KR101454360B1 - 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 및 이를 이용한 창상피복재 - Google Patents

파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 및 이를 이용한 창상피복재 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 미세조류의 기능성 물질을 나노섬유에 혼입하여 창상피복재로 사용하기 위하여, 기존에 파에도닥틸룸 트리코르누툼으로부터 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA)를 추출하는 과정 없이, 젤라틴을 방사 용매인 트리플루오르에틸 알콜(trifluoroethyl alcohol, TFE)에 용해하고, 상기 젤라틴이 용해된 방사 용매에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 첨가함으로써, 젤라틴과 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 용액을 제조하였고, 상기 방사 용매를 전기 방사하여 EPA가 적재된 젤라틴 나노 섬유를 제조하였다. 제조된 젤라틴 나노 섬유에 EPA가 적재된 것을 확인하였고, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유가 항균 기능을 가지고, 세포 독성이 낮으며, 세포의 부착능 및 세포의 증식력이 우수한 것을 확인하였으므로, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유를 창상피복재로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 및 이를 이용한 창상피복재{A gelatin nanofibrous web containing Phaeodactylum triconutum extracts and wound dressing using the same}
본 발명은 파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum) 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 및 이를 이용한 창상피복재에 관한 것이다.
매년 해양 생물종을 통해 다양하고 새로운 화학적 조성물이 보고됨에 따라 해양자원에 따른 관심이 증가하고 있다. 지금까지 35000종이 넘는 해양 생물과 18500개에 가까운 해양유래 화학물질이 발견되었다. 그러나 이러한 결과는 200000~800000에 가까운 해양생물종이 있을 것이라는 연구결과에 비추어보면 시작에 불과하다.
미세조류는 마이크로미터의 크기를 갖는 단세포 동물이며 해양 시스템에서 찾을 수 있다. 자연계에서 미세조류는 해양 시스템에서 1차적인 생산자일뿐만 아니라 광합성을 통해 대기 중 산소를 생산하는 중요한 생산자이기도 하다. 산업적인 면에서 미세조류는 생물다양성에 기원하여 다양한 화합물을 생산하는 생물자원의 원료로서 제안되고 있다. 항산화능을 비롯하여 항염증, 항균 및 항바이러스 기능을 갖는 고부가가치 원료들이 발견되고 있고, 발견된 것 중 일부는 현재 임상시험 중에 있다. 게다가 미세조류는 바이오 리파이너리 산업에서 훌륭한 재료로 관심을 받고 있다. 미세조류의 구성 성분은 바이오연료 및 바이오 플라스틱 그리고 생화학적인 과정을 거쳐서 화학물을 만들어내는 공정에 사용되고 있다.
파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum)은 규조류의 일종으로서 전세계 해양에 두루 존재하며 쉽게 배양이 가능하며 지방산이나 장쇄 고도 불포화 지방산의 원료 중 하나이며 영양제품, 제약 및 화장품의 원료로 사용되고 있다. 물에 용해되는 파에도닥틸룸 트리코르누툼의 성분은 항염증 및 항진통 및 자유 라디칼 소거 활성(free radical scavenging activities)이 있다고 알려져 있다. 또한 파에도닥틸룸 트리코르누툼에는 장쇄 고도 불포화 지방산(long-chain polyunsaturated fatty acids, PUFAs)의 함량이 높은데 그 중 가장 관심을 받는 물질은 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA)로서 전체 파에도닥틸룸 지방산 함량 중에 20~40%를 차지하고 있다.
최근 파에도닥틸룸의 항균 기능이 보고되고 있는데 이는 파에도닥틸룸의 형태형(morphotypes)에 따라 그 기능성의 차이를 보인다. 일반적으로 방추형 모양의 파에도닥틸룸은 타원형 모양의 그것에 비해 불포화 지방산의 함량이 높기 때문에 보다 높은 항균기능을 가지고 있다. 또한 메탄올에 추출한 파에도닥틸룸은 황색 포도 상구균에 대한 항균성을 나타냈으며 이는 EPA가 중요한 역할을 담당하는 것으로 나타났다(대한민국 등록특허 10-0763007).
