KR101346656B1

KR101346656B1 - 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101346656B1
Application number: KR1020120096312A
Authority: KR
Inventors: 박영환; 이기훈; 곽효원; 차범규
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2013-12-30

Abstract

본 발명은 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물을 함유하는 실크 피브로인(Silk Fibroin) 나노섬유 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체는 독성이 없고, 생체적합성이 우수하며, 생체재료로 활용되기에 충분한 물성을 가지고 있으며, 실크 피브로인 나노섬유 내에 항혈전 효과를 나타내는 스피루리나 추출물이 전체적으로 균일하게 내부 담재되어 있어, 장기간 항혈전효과를 나타내므로, 지속적인 항혈전성이 요구되는 인공혈관 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 및 이의 제조방법{A silk-fibroin nanofibrous web containing Spirulina maxima extracts and method of preparation thereof}

본 발명은 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 및 이의 이용한 세포의 부착, 증식 및 재생용 이식재에 관한 것이다.

조직공학 기술이란 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조하고 이를 이용하여 생체조직 및 장기를 재생하는 기술이다. 조직공학 기술의 기본적인 원리는 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고 그 조직으로부터 세포를 분리한 다음 분리된 세포를 지지체에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것이다.

조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기의 재생에 적용되고 있다. 이와 같은 조직공학 기술에서 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위해서는 기본적으로 생체조직과 유사한 지지체를 제조하는 것이 우선이다. 상기 지지체의 기본적인 요건으로는 조직세포가 지지체에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있는 틀의 역할을 충분히 해야 하며, 생체에 이식된 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성 등이 있어야 한다.

미세조류(microalgae)는 해양 생태계의 생산자로서 스스로 광합성을 하는 단세포 생물이다. 스피루리나(Spirulina)는 미세조류 중에서도 녹조류의 일종으로 단백질, 필수지방산, 비타민, 미네랄 등이 풍부하여 인류의 식량자원으로 이용되어 왔고 가축의 사료나 수산양식에서도 널리 활용되어 왔다. 그러나 최근에는 미세조류가 다양한 생리활성 물질을 가지고 있음이 밝혀지면서 식품영양학, 피부미용학, 약학, 의학 등 생명공학 분야에서 주목받고 있다. 예컨대 스피루리나는 FDA(Food and Drug Administration)에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 승인을 받아 인체에 무해한 영양분과 약리적 성분을 제공하는 첨가제로서 활발히 연구되고 있다.

미세조류는 그 종류가 수십만에 이르고, 생장환경에 따라 다양한 생리활성 물질을 만들어 낸다. 특히 심해저나 용암지대 등 극한의 환경에서 자라는 미세조류에서는 육상에는 없는 새로운 기능성 물질이 발견되기도 한다. 따라서 미세조류는 그야말로 다양한 생리활성 물질의 보고라 할 수 있다. 그리고 미세조류는 대량생산이 용이하다. 실제로 산업분야에서는 미세조류를 식품이나 수산양식용으로 대량 배양하여 왔다. 최근에는 바이오에너지 분야에서 미세조류를 바이오매스(biomass)로 활용하기 위하여 미세조류의 생산량을 증대하기 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있어 앞으로 미세조류의 산업적 가치는 더욱 높아질 것이다. 따라서 미세조류를 생체재료로 활용하는 연구는 해양생명체 유래의 생체 활성 물질을 확보하는 원천기술을 선점하고 조직공학산업과 해양 바이오산업이라는 두 가지의 고부가가치 산업의 복합화를 통한 초고부가가치 산업을 선도할 수 있다는 점에서 큰 의미를 가진다. 더욱이 미세조류는 해양자원으로서 육상자원이 고갈되고 환경관련 규제가 강화될수록 그 중요성이 커질 것이다.

피코시아닌(Phycocyanin)은 남조류(cyanobacteria), 홍조류(rhodophytes), 땅속식물(cryptophytes)에서 발견되는 푸른색 색소이며, 특히 남조류가 고유의 푸른색을 가지는 것은 바로 피코시아닌을 다량 함유하고 있기 때문이다. 피코시아닌은 물에 녹으며 아주 강한 형광을 나타내고 항산화기능이 뛰어난 물질이다. 실제로 피코시아닌은 남조류가 식품, 화장품, 약품 등으로 활용되는데 필요한 핵심성분이다. 따라서 피코시아닌에 대한 연구 역시 매우 활발하게 진행되고 있으며 특히 최근에는 생명공학분야의 논문과 특허의 수 역시 증가하고 있다.

피코시아닌은 복합단백질로서 단백질 부분과 비단백질 부분으로 나뉜다. 비단백질 부분은 phycocyanobilin라고도 불리며 광합성에 관여하는 색소로서 열린고리 테트라피롤의 구조로 되어있다. phycocyanobilin은 펩티드결합을 통해 단백질 부분과 연결되어 있으며 전체적인 피코시아닌 단백질은 약 45000D의 분자량을 갖는다. 피코시아닌은 약 620 nm파장의 빛을 흡수하여 약 650 nm파장의 형광을 나타낸다. 특히 이때 형광의 세기가 매우 강해서 형광 탐침으로도 자주 활용되고 있다.

피코시아닌은 남조류 등 기타 미세조류로부터 추출하고 있으며 이때 가장 많이 이용되는 종이 바로 스피루리나이다. 스피루리나는 피코시아닌을 다량 함유하고 있을 뿐만 아니라 배양효율이 높기 때문이다. 스피루리나로부터 피코시아닌을 추출하는 방법은 매우 다양한데 크게 Water extraction, Homogenization, Freezing-thawing, Sonication 방법 등이 있다. 최근에는 더욱 높은 순도의 피코시아닌을 얻기 위해 크로마토그래피를 사용하기도 한다. 피코시아닌의 순도는 피코시아닌 고유의 흡광파장인 620 nm에서의 흡광도와 모든 단백질이 가지고 있는 아로마틱 아미노산의 흡광파장인 280 nm에서의 흡광도를 상대적으로 비교하여 평가한다. 피코시아닌 고유의 흡광파장은 바로 비단백질 부분인 phycocyanobilin에 의한 것이며 피코시아닌 고유의 형광성질 역시 이 부분 때문에 발생하게 된다. 일반적으로 피코시아닌의 순도, 즉 A ₆₂₀/A ₂₈₀의 값이 0.7 이상이면 food grade 라고 평가받고 있다. 그리고 순도 값이 3.9 이상이면 reactive grade, 그리고 4.0을 초과하면 analytical grade로 인정받는다. 그러나 일반적으로 순도가 높아지면 피코시아닌의 수율이 낮아지는데 0.74의 순도에서는 약 34%의 수율, 3.91의 순도에서는 약 9%의 수율이 얻어진다고 보고된 바 있다. 그리고 현재까지 얻어진 가장 순수한 피코시아닌은 그 순도가 6.69에 이른다.

