KR100763007B1

KR100763007B1 - 에이코사펜타에노산을 함유하는 항생제, 이를 생산하는균주, 그 생산방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100763007B1
Application number: KR1020060041651A
Authority: KR
Inventors: 지연태; 류진아; 이지연; 류재원; 장치호
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 에이엠팜(주)
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2007-10-04

Abstract

본 발명은 에이코사펜타에노산, 염 또는 유도체를 함유하는 항생제, 이를 생산하는 균주, 그 생산방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 그람양성 세균에 대한 항균 활성이 있는 에이코사펜타에노산을 함유하는 항생제, 이를 생산하는 균주 슈도모나스속 CJM01, 그 생산방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 에이코사펜타에노산을 함유하는 항생제는 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 충치균 어병균, 식중독균등 동물과 사람에 자주 발생하는 병원균 및 항생제 내성 균주에 특이적으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 항생제는 동물이나 사람에 자주 발생하는 식중독균, 항생제내성 감염 동물, 물고기 및 환자 치료, 유방염, 상처 부위나 피부이식시 썩음병, 충치균 예방용 치약, 가글, 축산, 양식, 양만의 사료첨가제, 축사 소독제, 등에 사용할 수 있다.

본 발병은 CJM01균주 배양에서 얻어지는 에이코사펜타에노산 유도체로부터 단백질 분해효소를 처리하여 주요 생리활성 물질인 에이코사펜타에노산을 대량 생산할 수 있다.

에이코사펜타에노산, 에이코사펜타에노산 유도체, 항생제, 슈도모나스속

Description

에이코사펜타에노산을 함유하는 항생제, 이를 생산하는 균주, 그 생산방법 및 이의 용도{Antibiotics comprising eicosapentaenoic acid as an active ingredient, strain producing the ingredient, producing method and use thereof}

도 1은 Bacillus thuringiensis CMB26 와 Pseudomonas CJM01의 co-streaking(A)과 CJM01 추출물의 CMB26에 대한 Disc test(B) 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 슈도모나스속 CJM01의 다양한 미생물에 대한 길항력을 나타낸 것이다.

도 3은 CJM01의 16s rRNA의　염기서열을 나타낸 것이다.

도 4는 CJM01 추출시료를 Gel Permeation Chromatography로 분획한 것을 나타낸 것이 다.

도 5는 Bacillus thuringiensis CMB26에 대한 CJM01 추출시료 GPC 분획의 항균력 시험 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 GPC 분획 18, 19의 HPLC를 통한 이차정제를 나타낸 것이다(A: GPC No. 18, B: GPC No. 19).

도 7은 HPLC 분획의 Bacillus thuringiensis CMB26에 대한 항균력 시험결과 를 나타낸 것이다(A: GPC No. 18, B: GPC No. 19).

도 8a는 TLC 분석결과를 나타낸 것이다. (lane1: Crude samples from P. aeruginosa CJM01, lane2: GPC No. 18 fraction from crude extracts, lane3: GPC No. 19 fraction from crude extracts, lane4: HPLC 1 fraction from GPC No. 18 fraction, lane5: HPLC 2 fraction from GPC No. 18 fraction)

도 8b는 TLC 후 1% 황산 반응 결과를 나타낸 것이다. (lane1: Glucose control, lane2: HPLC 1 fraction from GPC No. 18 fraction, lane3: HPLC 2 fraction from GPC No. 18 fraction)

도 9는 CJM01 시료의 SDS-PAGE 패턴을 나타낸 것이다. (lane1: size marker (GlobinⅢ: 2,512Da, GlobinⅡ: 6,214Da, GlobinⅠ: 8,159Da, GlobinⅠ+GlobinⅢ:10,700Da, GlobinⅠ+GlobinⅡ : 14,404Da, Globin: 16,949Da), lane2: Crude samples from P. aeruginosa CJM01, lane3: GPC No. 18 fraction from crude extracts, lane4: GPC No. 19 fraction from crude extracts, lane5: HPLC 1 fraction from GPC No. 18 fraction, lane6: HPLC 2 fraction from GPC No. 18 fraction).

도 10은 GPC 18의 HPLC 분획 1(A)과 2(B)의 MALDI-TOF 결과를 나타낸 것이다.

도 11a는 표준품의 지방산의 GLC 결과를 나타낸 것이다(RT 67.520 min).

도 11b는 본 발명에 따른 항균물질의 지방산 GLC 결과이다(RT 66.745).

도 12는 본 발명에 따른 항균물질을 CMB26과 10분간 접촉 후 주사현미경사진 이다(왼쪽: 대조구, 오른쪽: 처리구)

항생제(antibiotics)란 미생물이 생산하는 대사산물로 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질로 항균제(antibacterial agent)의 한 갈래이다. 항생제는 일정한 간격으로 지속적으로 복용하여 균을 죽일 수 있는 최소의 혈중 농도를 항상 유지해 주어야 한다. 그리고 증세가 완전히 없어진 후에도 2∼3일은 더 사용해야 한다. 증세가 없어졌다고 해도 몸 안에 남아있든 균들이 항생제의 사용을 중단하면 내성균(resistant bacteria)으로 변할 수 있기 때문이다. 내성균은 다른 균에도 내성을 전이시켜서 내성균이 계속 늘어나게 하기 때문에 내성이 생기면 항균력이 더 강한 항생제를 사용하든지 다른 계열의 항생제로 바꾸어야 한다.

