KR20170008024A

KR20170008024A - 3차원 조직 재생을 위한 적층 가능한 세포배양용장치 및 이를 이용한 배양방법

Info

Publication number: KR20170008024A
Application number: KR1020150099223A
Authority: KR
Inventors: 황창모; 홍소영
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2017-01-23
Also published as: KR101714010B1

Abstract

본 발명의 일 실시예는 지지체 및 상기 지지체의 적어도 일측에 연결되어 상기 지지체를 지지하는 프레임을 포함하는 복수개의 세포배양부 및 상기 복수개의 세포배양부가 적층되어 안착되는 고정바디부와, 상기 고정바디부 상에 서로 간격을 두고 형성된 복수개의 고정바를 포함하는 고정지그를 포함하고, 상기 프레임에는 복수개의 관통홀이 형성되며, 상기 복수개의 관통홀은 각각 상기 복수개의 고정바에 대응되는 위치에 형성되는, 세포배양용장치를 개시한다.

Description

3차원 조직 재생을 위한 적층 가능한 세포배양용장치 및 이를 이용한 배양방법{STACKABLE CELL CULTURE APPARATUS FOR 3D MEMBRANE REGENERATION AND CULTURE METHOD USING THE SAME}

본 발명의 실시예들은 3차원 조직 재생을 위한 적층가능한 세포배양용장치 및 이를 이용한 배양방법에 관한 것이다.

기존의 2차원 세포배양법은 세포가 플레이트의 바닥에 붙어 자라는 형태로서 현재 대부분의 분자 생물학 실험실의 기본으로 자리잡고 있다. 반면에, 2차원 세포 배양법은 실제 조직에서 세포가 주변 세포와 세포의 기질(Extracellular matrix)에 둘러싸인 3차원적인 공간에 존재하는 것을 효과적으로 반영하지 못하는 한계를 가지고 있다.

이러한 이유로 최근 들어 생체 내와 유사한 3차원적 세포 환경을 모방한 3차원 세포 배양법에 대한 관심이 증가되고 있다. 3차원 세포 배양은 세포가 평평한 플레이트의 2차원적인 환경에 적응하는 과정을 배제하여 실제 조직과 유사한 환경을 제공함으로써 생체 내 세포 성장, 분화 및 기능을 하도록 유도한다.

종래에는, 3차원 세포 배양법으로, 세포만을 이용하여 3차원 조직을 형성하는 방법이 있으며, 플레이트에 생체재료 박막을 부착하여 세포를 배양시킨 후, 이를 플레이트에서 떼어내어 적층시켜 3차원 조직을 형성하는 방법이 있다. 하지만, 이러한 종래의 방법들은 중간층의 세포들이 제대로 배양되지 못하고 죽기 때문에 3차원 배양세포의 두께를 두껍게 하는데 한계가 있고, 세포막을 다층으로 적층시키기 위해서 많은 시간이 요구된다는 단점이 있다. 특히, 플레이트에 유기물 박막을 부착하여 세포를 배양하는 방법의 경우 이를 플레이트로부터 분리한 후 반드시 체내에서의 배양과정이 필요하다는 문제점이 존재한다.

본 발명의 실시예들은 빠른 시간 안에 다층의 세포막을 용이하게 형성할 수 있는 세포배양용장치 및 이를 이용한 배양방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예는 지지체 및 상기 지지체의 적어도 일측에 연결되어 상기 지지체를 지지하는 프레임을 포함하는 복수개의 세포배양부; 및 상기 복수개의 세포배양부가 적층되어 안착되는 고정바디부와, 상기 고정바디부 상에 서로 간격을 두고 형성된 복수개의 고정바를 포함하는 고정지그;를 포함하고, 상기 프레임에는 복수개의 관통홀이 형성되며, 상기 복수개의 관통홀은 각각 상기 복수개의 고정바에 대응되는 위치에 형성되는, 세포배양용장치를 개시한다.

본 실시예에 있어서 상기 세포배양용장치는, 상기 복수개의 세포배양부 간의 적층 간격을 유지시키는 보조지그;를 하나 이상 더 포함할 수 있다.

본 실시예에 있어서 상기 프레임은 상기 복수개의 세포배양부가 적층되는 방향과 실질적으로 수직인 방향으로 형성된 돌출부를 하나 이상 포함할 수 있다.

본 실시예에 있어서 상기 관통홀의 형상은 상기 고정바의 단면 형상과 실질적으로 동일할 수 있다.

본 실시예에 있어서 상기 복수개의 관통홀은 상기 복수개의 세포배양부가 적층되는 방향으로 상기 프레임을 관통하도록 형성될 수 있다.

