KR100545404B1 - 키틴 또는 키토산의 나노섬유(초극세섬유)를 구성성분으로하는 부직포 - Google Patents
키틴 또는 키토산의 나노섬유(초극세섬유)를 구성성분으로하는 부직포 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에서는 키틴 또는 키토산의 나노섬유가 서로 얽혀 있는 구조를 갖는 부직포가 제공된다. 상기 키틴 부직포는 키틴을 전기방사 용매에 용해시킨 후 전기방사함으로써 제조될 수 있다. 또한 상기의 키틴 부직포를 알칼리 수용액으로 처리하여 탈아세틸화함으로써 키토산의 부직포를 제조할 수 있다. 본 발명의 부직포는 밀착성 및 공기투과도가 우수하고, 손상된 피부조직의 보호 및 세포 재생에 유리하므로 창상피복제나 인공피부, 조직공학용 스케폴드 등으로 이용할 수 있다.
키틴, 키토산, 나노섬유, 전기방사, 창상피복재, 인공피부, 조직공학용 스케폴드
Description
도 1은 전기방사에 사용되는 전기방사 장치의 일예를 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 키틴 초극세 섬유사를 5,000배 확대하여 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 키틴 초극세 섬유사의 직경에 따른 빈도수의 분포를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 제조된 키틴 나노섬유 집합체에 의한 정상적인 사람의 피부 각화세포, 구강 각화세포, 섬유아세포의 세포부착능 및 확산능을 측정한 결과이다.
PS: 폴리스틸렌 Chitin only: 키틴 부직포
BSA: chitin 시료에 소혈청 알부민 처리 Col 1: chitin 시료에 타입1 콜 라겐 처리
FN: chitin 시료에 피브로넥틴 처리 LN: chitin 시료에 라미닌 처리
도 5는 본 발명의 키틴 나노섬유 집합체(왼쪽)와 키틴 스폰지 필름(오른쪽)에 대하여 4일 후의 상처부위를 비교한 결과이다.
본 발명은 부직포에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 키틴 또는 키토산의 나노섬유를 구성성분으로 하는 부직포, 그리고 키틴 용액을 전기방사 용매에 용해시킨 후 전기방사하는 단계를 포함하는 부직포 및 상기의 부직포를 알칼리 수용액으로 처리하여 탈아세틸화시키는 키토산 부직포에 관한 것이다.
피부는 외부로부터 생체를 보호하는 최전선에 위치한 기관으로서 피부가 손상을 입게 되면 위험한 상황에 노출되기 쉽다. 피부의 기능은 복잡하여 인공적으로 제조된 피부 대체물은 피부가 가지는 기능을 모두 수행할 수는 없지만, 상처를 보호할 수는 있다.
인공피부는 임상적인 관점에서 일시적으로 발생된 피부의 상처를 보호할 목적으로 사용하는 것과 영구부착을 목적으로 하는 것으로 분류할 수 있다. 전자는 창상피복재, 동종피부, 타가배양피부 등으로 실제로 피부를 대행할 수 있는 기능을 가지고 있으며, 이에 반해 후자는 자신의 건강한 피부로부터 채취한 섬유아세포 또는 각화세포를 시험관내에서 배양하여 피부구조의 일부를 구축하는 것으로서 자가배양 피부라고도 한다.
또한 인체는 피부에 창상과 같은 결손 부위가 발생할 경우, 상기 결손 부위를 방어하고 자가 치유를 하려는 성질을 가지고 있는데 이런 경우에 결손 부위를 효과적으로 치유하고, 그 치유 속도를 높이기 위한 보조제로서, 창상피복재가 사용된다. 이러한 창상피복재가 갖추어야 할 조건으로는 생체적합성이 우수하여 결손 부위에 있어서 거부반응이 없어야 하며, 창상부위로부터 삼출하는 체액을 충분히 흡수할 수 있어야 하고, 피복재의 일부가 신생조직에 함몰되어도 분해 생성물이 독성을 나타내지 않아야 하며, 창상면과 피복재가 적절히 밀착되어야 한다. 또한, 결손 부위의 추가감염을 방지하기 위하여 창상치유 보조제 기능을 증진시킬 수 있는 다른 의약품과의 혼합이 용이하여야 하며, 혼합시 반응성이 적어야 한다.