항생제는 구조에 따라서 크게 페니실린류(penicillins), 세팔로스포린 류(cephalosporins), 아미노글리코사이드류(aminoglycosides), 테트라사이클린류(tetracyclines), 클로람페니콜(chloramphenicols)과 퀴놀론류(quinolones) 등으로 분류할 수 있으며, 이들의 항균력은 각각 다른 작용기작을 갖고 있다. 페니실린류는 세균의 세포벽 합성을 억제함으로써 항균작용(antibacterial effect)을 한다. 또한 화농성구균속(Staphylococcus sp.) 등 대부분의 그람양성균(Gram positive bacteria)과 임균류(Gonoccus sp.),ㅇ매독균류(Spirochaeta sp.) 등에 강력한 효과가 있다. 세팔로스포린류도 역시 병원균의 세포벽 합성을 억제하여 살균작용(bactericidal)을 한다. 페니실린에 저항성이 생긴 포도상구균(Staphylococcus aureus)과 같은 그람 양성균뿐 아니라 프로테우스속(Proteus sp.), 세라티아속(Serratia sp.), 엔테로박터속(Enterobacter sp.)과 같은 그람 음성균(Gram negative bacteria) 등에도 효과가 있다. 아미노글리코사이드류는 병원균의 단백질 합성을 억제하며 항균범위가 비교적 넓다. 테트라사이클린류는 화학적으로 테트라사이클린 핵을 가지고 있으며 원핵생물의 ribosome의 30s 소단위(small subunit)에 결합하여 A-site에 aminoacyl-tRNA가 결합하는 것을 방해하여 단백질합성을 억제함으로써 항균작용을 한다. 그람양성균에 효과가 있지만 페니실린보다는 약하다. 살모넬라속(Salmonella sp.), 프로테우스속 등의 그람 음성균의 감염, 서경림프육아종증(lymphogranuloma inguinale)을 일으키는 클래미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 연성하감(chancroid)을 일으키는 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi) 등에 효과가 있다. 클로람페니콜류는 ribosome 50s large subunit의 펩티드 전이효소(peptidyl transferase)를 저해하여 단백질 합성 중 peptide bond가 형 성되는 것을 방해한다. 이 물질은 그람양성균인 장티푸스균(Salmonella typhi), 프로테우스균 등의 그람 음성균인 리케차(Rickettsia) 및 대형 바이러스, 다른 항생제에 저항성이 있는 감수성균 감염에 효과가 있다. 퀴놀론류는 광범위 항생제로써 세균 DNA를 초나선(supercoil)으로 만드는 DNA 선회효소(DNA gyrase)를 억제한다. 또한, 이들은 포도상구균과 폐렴균(Streptococcus pneumoniae)등의 그람 양성균과 녹농균, 살모넬라속등의 그람 음성균에 대해 현저한 항균력을 나타낸다.

페니실린, 세팔로스포린, 아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 클로람페니콜과 퀴놀론 등 다양한 종류의 항생제가 임상적으로 사용되고 있다. 이들은 세포막의 형성을 저해하거나 단백질 합성을 저해하는 등 여러 기작으로 미생물에 대한 항균력을 갖고 있지만 현재에는 많은 미생물들이 이 항생제들에 대한 내성을 갖고 있어 문제가 되고 있다. 대표적으로 포도상구균은 페니실린의 베타락탐링(β-lactam ring)구조를 깨뜨리는 베타 락타메이즈(β-lactamase)를 생산하여 베타락탐계의 항생제에 대한 저항력을 갖는다[9]. 이와 같이 항생제 내성 미생물들은 자신의 염색체나 또는 plasmid에 존재하는 항생제 저항성 유전자를 갖고 있기도 하지만, 때로는 접합(conjugation)에 의해서 다른 균주로부터 저항성 유전자를 획득할 수 있다. 즉, 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium)은 반코마이신(vancomycin)에 대한 저항성을 접합에 의하여 획득한 후, 획득한 저항성 유전자를 같은 방법으로 다른 병원성균주에게 전달(conjugal transfer)[10]할 수 있기 때문에 여러 종류의 항생제에 저항성(multi-drugs resistance)을 갖는 병원균으로 형질전 환(transformation)될 수 있어 multi-drugs resistance 병원균에 대한 새로운 항생제에 대한 연구가 지속되고 있다.

항균물질은 방선균, 푸른곰팡이, 간균, 녹농균 및 형광균등 여러 종류의 미생물들이 생합성 된다. 이 균들은 자신을 보호하기 위해 항균물질을 생산, 분비하고, 이 균들이 분비한 항균물질은 주변의 다른 균들의 생육을 저해하여 생존경쟁의 우위를 점하고자 한다. 이들 중 녹농균 및 형광균과 같은 여러 종류의 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)에서 생산하는 항균물질로는 리포펩타이드류(lipo -peptides)와 람노리피드(rhamnolipid), 파이롤니트린(pyrrolnitrin), 파이오루테오린(pyoluteorin), 페나진류(phenazines) 등이 알려져 있다. 이들은 균의 종류와 분비되는 물질에 따라서 각각 다른 특성들을 갖고 있다.

