KR20210039549A - 3d 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파이버의 직경을 기준으로 그 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지는 낙엽 적층형 다공성 구조를 가지며, 상기 깊이로부터 중심까지는 비다공성 구조를 가지는 각각의 파이버들이 격자 형태로 적층되어 이루어진 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체와 이의 제조방법, 및 상기 낙엽적층구조를 가지는 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체에 세포와 생리활성인자를 탑재시킨 3D 프린팅 다공성 인공지지체에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 낙엽적층구조를 가지는 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체 표면이 세포가 점착하기 쉬운 구조로 인하여 세포 부착이 용이하여 세포 전달체 역할이 가능하며, 또한 낙엽적층구조의 독특한 구조는 어떠한 화학적 처리 없이 생리활성인자의 탑재 및 탑재된 생리활성인자의 서방형 방출이 가능하다. 상기 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체는 세포 전달체 역할이 가능하며 상기 지지체에 탑재된 생리활성인자는 서방형 방출되어 손상된 부위에서 세포의 분화 및 재생을 촉진하는 효과를 가진다.

Description

3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체 및 이의 제조방법{Porous polymer scaffold using 3D printing and method for preparing thereof}
본 발명은 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 3D 프린팅으로 제조된 인공 지지체를 간단한 방법으로 처리하여 낙엽이 적층된 것과 같은 다공성 구조를 갖도록 하고, 상기 다공성 구조에 다양한 세포와 생리활성인자를 탑재시켜 서방형 방출이 가능하도록 한 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체와 이의 제조방법에 관한 것이다.
현대 사회의 산업화와 고령화로 인해 의료기술이 발달하면서 다양한 질병과 사고에 대한 치료가 가능하지만, 여전히 한계점이 존재한다. 특히 손상된 조직이나 기능을 상실한 장기의 치료와 대체가 부족한 상황이다. 따라서 초고령화 사회와 수명연장 가속화가 진행됨에 따라 손상된 조직과 기능을 상실한 장기의 치료를 위한 연구가 현재 활발히 진행되고 있다.
손상된 조직과 장기를 치료하고 재생하기 위해서는 세포를 주입하여 치료하는 방법, 인공 지지체를 이식하여 치료하는 방법, 인공 지지체에 세포를 부착하거나 생리활성인자를 탑재하여 함께 이식하는 방법 등이 연구되고 활용되고 있다.
특히 조직공학에서 가장 주목받고 있는 것은 세포 배양의 효율을 높이고 생리활성인자 탑재 및 구조적 성능을 높여 더욱 효과적으로 인체 조직과 유사한 장기를 구현할 수 있는 인공 지지체이다.
최근 3D 프린팅 기술이 발달하면서 단순한 제품 모형 제작뿐 아니라 적극적으로 조직공학 분야에도 도입되어 사용되고 있다. 이는 면역 거부반응을 최소화 할 수 있는 개인 맞춤형 인공장기나 조직 등의 인공 지지체 제작에 혁신을 가져왔으며, 새로운 가능성으로 주목받고 있다.
현재 3D 프린팅 기술을 조직공학 분야에 효과적으로 도입시키기 위한 기술 개발이 활발히 진행중이며 기존 기술과 융합하여 다양한 분야에서 시도되고 있다. 더 나아가 3D 프린팅으로 제조된 인공 지지체에 생체기능성을 향상시킬 수 있는 재료 차원의 기능 향상; 세포의 부착과 증식 및 분화; 또는 생리활성인자의 탑재와 방출이 가능한 다공성 구조를 가지는 3D 프린팅 지지체의 제조 등 미세 구조적 기능 향상을 위한 연구 또한 활발히 진행되고 있다.
3D 프린팅 인공 지지체에 다공성 구조를 구현하는 방법으로는 고분자 용액에서 고분자 입자만을 녹여내 고분자 입자가 있던 자리에 공극을 형성시키거나; 상분리, 가스 발포 등을 이용하여 공극 공간을 비워내는 방법; 또는 미세 단위 구조물을 부착시키거나 첨가하는 등을 사용하는데 이러한 방법들은 그 과정이 매우 복잡하다는 문제가 있다.
생리활성인자의 탑재 역시 적층 제조기술과 온도 감응성 고분자를 이용하는 등 다양한 종류의 약물 전달 시스템들이 개발되고 있지만, 장기간 방출 조절이 어려우며 독성이 있는 화학물질을 사용하지 않은 시스템의 개발 사례는 매우 적다.
이처럼 3D 프린팅 기술을 이용한 인공 지지체 제작 방법에 대해 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 아직까지는 상기 문제점을 해결하기는 어려운 상황이다. 따라서 이러한 한계점을 극복할 수 있는 간단한 제조공정을 가지며 기능향상이 가능한 제조방법이 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-1772861호 한국특허출원 제2017-0071744호
Kim et al, "Release of BMP-2 from Porous Particles with Leaf-stacked Structure for Bone Regeneration"ACS Applied materials & interfaces, 10(25), 21091-21102, (2018)
이에 본 발명은 종래 3D 프린팅으로 제조된 인공 지지체에 생체기능성을 부여하여 재료 차원의 기능 향상은 물론, 세포의 부착과 증식/분화, 및 생리활성인자의 탑재와 방출이 가능하도록 3D 프린팅을 이용하여 제조된 인공 지지체에 낙엽적층 구조의 다공성을 부여한 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체를 제조하는 데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 3D 프린팅을 이용하여 제조된 인공 지지체를 매우 간단한 처리 과정을 거쳐 원하는 다공성을 가지도록 한 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 제조방법을 제공하는 데도 있다.
