하여 다공성 지지체를 제조하는 상분리법을 이용하고 있으나, 이것도 공극의 크기가 너무 작아 세포의 배양이 어려운 문제점을 갖고 있다(참조: H. Lo, M. S. Ponticiello, K. W. Leong, Tissue Eng.(1995) 1, 15-28; H. Lo, S. Kadiyala, S. E. Guggino, K. W. Leong, J. Biomed. Mater. Res.(1996) 30, 475-484; Ch. Sc hugens, V. Maguet, Ch. Grandfils, R. Jerome, Ph. Teyssie, J. Biomed. Mater. Res.(1996) 30, 449-461).

이상의 방법들은 세포의 점착과 분화를 유도할 수 있는 삼차원적 고분자 지지체를 제조하기 위한 것들이나, 아직까지 생체 분해성 고분자로 삼차원 조직재생용 지지체를 만드는 방법에는 많은 문제점들이 남아있다

본 발명의 목적은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 구조적인 안정성을 갖으며 동시에 조직 재생을 유도할 수 있을 뿐만 아니라 생체 적합성을 높일 수 있는 네트워크 구조인 다공성 복합지지체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로섬유와 나노섬유로 이루어진 다공성 복합지지체 및 그의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 마이크로섬유와 나노섬유로 이루어진 다공성 복합지지체를 제공한다. 구체적으로, 마이크로섬유를 기본골격으로 하고, 생리활성 고분자로부터 얻어진 나노섬유가 이차원 구조 또는 삼차원 구조의 네트워크 형태로 이루어진 다공성 복합지지체를 제공한다.

도 5는 본 발명의 다공성 복합지지체의 일예를 나타낸 것으로, 굵고 검게 나타난 섬유가 마이크로섬유이다. 마이크로섬유는 직경이 30∼50 ㎛로서, 다공성 복합지지체의 기본골격을 갖는 지지체이다. 이러한 지지체로서의 특성으로 본 발명의 다공성 복합지지체에 일정 형태와 강도를 나타내어 조직이 삼차원적으로 재생되도록 한다.

본 발명에서 마이크로섬유는 합성고분자 및 천연고분자의 혼합물로서, 상기 합성고분자은 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactide-co-glycolide; PLGA) 등의 폴리 에스테르와 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트이며, 상기 천연고분자는 콜라겐 젤라틴, 히알루론산, 키틴 및 키토산으로 이루어지는 군으로부터 얻어진 것을 사용하며, 바람직하게는 폴리(D,L-락트산-채-글리콜산)으로부터 얻어진 것을 사용한다. 그러나, 본 발명에서 마이크로섬유는 조직재생용으로 사용할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 이에 대해 한정하지 않는다. 또한, 상기 마이크로섬유는 합성고분자와 천연고분자를 2:1∼1:2로 혼합하여 얻어진 것을 사용하며, 바람직하게는 1:1로 혼합하여 얻어진 것을 사용한다.

또한, 도 5에서 보는 바와 같이 얇고 하얗게 나타난 섬유가 나노섬유이다. 나노섬유는 직경이 0.2 ㎛이하로서, 마이크로섬유의 기본골격 위에 이차원 구조 또는 삼차원 구조의 네트워크 형태로 이루어진다. 이러한 나노섬유는 공극률을 높혀 세포와 관계하는 표면적을 크게 하며 세포가 잘 부착하고 증식되는 구조를 제공한다. 특히, 생리활성을 부여하는 고분자나 기존의 고분자에 생체적으로 합성을 증가할 수 있는 고분자를 사용하여 제조하므로써 조직 재생능을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 나노섬유는 천연고분자 및 합성고분자로부터 얻는데, 상기 천연고분자는 생체 친화성이 우수한 것으로 키토산 또는 콜라겐을 사용하며, 구체적으로 산용해성 제1형 콜라겐이나 수평균분자량 8만∼15만의 키토산을 사용한다. 합성고분자는 구조내에서 결정성을 갖고 있어 나노섬유 제조시 37℃ 수용액 상의 생체조건하에서 안정한 형태를 유지할 수 있는 것으로, 폴리락트산, 폴리락트산-글리콘산 공중합체 및 폴리글리코산으로 이루어진 그룹 중 선택된 것을 사용하며, 바람직하게는 수평균분자량 10만∼35만의 폴리락트산을 사용한다. 이때, 상기 천연고분자 및 합성고분자 중 하나를 선택하여 단독으로 사용할 수 있으며, 또한 천연고분자와 합성고분자를 혼합하여 사용할 수 있다. 이는 구조내에서 결정성을 갖고 있어 나노섬유 제조시 생체조건하에서 안정한 형태를 유지할 수 있을 뿐만 아니라 생체 친화성을 나타내는 효과를 나타내기 위한 것으로, 이러한 효과를 고려하여 천연고분자 및 합성고분자의 혼합비는 중량비로 0.25:1∼0.5:1가 바람직하다.