최근 스피루리나의 기능성을 이용한 조직공학용 지지체 개발에 있어서 스피루리나 미세조류를 함유하는 나노섬유를 전기방사법을 이용하여 제조하는 연구가 진행되어 왔다. 스피루리나 단독으로는 전기방사를 할 수 없어 다른 생체고분자와 블렌드 하여 나노섬유를 제조하였는데 Morais 등은 PEO(polyethyleneoxide)에 스피루리나를 첨가하여 나노섬유를 제작할 수 있음을 보고하였다. 또한, Kim 등은 PCL(polycaprolataone)에 스피루리나를 함유시켜 전기방사 하였고 제조된 나노섬유 매트의 생체적합성을 확인하였다. 그러나 상기 두 논문 모두 전기방사 성공 여부만 확인했을 뿐, 전기방사 과정과 방사조건에 대한 고찰이 부족하고 특히 PEO는 물에 용해되기 때문에 실제로 생체재료로 응용하는데 문제점을 갖고 있다. 또한, 나노섬유 매트에 대한 보고는 스피루리나의 생리활성능을 검증하지 못하고 단지 스피루리나를 함유하는 경우 PCL 나노섬유의 세포증식이 잘 이루어지는 결과만을 도출하였다. 생분해성 고분자인 PCL은 기계적 물성이 우수하며 조직공학용 지지체의 재료로서 많은 연구가 진행되고 있으나 천연고분자에 비하여 생체적합성이 떨어지므로 스피루리나의 첨가 효과와 성능을 제대로 평가하는데 한계가 있다.

지혈 과정은 크게 혈소판에 의한 혈소판 마개의 형성과 혈장 단백질의 응고인자에 의한 혈전 생성으로 나눌 수 있다. 먼저, 혈관이 손상되면 혈소판이 혈관 내피 표면에 접착하게 된다. 특히 혈관이 손상되면 혈관 내 콜라겐 분자가 노출되는데 이때 혈소판은 혈장단백질 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor, vWF)를 분비하여 이를 매개로 콜라겐에 부착한다. 이 단백질은 노출된 콜라겐 분자를 변형시켜 혈소판이 잘 부착할 수 있게 도와준다. 이렇게 부착된 혈소판은 다양한 화학적 작용 물질을 분비하기 시작하는데 이를 혈소판 활성화(platelet activation)라고 한다. 혈소판의 대사, 형태, 표면 단백질에 다양한 변화를 가져오는 아데노신2인산(ADP)과 세로토닌 등이 혈소판의 활성화를 야기시키며 이들 변화과정 중 오래된 혈소판에 새로운 혈소판을 부착시키는 과정이 발생하는데 이를 혈소판 응집(platelet aggregation)이라고 한다. 이러한 일련의 과정을 통해 결국 혈소판이 응집되어 혈소판 마개(platelet plug)를 형성하게 된다. 혈소판 마개는 혈관 벽의 작은 손상 부분을 완전하게 보완할 수 있다. 이는 상대적으로 빠른 시간에 일어나는 일차적인 지혈과정이다.

혈소판 마개가 형성되고 나면 이차적으로 혈액 응고(blood coagulation 또는 clotting) 과정이 일어난다. 이는 혈액이 혈병(clot) 또는 혈전(thrombus)이라고 하는 겔(Gel) 형태로 응고하는 현상이다. 특히 혈병은 주로 섬유소(fibrin)라고 알려져 있는 단백질의 고분자중합체로 구성되어 있다. 혈액 응고는 1차적으로 형성된 혈소판 마개의 주변에 국소적으로 발생하게 된다. 그러나 이는 가장 우세한 지혈 작용으로서 매우 강력하게 손상된 혈관 벽을 제어한다. 미리 발생한 혈소판 마개를 더욱 강화시키며, 상처 부위에 남아있는 혈액들을 모두 응고시켜 버린다. 이 혈액응고 과정은 혈소판 응집과 마찬가지로 혈관의 손상으로 시작된다. 혈액이 손상된 혈관 조직의 기타 물질들과 접촉하게 되면 국소적으로 계단식 단계반응으로 화학물질들을 활성화 시킨다. 즉, 비활성 혈장단백질, "인자(factor)"는 단백질 가수분해효소로 전환(활성화)되어 다음 단계에 필요한 효소의 생산을 촉매 하게 된다. 결과적으로 트롬빈은 고분자인 혈장단백질 섬유소원을 가수분해하여 폴리펩티드로 나누며 그 다음에 섬유소원의 잔여물이 서로 결합하여 섬유소를 형성하게 된다. 이렇게 형성되는 섬유구조에 적혈구와 기타 세포 등이 걸려 함께 응고하게 되는데 이렇게 형성된 고형의 물질이 바로 혈전이다.

앞서 살펴본 지혈 과정 중 두 번째 과정인 혈장 단백질에 의한 혈액응고인자의 활성화 과정을 구체적으로 살펴보면, 겉보기로는 병행적인 두 경로로 구성되어 있다. 그러나 이 두 가지 경로는 결국 프로트롬빈이 트롬빈으로 활성화되는 작용에서 함께 상호적으로 작용하게 되어 이후의 공통 경로로 동시에 진행하게 된다. 그러나 실제로 이 두 경로는 순차적으로 활성화되며, 병행적이라고는 하나 곳곳에서 서로 상호작용하며 연관되어 일어나는 상호복합적인 반응과정이다. 내인성 경로(intrinsic pathway)는 혈액 내의 구성성분에 의해서 반응이 진행되며 외인성 경로(extrinsic pathway)는 혈액 외부의 세포성 인자가 함께 관여하여 진행되는 반응과정이다. 예를 들어 인체에서 채혈한 혈액이 유리 시험관에 접하게 될 때에도 인체와 동일하게 인자의 활성화와 혈소판 응집이 발생한다. 이는 결국 혈액 자체의 내인성 경로에 의해 혈액이 응고된 것이다. 반면 외인성 경로는 조직인자로부터 출발하여 혈장단백질 외의 단백질이 관여한다. 조직인자는 내피 밖 혈관의 벽에 있는 섬유모세포와 다른 세포를 포함한다. 혈관의 손상이 발생하면 혈액이 내피하세포(subendothelial cell)에 노출되어 외인성 경로에 따라 순차적으로 반응이 진행된다. 두 경로는 결국 인자 Xa로 수렴한다. 이는 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화 시키고 궁극적으로 섬유소의 형성을 촉매하게 된다.

이에, 본 발명자들은 항혈전 효과를 가지는 인공혈관의 제조에 사용하기 위한 나노섬유 지지체를 개발하기 위하여 노력한 결과, 생체적합성이 뛰어난 천연고분자 중에서 최근 조직공학용 지지체로 많은 관심과 연구가 진행되고 있는 실크 피브로인(Silk Fibroin, SF)을 선택하여 미세조류 스피루리나를 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 제조한 후 이의 특성을 분석한 결과, 항혈전 효과를 나타내는 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유는 독성이 없고, 생체적합성이 우수하며, 생체재료로 활용되기에 충분한 물성을 가지고 있으므로, 항혈전성이 요구되는 인공혈관으로 사용될 수 있음을 확인함으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물을 함유하는 실크 피브로인(Silk Fibroin) 나노섬유 지지체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 및 재생용 이식재를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물을 함유하는 실크 피브로인(Silk Fibroin) 나노섬유 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 스피루리나 추출물을 제조하는 단계;

2) 실크 피브로인을 용매에 용해하여 방사원액을 제조하는 단계;

3) 단계 2)에서 제조한 방사원액에 스피루리나 추출물을 혼합하는 단계; 및

4) 단계 3)의 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인을 전기방사하여 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 및 재생용 이식재를 제공한다.

