CN114832874B - 一种器官芯片及其集成模组和系统、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种器官芯片及其集成模组和系统、制备方法和应用。所述器官芯片包括底盖、PDMS薄膜、顶盖,所述底盖和顶盖内设有空腔,所述PDMS薄膜内设置有序纤维支架;所述底盖、PDMS薄膜、顶盖依次层叠设置,其中底盖和顶盖的空腔围合形成细胞培养腔室,所述有序纤维支架位于所述细胞培养腔室内,所述顶盖内还集成有电激励元件。将集成了多通道电刺激器和自动化灌注系统的模组与阵列化的器官芯片连接,对片上组织施加同步电刺激和持续流体刺激,可用于高通量药物检测的细胞培养中。
Description
技术领域
本发明属于器官芯片设计与生产技术领域,具体涉及一种器官芯片及其集成模组和系统、制备方法和应用。
背景技术
类似心肌细胞、神经细胞、骨骼肌细胞等,在体内长时间处于三维细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)微环境,ECM以多尺度微纳米纤维网、束结构约束细胞的形态。这种约束力作为外部机械信号传递到细胞内空间,引导肌原纤维方向来促进肌节的排列诱导形成了有序组织。另一方面,这类具有电生理特性的细胞通过浦肯野纤维传递电信号,达到同步收缩与舒张的功能。而在体外培养时,往往因无法模拟体内三维环境与电信号传递网络而使细胞不能获得完全成熟的表型。本发明在阵列化器官芯片内集成有序纤维支架与电激励元件实现细胞三维培养,有序纤维支架与电激励可再现体内ECM微环境,以促进细胞生长、沿外加电场方向排列,进而诱导组织成熟,阵列化的器官芯片可为高通量药物检测提供硬件支撑。
现阶段,研究者一般在PDMS薄膜或载玻片基底上使用碳棒或不锈钢针作为电激励元件培养细胞,此方法难以重建体内三维微环境。关于三维支架与电刺激元件的片上集成目前还未有相应的研究,且当前大部分的器官芯片均是制备单个芯片进行手动灌注培养,无法满足对复数个器官芯片同时激励与自动化灌注培养,大大限制了体外培养组织的高通量药物检测应用场景。随着微流控技术的发展,研究者普遍使用软光刻工艺制备柔性PDMS器官芯片。它们通常需要光刻制备模具,再通过PDMS浇筑成型的方法构建微流道结构,与载玻片或PDMS键合后进行细胞与营养液的灌注。其中光刻工艺流程复杂,受限于晶圆片的尺寸,难以制造阵列化器官芯片进行同步培养与灌注,难以实现支架与微流控芯片一体制造,由此带来的是成本的增加和制造一致性的下降。故急需一种合理的集成三维支架与电激励元件的阵列化器官芯片设计方案,与其对应的制作方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供了一种器官芯片及其集成模组和系统、制备方法和应用,解决了上述背景技术中的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是:提供了一种器官芯片,包括底盖、PDMS薄膜、顶盖,所述底盖和顶盖内设有空腔,所述PDMS薄膜内设置有序纤维支架;所述底盖、PDMS薄膜、顶盖依次层叠设置,其中底盖和顶盖的空腔围合形成细胞培养腔室,所述有序纤维支架位于所述细胞培养腔室内,所述顶盖内还集成有电激励元件。
在本发明一较佳实施例中,所述电激励元件包括铂丝,所述铂丝插入细胞培养腔室内且外部连接有电刺激器。
在本发明一较佳实施例中,所述PDMS薄膜为至少一层,单层厚度为100~300μm且各层的有序纤维支架堆叠形成三维有序纤维支架。
在本发明一较佳实施例中,所述有序纤维支架由若干纤维平行排列而成,所述三维有序纤维支架的有序度方向与微流体流场方向一致。
在本发明一较佳实施例中,所述有序纤维支架采用亲水处理后的纤维且有序纤维支架表面包被人纤连蛋白。
在本发明一较佳实施例中,所述底盖内设有细胞培养液灌注流道,所述PDMS薄膜内设有细胞悬浮液灌注流道,所述顶盖内设有细胞废液流道,各流道相互连通。