본 실시예에 있어서 상기 프레임은 상기 지지체의 측면을 따라 폐루프를 형성할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는 생체재료를 포함하는 다공성 박막일 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성될 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 프레임은 플라스틱, 금속, 세라믹 중 하나 이상의 재질을 포함할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는 양면 세포배양이 가능할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는 양면에 동일세포를 배양하는 방법, 서로 다른 세포를 배양하는 방법 및 양면에 서로 다른 세포를 혼합하여 배양하는 방법 중 어느 하나의 방법으로 세포배양이 가능할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는 전기방사법, 습식방사법, 졸겔법, 용융방사법, 압출방사법, 용매교환법, 스핀코팅법, 직조법, 블로잉(blowing)법 중 어느 하나의 방법으로 제조가능할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체의 표면은 코로나처리, 플라즈마처리, 산 또는 염기처리 중 어느 하나를 이용하여 친수화될 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는 세포부착성 생체활성물질을 함유하거나 표면에 코팅되며, 상기 세포부착성 생체활성물질은 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 라미긴, 아르기닌-글리신-글루탐산의 아미노산을 포함하는 세포부착성 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는 성장인자(gross factor)를 포함하며, 상기 성장인자는 VEGF(Vascular Endothelial Grwth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PDGF(Platelet-Derived Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor), IGF(Insunlin-like Growth Factor), substance P 및 PDX-1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는, 복수개의 관통홀이 형성된 프레임을 포함하는 복수개의 세포배양부 및 복수개의 고정바가 간격을 두고 배치된 고정지그를 이용한 배양방법에 있어서, (a) 상기 프레임에 지지체를 형성하는 단계; (b) 상기 지지체에 세포를 접종하는 단계; (c) 상기 복수개의 고정바에 상기 복수개의 관통홀을 각각 대응시켜 상기 세포배양부를 상기 고정지그에 안착시키는 단계; (d) 상기 (c)단계를 반복하여, 상기 복수개의 세포배양부를 상기 고정지그에 적층시키는 단계; (e) 상기 지지체에 접종된 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (f)상기 적층된 복수개의 세포배양부에서 상기 지지체 및 상기 지지체에 형성된 세포막을 분리시키는 단계;를 포함하는 배양방법을 개시한다.

본 실시예에 있어서, 상기 (c)단계와 (d) 단계 사이에, 보조지그를 이용하여 상기 복수개의 세포배양부의 적층 간격을 유지시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 (e) 단계 이후, 상기 보조지그를 제거하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 상기 프레임에 직접 전기방사하여 상기 지지체를 형성하거나, 외부에서 상기 지지체를 형성한 후, 상기 형성된 지지체를 상기 프레임에 꿰매거나, 초음파, 에폭시, 용매, 열융착 중 어느 하나를 이용하여 상기 프레임에 상기 지지체를 고정할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 지지체는 플라스틱, 금속, 세라믹 중 하나 이상의 재질을 포함할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계는, 일면에 제1 세포를 접종하고 제1 시간 경과 후, 타면에 제2 세포를 접종할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는 동일한 세포 또는 서로 다른 세포의 혼합일 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 (f) 단계는, 펀칭(punching)을 이용하여 상기 지지체 및 상기 지지체에 형성된 세포막을 분리시킬 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 (f) 단계 이후에, 상기 지지체 및 상기 지지체에 형성된 세포막을 다시 배양할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는, 상기 지지체의 표면을 코로나처리, 플라즈마처리, 산 또는 염기처리 중 어느 하나를 이용하여 친수화하는 단계를 포함할 수 있다.

전술한 것 외의 다른 측면, 특징, 이점이 이하의 도면, 특허청구범위 및 발명의 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용장치는 고정지그에 복수개의 세포배양부를 적층시킨 상태에서 세포를 배양시킴으로써, 다층의 3차원 조직을 빠른 시간 내에 제작할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용장치의 정면도이다.
도 2는 도 1에 도시된 지지체의 전자현미경 이미지이다.
도 3은 도 1에 도시된 세포배양부의 평면도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포배양용장치의 정면도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법을 나타낸 도면이다.
도 6은 도 5에 도시된 배양방법의 일 실시예를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법에 의해 형성된 3차원 조직의 예들을 나타낸 도면이다.
도 8은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3차원 조직의 두께를 나타낸 테이블이다.
도 9는 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3차원 조직의 CCK-8 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3겹의 3차원 조직의 시간에 따른 조직구조를 나타낸 이미지이다.
도 11은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3겹의 3차원 조직의 E-Cad 및 VE-Cad의 이미지이다.
도 12는 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 11겹의 3차원 조직의 형태(morphology)를 나타낸 이미지이다.
도 13은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 11겹의 3차원 조직의 조직구조를 나타낸 이미지이다.
도 14는 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 11겹의 3차원 조직의 VE-Cad의 이미지이다.
도 15는 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법을 나타낸 도면이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명의 효과 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하기로 하며, 도면을 참조하여 설명할 때 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

이하의 실시예에서, 제1, 제2 등의 용어는 한정적인 의미가 아니라 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하는 목적으로 사용되었다.