본 발명의 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물을 함유하는 실크 피브로인(Silk Fibroin) 나노섬유 지지체는 독성이 없고, 생체적합성이 우수하며, 생체재료로 활용되기에 충분한 물성을 가지고 있으며, 실크 피브로인 나노섬유 내에 항혈전 효과를 나타내는 스피루리나 추출물이 전체적으로 균일하게 담재되어 있어, 장기간 항혈전효과를 나타내므로, 지속적인 항혈전성이 요구되는 인공혈관 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 스피루리나 추출물(Spirulina extract, SPE)의 순도를 평가하기 위해서, UV-VIS(ultraviolet-visible spectrophotometry)를 이용하였으며 620 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 스피루리나 추출물이 함유된 방사원액의 점도를 확인한 도이다.
도 3은 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 직경과 형태를 FE-SEM(SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 확인한 도이다.
도 4는 포름산에 용해하는 고분자의 농도를 15%로 고정하고 실크 피브로인 스펀지와 스피루리나 추출물의 비율을 달리하여 방사용액을 제조하고, 구체적으로 각각의 실크피브로인과 스피루리나 추출물의 비율을 50:50 (실크피브로인 7.5%, 스피루리나 추출물 7.5%)과 25:75 (실크피브로인 3.75%, 스피루리나 11.25%)로 하여 제조된 나노섬유의 직경과 형태를 FE-SEM(SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 확인한 도이다.
도 5는 전기방사를 통해 제조된 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 및 실크 피브로인 나노섬유를 형광현미경을 통해 이미지를 확인한 도이다.
도 6는 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 구조를 FTIR을 통해 확인한 도이다:
(a) 실크 피브로인 나노섬유;
(b) 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유;
(c) 메탄올이 처리된 실크 피브로인 나노섬유; 및
(d) 메탄올이 처리된 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유.
도 7은 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유(c 및 d) 및 실크 피브로인 나노섬유(a 및 b)의 형태구조의 변화를 FE-SEM을 이용하여 확인한 도이다.
도 8은 다양한 농도의 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 기계적 물성을 확인한 도이다:
SF13SPE0: 실크 피브로인 13 중량%가 함유된 방사용액에 스피루리나 추출물 0 중량%를 첨가한 방사용액으로 제조된 나노섬유;
SF13SPE1: 실크 피브로인 13 중량%가 함유된 방사용액에 스피루리나 추출물 1 중량%를 첨가한 방사용액으로 제조된 나노섬유;
SF13SPE2: 실크 피브로인 13 중량%가 함유된 방사용액에 스피루리나 추출물 2 중량%를 첨가한 방사용액으로 제조된 나노섬유;
SF13SPE4: 실크 피브로인 13 중량%가 함유된 방사용액에 스피루리나 추출물 4 중량%를 첨가한 방사용액으로 제조된 나노섬유; 및
SF13SPE6: 실크 피브로인 13 중량%가 함유된 방사용액에 스피루리나 추출물 6 중량%를 첨가한 방사용액으로 제조된 나노섬유.
도 9는 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 혈소판 흡착 효과를 확인한 도이다:
(a) 스피루리나 추출물이 함유되지 않은 실크 피브로인 나노섬유;
(b) 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유; 및
(c) 해파린이 함유된 실크 피브로인 나노섬유(SH-H).
도 10은 실크 피브로인 나노섬유의 표면을 공초점형광현미경을 이용하여 각 시료의 표면지성을 분석한 도이다:
(a) 스피루리나 추출물이 함유되지 않은 실크 피브로인 나노섬유;
(b) 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유; 및
(c) 해파린이 함유된 실크 피브로인 나노섬유(SH-H).
도 11은 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 혈액적합성을 aPTT(activated partial tgromboplastin time), PT(prothrombin time) 및 TT(thrombin time)를 통하여 확인한 도이다.
도 12은 스피루리나 추출물의 세포독성을 확인한 도이다.
도 13은 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유의 세포독성을 확인한 도이다.
도 14는 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체의 세포 부착능을 확인한 도이다:
SF: 실크 피브로인 나노섬유 지지체; 및
SF-SPE: 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체.
도 15는 혈관세포(HUVECs; Human umbilical vein endothelial cells)에서 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체의 증식능을 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 스피루리나(Spirulina maxima) 추출물을 함유하는 실크 피브로인(Silk Fibroin) 나노섬유 지지체를 제공한다.

상기 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유는 하기의 방법을 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 스피루리나 추출물을 제조하는 단계;

4) 단계 3)의 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인을 전기방사하여 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 제조하는 단계.

상기 스피루리나 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것 일수 있으나 이에 한정하지 않는다:

1) 스피루리나에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 스피루리나는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 스피루리나 추출물은 물, 수용성 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 수용성 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 추출 방법으로는 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 스피루리나에 0.1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 40℃인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 48시간인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 스피루리나 추출물은 하기 [화학식 1]로 기재되는 피코시아닌(phycocyanin) 화합물을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

[화학식 1]

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상기 피코시아닌 화합물은 스피루리나를 원심분리한 다음, Sonication법과 Freezing-thawing법을 병행하여 식용 파코시아닌을 수득하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 실크 피브로인 나노섬유는 공지된 항혈전효과를 나타내는 추출물 또는 화학물을 포함하는 것이 바람직하고, 스피루리나 추출물을 포함하는 것이 보다 바람직하며, 파코시아닌을 포함하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유는 메탄올에 추가적으로 침지시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 용매는 포름산(formic acid) 또는 포름산 수용액인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 실크 피브로인을 용매에 3 내지 15 중량% 용해하는 것이 바람직하고, 포름산에 11 내지 14 중량% 용해하는 것이 보다 바람직하고, 13 중량% 용해하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 방사용액에 스피루리나 추출물을 1 내지 12 중량% 첨가하는 것이 바람직하고, 1 내지 6 중량% 첨가하는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 4)의 전기방사는 7 내지 15 kV의 전압범위로 인가하며, 0.1 내지 1 ml/h의 방사속도에서 수행되는 것이 바람직하고, 12kV의 공급전압 및 0.3 ml/h의 방사속도에서 수행되는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법으로 제조된 나노섬유는 지름이 100 nm 내지 800 nm인 것이 바람직하고, 200 nm 내지 600 nm인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 스피루리나를 원심분리한 다음, Sonication법과 Freezing-thawing법을 병행하여 식용 단계인 순도(A ₆₂₀/A ₂₈₀) 0.87의 피코시아닌을 수득한 후, 순도 및 아미노산 조성분석을 수행한 결과, 산성 아미노산이 다량 함유되어 있는 것을 확인하였다(도 1 및 표 1 참조).

또한, 본 발명자들은 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 제조하기 위하여 방사원액을 제조한 후, 방사용액의 점도 및 전기전도도를 확인한 결과, 스피루리나 추출물이 함유됨에 따라 방사용액의 점도 및 전기전도도가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 스피루리나 추출물의 질량이 소량이라도 전기전도도가 현저히 증가하였다. 그러나 스피루리나 추출물의 함량이 8 중량%를 초과하면, 방사용액의 겔화가 진행되므로 스피루리나 추출물의 함량은 방사용액에 1 내지 8 중량% 첨가하는 것이 바람직하다(도 2 및 표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 제조한 방사용액을 전기방사하여 나노섬유를 제조하였다. 상기 전기방사는 온도 26℃, 습도 40%인 항온항습실에서 진행되었으며, 이때 공급전압 12kV, 방사속도 0.3 ml/h, 방사구의 직경 0.8 mm, 방사구와 컬렉터의 거리 15cm에서 수행하였다. 또한, 상기 제조한 나노섬유를 최종적으로 300 mm×200 mm×0.1mm의 2차원 매트를 제조하였다.