현재, 화상으로 인한 열창 및 오랜 병상 생활 또는 불결한 피부관리에서 유발되는 욕창에 대한 방책으로서 인공피부와 항생제를 포함하는 창상피복재의 여러 종류가 현재 사용 중에 있으나, 감염을 효과적으로 저지하지는 못하고 있는 형편이다. 그러나, 앞으로 인구의 고령화 추세로 욕창 치료에 필요한 의료물품의 수요는 급격히 증가할 것으로 예상되므로, 이에 대한 연구개발 및 상품의 시판이 시급한 실정이다.
그 외에 상처에 대한 뼈치료, 유전적 기형 및 질병에는 때로 조직이식이 필요하다. 자가이식과 동종이식은 가장 안전한 이식방법이다. 그러나 공급이 제한되고 이들 이식조직들이 질병감염과 거부반응을 일으킬 위험이 있기 때문에, 합성생체적합물질도 이식조직편으로 널리 사용되고 있다. 이러한 생체적합물질 중 일부에서는 생체내 합병증이 관찰되었는데, 기계적 어긋남(압력 차폐)과 마모조직파편의 출현은 이식조직편 주위에 골위축증, 골다공증 또는 골용해를 일으키는 것이다(Woo et al., 1976; Terjesen et al., 1988).
따라서 조직공학(Tissue Engineering, TE)으로 정의되는 새로운 접근방법이 최근 많은 관심을 불러 일으켰는데 조직공학은 기능적인 조직대등체를 만들기 위하여 생물조직과 특정 상호작용을 할 수 있는 생체적합물질의 신규생산을 개발하는 것을 포함한다. 기초를 이루는 개념은 세포가 환자로부터 분리되고, 세포배양에서 팽창되어, 'TE 구조체'라 불리는 스케폴드/생물학적 복합물을 형성하기 위하여 특정 생체적합물질로부터 제조된 스케폴드 상에 접종될 수 있다는 것이다. 그 다음에 그 구조체는 대체조직으로 기능하기 위하여 동일한 환자에게 이식될 수 있다. 그러한 시스템의 일부는 공여자 기관(organ)의 유용성이 제한되는 곳, 또는 어떤 경우(예를 들면, 젊은 환자들) 불충분한 자연대치를 이용할 수 있는 곳에서 기관조직대체에 유용하다. 스케폴드 그 자체는 성장인자, 유전자 및 약품으로부터 생물학적으로 활성을 가진 성분을 위한 운송수단으로 작용할 수도 있는데 수술에 대한 이러한 혁명적 접근방식은 환자의 안녕과 의료시스템의 발전 모두에 유익하게 광범위하게 적용될 수 있다. 여기서 스케폴드(scaffold)란 조직공학 또는 관련응용분야용 세포운반체로 디자인된 장치로, 바람직하게는 세포에 의해 전이증식되는 다공성 형태를 가지는 것을 말한다.
뼈조직의 성장에 대한 조직공학의 적용은 뼈발생간세포(osteogenic stem cells)를 모으는 단계, 그들을 접종하는 단계, 및 시험관 내에서 신규조직을 생산하기 위하여 그들을 성장시키는 단계를 포함한다. 새로 얻어진 조직은 자가이식에 사용될 수 있다. 생분해성 폴리에스테르-특히 폴리(락티드-코-글리콜리드) {poly(lactide-co-glycolide)}-는 여러 가지 다른 세포집단의 조직공학용 스케폴드로 사용되어 왔는데, 예를 들면: (J. of Biomed. Mater. Res. 27:11-13, 1993에서 Freed 등이 설명한 바와 같은) 연골세포(chondrocytes), (Journal of Biomedical Mat. Res. 29, 959-965, 1995에서 Mooney 등이 설명한 바와 같은) 간세포(hepatocytes) 및 가장 최근의 (J. Biomed. Mat. Res. 36:17-28에서 Ishaug 등과 Cells and Materials, 7, 223-234, 1997에서 Holy 등이 설명한 바와 같은) 골수유래 세포들이다. 특히, 이러한 폴리에스테르의 다공성 구조는 제조되어 세포로 접종되었다. 그러나 골수유래 세포가 이들 다공성구조에서 배양될 때, 뼈 내부성장은 3-D 중합성 스케폴드의 외부 가장자리 내에서만 발생하였기 때문에(상기 Ishaug 등; 상기 Holy 등) 이러한 경우에 제조되는 중합성 스케폴드는 필요한 세포성장이 자가이식으로 사용하거나 조직이식을 위한 적절한 조직을 제공하도록 하는 데는 불충분하였다.