상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 다공성 복합지지체는 마이크로섬유와 나노섬유를 복합하여 사용함으로써, 일정 형태와 강도를 유지하는 동시에 조직 재생능을 향상시킬 수 있는 것으로, 이를 고려하여 나노섬유의 양을 복합지지체에 대하여 10∼20 중량%로 조절하며, 마이크로섬유의 양을 복합지지체에 대하여 80∼90중량%로 조절한다. 상기 나노섬유의 양이 범위 미만인 경우 조직 재생능이 떨어져 충분한 효과를 얻을 수 없으며, 상기 범위를 초과한 경우 일정 형태 및 강도 유지에 어려움이 있어 지지체로서의 특성이 떨어지게 되는 단점이 있다.

또한, 본 발명은 상기 다공성 복합지지체에 추가로 조직재생을 유도할 수 있는 약물이나 성장인자를 포함한다.

상기 조직재생을 유도할 수 있는 약물의 일예는 DHEA 등이며, 성장인자는 혈소판유래 성장인자, 인슐린유사 성장인자, 상피성장인자 및 변환성성장인자로 이루어진 그룹 중 선택된 것이다. 그러나, 본 발명에서 약물이나 성장인자는 조직재생을 유도할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 이에 대해 한정하지 않는다. 이러한 약물이나 성장인자는 나노섬유에 위치하여 조직재생을 극대화시킬 수 있는 것으로, 나노섬유에 대하여 100∼5000 ng을 사용한다.

또한, 본 발명은 다공성 복합지지체의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 마이크로섬유를 제조하는 단계(단계 1),

천연고분자와 합성고분자를 단독 또는 혼합하여 유기용매에 용해시켜 방사액을 제조하는 단계(단계 2),

상기 방사액을 전기방사기 저장소에 충전시킨 후 전기방사기를 이용하여 나노섬유를 제조하는 단계(단계 3), 및

상기 단계 1에서 제조된 마이크로 섬유 위에 상기 단계 3의 나노섬유를 방사하여 다공성 복합지지체를 제조하는 단계(단계 4)를 포함하는 것으로 이루어진 다공성 복합지지체의 제조방법을 제공한다.

추가로, 상기 단계 2의 방사액 제조시 천연고분자와 합성고분자를 단독 또는 혼합하여 유기용매에 용해시키고, 추가로 약물을 용해시켜 방사액을 제조하는 것을 포함한다.

단계 1에서는 마이크로 섬유를 제조한다. 구체적으로, 합성고분자 및 천연고분자를 용매에 각각 용해시킨 후 유화제를 이용하여 이들의 혼합 용액을 제조한다. 이 후 상기 혼합 용액을 용액방사하여 마이크로섬유를 제조한 후 이를 압축가교하여 마이크로섬유를 완성한다.

먼저, 합성고분자 및 천연고분자를 용매에 각각 용해시키는데, 이때 합성고분자는 유기용매에 용해시키며, 천연고분자는 산용매에 용해시킨다.

상기 합성고분자를 용해시키는 유기용매는 아세톤, 클로로포름, 염화메틸렌 중에서 선택하며, 바람직하게는 염화메틸렌을 사용한다. 그러나 이에 국한하지 않고 상황에 따라 적절히 유기용매를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 합성고분자는 합성고분자 용액에 대하여 10∼20 중량%를 사용한다.

상기 키토산을 용해시키는 산용매는 초산, 락트산, 염산 중에서 선택하며, 바람직하게는 초산을 사용한다. 그러나 이에 국한하지 않고 상황에 따라 적절히 산용매를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 천연고분자는 천연고분자 용액에 대하여 4∼8 중량%를 사용한다.

이를 각각의 용액을 혼합하기 위해 유화제를 사용하며, 바람직하게는 트윈 80을 사용한다. 이때, 혼합 용액의 혼합비는 합성고분자:천연고분자=0.5:1∼2:1이 바람직하며, 원하는 성질에 따라 적절히 조절할 수 있다.