또한, 본 발명자들은 상기 제조한 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 직경과 형태를 확인한 결과, 스피루리나 추출물이 함유됨에 따라 전기방사된 나노섬유의 직경이 초기에는 감소하였다가 스피루리나 추출물의 함유량이 4%(w/v) 이상에서는 다시 급격히 증가하는 것을 확인하였다. 직경이 감소하는 현상은 스피루리나 추출물이 방사용액의 전기전도도를 높여 주기 때문에 섬유 형성 중 전하 간 반발력이 강하게 발생하였고 그 결과 섬유가 연신이 되었기 때문인 것을 확인하였다. 반면 스피루리나 추출물의 함유량이 10%(w/v) 농도 이상에서는 다량의 전하가 오히려 섬유의 형성을 불안정하게 만든다. 따라서 섬유 직경이 불균일해지고 아주 두꺼운 섬유나 branched fiber가 형성되므로 스피루리나 추출물의 은 방사용액에 1 내지 8 중량% 첨가하는 것이 바람직하다(도 3 및 도 4 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유내에 스피루리나 추출물이 균일하게 함유되어 있는지 확인한 결과, 실크 피브로인 나노섬유내에 균일하게 스피루리나 추출물이 함유되어 있는 것을 확인하였다. 따라서, 스피루리나 추출물이 실크 피브로인내에 균일하게 담재된 본 발명의 나노섬유는 실크피브로인 나노섬유에 스피루리나 추출물을 코딩하는 방법과 비교하여 스피루리나 추출물의 효과의 지속성이 현저하게 증가하고, 상기 나노섬유 제조공정상, 스피루리나 추출물을 코딩하는 추가적인 공정을 제거할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 우수한 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유를 메탄올에 침지시켜 단백질의 2차 구조의 변화를 유도한 후, FTIR을 이용하여 확인한 결과, 본 발명의 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유는 불규칙하게 배열된 단백질이 사슬이 평행구조로 정렬된 것을 확인하였으며, 상기 구조적 변화로 본 발명의 나노섬유가 물속에서 녹지 않고 안정성을 유지할 수 있는 것을 확인하였다(도 6 참조).

또한, 본 발명자들은 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 용해성을 확인하기 위하여, 상기 나노섬유를 PBS 용액에 3일 동안 상온에서 침지시킨 후, 진공 건조한 후 질량을 측정하였으며 또한 FE-SEM을 통하여 형태구조 변화를 확인한 결과, 전기방사한 실크 피브로인 나노섬유(SF)를 메탄올에 처리하지 않은 경우는 물에 침지하고 3일이 지난 후 질량이 약 34% 정도 감소하였으며 전자현미경 상으로도 용해에 따라 섬유형태가 많이 훼손되었음을 확인할 수 있었다(도 7a 및 7c 참조). 그러나 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유는 전자현미경 사진(도 7c)에 보여지는 바와 같이 섬유 형태를 유지하고 있는 것으로 관찰되었다. 반면 메탄올에 처리한 실크 피브로인 나노섬유의 경우(도 7b)에는 3일이 경과한 후에도 나노섬유가 형태를 완벽히 유지하고 있었고 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유(그림 7d)에서도 마찬가지로 섬유형태가 잘 유지된 것을 확인하였다(도 7 참조). 또한, 실크 피브로인 나노섬유 및 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 물에 3일 침지한 후 무게변화를 측정한 결과, 메탄올 처리한 경우 스피루리나 추출물 함유에 관계없이 질량감소가 현저히 줄어듦을 확인하였다. 스피루리나 추출물 함유 여부에 따른 용해성의 차이는 서로 다른 경향을 나타냈는데 메탄올 처리 시에는 약간의 질량감소(4% 질량감소 차이)가 나타난 반면 메탄올 처리하지 않은 실크 피브로인 나노섬유는 스피루리나 추출물을 함유하는 경우 용해되는 실크 피브로인 양이 다소 많이 줄어드는(8% 차이), 즉 용해 잔존무게가 훨씬 높은 결과를 확인하였다(표 3 참조). 또한, 형광현미경 관찰 결과, 스피루리나 고유의 형광이 여전히 나타나고 있는 것으로 보아 3일 동안 물에 침지하여도 실크 피브로인 나노섬유 내의 스피루리나가 섬유 내에 대부분 존재하고 밖으로 빠져나오지 않은 것을 확인하였다. 또한, 순수한 실크 피브로인 나노섬유와 마찬가지로 스피루리나가 함유된 실크 피브로인 나노섬유 역시 메탄올 처리로 인해 불용성 나노섬유 매트의 제조가 가능해졌으며 따라서 화학적 개질과 생물학적 실험이 가능해졌으며 실제 지지체로의 응용 시 생체 내에서 형태안정성을 가질 수 있을 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 스피루리나 추출물이 0 내지 6%(w/v) 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 기계적 물정 저하 여부 UTM(LRX plus, LLOYD INSTRUMENTS, UK)을 이용하여 확인한 결과, 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유는 생체재료로 활용되기에 충분한 물성을 가지고 있음을 확인하였다(도 8 참조).

또한, 본 발명자들은 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 혈액적합성을 확인한 결과, 본 발명의 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유는 혈액적합성이 유의적으로 향상되는 것을 확인하였다. 구체적으로 양성대조군인 해파린을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유보다 혈소판의 흡착을 더욱 효과적으로 억제하였으며, 혈장단백질의 응고시험을 통해서 공통경로 및 내인성 경로에서 응고과정을 저해하는 효과를 보였으며, 특히 공통 경로에서는 양성대조군인 해파린과 유사한 효과를 나타내었다(도 9 내지 11 참조).

또한, 본 발명자들은 스피루리나 추출물 및 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유가 생체재료로서 세포독성을 가지는지 MTT 에세이 분석을 통해 확인한 결과, 스피루리나 추출물은 0 내지 1000 ㎍/ml 농도에서 세포독성이 없는 것을 확인하였다(도 12 참조). 또한, 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유는 세포에 대한 독성이 거의 없었으며, 특히 SF13SPE6의 경우에는 오히려 세포활성화에 더욱 도움을 준 것을 확인하였다(도 13 참조).

또한, 본 발명자들은 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유 지지체의 세포 부착 및 증식능을 확인한 결과, 유의적인 세포 부착능 및 증식능을 가지는 것을 확인하였다(도 14 내지 15 참조).

따라서, 본 발명의 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체는 독성이 없고, 생체적합성이 우수하며, 생체재료로 활용되기에 충분한 물성을 가지고 있으며, 실크 피브로인 나노섬유 내에 항혈전효과를 가지는 스피루리나 추출물이 전체적으로 균일하게 내부 담재되어 있어, 장기간 항혈전효과를 나타내므로, 지속적인 항혈전성이 요구되는 인공혈관 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 및 재생용 이식재를 제공한다.

상기 세포는 혈관에서 유래한 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 스피루리아 ( Spirulina maxima ) 추출물의 제조 및 분석

<1-1> 스피루리아 추출물의 제조

스피루리나(Spirulina maxima , 한국해양미세조류은행 등록번호:KMMCC-1057)는 부경대학교 해양바이오신소재학과 한국해양 미세조류은행에서 분양받아 사용하였다.

구체적으로 스피루리나는 다량 냉장 원심분리기(Multi-tube carrier Refrigerated Centrifuge)(Vision Scientific CO. Ltd)로 3,000 rpm에서 25분간 원심분리한 다음, 동결하여 -70℃에서 분석 또는 추출 시까지 보관하였다. 추출방법은 Sonication법과 Freezing-thawing법을 병행하였으며 초음파를 가할 때는 열에 의한 손상을 최소화하기 위해 얼음 속에서 냉각하며 약 10분간 진행하였다. 5000G에서 원심분리 하였고 부유액을 동결건조 하여 파우더 형태로 만든 다음, 이후 실험을 진행하였다.