람노리피드는 일반적으로 한 개 혹은 두개의 람노오스(rhamnose)에 한 개 또는 두개의 지방쇄(lipid chain)를 갖고 있어서 생물 유화제(biosurfactants) 기능을 하고, 조절기작이 밝혀지지 않았지만 대장균군(Enterobacter sp.), 간균, 단구균류(Micrococcus sp.), 연쇄상 구균, 누룩곰팡이류(Aspergillus sp.)등에 대한 항균력을 갖고 있다. 파이롤니트린은 3-chloro-4-(2'-nitro-3'- chloro- phenyl)pyrrole 구조로 이루어져있고, 전자 전송 체계를 저해함으로써 방선균, 간균, 비병원성계상균류(Trichoderma sp.) 등에 대한 항균력을 갖는 것으로 밝혀졌다[12]. 파이오루테오린은 식물병원성 곰팡이에 대해 항균력이 있는 이차대사산물(secondary metabolites)이다. 또한, 페나진은 방향족 아미노산의 전구물질인 코리스믹산(chorismic acid)으로부터 생합성 되며, phenazine-1-carboxylate,1- hydroxyphenazine이나 파이오시아닌(pyocyanin) 형태로 존재한다. 이 물질들은 칸디다속(Candida sp.), 누룩곰팡이류 등의 성장을 저해한다.

Lipopeptide란 친수성인 펩타이드와 소수성인 지방산으로 구성 되어있는 양쪽성 화합물로 공기/물, 물/oil 사이의 경계면의 표면장력을 감소시키는 생물 유화제의 한 종류로 다양한 종류가 알려져 있다. 이들은 화학적 구조의 특성에 따라 항균력에 변화를 야기한다. 먼저, P. fluorescens strain 96.578에서 생합성 된 텐신(tensin)은 cyclic lipopeptide이다. 텐신은 식물 병원성 곰팡이인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항균력이 있는 것으로 알려져 있다. 박테리오신(bacteriocin)은 Pseudomonas 외에도 페디오코커스속(Pediococcus sp.), 락토코커스속(Lactococcus sp.), 락토바실러스속(Lactobacillus sp.), 바실러스속(Bacillus sp.)등에 의해서도 생합성 된다. 그중 Pseudomonas에서 생합성 되는 박테리오신은 2400Da으로 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 그리고 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)에 대한 항균력을 갖고 있다. 에코마이신(ecomycins)은 P. viridiflava 로부터 생산되는 항균물질로 아미노산 종류에 따라 A~C로 구분된다. 이들은 칸디다속, 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 푸사리움속(Fusarium sp.), 리족토니아 솔라니 등에 대해서 항균력을 갖고 있다. 시린고펩틴(syringopeptin)은 P. syringae pv. syringae 에 의해 생합성되는 22~25개의 아미노산으로 구성되어있는 cyclic lipopeptide이다. 그람 양성균인 바실러스속과 식 물 병원성 곰팡이인 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 대해 항균력이 있다. 비스코신아미드(viscosinamide)는 P. fluorescens DR54에의해 생산되는 항균물질로 피티움 울티뮴(Pythium ultimum)과 리조크토니아 솔라니와 같은 식물 곰팡이에 항균력을 갖는다. 코마이신(cormycin)은 P. corrugata에 의해 생산되는 lipodepsipeptide이다. 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 로도토룰라 필리마네(Rhodotorula pilimanae)에 대한 강한 항균력을 갖는다.

미생물에 대한 항균력을 가진 물질은 1929년 플레밍에 의해 페니실린이 발견된 이후 많은 발전이 되고 있다. 이후로 많은 종류의 항생 물질이 발견 되었고, 그에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 미생물들은 각각 다른 종류의 항생제에 대한 반응을 보이고 어떤 항생제에 대해서는 내성을 지니기도 한다. 항생제는 주로 세포내 물질들에 결합하여 세포막 생성저해(페니실린, 세팔로스포린)나, 단백질 합성을 저해(아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 클로람페니콜 등)하는 등의 기작에 의해 균에 대한 항균력을 갖는다. 항생제에 대한 내성의 원인은 여러 기작이 있지만 그중 하나는 이들 항생물질이 균의 세포막을 통과하지 못하면 내성을 갖게 된다. 세포막을 통과하기 위해서는 세포막에 존재하는 단백질들에 의해 물질이 유입된다. 하지만 요즘 연구 되고 있는 리포펩타이드류는 소수성과 친수성을 모두 갖고 있기 때문에 세포막의 단백질을 통해서 세포내로 들어가 작용하는 것이 아니라 세포막의 인지질 이중막(lipidbilayer)을 파괴하기 때문에 지금까지 연구되어 온 항생물질보다 유용하게 이용할 수 있는 것으로 보인다.

또한, 병원균으로부터 자유로워지기 위해서는 병원균에 대한 항균물질이 필 요하다. 항균물질은 세포막 형성을 저해하거나 유전자 발현을 저해하는 등 여러 기작으로 미생물에 대한 항균력을 갖는다. 우리가 알고 있는 항균물질은 1929년에 플레밍에 의해 발견된 페니실린(penecillin)이후로, 세팔로스포린(cephalosporin), 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 테트라사이클린(tetracycline)등 여러 종류가 발견되었다. 이 항균물질의 남용으로 인하여 많은 병원성 균들이 저항성을 갖기 때문에 새로운 항균물질의 지속적인 개발이 필요하다.