이하의 실시예에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

이하의 실시예에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다.

이하의 실시예에서, 막, 영역, 구성 요소 등의 부분이 다른 부분 위에 또는 상에 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.

도면에서는 설명의 편의를 위하여 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다. 예컨대, 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 임의로 나타내었으므로, 본 발명이 반드시 도시된 바에 한정되지 않는다.

어떤 실시예가 달리 구현 가능한 경우에 특정한 공정 순서는 설명되는 순서와 다르게 수행될 수도 있다. 예를 들어, 연속하여 설명되는 두 공정이 실질적으로 동시에 수행될 수도 있고, 설명되는 순서와 반대의 순서로 진행될 수 있다.

이하의 실시예에서, 막, 영역, 구성 요소 등이 연결되었다고 할 때, 막, 영역, 구성 요소들이 직접적으로 연결된 경우뿐만 아니라 막, 영역, 구성요소들 중간에 다른 막, 영역, 구성 요소들이 개재되어 간접적으로 연결된 경우도 포함한다. 예컨대, 본 명세서에서 막, 영역, 구성 요소 등이 전기적으로 연결되었다고 할 때, 막, 영역, 구성 요소 등이 직접 전기적으로 연결된 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 간접적으로 전기적 연결된 경우도 포함한다.

이하, 도 1 및 도 2를 참고하여 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용장치(10)를 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용장치(10)의 정면도이다. 도 1을 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용장치(10)는 복수개의 세포배양부(100) 및 이를 고정하는 고정지그(200)를 포함할 수 있다.

세포배양부(100)는 세포가 접종되어 배양될 수 있는 하나의 유닛으로서, 복수개의 세포배양부(100)를 고정지그(200)에 적층시킨 상태에서 세포를 배양할 수 있다. 세포배양부(100)는 지지체(110) 및 프레임(130)을 포함할 수 있다.

지지체(110)에는 세포가 접종되고 배양될 수 있으며, 일단면에 세포 배양이 가능할 뿐만 아니라, 일면 및 타면의 양면에도 세포 배양이 가능할 수 있다. 이때, 지지체(110)는 일면에 제1 세포, 일면에 대향되는 타면에 제2 세포를 배양할 수 있다. 제1 세포 및 제2 세포는 서로 다른 세포 또는 동일한 세포일 수 있으며, 서로 다른 세포의 혼합일 수 있다.

도 2는 도 1에 도시된 지지체(110)의 전자현미경 이미지이다. 도 2를 참고하면, 지지체(110)는 생체재료를 포함하는 다공성 박막일 수 있으며, 생체재료는 생분해성 재료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 지지체(110)는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성될 수 있으나, 본 발명에서는 이를 제한하지 않는다.

지지체(110)는 전기방사법, 습식방사법, 졸겔(sol-gel)법, 용융방사법, 압출방사법, 용매교환법, 스핀코팅법, 직조법, 블로잉(blowing)법 등을 이용하여 제조할 수 있다. 지지체(110)는 친수성을 부여하기 위하여, 표면에 코로나처리, 플라즈마처리, 산 또는 염기처리를 할 수 있다. 한편, 지지체(110)는 세포의 부착성을 높이기 위하여, 세포부착성 생체활성물질을 함유하거나 표면에 코팅할 수 있다. 세포부착성 생체활성물질은 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 라미긴, 아르기닌-글리신-글루탐산의 아미노산을 포함하는 세포부착성 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 지지체(110)는 0.01um 내지 1mm의 두께로 이루어질 수 있으며, 일 실시예로서, 1um 내지 100um의 두께를 형성할 수 있다.

지지체(110)는 세포생성, 세포분열, 혈관생성 등을 증진시키는 성성장인자(gross factor)를 포함할 수 있다. 성장인자는 VEGF(Vascular Endothelial Grwth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PDGF(Platelet-Derived Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor), IGF(Insunlin-like Growth Factor), substance P 및 PDX-1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.

프레임(130)은 지지체(110)의 적어도 일측에 연결되어 지지체(110)를 지지할 수 있다. 일 실시예로서, 프레임(130)은 지지체(110)의 측면을 따라 형성되어 폐루프를 이룰 수 있으며, 다른 실시예로서, 프레임(130)은 지지체(110)의 일부 측면에만 형성되어 개방된 형태를 이룰 수 있다. 다만, 이하에서는 설명의 편의를 위하여, 프레임(130)이 지지체(110)의 측면을 따라 형성되어 폐루프를 이루는 경우를 중심으로 설명하기로 한다.