<1-2> 스피루리아 추출물의 아미노산 조성 및 순도 측정

상기 실시예 <1-1>에서 수득한 동결건조된 스피루리아 추출물의 순도 및 아미노산 조성을 분석하였다.

구체적으로, 스피루리나 추출물(Spirulina extract, SPE)의 순도를 평가하기 위해서, UV-VIS(ultraviolet-visible spectrophotometry)를 이용하였으며 620 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 스푸루리나 추출물의 성분 분석을 위하여 고속 액체 크로마토그래프 1(Ultimate 3000, Dionex, USA)을 이용하여 아미노산 조성분석을 실시하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 한국 미세조류은행(부경대학교)에서 처음 제공받은 스피루리나는 매우 낮은 순도(A ₆₂₀/A ₂₈₀)를 나타내었다. 이는 스피루리나 세포의 모든 기관과 세포벽 및 불순물까지 모두 섞여있기 때문에 순도가 낮게 나타나는 것을 확인하였다. 증류수를 이용해 수용성 성분만을 추출한 경우 피코시아닌 고유의 640 nm 파장대의 흡광현상을 확인하였다. 또한, 초음파 처리와 반복적인 동결-해동 추출법을 사용한 결과 최종적으로 약 1.26의 순도를 가지는 피코시아닌을 얻을 수 있었으며 이때의 수율(yield)은 처음 시료 대비 약 30%인 것을 확인하였다. 이는 식품 등급인 0.7을 넘어서는 순도이며 별도의 크로마토그래피 과정을 거치지 않은 방법으로서는 높은 순도와 수율임을 확인하였다(도 1).

또한, 하기 [표 1]에 나타낸 바와 같이, 스피루리아 추출물의 아미노산 조성 분석결과 수용성 단백질이라는 것에서 예측할 수 있듯이 산성 및 염기성 아미노산이 45% 이상 함유하고 OH기를 함유하는 세린(Ser)도 8% 정도 함유한 것으로 나타났으며 특히 산성 아미노산(aspartic acid, glutamic acid)이 매우 많이 조성되어 있는 것을 확인하였다. 실크 피브로인(Silk Fibroin; 이후, 'SF'로 칭함)이 상대적으로 지방족 부사슬을 함유한 스피루리아 추출물이 첨가된 실크 피브로인/스피루리아 추출물 블렌드 용액 또는 나노섬유에서 스피루리아 추출물의 첨가에 따른 성질의 변화를 예측할 수 있다(표 1).

< 실시예 2> 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유의 제조

<2-1> 방사원액의 제조

스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 제조하기 위하여 방사원액을 제조하였다.

구체적으로, 완전 건조된 누에고치는 소듐올레이트(sodium oleate)(0.3 중량%), 무수 소듐 카보네이트(sodium carbonate anhydrous)(0.2 중량%) 수용액에서 1 시간 동안 95℃에서 정련하여 실크 세리신(sericin)을 제거하였다. 정련된 실크 피브로인는 CaCl₂로 85℃에서 3분 동안 용해한 후, 셀룰로오스 투석막(MWCO 12-14000)에 담겨 3일 동안 실온에서 투석하여 염을 제거하였고 최종적으로 동결 건조하여 실크 피브로인 스펀지를 수득하였다. 방사용액을 만들기 위한 용매로는 98% 포름산(KANTO chemical)을 사용하였다. 포름산에 실크 피브로인 스펀지 13% (w/v)를 용해하여 실크 피브로인 전기방사를 위한 방사용액을 만들었다. 여기에 스피루리나 추출물(Spirulina extract, 이후, "SPE"로 칭함)을 각각 0, 1, 2, 4, 6 및 8%(w/v) 첨가하여 각각 SF13SPE0 방사용액, SF13SPE1 방사용액, SF13SPE2 방사용액, SF13SPE4 방사용액, SF13SPE6 방사용액을 제조하였으며 용질이 완전히 용해될 때까지 상온에서 100 rpm의 속도로 교반해 주었다.

또한, 포름산에 용해하는 고분자의 농도를 15%로 고정하고 실크 피브로인 스펀지와 스피루리나 추출물의 비율을 달리하여 방사용액을 제조하였다. 각각의 실크피브로인과 스피루리나 추출물의 비율은 50:50 (실크피브로인 7.5%, 스피루리나 추출물 7.5%)과 25:75 (실크피브로인 3.75%, 스피루리나 11.25%)로 제조하였다.

<2-2> 나노섬유의 제조

전기방사는 온도 26℃, 습도 40%인 항온항습실에서 진행되었다. 방사조건은 공급전압 12kV, 방사속도 0.3 ml/h, 방사구의 직경 0.8 mm, 방사구와 컬렉터의 거리 15 cm이며 원기둥 형태의 컬렉터는 회전속도 100 rpm으로 유지하였다. 각 방사용액 20 ml를 8개의 다중노즐에서 하루 동안 연속 방사하여 최종적으로 300 mm×200mm×0.1mm 크기의 2차원 매트 형태로 나노섬유 지지체를 제조하였다. 스피루리나 추출물 함유량이 각각 0, 1, 2, 4, 6, 8%(w/v)인 실크 피브로인 나노섬유 시료는 각각 SF13SPE0(0% SPE), SF13SPE1(1% SPE), SF13SPE2(2% SPE), SF13SPE4(4% SPE), SF13SPE6(6% SPE)로 명명하였다.

<실험예 1> 방사용액의 점도 측정

전기방사를 통해 안정된 섬유형태를 얻기 위한 필요한 조건인 방사원액의 점도를 확인하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 제조한 각각의 방사용액을 원뿔-평판 점도계를 이용하여 25℃ 온도에서 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 모든 방사용액은 전단변형율(shear strain)이 높아질수록 점도 값이 낮아지는 것을 확인하였다. 즉, 비뉴톤점성(non-Newtonian) 및 전단 유동화(shear thinning) 한 거동을 보였다. 또한, 순수한 SF방사용액(SF13SPE0)보다는 미세조류 추출물을 함유한 방사용액에서 점도가 더 높은 것을 확인하였다. 그러나 미세조류 추출물의 함량이 높아질수록 점도상승의 폭은 줄어드는 것을 확인하였다(도 2).

< 실험예 2> 방사용액의 전기전도도 측정

전기방사시 방사용액 표면의 전하의 인장력은 방사용액의 신축현상을 증가시키며, 방사용액의 전기전도도가 증가하면 더 많은 전하들이 jet를 형성하여 섬유형성이 용이하며, 섬유의 직경이 감소한다. 따라서 섬유의 굵기나 형태의 중요한 영향을 미치는 상기 <실시예 2>에서 제조한 방사용액의 전도도를 전기전도도 측정계(Thermoscientific, ORION 4STAR)를 통해서 25℃ 온도에서 측정하였다.

그 결과, 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 용매로 사용된 98% 포름산의 경우 0.6 mS/cm의 전기전도도를 나타내었다. 그러나 SF를 13% (w/v) 첨가한 방사용액 SF13SPE0의 경우 그 값이 5.03 mS/cm로 전기전도도가 약 10배 가까이 증가하였다. 그리고 여기에 SPE를 첨가할수록 전기전도도가 계속해서 증가함을 확인하였다. 그리고 SPE의 양이 SF대비 약 10% 정도에 불과함에도 불구하고 전기전도도는 약 130%가량 증가하는 것으로 볼 때 방사용액의 전도성에 SPE의 영향이 매우 크다는 것을 확인하였다(표 2).