에이코사펜타에노산은 분자량이 302.44로 이중 결합이 5개가 있는 고도불포화 지방산 (20:5(5,8,11,14,17) )으로 분자식은 CH₃CH₂(CH=CHCH₂)₅(CH₂)₂COOH이다. 에이코사펜타에노산은 도코사헥사노에노산(docosahexaenoic acid(DHA))처럼 LDL-cholesterol을 감소시키고 HDL-cholesterol을 증가시키며 중성지방을 저하시키는 작용이 리놀산 보다 강하다고 알려져 있으며 심혈관계 질환에 유효한 것으로 알려져 있다. 에이코사펜타에노산은 몸 안에서 생성되지 않기 때문에 음식물을 통해 섭취해야 한다. 식물성 플랑크톤이나 해수산 클로렐라 등에 많이 함유되어 있고, 이를 먹는 어류 또는 이 어류를 먹이로 하는 물범 등 해양포유류의 몸에 축적된다. 고급생선보다는 고등어, 꽁치, 참치 등의 등푸른 생선에 많이 함유되어 있는데, 함유량이 가장 많은 것은 정어리이다. 어류 양식시 사료에 첨가하지 않으면 부화ㅇ생장이 저해된다.

덴마크의 다이아베르그 박사가 물고기와 바다표범을 주식으로 하고 있는 에스키모인에게 동맥경화, 뇌경색, 심근경색 등의 성인병이 적다는 사실을 발견ㅇ연 구한 결과, 에이코사펜타에노산 섭취에 따른 체질 때문임을 밝힌 이후 중요시되었다. 인체기능에 꼭 필요한 영양소일 뿐 아니라 혈중 콜레스테롤저하와 뇌기능을 촉진시키는 작용과 함께, 류머티스성 관절염, 심장질환, 동맥경화증, 폐질환의 예방과 치료에도 좋다는 연구결과가 보고되었다. 또 에이코사펜타에노산에서 유도된 TXA3와 PGI3은 육지동물의 혈소판에 들어 있는 TXA2의 생성을 저해하여 결과적으로는 이에 의한 혈소판응집억제 작용을 한다. 현재 함유식품은 건강식품으로서 많이 식용되고, 에이코사펜타에노산 제제는 혈소판응집에 의한 혈전증 예방약으로 시판되고 있다.

한편, 에이코사펜타에노산을 함유하는 항생제 및 이를 항균 목적으로 사용하는 용도는 본 발명이 최초이다.

본 발명의 목적은 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid)을 함유하는 것을 특징으로 하는 항생제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 그람양성 및 그람 음성 세균에 대한 항균 균주 슈도모나스속 CJM01을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 슈도모나스속 CJM01를 배양하여 배양물로부터 에이코사펜타에노산을 생산하는 방법 및 그 용도를 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid), 약제학적으로 허용되는 염 또는 이들의 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 항생제를 포함한다.

또한, 본 발명은 그람양성 세균에 대한 항균 균주 슈도모나스속(Pseudomonas sp.) CJM01(KCTC 10941BP)을 포함한다.

또한, 본 발명은 슈도모나스속 CJM01 균을 배양하여 배양물로부터 에이코사펜타에노산을 생산하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 및/또는 배양액을 함유하는 동물사료 첨가제를 포함한다.

또한, 본 발명은 슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 및/또는 배양액을 함유하는 미생물 살균제를 포함한다.

또한, 본 발명은 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid)을 함유하는 것을 특징으로 하는 치약, 가글제, 화장품을 포함한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid), 약제학적으로 허용되는 염 또는 이들의 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 항생제를 제공한다.

상기 본 발명에 의한 항생제에 있어서 "약제학적으로 허용되는 염"은 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기산을 포함하며 약제학적으로 허용되는 무독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 포함한다.

또한, 상기 항생제에 있어서 "이들의 유도체"는 유리 하이드록시, 아미노 또는 카보사이클릭 그룹의 유도체 (예, 에스테르, 에테르, 아미드, 카보네이트, 카바메이트 및 N-알킬 유도체)를 포함한다.

본 발명의 에이코사펜타에노산을 함유하는 항균물질은 세균의 세포벽을 순간적으로 파괴하는 항생제로 약제내성 출현빈도가 낮고 자연에서 쉽게 분해되는 친환경 항생제이다. 본 항생제는 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 충치균등 동물과 사람에 자주 발생하는 병원균에 특이적인 항균작용을 갖고, 특히 벤코마이신 저항성(VRE), 메칠로마이신저항성(MRE)등 항생제 내성 균주에 특이적인 항생제이다.

본 발명의 에이코사펜타에노산을 유효성분으로 함유하는 항생제는 항균제, 항진균제 및 식품 방부제, 화장품 보존제와 의약품 보존제의 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 에이코사펜타에노산 및 유도체는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 에이코사펜타에노산 및 유도체는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사 용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 에이코사펜타에노산 및 유도체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 에이코사펜타에노산 및 유도체의 유효용량은 1∼2 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.5∼1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 에이코사펜타에노산을 유효성분으로 함유하는 항생제는 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항생 펩타이드의 투여 농도는 약의 투여 경로 및 치료 회수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있다.