프레임(130)에는 접착체, 용매, 열을 이용하거나, 봉합을 통해 지지체(110)가 고정될 수 있다. 프레임(130)은 세포배양하는 과정에서 부식되거나 용출물이 발생하는 것을 최소화하기 위하여, 플라스틱재질, 금속재질, 세라믹재질 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴레에틸렌(PE), 폴리플루오린화비닐리덴(PVDF), 티타늄, 스테인레스스틸, 알루미나 등의 재질을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 이를 제한하지 않는다. 또한, 프레임(130)은 형틀(mold)를 이용하여 가열, 가압열처리, 진공발포 등의 방법으로 3차원적으로 형성될 수 있다. 한편, 프레임(130)에는 복수개의 관통홀(131)이 형성될 수 있다.

고정지그(200)는 복수개의 세포배양부(100)가 적층되어 안착되는 고정바디부(210)와, 고정바디부(210) 상에 서로 간격을 두고 형성된 복수개의 고정바(230)를 포함할 수 있다. 고정바(230)는 프레임(130)의 관통홀(131)이 통과되어 세포배양부(100)를 정렬하고 고정하는 것으로서, 고정바디부(210)의 외곽부분에 대칭적으로 형성될 수 있다.

이하, 도 3을 참고하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양부(100)를 설명한다.

도 3은 도 1에 도시된 세포배양부(100)의 평면도이다. 도 3을 참고하면, 세포배양부(100)는 원형, 타원형, 다각형 등의 다양한 형태로 형성될 수 있으며, 예를 들면, 도 3의 (a)와 같이 모서리가 곡면으로 이루어진 사각형으로 이루어질 수 있으며, 도 3의 (b)와 같이 원형으로 이루어질 수 있다. 다만, 본 발명에서는 이를 제한하지 않는다.

프레임(130)에는 복수개의 관통홀(131)이 형성될 수 있으며, 복수개의 관통홀(131)은 복수개의 세포배양부(100)가 적층되는 방향으로 프레임(130)을 관통하도록 형성될 수 있다. 복수개의 관통홀(131)은 복수개의 고정바(230)에 대응되는 위치에 형성될 수 있으며, 관통홀(131)의 형상은 고정바(230)의 단면 형상, 구체적으로는 수평 단면 형상과 실질적으로 동일할 수 있다. 일 실시예로서, 고정바(230)는 수평단면이 원형인 봉형태일 수 있으며, 도 3의 (a)와 같이, 사각형의 프레임(130)에는 마주보는 일면과 타면에 각각 2개의 원형 관통홀(131)이 대칭적으로 형성될 수 있다. 다른 실시예로서, 도 3의 (b)와 같이, 원형의 프레임(130)에는 중심을 기준으로 90도의 동일한 각도를 갖는 4개의 원형 관통홀이 형성될 수 있다. 다만, 이하에서는 설명의 편의를 위하여 사각형 프레임(130)에 관통홀(131)이 형성된 경우를 중심으로 설명하기로 한다.

프레임(130)은 적층되는 지지체(110)들 사이의 간격을 유지시키기 위하여 일정한 두께로 형성될 수 있다. 이때, 프레임(130)에는 지지체(110)들이 적층된 공간에 배양액 등의 물질이 잘 전달될 수 있도록, 복수개의 홈(137)이 형성될 수 있다. 홈(137)은 세포배양부(100)의 외부공간과 내부공간을 연통할 수 있으며, 배양액 등의 물질이 내부 공간으로 전달되도록 안내하는 역할을 할 수 있다.

한편, 프레임(130)은 고정지그(200)에 세포배양부(100)의 적층을 용이하기 하기 위해, 복수개의 세포배양부(100)가 고정지그(200)에 적층되는 방향과 실질적으로 수직인 방향으로 형성된 돌출부(135)를 적어도 하나 이상 포함할 수 있다.

전술한 바와 같이, 프레임(130)은 지지체(110)를 지지함과 동시에, 복수개의 고정바(230)를 통과하는 복수개의 관통홀(131)을 이용하여 복수개의 세포배양부(100)를 용이하게 정렬시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용장치(10)는 고정지그(200)에 복수개의 세포배양부(100)를 적층시킨 상태에서 세포를 배양시킴으로써, 다층의 세포막으로 이루어진 3차원 조직을 빠른 시간 내에 제작할 수 있다.

이하, 도 4를 참고하여 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포배양용장치(30)를 설명한다.