방사용액(Dope solution)	전도도(Conductivity)(mS/cm)
대조군(98% 포름산)	0.6
SF13SPE0	5.0
SF13SPE1	5.4
SF13SPE2	5.8
SF13SPE4	6.7
SF13SPE6	7.4

< 실험예 3> 나노섬유의 직경과 형태 확인

상기 실시예 <2-2>에서 제조한 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 직경과 형태를 FE-SEM(SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였고, 형광이미지는 형광현미경(Axiophot, Carl Zeiss, Germany)를 통해 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 스피루리나 추출물의 농도가 증가할수록 방사용액의 점도가 증가하므로 형성된 나노섬유의 직경이 굵어지는 것을 확인하였다. 그러나 스피루리나 추출물의 함유량이 0 내지 2%(w/v)인 SF 나노섬유매트에서 방사용액의 점도가 증가함에도 불구하고 전기전도도가 증가했기 때문에 섬유직경이 감소한 것을 확인하였다. 그러나 스피루리나 추출물의 함유량이 4%(w/v) 이상에서는 고분자용액의 농도와 점도가 더 높아지게 되고 전기전도도에 의한 영향은 상대적으로 작아져서 섬유직경이 다시 증가하는 것을 확인하였다(도 3).

아울러, 포름산에 용해하는 고분자의 농도를 15%로 고정하고 실크 피브로인 스펀지와 스피루리나 추출물의 비율을 달리하여 방사용액을 제조하였고, 구체적으로 각각의 실크피브로인과 스피루리나 추출물의 비율을 50:50 (실크피브로인 7.5%, 스피루리나 추출물 7.5%)과 25:75 (실크피브로인 3.75%, 스피루리나 11.25%)로 하여 제조하였을 때, 각각 평균 직경이 240 nm, 98 nm인 나노섬유를 수득하였다(도 4).

< 실험예 4> 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 특성 확인

전기방사를 통해 제조된 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유에 스피루리나 추출물이 균일하게 함유되어 있는지 확인하기 위하여 상기 <실시예 3>과 동일한 방법을 이용하여 형광현미경을 통해 이미지를 촬영하였다. 스피루리나 추출물의 주요 성분인 피코시아닌은 고유의 형광을 띄는 성질을 가지고 있으므로 이를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 실크단백질만으로 구성된 실크 피브로인 나노섬유매트에서는 형광이 발현되지 않는 반면, 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유에서는 형광이 매우 강하게 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 전체적으로 균일한 세기의 형광이 관찰되고 있으며 특히 섬유가 밀집한 부분에서 붉은 형광이 비교적 강한 것으로 볼 때 스피루리나 추출물이 섬유에 골고루 잘 분포되어 있음을 확인하였다(도 5).

< 실험예 5> 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 구조 분석 및 물성 측정

<5-1> 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 구조 분석

실크단백질의 2차 구조는 실크 Ⅰ구조와 실크 Ⅱ 구조를 띄는 것으로 알려져 있다. 실크 Ⅰ구조에서는 단백질 사슬이 무정형 상태인 불규칙 코일(random coil) 형태를 이루고 있으며 실크 Ⅱ구조에서는 사슬이 서로 교차하며 평면적인 형태인 β-sheet 구조로 배치되어 있다. 이는 실크단백질의 1차 구조인 아미노산의 서열, 특히 글라이신-알라닌(GA)의 반복구조에서 기인하며 실크단백질의 처리조건과 재생 형태에 따라 2차 구조의 전이가 일어나게 된다.

이러한 단백질의 2차 구조는 FTIR을 통해 확인하는 것이 일반적이다. 즉 단백질의 2차 구조는 아마이드, 피크의 위치를 통해 알 수 있으며 각각 C=O, N-H, C-N 결합의 신축운동에 따르는 고유 흡수파장이 나타나는 지점이다. 실크단백질의 경우 무정형의 불규칙 구조는 1650cm^-1, 1540cm^-1및 1230cm^-1에서 각각 아마이드 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에 해당하는 IR 흡수 피크가 관찰되며 단백질 사슬이 수소결합에 의해 서로 결합하여 평면 형태로 정렬되게 되면 흡수 피크의 위치가 각각 1630cm^-1, 1520cm^-1, 1260cm^-1으로 이동하게 된다고 보고되고 있다.

이에, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유를 메탄올에 침지시켜 단백질의 2차 구조 변화를 유도하였고, 단백질 2차 구조 분석을 위하여 FT-IR(Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA)을 이용하였으며 나노섬유를 구성하고 있는 실크 피브로인의 β-conformation 구조를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유매트를 메탄올에 침지시켜 처리한 경우 스피루리나 추출물 함유 여부에 관계없이 실크단백질의 실크 Ⅱ(β-sheet 결정구조) 특성에 관계되는 IR 흡수 파장대가 뚜렷하게 관찰되어 단백질 2차 구조의 전이를 확인하였다(도 6).

<5-2> 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 용해성 측정

스피루리나 함유 실크 피브로인 나노섬유의 물에 대한 안정성 및 저항성을 평가하기 위하여 상기 <실시예 2>에서 제조한 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유를 메탄올에 침지시켜 불용화시킨 후, 상기 나노섬유를 50 mm×50 mm×0.1mm 크기로 절단하여 초정밀저울로 질량을 측정하였다. 또한, 상기 나노섬유를 PBS 용액에 3일 동안 상온에서 침지시킨 후, 진공 건조한 후 질량을 측정하였으며 또한 FE-SEM을 통하여 형태구조 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 전기방사한 실크 피브로인 나노섬유를 메탄올에 처리하지 않은 경우는 물에 침지하고 3일이 지난 후 질량이 약 34% 정도 감소하였으며 전자현미경 상으로도 용해에 따라 섬유형태가 많이 훼손되었음을 확인할 수 있었다(도 7a 및 7c). 그러나 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유는 전자현미경 사진(도 7c)에 보여지는 바와 같이 섬유 형태를 유지하고 있는 것으로 관찰되었다. 반면 메탄올에 처리한 실크 피브로인 나노섬유의 경우(도 7b)에는 3일이 경과한 후에도 나노섬유가 형태를 완벽히 유지하고 있었고 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유(그림 7d)에서도 마찬가지로 섬유형태가 잘 유지된 것을 확인하였다(도 7).

또한, 하기 [표 3]에 나타낸 바와 같이, 실크 피브로인 나노섬유 및 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 물에 3일 침지한 후 무게변화를 측정한 결과, 메탄올 처리한 경우 스피루리나 추출물 함유에 관계없이 질량감소가 현저히 줄어듦을 확인하였다. 스피루리나 추출물 함유 여부에 따른 용해성의 차이는 서로 다른 경향을 나타냈는데 메탄올 처리 시에는 약간의 질량감소(4% 질량감소 차이)가 나타난 반면 메탄올 처리하지 않은 실크 피브로인 나노섬유는 스피루리나 추출물을 함유하는 경우 용해되는 실크 피브로인 양이 다소 많이 줄어드는(8% 차이), 즉 용해 잔존무게가 훨씬 높은 결과를 확인하였다(표 3).