또한, 본 발명의 추가의 목적은 상기 제조된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체의 낙엽적층구조에 형성된 다수의 다공들에 세포를 부착시킨 고분자 인공 지지체와 이의 제조방법을 제공하는 데도 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조된 다공성 고분자 인공 지지체의 낙엽적층구조에 형성된 다수의 다공들에 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체와 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명은 상기 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체를 골 조직, 연골 조직, 간 조직, 치아 조직, 침샘 조직, 부갑상선 조직 중에서 선택되는 어느 하나의 조직의 재생에 사용하는 용도를 제공할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체는 파이버의 직경을 기준으로 그 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지는 낙엽 적층형 다공성 구조를 가지며, 상기 깊이로부터 중심까지는 비다공성 구조를 가지는 각각의 파이버들이 격자 형태로 적층되어 이루어진 것을 그 특징으로 한다.
상기 다공성 고분자 인공 지지체에 사용되는 고분자는 분자량 1,000 ～ 1,000,000 g/mol인 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 공중합체(polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester)) 중에서 선택되는 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 단독 또는 2 종 이상 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 낙엽적층형 다공성 구조에 세포를 부착시킨 것을 특징으로 하는 세포가 부착된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체를 제공한다.
상기 낙엽적층형 다공성 구조에 부착되는 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 및 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 세포의 부착은 상기 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 가로*세로*높이가 4000*4000*4000㎛인 규격을 기준으로 1x103 내지 1x107 범위의 세포를 분주시켜 이용하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 낙엽적층형 다공성 구조에 생리활성인자를 탑재시킨 것을 특징으로 하는 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체를 제공한다.
상기 생리활성인자는 사이토카인, 호르몬, 인슐린, 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드/단백질; fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자; 유전자; 및 백신 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 탑재된 생리활성인자는 상기 다공성 고분자 인공 지지체로부터 서방형 방출되는 것을 특징으로 한다.
상기 생리활성인자는 상기 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체를 구성하는 각 파이버의 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지의 낙엽 적층형 다공성 구조에 탑재된 생리활성인자가 상기 낙엽적층형 다공성 구조를 통과하여 빠져나올 때, 상기 낙엽적층형 다공성 구조에 탈착과 흡착이 반복되면서 서방형 방출되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 생리활성인자는 탑재된 상기 인공 지지체로부터 서방형 방출되어, 세포의 분화 및 조직의 재생을 가속화시키는 데 특징이 있다.
추가로 본 발명의 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 제조방법은 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 용융시키고, 3D 프린터를 이용하여 압출된 파이버들을 적층시켜 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 제조하는 단계, 상기 제조된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 인체에 무해한 용매에서 열처리시켜 상기 파이버들의 표면 일부를 용해시키는 단계, 및 상기 열처리된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 냉각시켜 상기 각 파이버들의 용해된 부분이 수많은 낙엽이 적층되어 쌓여 있는 것과 같은 낙엽적층형 다공성 구조로 변환되는 단계를 포함하는 것을 그 특징으로 한다.
상기 인체에 무해한 용매는 테트라글리콜 (Tetraglycol), 1-메틸-2-피롤리디논 (1-methyl-2-Pyrrolidinone (NMP)), 트리아세틴 (triacetin), 벤질 알콜 (benzyl alcohol), 디메틸아세타메이트 (N,N Dimethyl Acetamide) 중에서 선택되는 1종 혹은 2 종 이상의 혼합물이 바람직하다.
상기 열처리는 용매의 온도 30~150℃에서 1초~5시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체를 골 조직, 연골 조직, 간 조직, 치아 조직, 침샘 조직, 부갑상선 조직 중에서 선택되는 어느 하나의 조직의 재생에 사용할 수 있다.
본 발명에 따르면, 3D 프린팅 기술로 제조한 인공 지지체를 매우 간단한 방법으로 처리하여 상기 인공 지지체를 구성하는 각각의 파이버의 표면과 일정 깊이까지 낙엽이 적층되어 있는 것과 같은 미세 다공 구조를 도입한 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체를 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면, 다양한 크기와 모양을 가지는 3D 프린팅 인공 지지체에도 상기 방법과 동일하게 낙엽적층구조를 도입하여 제조 및 응용이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 상기 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체는 도입된 낙엽적층구조로 인하여 인공 지지체 재료의 다공성이 크게 증가되어 세포 부착이 용이하고 세포의 증식과 분화가 가능하다. 또한, 독특한 낙엽적층구조로 인하여 추가의 표면처리나, 화학물질의 처리 없이 매우 간단한 방법으로 생리활성인자의 탑재가 가능하고 또한, 상기 탑재된 생리활성인자는 적정농도 이상으로 일정 기간 동안 서방형 방출이 가능하다.