도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포배양용장치(30)의 정면도이다. 도 4를 참고하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포배양용장치(30)는 복수개의 세포배양부(300), 고정지그(400) 및 보조지그(500)를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포배양용장치(30)는 보조지그(500)를 제외한 나머지 구성요소는 동일하므로, 중복되는 내용은 생략하기로 한다.

보조지그(500)는 복수개의 세포배양부(300) 간의 적층 간격을 유지시킬 수 있으며, 세포배양용장치(30)는 보조지그(500)를 적어도 하나 이상 포함할 수 있다. 일 실시예로서, 세포배양용장치(30)는 보조지그(500)를 하나 포함하여 복수개의 세포배양부(300) 간의 적층 간격을 유지시킬 수 있다. 다만, 이하에서는 설명의 편의를 위하여, 보조지그(500)가 복수개인 경우를 중심으로 설명하기로 한다.

보조지그(500)는 보조바디부(510)와, 서로 간격을 두고 배치되어 보조바디부(510)에 형성되는 복수개의 보조 암(arm, 530)을 포함할 수 있다. 보조바디부(510) 및 보조암(530)은 세포배양하는 과정에서 부식되거나 용출물이 발생하는 것을 최소화하기 위하여, 플라스틱재질, 금속재질, 세라믹재질 중 어느 하나로 이루어질 수 있다.

복수개의 보조암(530)은 서로 간격을 두고 배치되되, 고정지그(400)에 세포배양부(300)들이 적층되는 방향에 대응하도록 일정 방향으로 간격을 두고 배치될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포배양용장치(30)는 보조지그(500)를 더 구비함으로써, 복수개의 세포배양부(300)들의 사이에 일정한 간격을 유지시킨 채 세포를 배양할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예보다 배양공간이 더 확보됨으로써, 효과적으로 3차원 조직 재생을 위한 세포배양을 할 수 있다는 장점을 갖는다.

이하, 도 5를 참고하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양용장치(10)를 이용한 배양방법에 대하여 설명한다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법을 나타낸 도면이다. 도 5를 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법은 복수개의 관통홀(131)이 형성된 프레임(130)을 포함하는 복수개의 세포배양부(100)와, 복수개의 고정바(230)가 간격을 두고 배치된 고정지그(200)를 이용할 수 있다.

우선, 도 5의 (a)를 참고하면, 배양방법은 전술한 프레임(130)에 지지체(110)를 형성할 수 있다. 프레임(130)은 회전하는 원통면에 고정되며, 지지체(110)는 전기방사장치(1)를 이용하여 프레임(130)에 직접 고분자 용액을 전기방사(electrospinning)함으로써 형성될 수 있다. 이때, 지지체(110)를 두 가지 이상의 생체재료를 이용하여 방사하는 경우, 서로 다른 생체재료를 각각 단독 노즐을 통하여 동시에 방사하거나, 서로 다른 생체재료를 혼합하여 하나의 노즐을 통해 방사할 수 있다.

프레임(130)에 지지체(110)를 형성하는 다른 실시예로서, 외부에서 지지체(110)를 전기방사법, 습식방사법, 졸겔(sol-gel)법, 용융방사법, 압출방사법, 용매교환법, 스핀코팅법, 직조법, 블로잉(blowing)법 등을 이용하여 제조한 후, 전술한 방법으로 형성된 지지체(110)를 프레임(130)에 꿰매거나, 초음파, 에폭시, 용매, 열융착 등을 이용하여 프레임(130)에 고정할 수 있다. 본 발명에서는 지지체(110)를 형성하는 방법에 제한이 없으나, 설명의 편의를 위하여, 프레임(130)에 직접 전기방사하여 지지체(110)를 형성하는 경우를 중심으로 설명하기로 한다.

지지체(110)는 생체재료를 포함하는 다공성 박막일 수 있다. 지지체(110)는 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성될 수 있으나, 본 발명에서는 이를 제한하지 않는다. 한편, 지지체(110)는 친수성을 부여하기 위하여, 표면에 코로나처리, 플라즈마처리, 산 또는 염기처리를 할 수 있다.

다음, 도 5의 (b)를 참고하면, 배양방법은 지지체(110)에 세포(C)를 접종할 수 있다. 지지체(110)에는 하나의 세포 종류로만 접종되거나, 서로 다른 종류의 세포로 접종되어 순서에 따라 적층될 수 있다. 지지체(110)는 양면에 세포배양이 가능할 수 있다. 지지체(110)는 일면에 제1 세포, 일면에 대향되는 타면에 제2 세포를 배양할 수 있다. 제1 세포 및 제2 세포는 서로 다른 세포 또는 동일한 세포일 수 있으며, 서로 다른 세포의 혼합일 수 있다.