또한, 형광현미경 관찰 결과, 스피루리나 고유의 형광이 여전히 나타나고 있는 것으로 보아 3일 동안 물에 침지하여도 실크 피브로인 나노섬유 내의 스피루리나가 섬유 내에 대부분 존재하고 밖으로 빠져나오지 않은 것을 확인하였다. 또한, 순수한 실크 피브로인 나노섬유와 마찬가지로 스피루리나가 함유된 실크 피브로인 나노섬유 역시 메탄올 처리로 인해 불용성 나노섬유 매트의 제조가 가능해졌으며 따라서 화학적 개질과 생물학적 실험이 가능해졌으며 실제 지지체로의 응용 시 생체 내에서 형태안정성을 가질 수 있을 것을 확인하였다.

	Original weight(mg)	Residual weight(mg)	Residual rate(%)
실크 피브로인	6.4	4.2	65.62
실크 피브로인+ 스피루리나 추출물	10.7	7.9	73.83
실크 피브로인 Me-OH	5.9	5.6	94.91
실크 피브로인+ 스피루리나 추출물 Me-OH	10.4	9.5	91.34

<5-3> 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 기계적 물성 측정

스피루리나 추출물이 0 내지 6%(w/v) 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 기계적 물정 저하 여부를 확인하였다.

구체적으로, UTM(LRX plus, LLOYD INSTRUMENTS, UK)를 사용하여 응력-변형률 곡선을 얻었으며 곡선으로부터 인장강도, 신도 등 나노섬유 매트의 인장성질을 측정하였다. 시료의 크기는 50mm×10mm×0.1mm로 일정하게 절단하여 인장시험을 행하였으며 5개 이상의 측정값으로부터 평균값과 표준편차를 활용하여 통계적 유의성을 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 스피루리나 추출물이 0 내지 6%(w/v) 함유된 실크 피브로인 나노섬유는 스피루리나 추출물의 함유에 따른 실크 피브로인 나노섬유의 기계적 물성 저하가 일어나지 않는 것을 확인하였다. 따라서 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유는 생체재료로 활용되기 충분한 물성을 가지고 있음을 확인하였다(도 8).

< 실험예 6> 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 혈액적합성 확인

<6-1> 혈소판 흡착효과 확인

스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 혈액적합성을 확인하기 위하여, 혈소판 흡착 실험을 진행하였다. 혈소판은 그 자체로 혈소판 혈전을 생성할 뿐 아니라 후에 발생하는 이차적인 혈액응고 과정에도 계속해서 영향을 미치기 때문에 전체적인 지혈과정에 있어 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 생체재료의 혈액적합성 측면에 있어서도 혈소판과의 관계는 우선적으로 평가되어야 한다. 혈소판을 이용하여 재료의 혈액적합성을 평가하고자 하는 경우 혈소판이 재료에 흡착된 양과 재료에 흡착된 혈소판의 형태를 통해 혈소판의 활성화와 혈소판 응집의 가능성을 확인할 수 있다.

이에, 토끼에서 채취한 혈액을 1,200rpm으로 원심 분리하여 PRP(platelet rich plasma)를 수득하였다. 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유 기반의 2차원 매트를 각각 10mm×10mm×0.1mm 크기로 절단한 시료를 PBS 용액으로 가볍게 세척한 후 PRP와 반응시켰으며 지속적으로 교반시켰다. 반응시킨 나노섬유는 형광 염색하여 공초점형광현미경을 통해 매트에 흡착된 혈소판을 관찰하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 스피루리나 추출물이 함유되지 않은 실크 피브로인 나노섬유(a)는 방사형으로 다리를 뻗은 별 모양의 혈소판이 유의적으로 관찰되었으며, 혈소판의 활성화 과정을 저해하는 효능이 있다고 알려진 해파린을 양성대조군으로 사용한 해파린이 함유된 실크 피브로인 나노섬유(SH-H)(c)에서는 대부분 혈소판이 활성화되지 않는 원형모양을 나타내었다. 또한, 본 발명의 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유(b)에서는 혈소판의 수가 유의적으로 감소되어 혈소판 흡착을 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였다(도 9).

<6-2> 실크 피브로인 나노섬유의 표면 지형 분석

해파린이 함유된 실크 피브로인 나노섬유는 유의적으로 혈소판을 활성화과정을 저해시키는 효과를 나타내나, 상기 나노섬유에 흡착된 혈소판의 수가 다량 존재하여, 공초점형광현미경을 이용하여 각 시료의 표면지성을 분석하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 해파린이 함유된 실크 피브로인 나노섬유(SF-H)는 혈소판의 활성화를 저해하는 효능은 나타내었지만 고유의 울퉁불퉁한 표면 특성 때문에 혈소판의 흡착 자체를 저해하지는 못했다. 비록 완전히 활성화되지 못한 혈소판이라 할지라도 혈액응고 인자를 배출하며, 혈소판 그 자체의 응집만으로도 혈액적합성을 떨어뜨리기 때문에 다수의 혈소판이 흡착되는 SF-H 나노섬유의 경우 생체적합성에 문제가 있음을 확인하였다. 반면 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 경우 혈소판의 흡착 정도가 SF-H 나노섬유에 비해서는 약 60%, 스피루리나 추출물이 함유되지 않은 실크 피브로인 나노섬유에 비해서는 약 30% 이상 감소하였으므로 혈액적합성이 현저하게 뛰어남을 확인하였다(도 10).

<6-3> 혈장단백질 응고실험

스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 혈액적합성을 확인하기 위하여, 혈장단백질 응고실험을 수행하였다.

구체적으로, aPTT(activated partial tgromboplastin time), PT(prothrombin time) 및 TT(thrombin time)를 통하여 확인하였다. 응고시간은 phto-optical clot detection 장비인 Coatron M1 (TECO Co., Germany)를 사용하여 측정하였다.

스피루리나 추출물의 영향을 알아보기 위해서 스피루리나 추출물을 전체 시약 대비 0 내지 10000㎍/ml 농도로 첨가하였다. 또한, 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유의 혈장단백질 응고 실험은 나노섬유를 10mm×10mm×0.1mm 크기로 만들어 시약에 1분 동안 침지 시켰다. 특히 시료가 흡광도에 영향을 주지 못하도록 특별히 주의를 기울여 30회 이상 반복해서 측정하였다.

aPTT(activated partial tgromboplastin time) 에세이는 혈장, 시료, aPTT reagent를 각각 1:1:1 비율로 75 uL튜브에 첨가하여 37℃에서 5분간 가온한 후, 25 mM CaCl₂ 25uL를 첨가하여 혈장이 응고될 때까지의 시간을 반복 측정하여 평균값을 구하였다. 대조군으로는 3차 증류수를 사용하였다.

TT(thrombin time) 에세이는 혈장과 시료를 1:1의 비율로 혼합한 용액 100 uL를 37℃에서 1분간 반응시킨 후, 37℃로 미리 예열된 5 unit TT reagent 50uL를 첨가하여 혈장이 응고될 때까지의 시간을 반복 측정하여 평균값을 구하였다.

또한, PT(prothrombin time) 에세이는 혈장과 시료를 1:1의 비율로 혼합한 용액 50uL를 37℃에서 2분간 반응시킨 후, PT reagent 50uL를 첨가하여 혈장이 응고될 때까지의 시간을 반복 측정하여 평균값을 구하였다.

그 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 스피루리나 추출물이 내인성 경로에 미치는 영향을 aPTT 에세이로 측정한 결과, 순수한 혈액의 경우 약 37초 정도에 혈액이 굳는 것을 확인하였다. 음성대조군인 삼차 증류수를 첨가하였을 경우는 약 44초까지 응고시간이 지연되었다. 그러나 1 mg/ml농도의 스피루리나 추출물이 첨가된 경우, 응고시간은 65초까지 연장되는 결과를 확인하였다. 따라서, 전체 반응용액에 첨가된 스피루리나 추출물의 질량이 일반적인 저울로는 측정할 수 없을 정도의 양인 수십 마이크로그램인 것을 고려한다면 혈액응고 지연효과가 매우 뛰어남을 확인하였다(도 11a).