키틴은 식물의 셀룰로오스(섬유소)와 유사한 구조를 갖는 분자량 2만 이상의 천연 다당류이며 새우 등의 갑각류 및 균류나 조류 등의 고등 식물 세포벽에 존재하는 천연 고분자 물질이다. 그리고 키토산은 키틴을 강알칼리로 탈아세틸화하여 얻어지는 물질로, 저농도 산성 용액에 잘 용해되는 특징을 가지고 있다.
키틴과 키토산은 무독성, 환경 친화성, 생분해성 및 생체 적합성이 우수하여 여러 의료용 분야에 많이 활용되고 있는데 특히 Prudden 등은 상기 키틴 및 키토산 제제가 상처 치유를 촉진시키는 효과가 있음을 보고한 바 있으며(L. L. Balassa 및 J. F. Prudden, Proc. 1st International Conference Chitin/Chitosan, MIT (1977) 296∼297쪽), 또 이들은 어떤 성분이 상처치유 효과에 기여하는가를 연구한 결과, 키틴의 구성단위인 N-아세틸글루코스아민과 키토산의 구성단위인 글루코스아민이 상처치유에 관여한다는 결론을 얻었다.
다이네쉬 등( Rev. Macromol. Chem. Phys., C40(1), 69-83 (2000) )은 키틴과 키토산 및 이들을 이용한 화합물을 이용한 상처 치유제, 인공 피부, 약전성재료, 혈액 응집제, 인공신장막, 생분해성 수술용 봉합사, 항균성 재료로의 적용 가능성과 우수한 기능성을 보고하였다. 또한 마리에판 등( ILEE Engineering In Medicine and Biology November/December, 1999)은 상처치유의 목적으로 키토산 박막이 도포된 침대보를 이용하였을 때 흉터를 예방하고 상처치유를 촉진한다는 연구결과를 보고하고 있다.
한편 독일특허 제DE1906155호, 제DE1906159호는 키틴, 키토산 관련 창상피복재에 관한 최초의 특허로서, 상기 특허에 따르면 분쇄된 키틴 분말이 상처 회복에 좋다고 기재되어 있다. 또한 영국특허 제GB1252373호에도 이와 유사한 내용을 제시하고 있다.
미국특허 3632754호, 3914413호에는 키틴이 창상 치유를 촉진시킨다는 내용이 기재되었으며, 유럽특허 제EP0089152호, 일본특허 제JP86141373호 등에는 키토산을 케라틴 또는 콜라겐과 복합시킨 필름으로 만들어 창상 보호제로 사용하는데 대하여 기재되어 있다
한편, 대한민국 특허공고공보 제01-2410호, 유럽특허 제EP0089153호, 일본특허 제JP86141373호 등은 키토산 혹은 키틴 유도체로 구성되는 군에서 선택되는 다 당류와 케라틴 혹은 콜라겐 등의 단백질을 이용한 다당류와 단백질 사이의 복합체를 창상피복재로 사용하는 데에 대하여 기술하고 있다.