在本发明一较佳实施例中,所述底盖、PDMS薄膜、顶盖通过氧等离子体对准键合。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是:提供了一种器官芯片阵列化集成模组,包括基片,所述基片上设有多通道流体灌注器、多通道电刺激集成器和上述的器官芯片,所述器官芯片阵列排布。
在本发明一较佳实施例中,所述器官芯片集成于微流控导流板内,所述多通道流体灌注器通过培养液毛细管与微流控导流板连接。
在本发明一较佳实施例中,所述多通道电刺激集成器包括若干电刺激连接孔,所述电刺激连接孔用于接入电源且孔内设有若干导线,所述导线分别与各器官芯片的铂丝连接。
在本发明一较佳实施例中,所述器官芯片通过定位夹具固定于基板上。
在本发明一较佳实施例中,所述基板的外周还设有支撑框架。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是:提供了一种器官芯片自动灌注集成系统,包括控制器、空气压力源、储液管、器官芯片阵列化集成模组和废液池;所述空气压力源连接储液管用于提供出液动力,所述储液管连接至器官芯片阵列化集成模组,所述器官芯片阵列化集成模组为如上述的一种器官芯片阵列化集成模组,所述废液池用于收集细胞培养废液。
在本发明一较佳实施例中,所述空气压力源和储液管之间设有压力调节器。
在本发明一较佳实施例中,所述储液管包括细胞培养液储液管和细胞悬浮液储液管,二者与器官芯片阵列化集成模组的连接管路上设有切换阀和流量传感器,所述切换阀和流量传感器连接至所述控制器。
在本发明一较佳实施例中,所述切换阀包括一转多切换阀(M-Switch)和体积定量切换阀(L-Switch),所述一转多切换阀用于控制细胞培养液在不同器官芯片间的切换灌注,所述体积定量切换阀配合流量传感器用于接种时细胞悬浮液的定量循环灌注。
压力调节器通过正压驱动储液管里的细胞悬浮液进入体积定量的切换阀,再根据灌注软件的流量与路径的设定,将自动打开阀门进入指定芯片内完成细胞悬浮液的定量接种;在细胞接种完成后封口以保证芯片的密封性,通过一转十切换阀接口可为十个器官芯片上培养的细胞供给培养液;通过连接流量传感器实时监测流量,与压力调节器形成反馈系统实时调节,以保证始终是以恒定的流量进行灌注。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是:提供了所述器官芯片的制备方法,包括如下步骤:
1)通过PDMS浇筑成型制备底盖及其空腔、顶盖及其空腔和电激励路径;
2)通过纳米压印方法制备厚度为100~300μm且带有微流道结构的PDMS薄膜;
3)在所述PDMS薄膜的原位上滚筒静电纺丝制备有序纤维,并进行亲水处理;
4)PDMS对准键合:氧等离子体处理后逐层对准键合,键合后压紧加热60℃放置12hr;
5)在顶盖的电激励路径内插入铂丝,连接处涂覆PDMS进行密封,保证培养腔室的密封性良好,外部留出接触点用于连接外部电刺激器。
在本发明一较佳实施例中,所述4)中亲水处理为对所述有序纤维氧等离子体处理后,滴覆0.5%的SDS。此外还可进行纤维密度、纤维直径、纤维有序度、纤维力学性能和支架表面亲疏水性的调控。由于静电纺丝生物相容性良好的聚己内酯(PCL)纤维具有高度疏水特性,使得细胞难以均匀铺展在纤维上,通过氧等离子体与十二烷基硫酸钠(SDS)处理后,使支架表面发生化学改性,从而保证支架的长久亲水性。通过直接在各层的微流道结构上制备有序纤维,保证了细胞接种灌注时能相对均匀分布在每一层纤维薄膜上。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之五是:提供了一种应用,在高通量药物检测中,采用如上述的器官芯片或器官芯片阵列化集成模组或器官芯片自动灌注集成系统,再现体内ECM微环境,以促进细胞生长、沿外加刺激电场方向排列,进而诱导组织成熟。