과거에 사용되던 창상피복재는 추가적인 감염을 예방하기 위하여 상처를 덮는데 그 초점이 맞춰졌었으나, 최근에는 창상피복재를 통해 효과적인 상처 치유 과정을 유도하기 위한 그 추가적인 기능에 그 초점을 맞추고 있다. 이러한 목적에 맞는 생화학적·생물학적으로 기능성이 부여된 창상피복재들이 현재 개발되고 있다. 이러한 창상피복재들은 상처부위에 화학적으로 개질된 환경을 제공함으로써 보다 빠른 상처치유과정 및 오랜 상처 치유 기간을 제공한다. 상기 기능을 가지기 위하여 현재 항생제 및 성장인자 그리고 비타민등을 이용하여 생리활성적인 기능을 부여한 창상피복재들이 생산되고 있다. 특히 최근에는 항균기능이 강화된 창상피복재가 시판되고 있는데 대부분은 은이온을 함유한 창상피복재이다.
상기와 같은 창상피복재의 제조시에 쓰이는 방법으로 전기방사 방법이 있다. 전기방사는 간단하고 효과적으로 나노 미터 스케일의 직경을 갖는 미세섬유를 제조할 수 있는 기술이다. 상기 나노섬유는 금속 콜렉터에서 수집되고, 결국에는 부직포 형태를 갖는다. 이러한 나노섬유는 부피에 대한 표면적의 비율이 크기 때문에 생리 활성을 갖는 물질을 전달하는데 있어 효과적인 전달체로 사용될 수 있다. 최근에는 생리활성 성분을 포함한 나노섬유를 제조하여 창상피복재로 사용하는 연구가 많이 보고되고 있다. 하지만 아직까지 파에도닥틸룸 트리코르누툼으로부터 유래되는 EPA를 적재한 젤라틴 나노 섬유로 구성된 창상피복재의 이용에 대해서는 연구된 바가 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 미세조류의 기능성 물질을 나노섬유에 혼입하여 창상피복재로 사용하기 위하여, 기존에 파에도닥틸룸 트리코르누툼으로부터 EPA를 추출하는 과정 없이, 젤라틴을 방사 용매인 트리플루오르에틸 알콜(trifluoroethyl alcohol, TFE)에 용해하고, 상기 젤라틴이 용해된 방사 용매에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 첨가함으로써, 젤라틴과 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 용액을 제조하였고, 상기 방사 용매를 전기 방사하여 EPA가 적재된 젤라틴 나노 섬유를 제조하였다. 제조된 젤라틴 나노 섬유에 EPA가 적재된 것을 확인하였고, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유가 항균 기능을 가지고, 세포 독성이 낮으며, 세포의 부착능 및 세포의 증식력이 우수한 것을 확인하였으므로, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유를 창상피복재로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum) 추출물을 함유하는 젤라틴(gelatin) 나노 섬유 지지체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은
1) 젤라틴을 방사 용매에 용해하여 방사원액을 제조하는 단계;
2) 파에도닥틸룸을 단계 1)의 젤라틴이 용해된 방사 용매에 첨가하여 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 수득하는 단계;및
3) 단계 2)의 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 전기방사하여 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 상기 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 또는 재생용 창상피복재를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum) 추출물을 함유하는 젤라틴(gelatin) 나노 섬유 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 젤라틴을 방사 용매에 용해하여 방사원액을 제조하는 단계;
2) 파에도닥틸룸을 단계 1)의 젤라틴이 용해된 방사 용매에 첨가하여 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 수득하는 단계;및
3) 단계 2)의 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 전기방사하여 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 또는 재생용 창상피복재를 제공한다.