이상과 같이 키틴과 키토산을 인체 병리학적인 용도로 적용하려는 기술들은 이미 보고된 것이 많다. 하지만 기존의 기술에서는 키틴 또는 키토산을 인체 적합성 소재로서의 가능성을 제시하였을 뿐 상업화시키지 못하였으며, 임상병리학적인 다양한 처리에 적합하면서 기능성이 최대로 발휘되는 효과적인 형태의 제품은 아직 출시되지 않고 있다.
이에 본 발명자는 피부와의 밀착성, 투과성, 항생제 등의 의약품 함침성 및 사용시의 용이성 등을 모두 만족하는 부직포를 개발하고자 노력한 결과, 키틴의 나노섬유가 서로 얽혀 있는 구조를 갖는 부직포가 상기한 요구조건을 만족할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피부와의 밀착성, 투과성, 항생제 등의 의약품 함침성 및 사용시의 용이성 등을 모두 만족하는 부직포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 키틴 또는 키토산의 나노섬유를 구성성분으로 하는 부직포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 키틴을 방사 용매에 용해시킨 후 전기방사하는 단계를 포함하는 부직포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기방사에 의해 제조된 키틴 부직포를 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 등의 알칼리 수용액으로 처리하여 키토산 부직포를 제공하는데 있다.
본 발명에 따른 부직포는 키틴 또는 키토산의 나노섬유를 구성성분으로 하고 있다. 본 명세서에서 "나노섬유(또는 초극세섬유)"라 함은 나노입경을 갖는 섬유를 말하며, 전기방사시의 조건을 적절히 조절함으로써 50 - 1,000 nm의 입경을 갖는 나노섬유가 용이하게 제조될 수 있다. 피부와의 접촉성, 창상피복재 내의 공극의 비율, 창상 피복재의 기계적 강도 등을 고려할 때, 100 ∼ 1,000 nm의 직경을 갖는 나노섬유가 바람직하다. 가장 바람직하게는 200 ∼ 700 nm이다.
본 발명의 부직포는 직경이 나노크기의 초극세사로 구성된 섬유집합체로서, 성질이 유연하며, 미세공간이 많고 단위 중량당 표면적이 큰 특징을 가지고 있어 창상피복재나 인공피부, 조직공학용 스케폴드로 전개시, 피부와의 밀착성 및 공기투과도가 우수하며 외부로부터의 세균의 침투에 의한 감염을 방지할 수 있으므로, 손상된 조직의 세포를 효율적으로 재생시킬 수 있다. 특히 손상된 조직이 피부 각화세포 및 구강 각화세포일 때, 우수한 효과를 보인다. 본 발명의 구체예에 따르면, 키틴 나노섬유로 이루어진 부직포 형태의 창상 피복재는 정상적인 사람의 피부 각화세포(NHEK: normal human epithermal keratinocyte) 및 구강 각화세포(NHOK: noraml human oral keratinocyte)의 세포부착능을 측정한 결과, 종래의 스폰지 형태의 창상피복재에 비해 현저히 향상된 세포부착능 및 확산능을 제공하였다(도 4 참조).
본 발명의 부직포가 창상피복재로 사용될 경우, 결손부위의 추가감염을 방지하기 위하여, 창상피복재에 통상 사용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 첨가제의 예로는 가소제, 유연제, 항생제, 항미생물제, 세포, 효소, 항체, 안료 등을 들 수 있다.
상기 키틴 용액은 방사 용매에 용해된 후 전기방사 장치에 적용되어 나노섬유가 서로 얽혀 있는 구조의 부직포가 제조된다. 본 명세서에서 "방사 용매"라 함은 키틴을 용해시킬 수 있어야 한다는 전제하에 전기방사에 적용할 수 있는 용매를 말하며, 그러한 예로는
N-메틸모폴린옥시드(N-methylmorpholine oxide)/물, 헥사플루오로이소프로판올 (hexafluoro-2-propanol), 헥사플루오로아세톤의 수화물 (hexafluoroacetone.hydrate) 디메틸아세트아미드(dimethylacetamine)/염화리튬 (LiCl), N-메틸피롤리돈(N-methylpyrollidone)/염화리튬(LiCl), LiCNS, Ca(CNS)₂, CaI, CaBr₂ ,CaCl₂ 등의 무기염을 포함하는 용제, 삼염화초산 (trichloroacetic acid, Cl3CCOOH), 삼염화초산/염화메탄(chloromethane), 삼염화초산/이염화메탄 (dichloromethane), 삼염화초산/1,1,2-삼염화에탄(1,1,2-trichloroethane), 황산, 포름산, 인산, 포름산/이염화초산(dichloroacetic acid)/디프로필에테르(dipropyl ether)가 있으며, 바람직한 용제로는 N-메틸모폴린옥시드(N-methylmorpholine oxide)/물, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoro-2-propanol), 헥사플루오로아세톤의 수화물(hexafluoroacetone.hydrate), 포름산(formic acid)이 있다.