본 발명은 슈도모나스속 CJM01 균을 배양하여 배양물로부터 에이코사펜타에노산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 토양에서 분리한 신규한 균주인 Pseudomonas sp . CJM01은 Bacillus thuringiensis CMB26에 대해 높은 항균 능력을 나타낸다. CMB26은 lipoepetides를 분비하는 미생물로서 식물 병원성 곰팡이에 대한 항균력을 갖는 균이다(Kim PI et al., J Appl Microbiol. 2004; 97(5): 942-9). CJM01에서 분비하는 물질은 CMB26 이외에도 항생제 내성을 갖고 있는 균(Staphylococcus sp.)이나, 탄저균(Bacillus anthracis), 충치원인균(Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus)과 같은 여러 종류의 병원균에 대하여 항균력을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에서는 CJM01 균주가 생산하는 항균 물질을 분리 정제 하고, 이 물질의 구조를 밝혔다.

본 발명에서 토양으로부터 분리하여 사용한 균주는 바실러스속(Bacillus sp.)에 대한 항균력을 갖고 있는 연녹색의 균이었고, 이 균의 이름을 CJM01이라 명하였다. CJM01의 16s rRNA 유전자의 염기서열 비교결과 슈도모나스 아르기노사(Pseudomonas aeruginosa PA01)와 99.6% 동일하였다. 따라서 CJM01을 Pseudomonas sp. CJM01로 명명하였으며, KCTC 유전자은행에 2006년 4월 26일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 10941BP 이다.

바실러스속 CJM01에 의해 분비되는 물질은 그람 양성균인 바실러스속 스트렙토코커스속(Streptococcus sp.), 스타필로코커스속(Staphylococcus sp.)에 강력한 항균력을 갖고, 그람 음성균으로 식중독 및 어병균인 Edwardsiella tarda 과 Samolella, 비브리오(Vibrio)와 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici)에 대한 항균력을 갖고 있다.

바실러스속 CJM01에 의해 분비되는 항균물질은 동량의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출한 다음 최소량의 메탄올(methanol)에 녹여 GPC(Gel Permeation Chromatography)에 의해 일차 분리정제한 후, HPLC(High Pressure Liquid Chromatography)를 이용하여 분획을 받아 활성을 확인 한 결과 2개의 분획에서 항균력을 보였다. 이 2개의 분획의 분자량은 MALDI-TOF에 의해 분석결과 4819와 4823Da이었다. 본 발명에 의하면 바실러스속 CJM01 균주가 분비하는 에이코사펜타에노산은 팹타이드가 결합된 리포펩타이드(lipopeptide)인 것으로 밝혀졌다.

본 발명에서 토양에서 분리한 신규한 슈도모나스 CJM01균주는 그람 양성 세균과 그람 양성 병원균 그람 음성 병원균에 특이적으로 항균작용을 갖는다. 슈도모나스 CJM01균주가 생산하는 항균물질은 두뇌발달에 관여하는 것으로 알려진 에이코사펜타에노 지방산을 기본 구조로 갖고 있는 새로운 개념의 항생제이다.

본 발명에 의한 슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 및/또는 배양액은 동물사료에 첨가제로 포함될 수 있다. 또한, 슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 및/또는 배양액은 미생물 살균제에 포함될 수 있다.

이하 본 발명은 내용을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 균주 및 배양

본 발명에서 토양으로부터 CJM01 균주를 분리하여 사용하였으며, 본 발명에서 사용된 전체 균주들은 표 1과 같다. 물질 추출 및 활성 확인을 하기위한 균 배양 배지로는 Luria-Bertani 액체배지(LB: tryptone 10g/ℓ, yeast extract 5g/ℓ, sodium chloride 10g/ℓ), LB 한천배지(LB broth, 15% agar), 항균 물질 생산배지로는 M9 액체배지(Na₂HPO₄ 6g/ℓ, KH₂PO₄ 3g/ℓ, NH₄Cl 1g/ℓ, NaCl 0.5g/ℓ, 40% glucose 10㎖/ℓ, 1M MgSO₄ 7HO 1㎖/ℓ, 0.1M CaCl₂ 1㎖/ℓ)를 사용하였다.

<표 1>

strain	source
Pseudomonas sp . CJM01	our lab
Bacillus anthracis	KCTC 3561
Bacillus thuringiensis CMB26	our lab
Bacillus thuringiensis	KCTC 1034
Bacillus thuringiensis	KCTC 1508
Bacillus thuringiensis	KCTC 1509
Bacillus thuringiensis	KCTC 1519
Bacillus subtilis	KCCM 12252
Staphylococcus aureus	KACC 10778
Staphylococcus warneri	KACC 10785
Staphylococcus schleiferi	KACC 10789
Escherichia coli JM109	our lab
Escherichia coli DH5 ??	our lab
Escherichia coli 0157	our lab
Vibrio sp .	Dr. Choi's lab
Vibrio anguillarm	Dr. Choi's lab
Acinetobacter sp .	KCCM 40421
Pseudomonas agarici	ATCC 25941
Streptococcus mutans	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	ATCC 33478
Edwardsiella tarda	our lab
Salmonella sp.	our lab

[실시예 2] CJM01의 길항력

항균력 확인은 37℃에서 12시간 이상 LB 액체배지에서 배양된 균을 LB 한천 배지에 도말하여 37℃에서 1시간 동안 키운 후 시료를 적신 paper disc를 이용하여 확인하였다. 균은 LB 한천배지(37℃, standing incubator)에서 배양하였고, 5㎖ LB 액체배지(37℃, 150rpm shaking incubator)에서 12시간 동안 배양하였다. 이 항균물질의 생산은 M9 액체배지(37℃, 150rpm shaking incubator) 1ℓ에 종균 1㎖을 접종하여 25시간 동안 배양하였다.