본 발명에서는 미세조류의 기능성 물질을 나노섬유에 혼입하여 창상피복재로 사용하기 위하여, 기존에 파에도닥틸룸 트리코르누툼으로부터 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA)를 추출하는 과정 없이, 젤라틴을 방사 용매인 트리플루오르에틸 알콜(trifluoroethyl alcohol, TFE)에 용해하고, 상기 젤라틴이 용해된 방사 용매에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 첨가함으로써, 젤라틴과 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 용액을 제조하였고, 상기 방사 용매를 전기 방사하여 EPA가 적재된 젤라틴 나노 섬유를 제조하였다. 제조된 젤라틴 나노 섬유에 EPA가 적재된 것을 확인하였고, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유가 항균 기능을 가지고, 세포 독성이 낮으며, 세포의 부착능 및 세포의 증식력이 우수한 것을 확인하였으므로, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유를 창상피복재로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 젤라틴 단독과, 젤라틴 및 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 나노 섬유 표면을 나타낸 사진이다.
도 2는 젤라틴 단독과 젤라틴과 파에도닥틸룸을 젤라틴 방사 용매인 트리플루오르에탄올(2, 2, 2- trifluoroethanol, TFE)에 다양한 비율로 혼합하고, 혼합 용액을 전기방사하여 제조한 나노 섬유 지지체의 SEM 이미지이다:
(a) G8(8% 젤라틴),
(b) G8P0.5(8% 젤라틴 + 0.5% 파에도닥틸룸),
(c) G8P1.0(8% 젤라틴 + 1.0% 파에도닥틸룸),
(d) G10(10% 젤라틴),
(e) G10P1.0(10% 젤라틴 + 1.0% 파에도닥틸룸),
(f) G12(12% 젤라틴), 및
(g) G12P1.0(12% 젤라틴 + 1.0% 파에도닥틸룸).
도 3은 젤라틴 단독과 젤라틴과 파에도닥틸룸을 젤라틴 방사 용매인 TFE에 다양한 비율로 혼합하고, 혼합 용액을 전기방사하여 제조한 나노 섬유 지지체들의 섬유 직경을 나타낸 그래프이다.
도 4는 파에도닥틸룸 추출물 및 파에도닥틸룸 추출물이 함유된 전기방사로 제조된 젤라틴 매트의 광학 및 형광 현미경 이미지이다:
(a) 파에도닥틸룸 추출물,및
(b) 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유.
도 5는 파에도닥틸룸의 지방산 조성표(a) 및 TFE로 추출한 파에도닥틸룸 추출물의 지방산 조성표(b)를 나타낸 도이다:
C20:5n3 : 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA)를 뜻함.
도 6은 TFE로 추출한 파에도닥틸룸 추출물의 지방산 조성표(a) 및 파에도닥틸룸 추출물이 혼입된 젤라틴 나노섬유의 지방산 조성표(b)를 나타낸 도이다.
도 7은 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 가교 후 사진(a), 및 가교한 나노섬유를 2시간 동안 물에 처리한 후의 사진(b)을 나타낸 것이다.
도 8은 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 용출물 세포독성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9은 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 초기 섬유아세포 부착 능력을 나타낸 그래프이다.
도 10은 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 섬유아세포 증식능력을 나타낸 그래프이다.
도 11은 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 항균능 평가 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum) 추출물을 함유하는 젤라틴(gelatin) 나노 섬유 지지체를 제공한다.
상기 파에도닥틸룸 추출물은 하기 [화학식 1]로 기재되는 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 화합물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
[화학식 1]
Figure 112012070463074-pat00001
.
상기 파에도닥틸룸 추출물은 트리플루오르에탄올(2, 2, 2- trifluoroethanol, TFE)을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 파에도닥틸룸 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것 일수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
1) 파에도닥틸룸 트리코르누툼에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 파에도닥틸룸 트리코르누툼은 배양한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 파에도닥틸룸 추출물은 물, 수용성 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 수용성 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 추출 방법으로는 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 파에도닥틸룸 트리코르누툼에 0.1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 40℃인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 48시간인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 젤라틴을 방사 용매에 용해하여 방사원액을 제조하는 단계;
2) 파에도닥틸룸을 단계 1)의 젤라틴이 용해된 방사 용매에 첨가하여 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 수득하는 단계;및
3) 단계 2)의 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 전기방사하여 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 파에도닥틸룸 추출물은 하기 [화학식 1]로 기재되는 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 화합물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
[화학식 1]
Figure 112012070463074-pat00002
.
