CN102813965B - 一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架及其制备方法，包括：（1）以蚕茧为原料，制备质量百分比为30~40%的再生丝素蛋白水溶液；（2）采用静电纺丝工艺，以高速旋转的辊筒为收集装置制备有序排列的丝素蛋白纤维毡；（3）通过改变包覆在滚筒上铝箔的接收方向，制得不同层数、厚度和复合角度的取向纤维毡，并对其进行后处理，提高其力学性能。该方法制备的组织工程支架，结构致密、均匀，面积大小可控，具有优异的力学性能、尺寸稳定性，其表面取向形貌能引导细胞生长的形态和方向，促进细胞的黏附和增殖，其应用于生物医学领域,包括尿道、神经、肌肉、血管、肌腱和韧带的修复和再生。

Description

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架及其制备方法，以丝素蛋白水溶液为纺丝液，通过静电纺丝工艺并以高速旋转的辊筒为接收装置制备了双轴取向的纤维毡，以醇-水混合溶液为后处理剂，获得力学性能优异并能引导细胞生长方向和形态的再生丝素蛋白纤维毡，该纤维毡可作为生物支架用于组织纤维修复、组织工程支架等生物医用领域。

背景技术

以多种自体组织为重建材料的替代疗法在人体多种组织修复治疗中显示了良好的应用前景，但该疗法存在以“牺牲正常组织为代价，以手术创伤修复组织缺损”的缺憾，不可避免的引起取材部位的并发症。组织工程的兴起和迅猛发展为人体组织修复开辟了新的治疗途径。

静电纺丝技术是制备组织工程支架的方法之一,相比于其它的方法,此技术更加的方便、简单、灵活,而且可以适用于大部分的聚合物。其制备的纳米级纤维具有比表面积大、孔隙率高、长径比大、表面能和活性高、纤维精细程度和均一性高等特点,已经得到了人们广泛的关注。但是由于纺丝过程中存在着一种不稳定“鞭动”的状态,使得接收到的纤维取向往往是杂乱无章的。对于纳米纤维的一些应用需要纤维毡有很好的力学和光学性能,而普通方法得到的无规纤维毡是各向同性的，不能满足上述条件。同时在组织工程支架的临床应用中，缝合滞留应力直接关系到移植过程，因而是一个很关键的因素。经过后处理的未取向再生丝素蛋白纤维毡的缝合滞留应力常常不能满足移植过程中对缝合力的要求，而单取向的纤维毡在垂直于取向方向的力学性能也往往达不到该要求。

丝素蛋白不仅具有优异的力学性能，而且具有良好的生物相容性、可降解性、良好的透气透湿性等。现有技术纺制丝素蛋白纤维时通常利用高速旋转的辊筒收集装置，可使纤维在静电纺后具有极高的排列规整性，纤维毡在受力时沿纤维排列方向可承受更高的张力，从而有效提高纤维毡纵向的力学性能，但是纤维毡横向的力学性能却仍然较差，甚至有可能降低。公开号CN101538746A的“取向可控静电纺丝纳米聚合物纤维的制备原理及新方法”公开了一种以高介电常数为材料的收集极板为接受装置制备取向可控的聚合物纳米纤维。公开号CN102260930的中国发明专利“一种收集取向纳米纤维装置及其方法”公开了一种利用两块金属板之间形成的电容，将静电纺射流拉伸，并采用高速旋转的辊筒收集具有高取向度的纤维。Meinel等以高速旋转的辊筒为收集装置，采用静电纺丝方法成功制备了高取向度的丝素蛋白/聚氧化乙烯纤维毡，并在其上培养人体干细胞，证明支架表面形态影响细胞的生长形态和基因表达。相比较于明胶，丝素蛋白具有较好的力学性能、可塑性，因此采用高速旋转的辊筒作为收集装置其取向度受到的限制较小。Li等采用具有一定间隔的分离式收集装置，制备了高度有序的纤维，并通过改变收集装置的个数得到了交错排列并呈一定角度的多层取向纤维毡。但这种方法得到的纤维毡面积太小，不到2cm²，限制了其应用。Yang等发明了一种磁化静电纺丝方法生产高度有序的PVA纤维，通过改变基底接收方向，得到了以一定角度交替复合在一起的多层有序纤维毡。但这种方法得到的纤维中含有磁性纳米粒子，对人体机理的影响还未知，且相邻的单层取向纤维毡之间贴附不紧密，进而影响纤维支架的力学性能和尺寸稳定性。Li等采用静电纺丝和离心纺丝相结合的纺丝技术制备了取向纤维，并通过旋转接收纤维毡基底的方向制得多层有序、相邻层之间纤维取向呈一定角度的纤维毡。虽然得到纤维毡的面积可以达20cm²，但由于环形收集装置上沿径向方向上的线速度不同，线速度的大小影响纤维内部结构和有序度，进而得到的纤维毡的结构和形貌不均匀，影响纤维毡的力学性能。至目前为止，还未见制备多层有序的结构致密、均匀以及面积大小可控的丝素蛋白组织工程支架的相关研究和生产的文献报道或专利。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架及其制备方法，是采用静电纺丝工艺，以高速旋转的辊筒为收集装置，并改变接收器上铝箔的接收方向，制备复合纤维毡的方法。通过该方法制得的再生丝素蛋白组织工程支架是由多层取向方向成一定角度的单层再生丝素蛋白纤维毡构成，单层再生丝素蛋白纤维毡由再生丝素蛋白纤维同向排列而成，相邻层之间粘附紧密，多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架结构致密、均匀、面积大小可控，力学性能优异，同时该制备过程简单，易于操作，只需要改变接收纤维毡的铝箔在辊筒上的贴附方向，对环境也无污染。