이후, 에틸렌글리콜과 메탄올을 1:1로 혼합한 용액에 염화나트륨 용액을 녹여 응고조를 제조한다. 상기에서 제조된 혼합 용액에 알칼리 메탄올 용액을 응고조로 사용하여 용액방사한 후, 중성이 될 때까지 세척하고 건조하여 마이크로섬유를 제조한다. 이때 응고조의 비율은 25% 에틸렌글리콜, 70% 메탄올, 5중량% 염화나트륨일 때가 가장 바람직하다. 본 발명의 천연고분자는 산용액에 용해되며 알칼리 용액에서 응고되며, 본 발명의 합성고분자는 염화메틸렌에 잘 용해되며, 메탄올에서는 응고되는데, 이러한 용매의 성질을 이용하면 바람직한 응고조를 제조할 수 있다.

알칼리성 메탄올 응고액은 수산화나트륨, 수산화칼륨 중에서 선택된 강염기를 포함하는 에틸렌글리콜과 메탄올의 혼합용액이며, 이때 염기는 4∼20%, 메탄올은 30∼60%가 바람직하다.

마지막으로, 연골 결손부위의 형태와 크기에 적합한 모양의 성형틀에 상기에서 제조한 마이크로섬유를 충전 및 압축하고 체내와 같은 수상에서 1 시간이상 평형화시킨 후 동결 건조하여 염화메틸렌 등의 고분자를 녹일 수 있는 증기에서 2∼8시간 가교하여 적용부위에 적합한 지지체를 제조한다. 이때 압력은 5000kg∼2ton 이 바람직하며, 1∼2ton 이 더욱 바람직하다.

단계 2에서는 천연고분자와 합성고분자가 용해된 방사액을 제조하며, 추가로 약물을 함께 용해시켜 방사액을 제조한다.

상기 천연고분자 및 합성고분자는 나노섬유를 제조하기 위한 원료로서, 천연고분자는 생체 친화성이 우수한 것으로 키토산 및 콜라겐으로 이루어진 그룹 중 선택된 것을 사용하며, 바람직하게는 제1형 콜라겐이나 수평균분자량 8만∼15만의 키토산을 사용한다.

또한 합성고분자는 구조내에서 결정성을 갖고 있어 나노섬유 제조시 37℃ 수용액 상의 생체조건하에서 안정한 형태를 유지할 수 있는 것으로 폴리락트산, 폴리락트산-글리콘산 공중합체 및 폴리글리코산으로 이루어진 그룹 중 선택된 합성고분자를 사용하며, 바람직하게는 수평균분자량 10만∼35만의 폴리락트산을 사용한다. 이때, 상기 천연고분자 및 합성고분자 중 하나를 선택하여 단독으로 사용할 수 있으며, 또한 천연고분자와 합성고분자를 혼합하여 사용할 수 있다. 이는 구조내에서 결정성을 갖고 있어 나노섬유 제조시 37℃ 수용액 상의 생체조건하에서 안정한 형태를 유지할 수 있을 뿐만 아니라 생체 친화성을 나타내는 특징을 나타내기 위함이다.

상기 고분자의 사용량은 방사액에 대하여 각각 천연고분자 5∼10중량%, 합성고분자 10∼20중량%이다.

단계 1에서 사용되는 용매는 합성고분자 및 천연고분자를 용이하게 용해할 수 있는 것으로, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판올, 염화메틸렌 및 아세톤으로 이루어진 그룹 중 선택된 하나 또는 그 이상의 혼합액이며, 바람직하게는 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판올과 염화메틸렌이 부피비로 1:1∼5:1의 비율로 혼합된 용매를 사용한다.

또한, 단계 1은 추가로 혈소판유래 성장인자, 인슐린유사 성장인자, 상피성장인자 및 변환성장인자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 약물을 방사액에 용해시키며, 첨가되는 양은 고분자에 대하여 100∼5000 ng이 바람직하다. 상기 약물은 다공성 복합지지체에 포함되어 조직재생을 극대화시키기 위해 첨가하는 것으로, 첨가 방법은 스판 80 등과 같은 계면활성제를 사용하여 방사액에 유화시켜 유중수형 에멀젼을 제조한다.

단계 3에서는 상기 방사액을 전기방사기를 이용하여 나노섬유를 제조한다.