상기 단계 1)의 용매는 TFE인 것을 특징으로 하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 젤라틴을 용매에 6 내지 14 중량% 용해하는 것일 수 있고, 7 내지 13% 중량 용해하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 8 내지 12 중량% 용해하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 방사 용매에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 0.1 내지 2 중량% 첨가하는 것일 수 있고, 0.25 내지 1.5% 중량 첨가하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 0.5 내지 1 중량% 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 전기방사는 10 내지 15 kV의 전압범위로 인가하며, 0.5 내지 1.5 ml/h의 방사속도에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 나노섬유는 지름이 150 nm 내지 1100 nm인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
아울러, 본 발명은 상기 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 또는 재생용 창상피복재를 제공한다.
상기 지지체는 항균 기능을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 세포는 피부 유래 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 미세조류의 기능성 물질을 나노섬유에 혼입하여 창상피복재로 사용하기 위하여, 미세조류인 파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum)을 배양하고 수득하였고, 기존에 파에도닥틸룸 트리코르누툼으로부터 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA)를 추출하는 과정 없이, 젤라틴을 방사 용매인 트리플루오르에탄올(2, 2, 2- trifluoroethanol, TFE)에 용해하고, 상기 젤라틴이 용해된 방사 용매에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 첨가함으로써, 젤라틴과 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 용액을 제조하였다(표 1 참조). 상기 혼합 용액을 전기방사하여 젤라틴과 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 나노섬유를 제조하였다(도 1 내지 도 3 참조). 상기 제조된 나노섬유에 에이코사펜타에노산이 적재된 것을 확인하였다(도 4 및 도 6 참조). 아울러, 상기 제조된 나노섬유의 불용화 정도를 확인하였을 때, 젤라틴과 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 나노섬유의 가교 후 팽윤이 일어나긴 하나 완벽히 용해되지 않으므로 안정성을 증대시키는 효과가 있는 것을 확인하였다(도 7 참조).
상기 제조된 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유가 세포 독성이 낮으며(도 8 참조), 세포의 부착능(도 9 참조) 및 세포의 증식력이 우수하며(도 10 참조), 항균 기능을 가지는 것을 확인하였다(표 2 및 도 11 참조).
따라서, 젤라틴을 방사 용매인 트리플루오르에탄올(2, 2, 2- trifluoroethanol, TFE)에 용해하고, 상기 젤라틴이 용해된 방사 용매에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 첨가함으로써, 젤라틴과 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물이 혼합된 용액을 제조하였고, 상기 방사 용매를 전기 방사하여 EPA가 적재된 젤라틴 나노 섬유를 제조하였다. 상기 제조된 젤라틴 나노 섬유에 EPA가 적재된 것을 확인하였고, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유가 항균 기능을 가지고, 세포 독성이 낮으며, 세포의 부착능 및 세포의 증식력이 우수한 것을 확인하였으므로, 상기 제조된 EPA-젤라틴 나노 섬유를 창상피복재로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 파에도닥틸룸 트리코르누툼 ( Phaeodactylum triconutum ) 배양 및 수득
미세조류인 파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum)은 부경대학교 해양바이오신소재학과 한국해양 미세조류은행에서 분양받아 사용하였다. 배양된 미세조류 세포는 Al2(SO4)3(v/v) 200 ppm하에서 응집시켰으며 냉장 원심분리기(Hanseong Co., Ansan, Korea)에서 200 rpm에서 원심분리하였다. 상기 분리된 미세조류 세포를 70 ℃에서 동결건조하여 순수한 파에도닥틸룸 트리코르누툼 파우더를 수득하였다.