그 결과 CJM01의 여러 종류의 ??원성 미생물에 대한 길항력은 도 1, 2 및 표 2와 같았다. 표 2에서 보는 바와 같이 CJM01은 그람 양성(G(+))과 음성균(G(-)에 관계없이 실험균 대부분에 대하여 항균력을 나타냈다. 항균력 측정은 Inhibition zone의 직경을 측정하였다.

특히 동물과 사람에게 치명적인 병을 일으키는 Bacillus cereus family에 속하는 탄저병원인균인 B. anthracics, 식중독 원인균인 B. cereus(data not shown), 어병 및 식중독균인 Edwardsiella tarda, Salmonella sp. 식품 부패에 원인을 제공하는 B. mycoides(data not shown)와 B. megaterium (data not shown) 그리고 BT toxin을 분비하여 곤충을 사멸시키는 B. thuringiensis 및 B. subtilis에 대해 강한 길항력을 보여 주었다. 또한 여러 가지 항생제에 대한 저항성 균(multidrug resistance pathogens) 들인 Staphylococcus aureus, Staphylococcus warneri 및 Staphylococcus schleiferi 등에 대하여 우수한 길항력을 갖고 있었고, 그람 양성균으로 동물과, 사람의 대표적인 충치 원인균인 Streptococcus mutans 와 Streptococcus sobrinus에 대해서도 항균력을 보였다. 그리고 그람 음성균인 Pseudomonas agarici, Edwardsiella tarda, Salmonella sp.에 대하여는 그람 양 성과 동일한 길항력을 보였으나, Vibrio sp. 에 대하여는 약한 길항력을 보였고, 대장균(E.coli )과 폐렴이나 폐혈증에 원인이 되는 Acinetobacter sp. 에 대한 길항력은 없었다.

<표 2>

Test strain	G(-) or G(+)	Inhibition zone(㎜)
Bacillus anthracis	G(+)	35
Bacillus thuringiensis CMB26	〃	25
Bacillus thuringiensis KCTC1034	〃	32
Bacillus thuringiensis KCTC1508	〃	15
Bacillus thuringiensis KCTC1509	〃	25
Bacillus thuringiensis KCTC1519	〃	30
Bacillus subtilis KCCM12252	〃	32
Staphylococcus aureus KACC10778	〃	25
Staphylococcus warneri KACC10785	〃	15
Staphylococcus schleiferi KACC10789	〃	34
Streptococcus mutans ATCC25175	〃	20
Streptococcus sobrinus ATCC33478	〃	22
Escherichia coli JM109	G(-)	-
Escherichia coli DH5??	〃	-
Escherichia coli 0157	〃	-
Vibrio sp.	〃	15
Vibrio anguillarm	〃	15
Acinetobacter sp. KCCM40421	〃	-
Pseudomonas agarici ATCC25941	〃	30
Edwardsiella tarda	〃	35
Salmonella sp .	〃	35

[실시예 3] CJM01의 동정

본 발명에서 CJM01의 동정을 위해서 16s rRNA의 염기서열을 확인하였다. 먼저, CJM01로 부터 Rogers and Bendich의 방법(Rogers and Bendich Rogers, S.O. and Bendich, A.J.. Plant Molecular Biology 1985 5:69-7)으로 genomic DNA를 추출하였다. 이 추출한 DNA를 일반적으로 보급되어있는 그람 음성균의 universal 16s rRNA primer를 이용하여 320bp 염기서열 분석을 한 다음 이 서열이 P. aeruginosa PA01과 유사함을 알고, P. aeruginosa PA01균주의 16s rRNA 유전자의 전체염기서열(full genome sequence)를 이용하여 PA01 F, R primer를 합성하여 PCR을 수행하였다(표 3). PCR의 산물은 한국 기초과학 지원센터 광주·전남 분소에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다(도 3). CJM01의 분석된 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information, USA.)에서 비교, 분석한 결과 P. aeruginosa PA01과 99.6%의 상동성(homology)을 보였다. CJM01을 Pseudomonas sp. CJM01로 명명하였으며, KCTC 유전자은행에 2006년 4월 26일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 10941BP 이다.

<표 3>

From	name	sequence
Universal Gram (-) 16s rRNA primer	G(-)F primer	TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC
Universal Gram (-) 16s rRNA primer	G(-)R primer	CCCACTGCTGCCTCCCGTAGG
P. aeruginosa PA01	PA01F primer	GCCATGCAGCACCTGTGTCTG
P. aeruginosa PA01	PA01R primer	CGTCGGGCTCTACCTGCTGG

[실시예 4] 항균물질의 정제

배양한 균체는 원심분리(6000rpm, at 4℃, for 20min)로 제거하고 배양액을 얻었다. 이 배양액에 동일 부피의 에틸아세테이트를 넣고 30분 동안 섞어주었다. 뷰렛을 이용하여 배양액 층과 에틸아세테이트 층을 분리하고 에틸 아세테이트 층을 모은 다음, 에틸아세테이트는 evaporator를 사용하여 증발시켰다. 샘플을 최소량의 메탄올에 녹여낸 다음 0.20㎛ non-pyrogenic hydrophilic filter(Sartorious AG, Goettingen, Germany)를 이용하여 여과하였다.