따라서, 본 발명에 따른 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체 제조기술은 종래의 인공 지지체와 3D 프린팅을 이용하여 제조된 인공지지체의 한계점을 뛰어넘고 조직 재생을 위한 다양한 바이오 분야에서 새로운 개념의 인공 지지체로서 매우 유용하게 사용될 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 실시예 1의 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 제조과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1의 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 형태와 표면을 나타낸 주사전자현미경사진이다.
도 3은 대조군 1의 낙엽적층구조가 도입되지 않은 3D 프린팅 인공 지지체의 형태와 표면을 나타낸 주사전자현미경사진이다.
도 4는 실시예 1의 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체와 대조군 1의 낙엽적층구조가 도입되지 않은 3D 프린팅 인공 지지체의 파이버 직경을 비교한 SEM 단면 사진이다.
도 5는 20℃에서 열처리 시간을 각각 1초(A), 1분(B), 6시간(C) 동안 변화시키면서 제조된 비교예 1에 따른 3D 프린팅 인공 지지체의 구조를 확인한 주사전자현미경사진이다.
도 6은 실시예 1과 대조군 1에 따라 제조된 3D 프린팅 인공 지지체의 압축강도 측정 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1과 대조군 1 에서 제조된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에 세포 현탁액 분주 및 세포 부착 과정을 나타낸 그림이다.
도 8과 9는 각각 실시예 2와 대조군 2에 따라 제조된 인공 지지체에 세포의 부착 여부를 확인한 주사전자현미경 (SEM) 사진이다.
도 10은 실시예 2와 대조군 2에 따라 제조된 인공 지지체의 표면 및 내부에 부착된 세포의 생존율과 증식율을 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay를 통해 정량화한 그래프이다 (**P<0.01).
도 11은 실시예 3과 대조군 3에 따라 제조된 각 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체로부터 BMP-2 방출 거동 (누적)을 나타낸 그래프이다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는 (comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
본 발명은 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체와 이의 제조방법, 상기 다공성 고분자 인공 지지체에 세포와 다양한 생리활성인자를 부착시킨 다공성 고분자 인공 지지체와 이를 다양한 용도에 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명에 따른 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체는 파이버의 직경을 기준으로 그 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지는 낙엽 적층형 다공성 구조를 가지며, 상기 깊이로부터 중심까지는 비다공성 구조를 가지는 각각의 파이버들이 격자 형태로 적층되어 이루어진 것을 그 특징으로 한다.
즉, 본 발명은 3D 프린팅 기법을 이용하여 인공 지지체를 제조하고, 상기 인공 지지체를 간단하게 처리하여 인공지지체를 구성하는 각각의 파이버들이 그 표면과 일정 깊이에까지만 다수의 다공들이 포함된 낙엽적층 구조를 가지도록 한 것이다.
본 발명에서 ‘인공지지체의 표면과 일정 깊이까지만 다수의 다공들이 포함된다’라는 의미는 파이버의 직경을 기준으로 그 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지 낙엽 적층형 다공성 구조를 가진다는 것이다.
또한, 파이버의 직경을 기준으로 상기 다공성 구조를 가지는 일정 깊이로부터 파이버의 중심까지는 비다공성 구조를 가지는 것이다.
이는 본 발명에서 3D 프린팅으로 제조된 다공성 구조의 인공지지체를 구성하는 각 파이버들이 내부 전체에까지 다공성 구조를 가지게 되면 이들로 구성된 인공지지체의 물성이 저하되어 차후 소정의 용도로 사용될 때 제약이 따를 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 적절한 다공성을 가지면서 3D 인공지지체의 물성을 함께 유지할 수 있도록 최종 제조된 인공지지체에서 그 다공성 구조를 조절한 데 특징이 있다.
또한, 상기 깊이는 원하는 용도에 따라 조정하여 사용할 수 있으며, 다공성 구조를 가지는 깊이가 깊어질수록 차후 세포나 생리활성인자들을 부착시키는 데는 유리한 구조를 가짐은 당업자에게 자명하다 할 수 있다.
이러한 본 발명의 인공 지지체에 사용되는 재료는 분자량 1,000~1,000,000 g/mol인 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 공중합체(polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester)) 중에서 선택되는 생체적합성과 생분해성 고분자를 단독 또는 2 종 이상 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 인공 지지체에 다공성을 부여하여 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체의 제조방법은 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 용융시키고, 3D 프린터를 이용하여 압출된 파이버들을 적층시켜 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 제조하는 단계, 상기 제조된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 인체에 무해한 용매에서 열처리시켜 상기 파이버들의 표면 일부를 용해시키는 단계, 및 상기 열처리된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 냉각시켜 상기 각 파이버들의 용해된 부분이 수많은 낙엽이 적층되어 쌓여 있는 것과 같은 낙엽적층형 다공성 구조로 변환시키는 단계를 거쳐 이루어질 수 있다.
첫 번째 단계는 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 용융시키고, 3D 프린터를 이용하여 압출된 파이버들을 적층시켜 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 제조한다.
상기 3D 프린팅 고분자 인공 지지체의 규격은 압출된 파이버를 격자 모양으로 일정한 높이로 쌓아올려(적층) 제조할 수 있으며, 그 크기는 소정의 용도에 따라 적절히 조절될 수 있다.