< 실시예 2> 방사원액의 제조
방사원액을 만들기 위한 용매로는 트리플루오르에탄올(2, 2, 2- trifluoroethanol, TFE)를 사용하였다. 젤라틴은 Merck KGaA(for microbiology, Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, 트리플루오르에탄올(2, 2, 2- trifluoroethanol, TFE) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)(GTA, 25% (v/v), aqueous solution)은 Sigma Aldrich에서 구입하였다. TFE에 젤라틴을 8%~12% (w/v) 용해하였으며 여기에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 1% (w/v) 첨가하여 방사용액을 제조하였으며 불용성 물질이나 불순물을 제거하기 위하여 필터페이퍼에 용액을 통과시켰다. 방사용액의 점도와 전기전도도의 측정은 원뿔-평판 점도계(BROOKFIELD DV-Ⅱ+Pro, USA)와 디지털 전기전도도 측정계(Thermoscientific, ORION 4STAR)를 통해서 25 ℃ 온도에서 측정하였다. 젤라틴 단독과 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액의 혼합 비율 및 이에 따른 전기전도도 및 점도는 하기 표 1과 같다(표 1).
Sample Gelatin
(%) 		Microalgae
(%) 		Total
(%) 		전기전도도(C)
(μS/cm) 		점도
(mPas)
G8 8.0 0 8.0 48.3 15.7
G8P0.5 8.0 0.5 8.5 89.3 15.7
G8P1.0 8.0 1.0 9.0 124.3 15.8
G10 10 0 10.0 50.2 18.7
G10P1.0 10 1.0 11.0 121.7 18.9
G12 12 0 12.0 51.2 21.2
G12P1.0 12 1.0 13.0 126.5 21.4
상기 조건으로 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노 섬유를 제조하였을 때, 파에도닥틸룸 추출물이 혼합되는 경우 점도의 변화는 크게 없으나 전도도의 변화가 크게 증가함을 확인하였다. 이는 일반적인 젤라틴 전기 방사와 다른 조건이 필요하는 것을 나타낸다.
< 실시예 3> 나노섬유의 제조
전기방사는 온도 26 ℃, 습도 40%인 항온항습실에서 진행되었다. 방사조건은 공급전압 15 kV, 방사속도 1.0 ml/h, 방사구의 직경 0.8 mm, 방사구와 컬렉터의 거리 15 cm이며 원기둥 형태의 컬렉터는 회전속도 100 rpm으로 유지하였다. 상기 실시예 2에서 제조된 각 방사용액 5 ml씩 6개의 다중노즐에서 5시간 동안 방사하여 최종적으로 300mm×200mm×0.1mm 크기의 2차원 매트 형태로 나노섬유 지지체를 제조하였다. 상기 제조된 나노섬유의 직경과 형태는 FE-SEM(SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였고, analyzing software(Leopard, Korea)를 이용하여 나노섬유의 직경을 분석하였다.
그 결과, 젤라틴 단독과, 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유 표면을 확인하였고(도 1), 젤라틴 단독과 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물을 다양한 비율로 혼합하였을 제조되는 나노섬유의 직경 및 형태를 확인하였다(도 2). 도 2에서 확인할 수 있듯이, 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물의 혼합 비율에 따라, 제조된 나노섬유의 직경이 상이한 것을 확인할 수 있었다. 젤라틴 단독과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 자세한 섬유 직경은 도 3과 같다(도 3). 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 경우 전도도가 증가하므로 동일 조건에서 섬유의 직경이 감소된다.
아울러, 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유에서 파에도닥틸룸 추출물이 혼입을 형광이미지로 확인하였고, 상기 형광 이미지는 형광현미경(Axiophot, Carl Zeiss, Germany)를 통해 얻었다.
그 결과, 도 4의 (a)와 같이 파에도닥틸룸 추출물은 그 안에 포함된 색소 성분에 의해 형광을 나타낸다. 젤라틴 단독 섬유는 형광을 나타내지 않지만, 형광을 나타내는 파에도닥틸룸 추출물을 혼입시킨 경우 도 4의 (b)와 같이 형광을 나타내므로 파에도닥틸룸 추출물이 성공적으로 혼입된 것을 나타낸다(도 4).