전기 방사기를 이용한 방사절차는 도 1을 참고로 하여 하기에 기술하였다. 전압 발생장치(5)에서 일정 전류를 흘려서 노즐(2)과 컬렉터(4) 사이에 전기장을 형성시킨다. 방사액 저장소(1)에 충전된 고분자 용액을 이 전기장의 힘과 중력에 의하여 컬렉터(4)에 방사한다. 노즐(2)과 컬렉터(4) 사이의 전기장의 거리와 전압 방사액 저장소(1)의 노즐 크기등을 조절하여 방사 조건을 변화시킬 수 있다. 이때, 방사액의 농도와 방사거리에 따라서 제조되는 형태를 조절할 수 있는데, 본 단계에서는 전기방사기의 조건을 최적으로 조절하여 나노섬유를 제조한다. 상기 전기방사기의 조건은 방사거리 10∼20 ㎝이며, 전압 15∼25 V가 바람직하다. 본 발명에서 전기 방사기는 Chungpa EMT사(한국)에서 제조한 DH High Voltage Generator(모델명 : CPS-40K03VIT)를 사용할 수 있다.

마지막으로 단계 4에서는 제조된 마이크로섬유 위에 상기 단계 3의 나노섬유를 방사하여 다공성 복합지지체는 제조한다. 구체적으로 얇게 잘펴놓은 상태의 마이크로섬유 매트릭스 위에 나노섬유를 방사하여 적당한 두께로 포개어 적층압축한 후 결손부위에 맞게 성형하여 다공성 복합지지체를 제조한다.

본 발명의 다공성 복합지지체는 인체내 기관이나 조직이 기능을 읽거나 유실시에 효과적으로 조직을 재생하기 위한 것으로, 세포부착에 유용한 다공성 복합지지체이다. 이러한 다공성 복합지지체는 연골세포 또는 뼈세포 등 다양하게 적용할 수 있으며, 바람직하게는 연골세포에 적용할 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제조예 1> 콜라겐 나노섬유 제조

어린 소의 가죽(calf skin)에서 얻은 산용해성 제1형 콜라겐 1g을 각각 5%, 8%, 10%의 농도로 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오로프로판올(1,1,1,3,3,3 hexafluoropropanol)용액에 용해시켜 방사액을 제조하였다. 상기 방사액 전기 방사법을 이용하여 나노 섬유를 제조하였다(도 1 참조).

전기 방사기는 Chungpa EMT사(한국)에서 제조한 DH High Voltage Generator(모델명 : CPS-40K03VIT)를 사용하였다.

전기 방사의 자세한 방법은 하기와 같이 첨부된 도 1과 함께 기술하였다.

상기에서 제조된 각각 농도를 갖는 콜라겐 용액(방사액)을 방사액 저장소(1)에 충전하였다. 상기 방사액 저장소(1)는 10 ㎖ 피펫을 사용하였으며 상기 피펫의 입구를 불로 달구어 지름 0.5mm로 조절하여 노즐(2)로 사용하였다. 방사시 방사액의 방출 속도를 0.5 ㎖/min으로 조절하였으며, 전압을 15∼25 V 사이로 조절하고, 전기장의 거리를 10∼20 ㎝로 조절하였으며, 상기 조건하에 방사액을 방사하여 컬렉터(4)에 콜라겐 나노 섬유를 제조하였다.

이때, 얻은 콜라겐 나노섬유는 2 ㎛ 이하의 두께를 갖음을 확인하였다.

도 2는 이 중 20 V 전압, 20 ㎝ 전기장 거리의 조건하에서 8% 콜라겐 방상액으로 얻은 콜라겐 나노섬유의 시차현미경 사진(3500배)을 나타낸 것이다.

<제조예 2> 키토산 나노섬유 제조

수평균분자량 8만∼15만의 키토산을 0.5∼2% 농도로 유기 용매에 녹여 방사액을 제조하였다. 이때 사용한 유기 용매는 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오로프로판올(1,1,1,3,3,3 hexafluoropropanol)과 염화메틸의 혼합용액을 사용하였으며, 염화메틸의 양은 혼합용액에 대하여 5∼40 중량%이었다.

각각의 농도의 키토산 방사액을 상기 제조예와 동일한 방법으로 방사하여 키토산 나노섬유를 제조하였다.