전기방사에 통상 사용될 수 있는 전기방사 장치는 특별히 제한되지 아니하며, 나노섬유의 직경, 나노섬유의 굵기 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있으며, 일반적으로 사용되는 고전압(5 ∼ 50kV)을 걸어줄 수 있는 전기방사 장치가 널리 사용될 수 있다.
나노섬유(또는 초극세 섬유)의 직경은 키틴 용액의 농도, 사용한 전기방사 장치의 종류 및 전기방사시의 조건을 적절히 조절함으로써 100 - 1,000 nm, 바람직하게는 200 ∼ 700 nm의 범위 내에서 적절히 조절할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 키틴 농도는 0.1 ∼ 20 중량%를 사용하고, 키틴의 분자량에 따라 다르지만 바람직하게는 3 ∼ 15 중량%이다. 또한, 주어진 전압은 5 ∼ 35 kV의 범위에서 수행되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 15 ∼ 25 kV이였다. 방사구와 집적판 사이의 거리는 5 ∼ 30 cm가 바람직하였고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 15 cm이였다. 다만, 상기한 키틴 용액의 농도, 전압 및 방사구와 집적판 사이의 거리는 전기방사 장치의 종류, 요구되는 물성, 부직포의 형상 등을 전체적으로 고려하여 정해져야 한다. 전기방사된 나노섬유는 서로 얽혀 있는 부직포 형태를 형성하였다.
천연에 존재하는 키틴은 부분적으로 탈아세틸화되어 있는 것이 보통인데, 키토산은 이렇게 키틴의 단량체에서 아세틸기가 떨어져 나간 형태로서 D-글루코사민이 5천개 이상이 반복적으로 결합하고 분자량이 1 ∼ 2 만 이상인 탄수화물이다. 키토산의 부직포는 상기와 같이 키틴용액의 전기방사에 의해 제조된 부직포를 통상적으로 알려진 수산화나트륨 혹은 수산화칼륨 등의 알칼리 수용액으로 처리하여 탈아세틸화함으로써 제조할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명 범위 및 목적을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 명세서를 참고하여 변형시키거나 개선시킬 수 있을 것이다.
<실시예 1>
키틴을 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoro-2-propanol)에 녹여 3%의 용액으로 제조하고, 도 1의 전기방사 장치를 이용하여 방사구 선단부에서 집적판까지의 거리는 5 cm, 전압은 15 kV로 고정한 후 전기방사하여 키틴 나노섬유의 섬유집합체를 제조하였다. 섬유 집합체를 구성하는 초극세 섬유의 직경을 분석하기 위하여 화상분석기(image analyzer)(Scope Eye, 한국)를 이용하였다. 도 3은 그 결과를 도시한 것으로서 100 ∼ 400 nm의 직경에 해당되는 섬유수가 밀집된 결과를 확인할 수 있었다. 상기에서 제조된 섬유집합체를 주사전자현미경(Hidachi S-2350, 일본)을 이용하여 5,000 배의 배율로 확대하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 2에 도시하였다. 상기 결과에서 볼 수 있듯이, 섬유집합체는 100 ∼ 400 nm의 균일한 굵기를 갖는 나노섬유가 부직포 형태로 서로 얽혀 있는 구조를 갖고 있었다.