< 실시예 4> 나노섬유의 지방산 조성 확인
파에도닥틸룸 트리코르누툼에 함유되어 있는 지방산의 조성을 살펴보기 위하여 미세조류 자체, TFE에 용해한 파에도닥틸룸 트리코르누툼, 및 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 함유한 젤라틴 나노섬유의 지방산 함량분석을 가스크로마토그래피 (지방산, 휘발성분 분석) Agilent 7890 gas chromatography(agilent, USA)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 TFE로 추출하여도, EPA가 추출되는 것을 확인하였고(도 5의 (b)), 파에도닥틸룸 추출물이 혼입된 젤라틴 나노섬유의 지방산 조성을 확인한 결과 EPA가 나노섬유 안에 존재하는 것을 확인하였다(도 6의 (b)).
< 실시예 5> 나노섬유의 불용화 시험
제조한 나노섬유 지지체를 아크릴판을 이용하여 glutaraldehyde(GTA, 25% (v /v), aqueous solution)10 ml 위에 고정화하였으며 이를 항온 항습실에서 증기를 이용하여 25℃에서 48시간 동안 가교하였다. 가교 후에 나노섬유 지지체에 남아있을지 모르는 GTA의 반응기를 제거하고 가교 효율을 높이기 위하여 100 ℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이후 fume hood에서 2시간 동안 건조하여 사용하였다. 나노섬유의 불용화를 시험하기 위하여, 제조한 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 가교 후에, 상기 가교한 나노섬유를 2시간 동안 37.8℃ DI water로 처리한 후 나노 섬유의 불용화 정도를 확인하였다.
그 결과, 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 가교 후 팽윤이 일어나긴 하나 완벽히 용해되지 않으므로 안정성을 증대시키는 효과가 있었다(도 7).
< 실시예 6> 나노섬유 지지체의 세포적합성 평가
<6-1> 세포 독성 평가
나노 섬유 지지체의 세포적합성 평가에 사용된 세포는 Mouse connective tissue, fibroblast0like cells (L929)을 사용하였다. 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 함유한 나노섬유의 독성을 평가하기 위하여 ISO10993-5에 따라 실험을 진행하였다. OPTI-MEM 배양 배지에 10 mg/ml의 추출비(extraction ratio)로 24시간 동안 37℃의 CO2배양기에서 2차원 나노섬유 매트의 성분을 추출한 배지를 통해 세포를 배양한 후, 역시 6시간, 1일, 2일 후 MTT assay를 시행하였다.
그 결과, 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 안정성을 측정하기 위하여 나노섬유에서 용출되는 물질의 안정성을 검증한 결과 세포독성이 없는 것을 확인하였다(도 8).
<6-2> 세포 부착 및 증식 효과 평가
나노섬유 지지체의 세포 부착 및 증식효과를 평가하기 위하여 96-well plate (SPL Life Sciences, Korea) 위에 2차원 나노섬유 지지체를 크기에 맞게 절단하여 부착시켰으며 각 well당 1×104 씩 세포를 주입하였다. 세포 seeding 후 2시간, 24시간, 3일, 그리고 5일후에 MTT assay를 실시하였다. MTT assay를 위해 세포에 MTT 시약(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)을 주입하고 4시간 동안 37℃의 CO2 배양기에서 반응시켰다. 다시 DMSO를 첨가하여 30분 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시료는 5개의 시료를 평가하였으며 평균값과 표준편차를 활용하여 통계적으로 분석하였다.
그 결과, 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 군의 경우 추출물이 미포함된 처리구(G10)에 비하여 빠른 시기에(세포 부착 2 시간) 세포가 부착되는 것을 확인하였다(도 9). 아울러, 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 군의 경우 추출물이 미포함된 처리구(G10)에 비하여 세포의 증식이 보다 높은 것을 확인하였다(도 10).