두 번째 단계는, 상기 제조된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 인체에 무해한 용매에서 열처리시켜 상기 파이버들의 표면 일부를 용해시키는 과정을 거친다. 여기서 상기 ‘파이버들의 표면 일부’라는 것은 파이버의 직경을 기준으로 그 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지를 의미한다.
상기 열처리 과정은 인공지지체를 구성하는 파이버들의 표면과 일부 깊이까지 용해시키는 과정으로서, 용매 온도 30~150℃에서 1초~5시간 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 열처리 온도가 30℃ 미만인 경우 본 발명에서 인공지지체 제조에 사용된 상기 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자가 용해되지 않을 수 있고, 또한 150℃를 초과하는 경우 제조에 사용된 상기 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자가 모두 용해되는 문제가 있을 수 있어 바람직하지 못하다.
또한, 적절한 깊이까지 용해시키기 위하여 열처리 시간도 1초~5시간의 범위 내에서 적절히 수행하는 것이 바람직하다.
상기 인체에 무해한 용매는 테트라글리콜 (Tetraglycol), 1-메틸-2-피롤리디논 (1-methyl-2-Pyrrolidinone (NMP)), 트리아세틴 (triacetin), 벤질 알콜 (benzyl alcohol), 디메틸아세타메이트 (N,N Dimethyl Acetamide) 중에서 선택되는 1종 혹은 2 종 이상의 혼합물이 바람직하게 사용될 수 있다.
마지막 제3단계는 상기 열처리된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 냉각시켜 상기 각 파이버들의 용해된 부분이 수많은 낙엽이 적층되어 쌓여 있는 것과 같은 낙엽적층형 다공성 구조로 변환시키는 과정을 거친다.
본 발명 출원인의 기 등록특허인 특허문헌 1(한국등록특허 제10-1772861호)에 따르면, 상기 생체적합성과 생분해성 고분자를 인체에 무해한 용매에 녹인 다음 이중분사노즐장치를 이용하여 표면 및 내부 전반에 걸쳐 다수의 다공들을 포함하는 낙엽적층구조의 고분자 미세입자를 제조할 수 있었다.
그러나, 본 발명에서는 상기 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 3D 프린팅법으로 제조한 인공 지지체를 이용하는 것인 만큼, 인공지지체의 물성 확보와 장기적인 내구성 확보를 위해 종래 특허문헌 1과 같이 미세입자에서 표면 및 내부 전체에 형성시켰던 다공 구조를 인공지지체 표면에만 형성되도록 한 데 특징이 있다.
이를 위해 본 발명에서는 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 이용하여 3D 프린팅으로 인공 지지체를 제조하고, 상기 고분자를 용해시킬 수 있는 각 용매에 이를 침지시킨 다음 각 용매의 온도를 일시적으로 높였다가 다시 냉각시키는 방법을 이용한다. 여기서, 상기 용매의 온도는 각 고분자를 용해시킬 수 있는 온도를 의미하여, 일시적으로 용매의 온도를 높이게 되면 상기 인공지지체를 구성하는 파이버들의 외표면과 일정 깊이까지 일부분만 용매에 녹게 되고, 상기 용매의 온도를 다시 낮추어 이를 냉각시키면, 녹았던 파이버의 외표면과 일정 깊이까지만 상기 특허문헌 1과 같은 다수의 낙엽들이 적층된 것과 같은 다공성 구조로 바뀌는 원리이다.
상기 냉각 과정은 상온에서 이루어질 수 있으며, 사용되는 용매와 온도에 따라 적절히 조절될 수 있다.
결과적으로, 본 발명에 따른 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체는 3D 프린팅으로 압출된 재료에 별도의 간단한 열처리 과정만으로 낙엽적층형 다공성 구조를 도입시킬 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명에 따른 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체는 그 표면과 일정 깊이에만 낙엽적층형 다공성 구조를 가지므로, 별도의 표면처리나 첨가제의 없이도 다양한 성분들을 부착시킬 수 있는 효과를 가진다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제조된 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체의 낙엽적층형 다공성 구조에 세포를 부착시킨 것을 특징으로 하는 세포가 부착된 구조의 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체를 제공할 수 있다.
상기 낙엽적층구조에 부착 가능한 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 및 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않고 소정의 효과를 위하여 다양한 다른 세포의 부착도 가능함은 당업자들에게 자명하다.
상기 나열된 세포들의 부착 방법은 상기 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체의 가로 * 세로 * 높이가 4000 * 4000 * 4000 ㎛인 규격을 기준으로 1x103 내지 1x107 범위의 세포를 분주시켜 이용할 수 있으나, 소정의 용도에 따라 인공지지체 규격을 조절할 수 있음은 물론이다.
본 발명과 같이 제조된 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체는 그 표면과 일정 깊이까지 형성된 독특한 낙엽적층의 다공성 구조로 인해 효과적으로 세포들을 부착시킬 수 있다.