Gel Permeation Chromatography:

에틸아세테이트에 의해 추출된 시료원액은 Gel Permeation Chromatography로 의해 일차정제 하여 총 95개의 분획을 획득하였다(도 4). 길이 60cm 직경 2㎝의 컬럼(column)은 Sephadex^TM LH-20(Amersham Biosciences Co.)으로 충전한 후 AKTA FPLC(Amersham Biosciences Co.)를 이용하여 물질을 정제하였다. 2㎖(1㎎/㎖)의 시료를 컬럼에 주입한 후 분당 1㎖의 유속으로 메탄올을 흘려주어 900분 동안 시료를 분리 정제 하였다. 215nm에서 관찰하였고 한 튜브에 5㎖ml씩 모아 건조 시킨 후 활성 확인 하였다.

HPLC:

항균력이 있는 샘플은 Hewlett Packard Serise 1100 G1322A with Vydac 208TP54 reverse phase C8 column(4.6㎜ID ㅧ 25㎝ L, 5㎛ particle diameter, Vydac Co.)을 이용한 semi-preparative HPLC를 사용하여 분리 정제 하였다. 시료는 20㎕(100mg/ml)가 주입되었고, 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)를 함유한 10% acetonitril 에 0.1% TFA를 함유한 100% aceto -nitril 까지 1분당 1㎖ 씩 45분 동안 농도구배를 주어 흘려줌으로써 분리 정제하였다. 215㎚에서 흡광도의 변화로 시료의 용출을 확인 하였고, 각 분획별로 물질을 모아 건조 시킨 후 100㎕ 메탄올에 녹여 이중 10㎕를 이용하여 항균력을 확인하였다.

항균력이 있는 분획을 모으기 위하여 Vydac 208TP54 reverse phase C8 column 을 이용하여 0.1% TFA를 함유한 50% Acetonitril에 0.1% TFA를 함유한 70% Acetonitril까지 1분당 1㎖씩 20분을 흘려줌으로써 분리 정제 하였다.

상기 95개 분획을 진공건조기(voccum dry)를 이용하여 완전 건조 시킨 다음, 1㎖의 메탄올에 재용해한 후 20㎕를 이용하여 B. thuringiensis CMB26에 대한 항균력을 확인하였다(도 5). 그 결과, 16~22번 분획에서 항균력을 나타냈다. 이중 항균력이 높은 18번과 19번을 이용하여 HPLC를 통한 이차정제를 하였다(도 6). 관찰되는 분획별로 시료를 모으고 모아진 시료들은 진공건조기를 이용하여 완전 건조 시킨 다음 200㎕ 메탄올에 재 용해시킨 후 20㎕를 이용하여 B. thuringiensis CMB26에 대한 항균력을 확인하였다(표 5, 도 7).

[실시예 5] Thin Layer Chromatography

분석을 위해 활성이 있는 샘플을 silica gel 60 F254(Mecrk KGaA 64271 Darmstadt, Germany)에서 분리하였다. 이동상 용매는 클로로포름(chloroform)-메탄올(Methanol)-H₂O(65:25:4 vol/vol/ vol)와 아세톤니트릴(acetonitrile)-H₂O(85:15 vol/vol)을 사용하였고, 확인을 위해 0.2% 닌히드린(ninhydrin)과 40% H₂SO₄, 1% H₂SO₄을 뿌린 후 200℃에서 5~30분 동안 발색시켰다.

원액, GPC 18, GPC 19, HPLC 1, HPLC 2 분획들의 TLC분석 결과 3개의 spot을 확인 할 수 있었고(도 8a), 이 spot 중에서 중앙 spot에서 활성을 확인할 수 있었다. acetonitrile : H2O = 85 : 15를 이용한 TLC 후 1% 황산 반응 결과 대조구로 포도당(glucose)을 사용하였다(도 8b). 그 결과 당은 검게 반응을 일으킴에 반해 시료는 노란색으로 나타나는 것으로 보아 당은 존재하지 않음을 확인 하였다. TLC 분석 결과로써는 HPLC 1번 분획보다 2번 분획이 정제가 잘 되었음을 확인 할 수 있었다. 그리고 닌히드린(ninhydrin) 반응이 일어나는 것으로 보아 이 시료에는 펩타이드 결합(peptide bond)이 존재할 것이라 추정되었다. 또한, GC분석에 의해 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid)이 존재함을 확인 하였다. 이러한 결과는 CJM01 균주가 분비하는 항균 물질은 에이코사펜타에노산을 포함한 리포펩타이드(lipopeptide)의 한 종류로 추정된다.