<제조예 3> 콜라겐과 폴리에스터의 혼합물로 이루어진 나노섬유 제조

산용해성 제1형 콜라겐 320 mg과 수평균분자량 10만의 폴리락트산 640 mg을 5 ml의 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오로프로판올에 용해시켜 방사액을 제조하였다.

상기 방사액을 도 1에서 보는 바와 같이, 방사 장치의 방사액 저장소(1)에 충전하고 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 방사하여 나노섬유를 제조하였다.

전기장 거리 15 cm, 전압 20 V로 방사한 경우, 가장 바람직한 형태의 나노섬유를 제조할 수 있었으며, 이렇게 얻어진 나노섬유를 시차현미경을 통하여 관찰하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.

콜라겐은 자체의 결정성이 없는 구조로, 이를 나노섬유로 제조하는 경우 체내와 같은 조건인 37℃의 수용액에서 쉽게 수축되어 섬유끼리 뭉치거나 나노 형태를 잃어버리게 된다. 그러나, 콜라겐에 결정성을 갖는 폴리락트산을 첨가함으로써 제조된 나노섬유가 수용액에서 본래의 형태를 유지하며 안정한 상태를 유지할 수 있었다.

<제조예 4> 키토산과 폴리에스터의 혼합물로 이루어진 나노섬유 제조

상기 제조예 2에서 사용한 키토산 100 mg과 수평균분자량 10만의 폴리락트산 300 mg을 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오로프로판올과 염화메칠이 2:1(w/w)으로 이루어진 혼합용액 10 ml에 용해시켜 방사액을 제조하였다.

상기 방사액을 도 1에서 보는 바와 같이, 방사 장치의 방사액 저장소(1)에 충전하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 방사하여 나노섬유를 제조하였다.

전기장 거리 15 cm, 전압 25 V로 방사한 경우, 가장 바람직한 형태의 나노섬유를 제조할 수 있었으며, 이렇게 얻어진 나노섬유를 시차현미경을 통하여 관찰하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

폴리에스터는 생분해성이고 안정한 형태를 유지할 수 있는 것으로, 미국 식품의약품안전국에 의해 허가를 받아서 생체재료로 널리 사용되고 있으나, 분해산물에 의하여 국소적으로 산의 농도가 높아져서 조직 독성이 생기는 문제를 갖고 있다. 이에, 폴리락트산에 생체 친화성을 갖는 키토산을 첨가함으로써, 제조된 나노섬유가 생체 친화성을 향상시킬 수 있었다.

<실시예 1> 나노섬유와 마이크로섬유 복합 지지체의 제조 1

(단계 1)마이크로섬유의 제조

먼저, 폴리락트산-글리콜산 공중합체를 아세톤에 용해시키고, 키토산은 5 % 초산에 용해시켰다. 상기 용해된 용액을 각각 혼합한 후, 유화제 트윈 80을 이용하여 두 용액을 혼합하였다. 이때, 혼합된 용액의 혼합비는 중량비로 폴리에스테르:키토산=0.5:1의 비율이었다.

이후 에틸렌글리콜과 메탄올을 1:1로 혼합한 용액에 염화나트륨 용액을 녹여 응고조를 제조하였다. 상기에서 혼합된 용액에 알칼리-axksdhf 용액을 응고조로 사용하여 용액방사한 후 중성이 될 때까지 세척한 후 건조시켜 마이크로 섬유를 제조하였다. 이때, 응고조의 비율은 25 중량% 에틸렌글리콜, 70 중량% 메탄올, 5 중량% 염화나트륨이다.

이후, 연골 결손부위의 형태와 크기에 적합한 모양의 성형틀에 상기 제조된 마이크로섬유를 충전하였다. 이를 압축하고 체내와 동일한 수상에서 1 시간 동안 평형화시킨 후 동결 건조하여 염화메틸렌 증기에서 4 시간 동안 가교하여 적용부위에 적합한 지지체를 제조하였다. 이때, 압력은 2 톤이었다.

(단계 2) 방사액 제조

(단계 3) 나노섬유의 제조

상기 단계 2 및 단계 3은 제조예 3에 기재된 바와 같다.

(단계 4)

얇게 잘펴놓은 상태의 마이크로섬유 매트릭스 위에 도 1에 나타낸 전기방사장치를 이용하여 나노섬유를 방사하여 적당한 두께로 포개어 적층압축한 후 결손부위에 맞게 성형하여 다공성 복합지지체를 제조하였다. 이때 전기장 거리 ㎝, 전압 20 V의 조건하에서 수행하였다.