<실시예 2>
키틴을 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoro-2-propanol)에 녹여 3%의 용액의 동일한 농도 및 방사구 선단부에서 집적판까지의 거리가 7 cm로 동일하고, 전압을 20 kV로 변경하여 전기방사하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 수행한 결과, 굵기가 비교적 균일한 (210±140 nm) 초극세 섬유사의 집합체를 제조하였다.
<실시예 3>
키틴을 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoro-2-propanol)에 녹여 3%의 용액의 동일한 농도로 제조하고, 방사구 선단부에서 집적판까지의 거리를 7 cm 및 전압을 25 kV로 변경하여 전기방사하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 수행한 결과, 굵기가 비교적 균일한 (230±150 nm) 초극세 섬유사의 집합체를 제조하였다.
<실시예 4>
키틴을 N-메틸모폴린옥시드(N-methylmopholine oxide)/물에 녹여 3%의 용액을 제조하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1 내지 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
<실시예 5>
키틴을 헥사플루오로아세톤의 수화물(hexafluoroacetone.hydrate)에 녹여 3%의 용액을 제조하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1 내지 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
<실시예 6>
키틴을 인산(phosphoric acid)에 녹여 3%의 용액을 제조하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1내지 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
<실시예 7>
상기 실시예1 내지 6에 의해 제조된 부직포를 수산화나트륨으로 처리하여 탈아세틸화한다. 수행한 결과, 굵기가 비교적 균일한 키토산의 초극세 섬유사의 집합체가 제조되었다.
<실험예 1> 창상피복용 키틴 나노섬유 부직포의 세포부착능 측정
실시예에서 제조된 키틴 나노섬유 집합체에 의한 사람 정상 구강각화세포 (NHOK), 사람 정상 피부각화세포(NHEK) 및 사람 정상 치은섬유모세포(NHGF)의 세포부착능을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
단계 1: 사람 정상 구강각화세포의 준비
NHOK(normal human oral keratinocytes, 이하, "NHOK"라고 함)는 사람 치은(gingiva)조직으로부터 채취하여 조직표본을 18내지 30세 사이 연령의 건강한 사람에게서 얻었다. 상기 조직표본은 3X 항생제가 함유된 칼슘 및 마그네슘이 포함되지 않은 행크스 균질염 용액(calcium- and magnesium-free Hanks balanced salt solution, CMF-HBSS; GibcoBRL)으로 3회 세척하였다.
치은조직으로부터 상피층을 분리하기 위하여 상기조직에 콜라겐네이즈 (collgenase type II, 1.0mg/ml; sigma Chemical Co.) 및 디스파아제(dispase grade II, 2.4 mg/ml; Boeringer-Mannheim)를 함유한 CMF-HBSS를 첨가하여 95%의 공기와 5%의 이산화탄소 조건 하에서 37℃, 90분 동안 배양하였다. NHOK는 상기와 같이 분리된 치은조직으로부터 준비하였으며, 0.15 mM 칼슘과 성장인자(growth factor) 블릿키트를 포함한 상피세포 배양액(KGM; Clonetics Corp.)에서 세포배양을 시행하였다. 세포의 밀도가 대략 70%가 되었을 때 NHOK를 60-mm 페트리 디쉬 당 1 × 105 개의 세포수로 분주하였고, 세포밀도가 대략 70%가 될 때까지 배양하였다. 이와 같이 계대배양(subculture)을 실시하였으며, 2회 계대배양한 NHOK를 사용하였다.
단계 2: 사람 정상 피부구강각화세포의 준비
NHEK(normal human epidermal keratinocytes, 이하 "NHEK"라고 함)는 사람의 표피(foreskin)조직으로부터 채취하여 조직표본을 1내지 3세 사이 연령의 건강한 사람에게서 얻은 것을 제외하고는 NHOK와 동일한 방법으로 처리하였다.