또한, 도 11b 및 도 11c에 나타낸 바와 같이, 스피루리나 추출물이 공통 경로에 미치는 영향을 TT 에세이로 측정한 결과, 순수한 혈액의 경우 약 24초에 혈액이 굳었으며 여기에 삼차 증류수를 첨가하였을 경우 혈액 응고시간은 크게 증가하지 않았다. 그러나 스피루리나 추출물을 극소량만 첨가하였음에도 불구하고 혈액응고시간이 크게 지연되는 결과를 확인하였다. 특히 농도가 10㎍/ml로 매우 낮은 농도에서도 불구하고 충분한 혈액응고 지연효과를 나타내었으며 이는 상기 내인성 경로에서보다 공통 경로에서 약 수 백배 가량 더 뛰어난 결과를 가진다는 것을 의미한다. 특히 양성대조군인 해파린과 비교했을 때도 유사한 정도의 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 그러나 외인성 경로에서는 혈액응고 과정에 큰 영향을 미치지 않는 것을 PT assay를 통하여 확인할 수 있었다(도 11b 및 도 11c).

따라서, 스피루리나 추출물은 공통 경로와 내인성 경로 모두에서 혈액응고를 지연하는 효과를 나타내었다. 특히 공통 경로에서의 응고 지연효과는 매우 탁월했으며, 공통 경로가 혈액응고 과정 중 최종단계로서 그 중요성이 크다는 것을 고려할 때 스피루리나 추출물이 혈액응고의 중추적인 과정에 매우 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다.

< 실험예 7> 스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 세포적합성 확인

스피루리나 추출물이 함유된 실크 피브로인 나노섬유의 생체재료 및 조직공학적 응용을 위하여 세포적합성을 확인하였다.

구체적으로, 세포적합성 평가에 사용된 세포는 Mouse connective tissue, fibroblast0like cells (L929)을 사용하였다. 10%의 FBS(fetal bovine serum)와 1%의 penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM을 배지로 사용하였으며 37℃의 CO₂배양기에서 배양하였다.

<7-1> 스피루리나 추출물의 세포독성 확인

스피루리나 추출물의 세포독성을 평가하기 위해 배지에 스피루리나 추출물을 각각 0, 10, 100, 1000, 10000㎍/ml 농도로 첨가하였으며. 스피루리나 추출물이 함유된 배지를 주입하기 하루 전에 FBS를 제거한 배지에서 세포를 배양하였다. 스피루리나 추출물가 함유된 배지를 주입하고 1일 후 MTT assay를 이용하여 세포독성을 확인하였다.

MTT 에세이를 위해 세포에 MTT 시약(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)을 주입하고 4시간 동안 37℃의 CO₂배양기에서 반응시켰다. 다시 DMSO를 첨가하여 30분 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시료는 5개의 시료를 평가하였으며 평균값과 표준편차를 활용하여 통계적으로 분석하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 스피루리나 추출물은 0 내지 1000 ㎍/ml 농도에서 세포독성이 없는 것을 확인하였다(도 12).

<7-2> 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유에 대한 세포독성 확인

스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유에 대한 세포독성평가는 ISO10993-5 규정에 따라 실험을 진행하였다.

구체적으로, 10 mg/ml의 추출비(extraction ratio)로 24시간 동안 37℃의 CO₂배양기에서 2차원 나노섬유 매트의 성분을 추출한 배지를 통해 세포를 배양한 후, 역시 24시간이 지난 다음 MTT 에세이를 시행하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유는 대체적으로 양성대조군인 tissue culture plate(TCP)와 음성대조군인 실크 피브로인 나노섬유의 중간 정도의 OD값을 나타내었다. 즉, 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유는 세포에 대한 독성이 거의 없었으며, 특히 SF13SPE6의 경우에는 오히려 세포활성화에 더욱 도움을 준 것을 확인하였다(도 13).

<7-3> 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유 지지체의 세포 부착 및 증식능 확인

스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유 지지체의 세포 부착 및 증식능 평가를 위해 96-well TCPS 위에 2차원 매트를 크기에 맞게 절단하여 부착시켰으며 각 매트 당 1×0⁴ 세포를 주입하였다. 세포 seeding 후 2시간, 24시간, 48시간 그리고 72시간 마다 MTT assay를 실시하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 초기 부착능은 양성대조군인 TCPS에 비해 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유가 현저한 세포 부착능을 나타내었다(도 14a). 또한, 세포활성화는 세포 seeding 후 1일, 2일, 3일을 각각 측정한 결과(도 14b), 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유 나노섬유가 양성대조군인 TCP보다는 낮지만 실크 피브로인 나노섬유보다는 세포활성화에 더 도움을 준다는 것을 확인하였다.

<7-4> 세포 부착 시험

혈관세포로 알려진 HUVECs(Human umbilical vein endothelial cells) 세포를 통해 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유에 세포가 잘 부착하여 증식할 수 있는지 여부를 형광이미지를 통해 세포의 형태를 관찰하였다.

구체적으로, 상기 나노섬유 매트에 세포를 직접 씨딩(seeding)하여 배양하였으며 2, 24, 48 그리고 72시간마다 형광 염색하여 공초점형광현미경을 통해서 그 형태를 관찰하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 HUVECs가 스피루리나 추출물 함유 실크 피브로인 나노섬유 매트 지지체에서 완전히 뻗어(spreading) 잘 자라고 있음을 확인하였다(도 15).

Claims

스피루리나 막시마(Spirulina maxima) 추출물을 함유하는 실크 피브로인(Silk Fibroin) 나노섬유 지지체.
제 1항에 있어서, 상기 스피루리나 막시마 추출물은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체:
[화학식 1]

.
제 1항에 있어서, 상기 스피루리나 막시마 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유는 메탄올에 추가적으로 침지시키는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체.
1) 스피루리나 막시마 추출물을 제조하는 단계;
2) 실크 피브로인을 용매에 용해하여 방사원액을 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조한 방사원액에 스피루리나 막시마 추출물을 혼합하는 단계; 및
4) 단계 3)의 스피루리나 막시마 추출물을 함유하는 실크 피브로인을 전기방사하여 스피루리나 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 제조하는 단계를 포함하는 스피루리나 막시마 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 1)의 스피루리나 막시마 추출물은 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법:
[화학식 1]

.
제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 용매는 포름산(formic acid)인 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 실크 피브로인을 용매에 3 내지 15 중량% 용해하는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 3)의 방사용액에 스피루리나 막시마 추출물을 1 내지 12 중량% 첨가하는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 4)의 전기방사는 7 내지 15 kV의 전압범위로 인가하며, 0.1 내지 1 ml/h의 방사속도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 4)의 스피루리나 막시마 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유를 메탄올에 추가적으로 침지시키는 단계를 포함하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 나노섬유는 지름이 100 nm 내지 800 nm인 것을 특징으로 하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체 제조방법.
제 1항의 스피루리나 막시마 추출물을 함유하는 실크 피브로인 나노섬유 지지체를 포함하는 세포의 부착, 증식 및 재생용 이식재.
제 12항에 있어서, 상기 세포는 혈관에서 유래한 것을 특징으로 하는 세포의 부착, 증식 및 재생용 이식재.