또한, 이렇게 부착된 세포들은 다공성 구조의 인공 지지체에서 증식되고, 이로로부터 장기간 지속적인 서방형으로 방출되어 상기 세포들이 가진 역할들을 지속적으로 수행할 수 있도록 분화되는 효과를 가지므로 다양한 세포 전달체 역할이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체의 낙엽적층형 다공성 구조에 형성된 다수의 다공들에 생리활성인자를 탑재시킨 것을 특징으로 하는 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체를 제공할 수 있다.
본 발명에서는 3D 프린팅 인공 지지체 표면에 형성된 독특한 낙엽이 적층된 것과 같은 다공성 구조로 인해 어떠한 화학물질의 처리 없이 생리활성인자의 탑재가 가능하며 장기간 적정농도 이상으로 지속적인 방출이 가능하다. 이를 이용하여 종래 기술적 한계가 있던 3D 프린팅 인공 지지체의 기능향상을 위한 복잡한 공정과정을 극복하여 생리활성인자의 탑재가 용이한 3D 프린팅 인공 지지체를 제공할 수 있다.
상기 생리활성인자는 사이토카인, 호르몬, 인슐린, 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드/단백질; fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자; 유전자; 및 백신 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 생리활성인자의 탑재는 종래 고분자 미세입자에 탑재시키는 것과 동일한 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 생리활성인자 용액 내의 생리활성인자의 단순 흡착의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 생리활성인자는 상기 3D 프린팅으로 제조된 다공성 고분자 인공 지지체로부터 서방형 방출되는 특징을 가진다.
이러한 생리활성인자의 서방형 방출은 상기 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체 표면과 일정 깊이까지 형성된 다공들에 탑재된 생리활성인자가 다수의 낙엽들이 적층된 형태의 다공 구조를 통과하면서 상기 생리활성인자가 상기 다공 구조에 탈착/흡착이 반복되면서 이루어지는 것이다.
또한, 상기 생리활성인자는 탑재된 상기 인공 지지체로부터 서방형 방출되어, 손상된 부위에서 세포의 분화 및 재생을 촉진하는 효과를 가진다.
추가적으로, 본 발명에 따른 상기 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅을 이용한 다공성 고분자 인공 지지체를 골 조직, 연골 조직, 간 조직, 치아 조직, 침샘 조직, 부갑상선 조직 중에서 선택되는 어느 하나의 조직의 재생에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체는 조직공학적, 재생의학적, 진단의학적, 약물스크리닝, 동물실험대체재 등 다양한 분야로의 응용이 가능하다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
실시예 1: 낙엽적층 구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 제조
생체적합성·생분해성을 나타내는 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL) 펠렛을 용융시켜 3D 프린터기에 넣고 압출 성형시켜 3D 프린팅 인공 지지체를 제작하였다. 3D 프린팅 인공 지지체의 규격은 파이버의 직경을 300㎛로 하여 사출시켜 가로*세로=300*600㎛의 격자 모양으로 하여 높이가 4000 ㎛가 되도록 쌓아 올려 3D 프린팅법을 이용하여 인공 지지체를 제조하였다.
그 후 용매 테트라글리콜을 오일 배쓰 (oil bath)를 이용하여 오일 중탕시켜 온도를 55℃가 되도록 맞추었다. 상기 제조된 인공 지지체를 상기 용매에 넣어 지지체가 완전히 잠기도록 하여 1분 동안 열처리를 진행하였다.
열처리 후 상기 인공 지지체를 테트라글리콜에서 꺼내어 유리 페트리 접시 위에 올려 실온에서 10분 동안 냉각시켰다.
냉각된 상기 인공 지지체를 상온의 새로운 테트라글리콜에 담구었다 빼는 과정을 진행하여 인공 지지체 표면에 생성된 낙엽적층 다공성 구조 사이의 잔여 폴리카프로락톤 용액을 세척시켰다. 그 후 증류수를 과량 넣어서 잔여 테트라글리콜을 완전히 세척해내었다.
세척이 끝난 인공 지지체는 동결건조시켜 낙엽적층 구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체를 제조하였다 (도 1의 제조과정 모식도 참조).
대조군 1 : 다공성 구조가 도입되지 않은 3D 프린팅 인공 지지체의 제조
생체적합성·생분해성을 나타내는 폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL)펠렛을 용융시켜 3D 프린터기에 넣어, 사출시켜 3D 프린팅 인공 지지체를 제작하였다. 3D 프린팅 인공 지지체의 규격은 파이버의 직경을 300 ㎛로 하여 사출시켜 가로*세로=300*600㎛의 격자 모양으로 하여 높이가 4000 ㎛가 되도록 쌓아 올려 3D 프린팅 인공 지지체를 제조하였다.
이후, 열처리 과정은 거치지 않고 3D 프린팅 인공 지지체를 본 발명에 따른 다공성 구조를 가지는 인공지지체와 비교하였다.
비교예 1~2 : 다양한 다공성 구조를 도입하기 위한 3D 프린팅 인공 지지체의 제조
3D 프린팅 인공 지지체에 다양한 구조의 다공성을 도입하기 위해 앞서 언급한 제조 조건의 범위를 벗어난 조건에서 제조하였다. 3D 프린팅 인공 지지체의 규격은 기존과 동일하게 진행하였으며, 제조한 온도 조건은 기존 열처리 온도 30~150℃를 벗어난 20℃, 160℃에서 진행하였고, 열처리 시간 조건은 1초, 1분 그리고 기존 1초~5시간을 벗어난 6시간으로 진행하였다. 그 외의 제조 조건과 제조 방법은 상기 실시예 1과 동일하게 진행하였다.