도 5는 제조된 나노섬유와 마이크로섬유 복합 지지체의 시차주사 현미경 사진을 나타낸 것이다. 도 5에서 보는 바와 같이, 나노섬유가 마이크로 섬유 사이에 잘 혼합된 형태를 유지하며 네트워크를 이루고 있다. 이는 생리 활성을 가진 나노섬유의 혼합으로 조직 재생을 유도하고 표면적의 증가로 세포의 부착 증식을 도울 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 2> 나노섬유와 마이크로섬유 복합 지지체의 제조 2

상기 제조예 3에서 제조된 방사액에 추가로 인슐린유사 성장인자 300 ng을 스판 80을 사용하여 유화시켜 방사액을 제조한 것을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 복합 지지체를 제조하였다.

이렇게 방사되는 나노섬유에 조직 재생을 유도할 수 있는 약물이나 성장인자를 함유하는 나노섬유를 제조함으로써 재생을 극대화할 수 있다.

<실험예 1> XRD 분석에 의한 안정성 분석

콜라겐, 폴리락트산과 그 혼합물의 재료 자체의 성질과 나노섬유 제조시의 결정성 감소에 의한 안정성 변화를 예측하기 위하여, 콜라겐, 제조예 1의 콜라겐 나노섬유, 본 발명의 제조방법에 의한 폴리락트산 나노섬유 및 제조예 3의 폴리락트산/콜라겐 나노섬유에 대한 XRD(X-ray Diffractometer(XRD 3000PTS); Rich. Seifert & Co.) 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 콜라겐의 경우, 나노섬유로 제조시 안정성이 더욱 떨어져서 실재 수용액 속에서 급격히 수축하여 나노 섬유들이 뭉치거나 형태를 잃고 유실되는 경향을 나타낸다. 이에, 2θ가 17°전후에 결정성을 갖는 폴리 락트산과 혼합을 하여 나노 섬유를 제조하여 결정성을 부여하여 수용액 내에서 안정성의 증가하고 일정한 형태를 유지하는 것을 알 수 있다.

실제로, 나노섬유로 부직포를 제조하여 건조시의 공극률과 37℃ 수용액상에서 공극률의 변화를 측정하여 보면 콜라겐만으로 만든 나노섬유는 50% 이상 공극률이 감소하는데 비해 콜라겐에 폴리락트산을 혼합하여 제조한 나노 섬유는 10% 정도의 공극률 감소를 보였다.

<실험예 2> 지지체의 연골세포 부착 실험

상기 실시예 1에서 제조된 복합 지지체를 70% 에탄올로 소독한 후 계대 배양한 연골 세포를 동적 배양(dynamic culture)을 한 후 시차주사 현미경으로 부착된 세포의 상태를 관찰하였다.

세포가 부착되지 않은 세포를 제거하고 0.1M 인산완충 생리식염수(PBS pH 7.4)에 25(w/w)%의 글루타르알데히드를 희석하여 얻어진 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 4∼20 분간 사전 고정하였다. 사전 고정 후 0.1M 인산완충 생리식염수로 세척하고 다시 0.1M 인산완충 생리식염수에 사산화 오스뮴을 용해하여 얻어진 1% 사산화 오스뮴 용액으로 0∼20분간 사후 고정하였다. 사후 고정후 에탄올로 물을 완전히 제거하고 동결건조후 시료를 그-파라듐 코팅하여 시차주사 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 7에서 나타내었다.

도 7에서 보는 바와 같이, 마이크로 섬유에 의해서 1일 뒤에도 일정한 형태로 강도를 유지하고 있었다. 또한 조직을 확대하여 지지체에 세포가 붙어있는 양상을 관찰한 결과 마이크로 섬유에도 일부의 연골 세포가 붙어있으나 많은 수의 세포나 나노섬유에 밀집되어 부착된 모습을 관찰할 수 있었다. 이는 나노섬유를 혼합함으로서 세포가 붙을 수 있는 공간을 제공하고 세포 활성을 갖는 나노섬유로 인하여 조직 재생을 유도한다는 것을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 조직재생용 복합지지체는 마이크로섬유 및 나노섬유가 네트워크로 이루어져 있어 일정 강도를 유지하여 생체내에서 안정한 형태를 유지할 수 있으며 그와 동시에 생체 모방 형태로 생리활성을 갖아서 조직 재생을 효과적으로 유도할 수 있다. 특히, 복합지지체를 구성하는 나노섬유는 공극률을 크게 하여 세포의 부착과 증식을 극대화할 수 있다. 또한, 자체의 생리활성을 갖는 콜라겐을 사용하거나 산을 중화시킬 수 있는 키토산을 사용하여 생체 적합성을 높이는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 전기방사 장치의 개략도를 나타낸 그림이며,