단계 3: 사람 정상 치은섬유모세포의 준비
NHGF(normal human gingival fibroblasts, 이하 "NHGF"라고 함)는 사람 치은(gingiva)조직을 18내지 30세 사이 연령의 건강한 사람에게서 얻어, 3X 항생제가 함유된 칼슘 및 마그네슘이 포함되지 않은 행크스 균질염 용액(calcium- and magnesium-free Hanks balanced salt solution, CMF-HBSS; GibcoBRL)으로 3회 세척한 다음 체외배양(explant culture)을 시행하여 얻었다. 세포의 밀도가 대략 80%가 되었을 때 NHGF를 1:3의 비율로 분주하여 세포밀도가 대략 80%가 될 때까지 배양을 시행하였다. 이와 같이 계대배양(subculture)을 실시하였으며, 4회 계대배양한 NHGF를 사용하였다.
단계 4: 세포부착능 측정
메탄올 수용액으로 10분 처리하여 제조되고 직경이 14 mm인 키틴 나노섬유 부직포를 24-웰 배양접시에 넣고, 0.4 ml의 소혈청 알부민(bovine serum albumin) (1 mg/ml), 타입 I 콜라겐(type I collagen) (50 ㎍/ml), 피부로넥틴(fibronectin) (1 ㎍/ml) 또는 라미닌(laminin) (10 ㎍/ml)을 첨가하고 실온에서 12 시간 배양하 여 세포외기질 단백질(extracellular protein)을 코팅시켰다. 키틴 나노섬유 부직포만을 시험하는 경우에는 0.4 ml의 인산화된 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 첨가하고 동일하게 처리하였다. 첨가한 세포외기질 단백질 (extracellular protein)을 제거하고, 각 웰을 PBS로 1회 조심스럽게 세척하였다. 세포외기질 단백질로 코팅이 안된 부위를 차단시키기 위하여 각 웰당 0.4 ml의 소혈청 알부민(bovine serum albumin) (1 mg/ml)을 첨가하고 37℃에서 30 분간 배양하였다. 소혈청 알부민을 제거하고, PBS로 조심스럽게 세척하였다. 각 웰당 1 × 105 cells (0.5 ml)를 분주하고, 95 %의 공기와 5 %의 이산화탄소 조건 하에서 37 ℃, 60분 동안 배양하였다. 이 때 사용한 배양액은 0.15 mM 칼슘과 성장인자 불릿키트를 포함한 상피세포 배양액(KGM; Clonetics Corp.)에서 배양하였다. 배양액을 제거한 후 PBS로 1 회 조심스럽게 세척하였다. 0.4 ml의 10% 포르말린 용액 (10% formalin in PBS)을 넣고, 실온에서 15 분간 방치시켜 세포를 고정시켰다. 고정액을 제거시키고, PBS로 2 회 세척한 후 키틴 나노섬유 부직포에 부착된 세포를 헤마토실린-에오신 용액(hematoxylin-eosin solution)으로 염색하였다. 염색액을 제거한 후 증류수로 3회 조심스럽게 세척한 다음 키틴 나노섬유 부직포에 부착된 세포의 사진을 촬영하였다. 대표값을 얻기 위하여 키틴 나노섬유 부직포를 4등분하여 각 부위 당 2 부분 총 8부분을 Olympus BX51 현미경으로 100배의 배율로 사진을 찍었다. 평균 백분율과 표준편차는 4번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.
단계 5: 세포스프레딩(cell spreading)능 측정
세포의 스프레딩(cell spreading)은 세포부착 실험에서 찍은 사진으로 분석하였다. 대표값을 얻기 위하여 키틴 나노섬유 부직포를 4등분하여 각 부위 당 2 부분 총 8 부분을 Olympus BX51 현미경으로 100배의 배율로 사진을 찍었다. Filopodia 및 lamellipodia와 같은 뻗침을 가진 납작하고 다각형의 세포를 spreading cell로 간주하였다. 반대로 키틴 나노섬유 부직포에 부착된 세포 중 세척할 때는 견디었지만 spreading은 되지 않은 세포를 non-spreading 세포로 간주하였다. Spread 형태를 나타내는 세포의 백분율은 spread cell의 수를 부직포에 부착된 전체 세포의 수로 나누어 계산 하였다. 평균 백분율과 표준편차는 4번의 독립적인 실험으로부터 계산하였다.