실험예 1 : 3D 프린팅 인공 지지체의 구조 확인
상기 실시예 1, 대조군 1, 및 비교예 1~2에 따라 각각 제조된 3D 프린팅 인공 지지체의 구조를 주사전자현미경 (SEM)을 통해 관찰하였으며 그 결과를 각각 도 2 내지 5에 나타내었다.
실시예 1에 따른 3D 프린팅 인공 지지체의 구조(도 2)를 참조하면, 인공지지체를 구성하는 파이버의 표면(a)에는 다수의 낙엽적층형 다공성 구조가 형성되어 있음을 확인할 수 있으며, 또한, 인공지지체를 구성하는 파이버의 단면(b)을 잘라 관찰한 사진과 이의 확대사진을 참조하면, 바깥 외표면과 일정깊이(전체 파이버 직경 200㎛ 중 50㎛)까지 낙엽적층형 다공성 구조가 형성되어 있으며, 상기 깊이부터 파이버 내부까지는 매끈한 비다공성(dense) 구조로 이루어져 있음을 확인할 수 있다.
그러나, 낙엽적층구조를 도입하지 않은 대조군 1에 따른 3D 프린팅 인공 지지체의 구조를 나타낸 다음 도 3을 참조하면, 표면(a)이 매끄러우며 파이버의 단면(b)과 이의 확대사진을 보았을 때 원형의 다공성이 없는 매끈한 구조를 관찰할 수 있었다.
또한, 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체는 지지체 전체 표면에 낙엽적층구조가 형성되었으며 이로 인해 낙엽적층 구조를 도입하지 않은 대조군 1의 SEM 사진과 비교하였을 때 전체 파이버의 직경이 증가한 것을 확인하였다.(도 4 참조)
또한, 20℃에서 각각 1초, 1분, 6시간동안 열처리하여 제조한 비교예 1의 결과인 도 5를 참조하면, 3D 프린팅 인공 지지체에 충분한 열이 전달되지 않았고 이에 따라 열처리 시간이 증가하여도 3D 프린팅 인공 지지체에 다공성 구조가 형성되지 않았으며 확대사진을 보았을 때 또한 파이버의 표면이 다공성이 없는 매끈한 구조를 관찰 할 수 있었다. 즉, 상기 대조군 1과 유사한 구조를 가짐을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 160℃에서 1초, 1분, 6시간동안 열처리를 진행한 비교예 2에 있어서는 열처리 온도가 너무 높아 3D 프린팅 인공 지지체가 모두 녹아 더 이상의 실험을 진행할 수 없었다.
이러한 결과를 통해 본 발명과 같은 3D 프린팅 인공 지지체에 적절한 낙엽적층구조 및 다공성을 부여할 수 있는 열처리 조건은 최적의 온도와 시간 조건이 만족할 때만 가능함을 확인하였다.
실험예 2 : 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 물성 측정
상기 실시예 1과 대조군 1에 따라 각각 제조된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체와 낙엽적층구조가 도입되지 않은 3D 프린팅 인공 지지체를 이용하여 가로*세로*높이=4000*4000*4000㎛의 규격으로 하여 압축 강도를 측정하였다.
각 인공 지지체의 각각 건조된 상태와 젖은 상태의 압축 강도를 압축강도시험기를 통해 관찰하였으며 그 결과를 각각 다음 도 6에 나타내었다. 젖은 상태의 지지체를 제조하기 위해서 건조된 상태의 지지체를 37℃의 PBS와 함께 주사기에 넣고 양압과 음압을 한 번씩 가해주었다. 그 다음 목공용 클램프로 양압을 가해 고정시킨 뒤 37℃의 조건에서 24시간 동안 보관하였다. 24시간 후 지지체 표면의 과량의 물기만을 타올을 이용하여 흡수시킨 후 압축 강도를 측정하였다. 압축 강도는 압축강도시험기를 이용하여 측정하였으며 측정 조건은 3kN load cell을 이용하고 cross-head speed는 1 mm/min으로 하여 측정하였다. 측정 결과 stroke(mm)에 따른 하중(N) 값을 얻을 수 있었는데 이 데이터를 기반으로 stress/strain curve를 그려서 각 실험군의 물성을 비교하였다. Strain(%) 부분은 stroke(mm) 값을 지지체의 높이인 4mm로 나눈 뒤 백분율로 변환하였고 stress(MPa) 부분은 하중(N) 값을 지지체의 면적인 16mm2로 나누었다.