[실시예 6] Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE )

활성이 있는 시료들은 말린 후에 0.1㎎/㎖ 메탄올에 녹인 후 20kDa 이하의 단백질을 분석할 수 있는 Tricin SDS-PAGE(Schagger H, von Jagow G., Anal Biochem. 1987 Nov 1;166(2):368-79)를 이용하여 분석하였다. 전기영동 후에 겔은 silver staining(EZbiopac, Co., LTD.)을 이용하여 염색하였다(도 9). 원액, GPC 18, GPC 19, HPLC 1, HPLC 2를 전기영동 해본 결과 다섯 가지 시료에 있어서 차이점이 보이지 않게 끌림 현상이 있음을 확인 할 수 있었다. 이는 시료에 lipid가 존재하여 일어나는 현상일 것으로 추정된다.

[실시예 7] MALDI-TOF 질량분석기를 사용한 질량분석

HPLC에 의해 분리한 샘플을 메탄올에 녹여 0.1㎎/㎖ 농도가 되도록 하고 acetonitrile: water: trifluoroacetic acid (50:50:0.1,v/v/v)에 녹인 0.1%　2,5-Dihydroxybenzoic acid와 1:1 부피로 섞어 stainless-steel sample slide에 spotting 하여 말린 후 MALDI-TOF MS (Applied Biosystems Voyager-DE STR)를 이용하여 질량 분석을 하였다. 그 결과 P. aeruginosa CJM01로부터 분리 정제된 2가지 분획들의 분자량은 4819Da과 4823Da로 추정되었다(도 10).

[실시예 8] Gas Liquid Chromatography를 이용한 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid) 분석

항균성을 갖는 물질의 지방산 분석은 Wungaarden의 방법에 준하였다. 분지 정제된 시료를 BF₃-methanol을 이용하여 methyl ester로 조제하여 분석용 시료로 하였다. 즉, 지방질 시료가 들어 있는 50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 0.5N 메탄올성 수산화나트륨 2㎖를 가하고 냉각관에 연결시켜 물중탕에서 5분 정도 끓이고 다시 핵산 4㎖를 가해 2~3분간 더 끓이며 여기에 염화나트륨 포화용액을 충분히 가하여 액체 표면이 플라스크의 검량선까지 오도록 하였다. 이때 핵산층에서 10㎖를 취하여 50℃에서 회전감압 농축하여 1㎖를 cap test tube에 옮기고 소량의 무수 황산나트륨을 가하여 수분을 제거한 후 하루 이내에 Gas Liquid Chromatography(GLC)를 이 용하여 분석하였고 분석조건은 아래와 같으며 이때 지방산의 정량은 methylester화된 표준품(Sigma Co. U.S.A)과 함께 분석하여 구하였다.

· 분석조건

Item	Condition
Instrument	5890 Series-II GC (Hewlett Packard Co. USA)
Detector	Flame ionization detector
Column	HP-innowax (Crosslinked Polyethylene Glycol) (50ml ㅧ 0.2mm ID)
Carrier gas	N₂
Oven temp.	190℃
Injection temp.	220℃
Detector temp.	250℃
Injection volumn	2.0μl

지방산 GLC 분석 결과 상기 항균물질은 88.745분(min)에서 유일한 peak가 나타났다( 도 11 a). 이 peak에 해당하는 지방산을 표준품의 분석표와 비교한 결과 87.520분(min)에서 peak를 보이는 에이코사펜타노익엑시드(eicosapentaenoic acid)임을 알 수 있었다(도 11 b). 이러한 결과는 본 발명 항균 물질에 지방산인 에이코사펜타에노산이 포함하고 있음을 나타내는 것이다.

[실시예 9]

에이코사펜타에노산이 포함된 정제된 항균물질을 바실러스속(Bacillus sp .)CMB26 균주와 30분간 접촉시킨 후 주사전자 현미경사진을 촬영한 것이다. 그림에서 보듯이 본 발명 항균물질은 접촉즉시 세균의 세포벽을 파괴하는 것을 볼 수 있다(도 12).

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 에이코사펜타에노산을 함유하는 항균물질을 제공함으로써, 상기 항균물질을 의료 보조용 건강식품 및 에이코사펜타에노산을 함유하는 항생제로 사용할 수 있게 한다. 상기 항생제는 포도상구균, 연쇄상구균, 탄저균, 충치균 등 동물과 사람에 자주 발생하는 병원균 및 항생제 내성 균주에 특이적으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 항생제는 동물, 사람에 자주 발생하는 식중독균, 항생제내성 감염 동물 및 환자 치료, 유방염, 상처 부위나 피부이식시 썩음병, 충치균 예방용 치약, 가글 등에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 토양에서 분리한 그람양성 세균에 대한 항균 균주 슈도모나스속 CJM01 및 에이코사펜타에노산 및 이를 함유하는 항생물질의 생산방법을 제공함으로써, 상기 균주로부터 에이코사펜타에노산 및 에이코사펜타에노산 함유하는 항균물질을 생산할 수 있게 한다.

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그람양성 세균에 대한 항균 균주 슈도모나스속(Pseudomonas sp.) CJM01(KCTC 10941BP).
슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균을 배양하여 배양물로부터 에이코사펜타에노산을 생산하는 방법.
슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 또는 슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 배양액을 함유하는 동물사료 첨가제.
슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 또는 슈도모나스속 CJM01(KCTC10941BP) 균체 배양액을 함유하는 미생물 살균제.
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