도 4는 실시예에서 제조된 키틴 나노섬유 집합체에 의한 사람 정상 구강각화세포(NHOK), 사람 정상 피부각화세포(NHEK) 및 사람 정상 치은섬유모세포(NHGF)의 세포부착능과 세포스프레딩을 측정한 결과를 나타낸 것으로서, 폴리스티렌에 비하여, 세포외기질 단백질 전처리 여부에 관계없이 키틴 나노섬유 부직포의 세포부착능과 세포스프레딩이 매우 우수함을 확인하였다.
<실험예 2> 창상피복용 키틴 나노섬유 부직포의 상처치유능 평가
중량이 약 250g 되는 실험용 쥐의 등에 크기가 1cm ×1cm의 정방형의 상처(피부전층 결손)를 두 개씩 만들어서 한쪽에는 전기방사를 수행하기 이전 상태인 키 틴 스폰지 필름(한국공개특허공보 제2000-51938호 참조)를 붙인 다음, 봉합하여 고정하고 다른 쪽에는 본 발명에 따른 부직포 형태의 키틴 나노섬유 집합체를 동일한 방법으로 고정하였다. 4일이 지난 후에 상처부위를 관찰하였다.
도 5는 본 발명의 키틴 나노섬유 집합체(왼쪽)와 키틴 스폰지 필름(오른쪽)에 대하여 4일 후의 상처부위를 비교한 결과를 나타낸 사진으로서, 키틴 나노섬유 부직포(오른쪽)의 경우, 종래의 키틴 스폰지 필름(왼쪽)에 비해 상처가 현저히 빠른 속도로 아물었으며, 이러한 결과로부터 키틴 필름에 비하여 키틴 나노섬유 부직포의 상처 치유능이 현저히 우수함을 확인하였다.
본 발명의 부직포는 직경이 나노크기의 초극세사로 이뤄진 섬유집합체로서, 성질이 유연하며, 미세공간이 많고 단위 중량당 표면적이 큰 특징을 가지고 있어 창상피복재(wound dressing), 인공피부(artificial skin), 조직배양용 스케폴드 (scaffolds for tissue engineering)로 전개시 피부와의 밀착성 및 공기투과도가 우수하며 외부로부터의 세균의 침투에 의한 감염을 방지할 수 있으므로, 손상된 조직의 세포를 효율적으로 재생시킬 수 있다는 장점을 갖는다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 기술되었지만, 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
Claims (8)
- 삭제
- 키틴을 함유하는 용액을 전기 방사한 나노섬유를 포함하는 키틴 함유 부직포를 제조하는 방법에 있어서,상기 용액의 용매를 헥사플루오로이소프로판올, N-메틸모폴린옥사이드/물 및 헥사플루오로아세톤의 수화물로 이루어진 군에서 적어도 하나 선택하는 단계; 및상기 키틴 함유 용액의 농도를 3~15중량%로 조절하는 단계를 포함하는 키틴 함유 부직포를 제조하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 키틴 함유 용액을 10 ~ 35kV의 전압으로 전기방사하는 단계를 더 포함하는 키틴 함유 부직포를 제조하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 나노섬유로 이루어진 부직포에 가소제, 유연제, 항생제, 항미생물제, 세포, 효소, 항체, 안료 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 첨가제를 포함시키는 단계를 더 포함하는 키틴 함유 부직포를 제조하는 방법.
- 삭제
- 제 2항의 제조방법에 따라 제조된 키틴 함유 부직포를 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 용액으로 탈아세틸화시켜서 키토산 함유 부직포를 제조하는 방법.
- 제 2항 또는 제 6항의 제조방법으로 제조된 부직포를 피부 각화세포 및 구강 각화세포에 적용하는 것을 특징으로 창상피복재.
- 제 2항 또는 제 6항의 제조방법으로 제조된 부직포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조직공학용 스케폴드.
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