다음 도 6의 결과를 참조하면, 각각 건조된 상태와 젖은 상태의 낙엽적층구조를 도입하지 않은 3D 프린팅 인공 지지체(대조군 1)와 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체(실시예 1)의 압축 강도 측정 결과 물성 변화에 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 이를 통해 기존의 낙엽적층구조가 도입되지 않은 3D 프린팅 인공 지지체와, 같은 재료로 제조된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 물성을 비교하였을 때 큰 변화가 없는 것으로 보아 도입된 낙엽들이 적층된 형태의 다공 구조가 지지체의 물성 변화에 영향을 미치지 않으며 기능 향상이 가능하다는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에 세포 부착
상기 실시예 1에 따라 제조된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 가로*세로*높이=4000*4000*4000㎛의 규격으로 하여 총 분주 된 세포 수가 2x105 세포가 되도록 세포를 분주하였다. 세포를 분주하기 전 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 내부에 PBS 또는 배지를 탑재하여 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체 표면에 친수성을 가지며 세포 배양 시 배지 내부에 가라앉을 수 있게 하였다. 그 다음 2x105 세포 현탁액의 부피가 1 mL가 되게 하여 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체의 표면에 세포 현탁액을 분주한 후 약 16시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여 세포 부착을 유도하였다. (도 7 세포 부착 과정 참조).
대조군 2 : 3D 프린팅 인공 지지체에 세포 부착
상기 대조군 1에 따라 제조된 낙엽적층구조가 도입되지 않은 3D 프린팅 인공 지지체를 이용하여 상기 실시예 2와 동일하게 세포를 부착시켜 비교하였다.
실험예 3 : 인공 지지체에 부착시킨 세포의 부착 확인
상기 실시예 2와 대조군 2에 따라 인공 지지체에 부착된 세포를 주사전자현미경 (SEM)을 통해 관찰하였으며 그 결과를 각각 다음 도 8과 9에 나타내었다.
낙엽적층구조를 도입하지 않은 3D 프린팅 인공 지지체(도 9)는 전체적으로 표면이 세포를 부착하기 전과 유사하게 매끈하며 확대했을 때 파이버의 표면에 세포가 거의 부착되지 않았고, 파이버들 간의 사이 간격에 세포가 적은 양 부착되어 있는 것을 확인하였다.
그러나, 본 발명의 실시예 2에 따른 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체(도 8)는 전체적으로 보았을 때, 표면에 낙엽적층구조가 보이지 않을 정도로 많은 양의 세포가 부착되어 있는 것을 확인하였다. 표면을 확대했을 때 세포들이 낙엽적층구조의 표면에 부착한 것을 확인하였고, 세포 부착 후 0일 보다 3일, 7일차가 될수록 세포가 증식하여 지지체 표면을 뒤덮은 것을 확인하였다.
실험예 4 : 4공 지지체에 부착시킨 세포의 생존율 및 증식률 분석
상기 실시예 2와 대조군 2에 따라 인공 지지체에 부착된 세포의 생존율 및 증식률을 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay를 실시하여 정량화 하였으며, 그 결과를 다음 도 10에 나타내었다.
다음 도 10을 참조하면, 상기 도 8과 9의 결과와 같이 낙엽적층구조를 도입하지 않은 3D 프린팅 인공 지지체(대조군 2)보다 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체(실시예 2)에서 세포가 더 많이 부착된 것을 확인하였다. 또한, 시간이 지날수록 세포가 점점 증식하였고 계속해서 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에서 더 많은 세포 수가 측정되었다.
실시예 3 : 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에 생리활성인자 탑재
상기 실시예 1에서 제조된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에 골형성단백질인 BMP-2(bone morphogenetic protein-2)를 탑재시켰다. 상기 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체를 가로*세로*높이=4000*4000*4000㎛의 규격으로 하였고, 상기 BMP-2를 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체 부피당 1 μ의 농도로 제조하여 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에 양압과 음압을 통하여 탑재시켰다. 그 후 4℃에서 3시간 보관하여 BMP-2를 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체 표면에 흡착을 유도하였고 이후 PBS로 1회 세척하여 흡착되지 않은 BMP-2를 세척하였다. 그 후 동결 건조시켜 BMP-2가 흡착된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체를 제조하였다.
대조군 3 : 3D 프린팅 인공 지지체에 생리활성인자 탑재
상기 대조군 1에 따라 제조된 낙엽적층구조가 도입되지 않은 3D 프린팅 인공 지지체를 이용하여 상기 실시예 3과 동일하게 생리활성인자를 탑재시켜 비교하였다.
실험예 5 : 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에 탑재된 BMP-2 방출 거동 확인
상기 실시예 3과 대조군 3에 따라 제조된 BMP-2가 흡착된 인공 지지체(가로*세로*높이=4000*4000*4000㎛)를 소태 아혈청이 1% 비율로 들어있는 PBS (보관용액)에 넣고 37℃, 50 rpm에서 보관하였다. 매일 보관용액을 채취하고 새로운 보관용액으로 갈아주었으며, 채취한 보관용액은 효소면역정량법으로 BMP-2의 양을 측정하였다. 측정된 양은 누적 방출량으로 나타내었으며, 그 결과를 다음 도 11에 나타내었다.