다음, 도 5의 (c)를 참고하면, 배양방법은 복수개의 고정바(230)에 복수개의 관통홀(131)을 각각 대응시켜 세포배양부(100)를 고정지그(200)에 안착시킬 수 있다. 이후, 배양방법은 동일한 방법을 반복하여, 복수개의 세포배양부(100)들을 고정지그(200)에 적층시킬 수 있다.

다음, 배양방법은 세포배양부(100)들을 적층시킨 상태에서 지지체(110)에 접종된 세포를 배양시킬 수 있다. 이때, 세포 배양은 생체 내부 조건과 유사한 환경 하에서 진행될 수 있다.

다음, 도 5의 (d)를 참고하면, 배양방법은 적층된 복수개의 세포배양부(100)에서 지지체(110)와, 세포배양에 의해 지지체(110)에 형성된 세포막을 함께 분리시킬 수 있다. 이때, 배양방법은 고정지그(200)에 세포배양부(100)가 고정된 상태에서 지지체(110)들이 적층되어 있는 영역을 펀칭(punching)하는 것으로, 전술한 지지체(110)와, 지지체(110)에 형성된 세포막을 분리시킬 수 있다. 분리된 세포막은 지지체(110)들의 적층으로 인해, 3차원 조직(A)을 형성할 수 있다. 배양방법은 3차원 조직(A)을 생체 내부 조건과 유사한 환경을 제공하는 세포배양기에서 다시 배양할 수 있다.

도 6은 도 5에 도시된 세포배양용장치(10)를 이용한 배양방법의 일 실시예를 나타낸 사진이다. 도 6을 참고하면, (a)는 관통홀(131)이 형성된 프레임(130)을 나타내며, (b)는 세포가 접종된 지지체(110)를 포함하는 세포배양부(100)를 배양액에서 배양하는 상태를 나타낸다. 또한, (c)는 고정지그(200)에 세포배양부(100)들이 적층된 상태를 나타며, (d)는 펀칭(punching)에 의해 분리된 3차원 조직(A)을 다시 배양하는 상태를 나타낸다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법에 의해 형성된 3차원 조직의 예들을 나타낸 도면이다. 도 7을 참고하면, (a)는 폴리카프로락토(이하, PCL)만으로 이루어진 3겹의 세포막으로 이루어진 조직이며, (b)는 콜라겐만으로 이루어진 3겹의 조직이다. 또한, (c), (d), (e) 및 (f)는 11겹의 세포막으로 이루어진 조직으로써, (c)는 PCL, (d)는 섬유아세포(PF), (e)는 2 대 1 비율의 섬유아세포 및 혈관내피세포, (f)는 4 대 1 비율의 섬유아세포 및 혈관내피세포를 나타낸다. 다만, 이는 예시일 뿐이며, 본 발명에서는 이를 제한하지 않는다.

도 8은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3차원 조직의 두께를 나타낸 테이블이다. 도 8을 참고하면, (a)는 3겹의 3차원 조직의 두께를 나타낸 것이며, (b)는 11겹의 3차원 조직 두께를 나타낸 것으로서, 적층되는 레이어(layer) 수에 따라 두께가 비례함을 알 수 있다.

도 9는 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3차원 조직의 CCK-8 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 10은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3겹의 3차원 조직의 시간에 따른 조직구조를 나타낸 이미지이다. 도 11은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 3겹의 3차원 조직의 E-Cad 및 VE-Cad의 이미지이다. 도 9 내지 도 11을 참고하면, 시간이 경과(1주, 2주, 4주)함에 따라 조직의 성장 경과를 알 수 있으며, PCL만으로 적층된 조직보다 PCL과 콜라겐(collagen)으로 적층된 조직의 세포 증식이 더 활발함을 알 수 있다.

도 12는 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 11겹의 3차원 조직의 형태(morphology)를 나타낸 이미지이다. 도 12의 (a)는 3차원 조직들이 형성된 지 하루 경과 후 조직 형태를 나타낸 이미지이며, 도 12의 (b)는 PF, 4 대 1 비율의 섬유아세포 및 혈관내피세포, 2 대 1 비율의 섬유아세포 및 혈관내피세포로 이루어지는 3차원 조직들이 형성된 지 일주일 경과 후 각각의 조직형태를 나타낸 이미지이다. 도 13은 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 11겹의 3차원 조직의 조직구조를 나타낸 이미지이다. 도 14는 도 5에 도시된 배양방법에 의해 형성된 11겹의 3차원 조직의 VE-Cad의 이미지이다. 도 12 내지 도 14를 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법에 의해 형성된 11겹의 3차원 조직 중 도 7에 도시된 적층예들의 조직 형성 정도를 비교할 수 있다. 조직 형성 정도는 적층예들에 따라 다르지만, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법에 의해 3차원 조직이 형성된 3차원 조직들은 공통적으로 중간층의 괴사없이 조직이 잘 형성되어 있음을 알 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양방법은 적층되는 세포막 사이의 공간이 확보되므로, 적층되는 세포막의 수가 증가하더라도 세포배양이 효과적으로 이루어질 수 있고, 이에 따라 조직이 잘 형성될 수 있다는 장점을 갖는다.