本发明提供一种力学性能优异、生物相容性好、生物降解性能优异的组织工程支架及其制备方法。

本发明的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架是多层有序取向的丝素蛋白纤维毡，是由多层取向方向成一定角度的单层再生丝素蛋白纤维毡构成；所述的单层再生丝素蛋白纤维毡由再生丝素蛋白纤维同向排列而成；所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架相邻层之间由于接触时溶剂未完全挥发而粘附紧密，层与层间的牵制作用强；所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架结构致密且均匀。

所述的一定角度为30°~90°之间的任意角度，所述的多层是指至少为2层。

作为优选的技术方案：

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的再生丝素蛋白纤维的直径范围为200nm~5μm；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的厚度为90~160μm。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的再生丝素蛋白纤维毡的孔隙率为20~60%。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的至少为2层是指单层再生丝素蛋白纤维毡的层数为2～10层。

本发明的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的应用，所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架用于生物医用领域，包括尿道、神经、肌肉、血管、肌腱和韧带的修复和再生。

本发明还提供了一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为30~40%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为30~40%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600~1000m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到至少12μm后，马上揭下铝箔并旋转30°~90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过4~6min；如此类推重复前述步骤，制得总厚度为90~160μm的再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述后处理剂中定长浸泡30min。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，所述的蚕茧为桑蚕茧。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，所述的静电纺丝技术制备取向纳米纤维组织工程支架时的纺丝环境温度为室温，纺丝环境相对湿度为45%~55%。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，所述的乙醇-水混合溶液中乙醇占乙醇-水混合溶液总体积的90%。

有益效果

本发明创造性地提出了多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法。在保证再生丝素蛋白较高浓度的前提下，避免了有机溶剂（如甲酸、六氟异丙醇等）的使用，不仅降低了生产成本，而且避免了对人体的伤害。按照本发明的方法制得的多层有序的丝素蛋白组织工程支架在各个方向均具有优异的力学性能，其表面取向形貌能够引导细胞生长的形态和方向。

附图说明

图1是铝箔旋转90度时相邻两层纤维毡排列呈一定角度的扫描电镜图

图2是铝箔旋转90度时相邻两层纤维毡排列呈一定角度的扫描电镜图

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架是多层有序取向的丝素蛋白纤维毡，是由多层取向方向成一定角度的单层再生丝素蛋白纤维毡构成；所述的单层再生丝素蛋白纤维毡由再生丝素蛋白纤维同向排列而成；所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架相邻层之间由于接触时溶剂未完全挥发而粘附紧密，层与层间的牵制作用强；所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架结构致密且均匀。

所述的一定角度为30°~90°之间的任意角度，所述的多层是指至少为2层。

图1是铝箔旋转90度时相邻两层纤维毡排列呈一定角度的扫描电镜图，放大倍数为500倍。

图2是铝箔旋转90度时相邻两层纤维毡排列呈一定角度的扫描电镜图，放大倍数为5000倍。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的再生丝素蛋白纤维的直径范围为200nm~5μm；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的厚度为90~160μm。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的再生丝素蛋白纤维毡的孔隙率为20~60%。

如上所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架，所述的至少为2层是指单层再生丝素蛋白纤维毡的层数为2～10层。

本发明的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的应用，所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架用于生物医用领域，包括尿道、神经、肌肉、血管、肌腱和韧带的修复和再生。

实施例1

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为45%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约60μm后，马上揭下铝箔并旋转90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过4min，制得总厚度约为120μm的二层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的断裂强度为2.46MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例2

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为30%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为30%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为800m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达约40μm后，马上揭下铝箔并旋转90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤一次，制得总厚度约为120μm的三层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的双向断裂强度分别为3.69MPa、6.53MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为200nm~2μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例3

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为40%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为55%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为40%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为700m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约30μm后，马上揭下铝箔并旋转90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过6min；如此类推重复前述步骤两次，制得总厚度约为120μm的四层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的断裂强度为3.83MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为1μm~5μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例4