도 2는 제조예 1에서 제조한 콜라겐 나노 섬유의 시차주사 현미경 사진(3500배)이며,

도 3은 제조예 3에 따라 키토산과 폴리락트산 혼합물로 제조된 나노섬유의 시차주사 현미경 사진(3500배)이며,

도 4는 제조예 4에 따라 콜라겐과 폴리락트산 혼합물로 제조된 나노섬유의 시차주사 현미경 사진(2000배)이며,

도 5는 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유과 마이크로 섬유 복합지지체의 시차주사현미경 사진(750배)이며,

도 6은 본 발명의 콜라겐, 콜라겐 나노섬유, 폴리락트산 나노섬유 및 폴리락트산/콜라겐 나노섬유의 XRD 분석결과를 나타낸 그래프이며,

도 7는 실시예 1에서 제조한 나노섬유와 마이크로섬유 복합지지체의 연골부착능을 나타내는 시차주사 현미경사진(500배)이다.

* 도면 중 주요부분에 대한 부호 설명 *

1 : 방사액 저장소, 2 : 노즐

3 : 전압전달코드, 4 : 컬렉터

5 : 전압발생장치, 6 : 마이크로 섬유

Claims

마이크로섬유를 기본골격으로 하고, 생리활성 고분자로부터 얻어진 나노섬유가 이차원 구조 또는 삼차원 구조의 네크워크 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체.
제 1항에 있어서, 상기 다공성 복합지지체가 추가로 혈소판유래 성장인자, 인슐린유사 성장인자, 상피성장인자 및 변환성성장인자로 이루어진 그룹 중 선택된 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체.
제 1항에 있어서, 상기 나노섬유가 복합지지체에 대하여 10∼20 중량% 포함되며, 상기 마이크로섬유가 복합지지체에 대하여 80∼90 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체.
제 1항에 있어서, 상기 마이크로섬유가 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)의 폴리 에스테르; 폴리(카프로락톤); 폴리(발레로락톤); 폴리(하이드록시부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트)로 이루어진 그룹 중 선택된 합성고분자와 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 키틴 및 키토산으로 이루어진 그룹 중 선택된 천연고분자의 혼합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체.
제 1항에 있어서, 상기 생리활성 고분자가 폴리락트산, 폴리락트산-글리콘산 공중합체과 폴리글리콘산으로 이루어진 그룹 중 선택된 합성고분자 및 키토산 및 콜라겐으로 이루어진 그룹 선택된 천연고분자의 혼합으로 이루어진 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체.
제 5항에 있어서, 상기 합성고분자와 천연고분자의 혼합비가 중량비로 0.25:1∼0.5:1 인 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체.
다공성 복합지지체의 제조에 있어서,

마이크로 섬유를 제조하는 단계(단계 1),

천연고분자와 합성 고분자의 혼합물을 유기용매에 용해시켜 방사액을 제조하는 단계(단계 2),

상기 방사액을 전기방사기 저장소에 충전시킨 후 전기방사기를 이용하여 나노섬유를 제조하는 단계(단계 3), 및

상기 단계 1에서 제조된 마이크로 섬유 위에 상기 단계 3의 나노섬유를 전기방사하여 다공성 복합지지체를 제조하는 단계(단계 4)를 포함하는 것으로 이루어진 다공성 복합지지체의 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 1에서 혈소판유래 성장인자, 인슐린유사 성장인자, 상피성장인자 및 변환성성장인자로 이루어진 그룹 중 선택된 약물을 추가로 용해시키는 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체의 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 1의 용매가 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오로프로판올, 염화메틸 및 아세톤으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체의 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 전기방사를 전압 15∼25 V, 방사거리 10∼20 ㎝ 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체의 제조방법.
세포부착에 유용한 제1항의 다공성 복합지지체.
제 11항에 있어서, 상기 세포가 연골세포인 것을 특징으로 하는 다공성 복합지지체.