이하, 도 15를 참고하여 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법을 설명한다.

도 15는 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법을 나타낸 도면이다. 도 15를 참고하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법은 복수개의 관통홀(331)이 형성된 프레임(330)을 포함하는 복수개의 세포배양부(300)와, 복수개의 고정바(430)가 간격을 두고 배치된 고정지그(400)를 이용할 수 있으며, 세포배양부(300)들의 적층간격을 유지시킬 수 있는 보조지그(500)를 더 이용할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법은 보조지그(500)를 이용하는 단계 외에 일 실시예의 배양방법과 동일하므로, 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

우선, 도 15의 (a)를 참고하면, 배양방법은 전술한 프레임(330)에 지지체(310)를 형성할 수 있다. 다음, 도 15의 (b)를 참고하면, 배양방법은 지지체(310)에 세포(C)를 접종할 수 있다. 다음, 도 15의 (c)를 참고하면, 배양방법은 복수개의 고정바(430)에 복수개의 관통홀(331)을 각각 대응시켜 세포배양부(300)를 고정지그(400)에 안착시킬 수 있다.

이때, 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법은 보조지그(500)를 이용하여 복수개의 세포배양부들의 적층 간격을 유지시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법은 일 실시예에 비해 세포배양부(300)들의 적층 간격을 더 크게 유지시킴으로써, 세포들의 배양환경을 더 적절히 유지시킬 수 있다는 장점을 갖게 된다. 이후, 배양방법은 동일한 방법을 반복하여, 복수개의 세포배양부(300)들을 고정지그(400)에 적층시킬 수 있다.

다음, 배양방법은 세포배양부(300)들을 적층시킨 상태에서 지지체(310)에 접종된 세포를 배양시킬 수 있다. 이후, 배양방법은 보조지그(500)를 제거하여 적층된 세포배양부(300)들이 가까워지도록 할 수 있다. 이를 통해, 배양된 세포들이 유기적으로 결합함으로써, 조직을 형성할 수 있게 된다.

다음, 도 15의 (d)를 참고하면, 배양방법은 적층된 복수개의 세포배양부(300)에서 지지체(310)와, 지지체(310)에 형성된 세포막을 함께 분리시킬 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 다른 실시예에 따른 배양방법은 일 실시예에 비해 세포배양부(300)들의 적층 간격을 더 크게 유지시킴으로써, 다층의 3차원 조직을 효과적으로 형성할 수 있다.

이와 같이 본 발명은 도면에 도시된 일 실시예를 참고로 하여 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 실시예의 변형이 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

1 : 전기방사장치
10, 30 : 세포배양용장치
100, 300 : 세포배양부
110, 310 : 지지체
130, 330 : 프레임
131, 331 : 관통홀
135 : 돌출부
137 : 홈
200, 400 : 고정지그
210, 410 : 고정바디부
230, 430 : 고정바
500 : 보조지그
510 : 보조바디부
530 : 보조암