다음 도 11을 참조하면, 생리활성인자의 탑재량은 낙엽적층구조를 도입하지 않은 3D 프린팅 인공 지지체(대조군 3)보다 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체(실시예 3)에서 다공성으로 인해 약 3배 가량 생리활성인자가 더 많이 탑재된 것을 확인하였다. 방출거동의 경우, 세포의 골세포로의 분화 및 신생골 형성을 위한 유효농도의 생리활성인자가 서방형으로 방출되고 있음을 확인하였고 낙엽적층구조를 도입하지 않은 3D 프린팅 인공 지지체보다 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에서 생리활성인자의 방출량이 더 많이 오랜기간 방출되는 것을 확인하였다. 즉, 어떠한 첨가제 및 표면 개질법 없이도 본 발명의 3D 프린팅 인공 지지체의 독특한 다공성의 낙엽적층구조에 생리활성인자가 탑재 및 서방형 방출되고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 생리활성인자가 탑재된 낙엽적층구조의 다공성 3D 프린팅 인공 지지체에 부착된 세포의 분화 촉진을 통한 조직의 재생을 보다 효과적으로 유도할 수 있음을 기대할 수 있었다.

Claims (14)

  1. 파이버의 직경을 기준으로 그 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지는 낙엽 적층형 다공성 구조를 가지며,
    상기 깊이로부터 중심까지는 비다공성 구조를 가지는 각각의 파이버들이 격자 형태로 적층되어 이루어진 것을 특징으로 하는 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 다공성 고분자 인공 지지체에 사용되는 고분자는 분자량 1,000 ～ 1,000,000 g/mol인 폴리락틱산 (poly(lactic acid)), 폴리글리콜산 (poly(glycolic acid)), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(poly(lactic acid-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤 공중합체(polycaprolactone), 폴리락틱산-카프로락톤 공중합체 (poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)), 폴리하이드록시부티릭산-하이드록시발러릭산 공중합체(polyhydroxybutyric acid-co-hydroxyvaleric acid), 폴리다이옥사논 (poly(dioxanone), 폴리포스포에스터 (poly(phosphoester)) 중에서 선택되는 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 단독 또는 2 종 이상 사용하는 것인 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  3. 제 1항에 따른 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 낙엽적층형 다공성 구조에 세포를 부착시킨 것을 특징으로 하는 세포가 부착된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 낙엽적층형 다공성 구조에 부착되는 세포는 상피세포, 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 심근 세포, 근세포, 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 중간엽 줄기세포, 골수유래줄기세포, 골막유래줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 및 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell) 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인 것인 세포가 부착된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 세포의 부착은 상기 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 가로*세로*높이가 4000*4000*4000㎛인 규격을 기준으로 1x103 내지 1x107 범위의 세포를 분주시켜 이용하는 것을 특징으로 하는 세포가 부착된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  6. 제 1항에 따른 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 낙엽적층형 다공성 구조에 생리활성인자를 탑재시킨 것을 특징으로 하는 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 생리활성인자는 사이토카인, 호르몬, 인슐린, 및 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 펩타이드/단백질; fibroblast growth factors (FGFs), vascular endothelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), transforming growth factors (TGFs), bone morphogenetic proteins (BMPs), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), 및 platelet-derived growth factor (PDGF) 중에서 선택되는 1종 이상의 성장인자; 유전자; 및 백신 중에서 선택되는 어느 하나인 것인 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 탑재된 생리활성인자는 상기 다공성 고분자 인공 지지체로부터 서방형 방출되는 것을 특징으로 하는 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 생리활성인자는 상기 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체를 구성하는 각 파이버의 표면, 및 상기 표면으로부터 1~50%의 깊이까지의 낙엽 적층형 다공성 구조에 탑재된 생리활성인자가 상기 낙엽적층형 다공성 구조를 통과하여 빠져나올 때,
    상기 낙엽적층형 다공성 구조에 탈착과 흡착이 반복되면서 서방형 방출되는 것인 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 생리활성인자는 탑재된 상기 인공 지지체로부터 서방형 방출되어, 세포의 분화 및 조직의 재생을 가속화시키는 것인 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체.
  11. 생체적합성과 생분해성을 가지는 고분자를 용융시키고, 3D 프린터를 이용하여 압출된 파이버들을 적층시켜 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 제조하는 단계,
    상기 제조된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 인체에 무해한 용매에서 열처리시켜 상기 파이버들의 표면 일부를 용해시키는 단계, 및
    상기 열처리된 3D 프린팅 고분자 인공 지지체를 냉각시켜 상기 각 파이버들의 용해된 부분이 수많은 낙엽이 적층되어 쌓여 있는 것과 같은 낙엽적층형 다공성 구조로 변환되는 단계를 포함하는 제 1항에 따른 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 인체에 무해한 용매는 테트라글리콜 (Tetraglycol), 1-메틸-2-피롤리디논 (1-methyl-2-Pyrrolidinone (NMP)), 트리아세틴 (triacetin), 벤질 알콜 (benzyl alcohol), 디메틸아세타메이트 (N,N Dimethyl Acetamide) 중에서 선택되는 1종 혹은 2 종 이상의 혼합물인 것인 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 열처리는 용매의 온도 30~150℃에서 1초~5시간 동안 이루어지는 것인 제조방법.
  14. 제 6항에 따른 생리활성인자가 탑재된 3D 프린팅 다공성 고분자 인공 지지체를 골 조직, 연골 조직, 간 조직, 치아 조직, 침샘 조직, 부갑상선 조직 중에서 선택되는 어느 하나의 조직의 재생에 사용하는 용도.
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