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为900m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约20μm后，马上揭下铝箔并旋转90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤四次，制得总厚度约为120μm的六层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的断裂强度为6.36MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例5

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到12μm后，马上揭下铝箔并旋转90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤四次，制得总厚度约为120μm的十层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的断裂强度为8.23MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例6

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约15μm后，马上揭下铝箔并旋转90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤四次，制得总厚度为约90μm的六层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的断裂强度为3.24MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例7

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约27μm后，马上揭下铝箔并旋转90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤，制得总厚度约为160μm的六层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的断裂强度为8.78MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例8

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约20μm后，马上揭下铝箔并旋转30°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤，制得总厚度约为120μm的六层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的双向断裂强度分别为4.37MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例9

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约20μm后，马上揭下铝箔并旋转45°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤，制得总厚度约为120μm的六层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的双向断裂强度分别为7.26MPa、5.23MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

实施例10

一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）以桑蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析、浓缩后，制备质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液在室温、环境相对湿度为50%条件下的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5%的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为33%的再生丝素蛋白水溶液；

（2）以步骤（1）制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为1000m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

（3）待第一层纤维毡厚度达到约27μm后，马上揭下铝箔并旋转60°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过5min；如此类推重复前述步骤，制得总厚度约为160μm的六层再生丝素蛋白纤维毡；

（4）以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤（3）制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的双向断裂强度分别为9.34、9.21MPa，孔隙率为20~60%；所制得的再生丝素蛋白纤维的直径范围为500nm~3μm；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述的乙醇-水混合溶液中浸泡30min。

Claims (8)

1.一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，其特征是包括以下步骤：

(1)以蚕茧为原料，经脱胶、溶解、透析和浓缩后，制备质量百分比为30～40％的再生丝素蛋白水溶液；

所述再生丝素蛋白水溶液的制备步骤如下：将蚕茧用质量百分比为0.5％的碳酸钠水溶液脱胶后，溶解于摩尔浓度为9.0mol/L的溴化锂水溶液中，得到再生丝素蛋白-溴化锂水溶液；将此溶液离心、过滤、透析和浓缩，得到质量百分比为30～40％的再生丝素蛋白水溶液；

(2)以步骤(1)制备再生丝素蛋白溶液为纺丝液，采用静电纺丝技术将其喷涂在高速旋转的辊筒上，辊筒表面旋转线速度为600～1000m/min，辊筒表面包覆有铝箔；喷丝头与高速旋转辊筒间接收距离为10cm，纺丝电压为20kV，制得取向纳米纤维毡；

(3)待第一层纤维毡厚度达到至少12μm后，马上揭下铝箔并旋转30°～90°，重新固定在辊筒上继续纺制第二层纤维毡，两层纤维毡的间隔时间不超过6min；如此类推重复前述步骤，制得总厚度为90～160μm的再生丝素蛋白纤维毡；

(4)以乙醇-水混合溶液作为后处理剂，对步骤(3)制备的再生丝素蛋白纤维毡进行后处理，取出晾干，即得到多层有序的丝素蛋白组织工程支架；

所述的两层纤维毡的间隔时间是指改变铝箔方向并重新固定铝箔的时间，控制间隔时间的目的是减少纤维毡中溶剂的挥发，增强层与层之间的粘附力；

所述的后处理是指将所述的再生丝素蛋白纤维毡在所述后处理剂中定长浸泡30min；

所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架是多层有序取向的丝素蛋白纤维毡，由多层取向方向成一定角度的单层再生丝素蛋白纤维毡构成；所述的单层再生丝素蛋白纤维毡由再生丝素蛋白纤维同向排列而成；所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架相邻层之间由于接触时溶剂未完全挥发而粘附紧密，层与层间的牵制作用强；所述的多层有序的再生丝素蛋白组织工程支架结构致密且均匀；

所述的一定角度为30°～90°之间的任意角度，所述的多层是指至少为2层。

2.根据权利要求1所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的蚕茧为桑蚕茧。

3.根据权利要求1所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的静电纺丝技术制备取向纳米纤维组织工程支架时的纺丝环境温度为室温，纺丝环境相对湿度为45％～55％。

4.根据权利要求1所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的乙醇-水混合溶液中乙醇占乙醇-水混合溶液总体积的90％。

5.根据权利要求1所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的再生丝素蛋白纤维的直径范围为200nm～5μm；所述的多层有序丝素蛋白组织工程支架的厚度为90～160μm。

6.根据权利要求1所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的再生丝素蛋白纤维毡的孔隙率为20～60％。

7.根据权利要求1所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述的至少为2层是指单层再生丝素蛋白纤维毡的层数为2～10层。

8.根据权利要求1所述方法制得的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架的应用，其特征在于，所述的一种多层有序的丝素蛋白组织工程支架用于生物医用领域。