Claims

지지체 및 상기 지지체의 적어도 일측에 연결되어 상기 지지체를 지지하는 프레임을 포함하는 복수개의 세포배양부; 및
상기 복수개의 세포배양부가 적층되어 안착되는 고정바디부와, 상기 고정바디부 상에 서로 간격을 두고 형성된 복수개의 고정바를 포함하는 고정지그;를 포함하고,
상기 프레임에는 복수개의 관통홀이 형성되며, 상기 복수개의 관통홀은 각각 상기 복수개의 고정바에 대응되는 위치에 형성되는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 복수개의 세포배양부 간의 적층 간격을 유지시키는 보조지그;를 하나 이상 더 포함하는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 프레임은 상기 복수개의 세포배양부가 적층되는 방향과 실질적으로 수직인 방향으로 형성된 돌출부를 하나 이상 포함하는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 관통홀의 형상은 상기 고정바의 단면 형상과 실질적으로 동일한, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 복수개의 관통홀은 상기 복수개의 세포배양부가 적층되는 방향으로 상기 프레임을 관통하도록 형성되는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 프레임은 상기 지지체의 측면을 따라 폐루프를 형성하는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 지지체는 생체재료를 포함하는 다공성 박막인, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 지지체는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 프레임은 플라스틱, 금속, 세라믹 중 하나 이상의 재질을 포함하는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 지지체는 양면 세포배양이 가능한, 세포배양용장치.
제 10항에 있어서,
상기 지지체는 양면에 동일세포를 배양하는 방법, 서로 다른 세포를 배양하는 방법 및 양면에 서로 다른 세포를 혼합하여 배양하는 방법 중 어느 하나의 방법으로 세포배양이 가능한, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 지지체는 전기방사법, 습식방사법, 졸겔법, 용융방사법, 압출방사법, 용매교환법, 스핀코팅법, 직조법, 블로잉(blowing)법 중 어느 하나의 방법으로 제조가능한, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 지지체의 표면은 코로나처리, 플라즈마처리, 산 또는 염기처리 중 어느 하나를 이용하여 친수화되는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 지지체는 세포부착성 생체활성물질을 함유하거나 표면에 코팅되며,
상기 세포부착성 생체활성물질은 콜라겐, 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 라미긴, 아르기닌-글리신-글루탐산의 아미노산을 포함하는 세포부착성 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세포배양용장치.
제 1항에 있어서,
상기 지지체는 성장인자(gross factor)를 포함하며,
상기 성장인자는 VEGF(Vascular Endothelial Grwth Factor), HGF(Hepatocyte Growth Factor), PDGF(Platelet-Derived Growth Factor), FGF(Fibroblast Growth Factor), IGF(Insunlin-like Growth Factor), substance P 및 PDX-1으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는, 세포배양용장치.
복수개의 관통홀이 형성된 프레임을 포함하는 복수개의 세포배양부 및 복수개의 고정바가 간격을 두고 배치된 고정지그를 이용한 배양방법에 있어서,
(a) 상기 프레임에 지지체를 형성하는 단계;
(b) 상기 지지체에 세포를 접종하는 단계;
(c) 상기 복수개의 고정바에 상기 복수개의 관통홀을 각각 대응시켜 상기 세포배양부를 상기 고정지그에 안착시키는 단계;
(d) 상기 (c)단계를 반복하여, 상기 복수개의 세포배양부를 상기 고정지그에 적층시키는 단계;
(e) 상기 지지체에 접종된 상기 세포를 배양하는 단계; 및
(f) 상기 적층된 복수개의 세포배양부에서 상기 지지체 및 상기 지지체에 형성된 세포막을 분리시키는 단계;
를 포함하는, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 (c)단계와 (d) 단계 사이에, 보조지그를 이용하여 상기 복수개의 세포배양부의 적층 간격을 유지시키는 단계;를 더 포함하는, 배양방법.
제 17항에 있어서
상기 (e) 단계 이후, 상기 보조지그를 제거하는 단계;를 더 포함하는, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 (a)단계는 상기 프레임에 직접 전기방사하여 상기 지지체를 형성하거나,
외부에서 상기 지지체를 형성한 후, 상기 형성된 지지체를 상기 프레임에 꿰매거나, 초음파, 에폭시, 용매, 열융착 중 어느 하나를 이용하여 상기 프레임에 상기 지지체를 고정하는, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 지지체는 생체재료를 포함하는 다공성 박막인, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 지지체는, 키토산, 엘라스틴, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리[(락틱-co-(글리콜산))(PLGA), 폴리[(3-하이드록시부티레이트)-co-(3-하이드록시발러레이트)(PHBV), 폴리다이옥산온(PDO), 폴리[(L-락타이드)-co-(카프로락톤)], 폴리(에스테르우레탄)(PEUU), 폴리[(L-락타이드)-co-(D-락타이드)], 폴리[에틸렌-co-(비닐 알코올)](PVOH), 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리스티렌(PS) 및 폴리아닐린(PAN)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체적합성 고분자, 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물로 형성되는, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 지지체는 플라스틱, 금속, 세라믹 중 하나 이상의 재질을 포함하는, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 지지체는 양면 세포배양이 가능한, 배양방법.
제 23항에 있어서,
상기 (b) 단계는, 일면에 제1 세포를 접종하고 제1 시간 경과 후, 타면에 제2 세포를 접종하는, 배양방법.
제 24항에 있어서,
상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는 동일한 세포 또는 서로 다른 세포의 혼합인, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 (f) 단계는, 펀칭(punching)을 이용하여 상기 지지체 및 상기 지지체에 형성된 세포막을 분리시키는, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 (f) 단계 이후에, 상기 지지체 및 상기 지지체에 형성된 세포막을 다시 배양하는 단계;를 더 포함하는, 배양방법.
제 16항에 있어서,
상기 (a) 단계는, 상기 지지체의 표면을 코로나처리, 플라즈마처리, 산 또는 염기처리 중 어느 하나를 이용하여 친수화하는 단계를 포함하는, 배양방법.