< 실시예 7> 나노섬유 지지체의 항균기능 평가
나노섬유의 항균효과를 평가하기 위하여 KS K 0693에 의거하여 실험을 진행하였다. 항균기능 평가에는 Staphylococcus aureus(MRSA)와 Escherichia coli를 균주로 사용하였으며 초기 균주의 농도는 각각 6.8 x 106, 8.2 x 106로 하였다. 0.4g의 나노섬유 지지체를 균주가 담겨있는 용액에 침지하였으며, 37℃에서 18시간 반응 후에 균주의 농도를 각각 측정하였다. 이때 항균능을 평가하는 방법은 다음과 같다.
Antimicrobial efficiency (%) = [(Mb -Ma)/Mb]×100
Ma: 시험편의 18 시간 배양후 생균수(3검체의 평균치)
Mb: 대조편의 18 시간 배양후 생균수(3검체의 평균치)
상기 나노 섬유 지지체의 항균 기능 평가 결과는 하기 표 2와 같다(표 2).
Figure 112012070463074-pat00003
표 2와 같이, 대조군에 비하여 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 나노섬유의 경우 생존하는 세포의 수가 현저히 감소한 것을 확인하였다(표 2 및 도 11).

Claims (13)

  1. 하기 [화학식 1]로 기재되는 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 화합물을 포함하는 파에도닥틸룸 트리코르누툼(Phaeodactylum triconutum) 추출물을 함유하는 젤라틴(gelatin) 나노 섬유 지지체:
    [화학식 1]
    Figure 112014086449965-pat00017
    .
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 파에도닥틸룸 추출물은 트리플루오르에탄올(2, 2, 2- trifluoroethanol, TFE)을 용매로 하여 추출하는 것을 특징으로 하는 젤라틴 나노 섬유 지지체.
  4. 1) 젤라틴을 방사 용매에 용해하여 방사원액을 제조하는 단계;
    2) 상기 [화학식 1]로 기재되는 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, EPA) 화합물을 포함하는 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물을 단계 1)의 젤라틴이 용해된 방사 용매에 첨가하여 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 수득하는 단계;및
    3) 단계 2)의 젤라틴과 파에도닥틸룸 추출물이 혼합된 용액을 전기방사하여 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 파에도닥틸룸 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조 방법.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 용매는 TFE인 것을 특징으로 하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 젤라틴을 용매에 6 내지 14 중량% 용해하는 것을 특징으로 하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조방법.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 젤라틴이 용해된 방사용매에 파에도닥틸룸 트리코르누툼을 0.1 내지 2 중량% 첨가하는 것을 특징으로 하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조방법.
  9. 제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 전기방사는 10 내지 15 kV의 전압범위로 인가하며, 0.5 내지 1.5 ml/h의 방사속도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조방법.
  10. 제 4항에 있어서, 상기 나노섬유는 지름이 150 nm 내지 1100 nm인 것을 특징으로 하는 젤라틴 나노섬유 지지체 제조방법.
  11. 제 1항의 파에도닥틸룸 트리코르누툼 추출물을 함유하는 젤라틴 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 또는 재생용 창상피복재.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 지지체는 항균 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 세포의 부착, 증식 또는 재생용 창상피복재.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 세포는 피부 유래 세포인 것을 특징으로 하는 세포의 부착, 증식 또는 재생용 창상피복재.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100806412B1 (ko) 2000-01-28 2008-02-21 스미스클라인 비참 코포레이션 전기방사 약제학적 조성물
KR100621569B1 (ko) 2003-10-28 2006-09-13 이승진 조직 재생을 유도하기 위한 생체 모방형태의 나노섬유와마이크로 섬유의 복합지지체 및 그의 제조방법
KR100763007B1 (ko) 2006-05-09 2007-10-04 전남대학교산학협력단 에이코사펜타에노산을 함유하는 항생제, 이를 생산하는균주, 그 생산방법 및 이의 용도

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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