在本发明一较佳实施例中,电场刺激的时间、频率、幅度、波形等参数可调节肌细胞的收缩功能,针对来源于人类多能干细胞的心肌细胞的电刺激参数设计:施加3-4V/cm的双相电场,频率从1Hz增加到6Hz,每天30分钟持续刺激6天。
本技术方案与背景技术相比,它具有如下优点:
1.本发明所述集成三维有序纤维支架的器官芯片,通过滚筒静电纺丝技术在带有微流道的柔性PDMS薄膜上制备有序纤维,逐层叠加的方式构建三维有序纤维支架。有序微纳米纤维为细胞提供粘附的线位点,引导肌原纤维方向来促进肌节的排列,诱导其形成有序组织。
2.本发明采用滚筒静电纺丝工艺,进行集成三维有序纤维支架的器官芯片阵列的一体化制造。不同于传统的硬质二维培养基底,通过滚筒静电纺丝与叠层工艺可实现三维有序纤维支架制备,促进细胞间的有序排列并构建一块细胞间良好通讯的较厚组织;不同于芯片内支架与芯片分开式制造,通过在PDMS薄膜上原位静电纺丝,可保证每块芯片的有序纤维支架均是在同一环境、同一工艺参数、同一时间下制备的,使得芯片间的一致性与稳定性大大提升,同时避免了支架在芯片内的定位问题。
3.本发明的器官芯片集成模组,不同于传统的片外电刺激装置,片内电刺激为细胞提供更加贴合体内微环境;不同于二维电刺激装置,通过有序纤维支架与电刺激的结合,可实现对细胞的三维电刺激,更进一步促进其细胞间的有序排列与电信号传递。;
4.本发明的器官芯片集成系统,采用阵列化器官芯片与自动化灌注系统的结合,使得外部设备与器官芯片能够更便利的连接与操控,减少因人为操作造成生物污染的风险,为细胞培养期间的灌注和高通量药物检测提供硬件基础。
附图说明
图1为实施例1中器官芯片层结构图;
图2为实施例1中三维有序纤维支架结构图;
图3为实施例1中顶盖结构图;
图4为实施例2中器官芯片集成模组结构图;
图5为实施例3中器官芯片集成系统结构图;
图6为实施例1中器官芯片制备工艺流程图。
其中,
1-底盖,2-第一层PDMS薄膜,21-有序纤维支架,22-细胞悬浮液灌注流道,3-第二层PDMS薄膜,4-顶盖,41-铂丝(电极),42-细胞接种入口,43-培养液入口,44-培养液出口,51-橡胶支撑框架,52-基片,53-多通道流体灌注器,54-(培养液毛细管)入口,55-多通道电刺激集成器,56-微流控导流板,57-培养液毛细管,58-定位夹具,59-电刺激连接孔,61-空气压力源,62-压力调节器,63-细胞悬浮液储液管,64-L-switch,65-培养液储液管,66-流量传感器,67-M-switch,68-上位机控制界面,69-外接电刺激器,70-废液池。
具体实施方式
下述实施例中的三维有序纤维支架21的设计方法,包括以下步骤:
1)预设纤维直径、密度和有序度范围:根据相应细胞所处的体内三维微环境形貌为设计纤维形貌的依据,确定最合适的纤维直径、密度和有序度范围;
2)调节纤维支架力学性能:根据相应细胞的体内微环境的刚度作为支架材料选择与的结构设计依据,选取可静电纺丝的生物相容性良好的材料,通过拉伸实验确定有序纤维支架21的刚度。
3)改善纤维支架表面疏水性:根据相应细胞的体内微环境的生化特性作为改善纤维支架表面性能的依据,使支架长久亲水后能够便于细胞在支架上均匀铺展,同时用人纤连蛋白(FN)包被纤维支架以促进细胞与纤维的粘附。
下述实施例中集成电激励元件的器官芯片的设计方法,包括以下步骤:
1)集成电激励元件器官芯片设计:根据芯片内有序纤维的方向确定电刺激的电场方向,有序纤维以力约束的方式引导细胞排列,而电刺激的电场方向与纤维平行可进一步促进有序排列细胞间的连接,使其能够形成有序电信号传递的一片组织;
2)电激励元件材料选择:铂丝41电极在反复电刺激下电阻能保持稳定。同时也不易发生电化学反应;
3)电刺激参数设计:针对来源于人类多能干细胞的心肌细胞的研究发现,施加3-4V/cm的双相电场,频率从1Hz增加到6Hz,每天30分钟持续刺激6天,细胞的成熟程度逐渐增高;
4)电激励元件表面处理:通过氧等离子体清洗机保证电激励元件的亲水性,使其能够充分与细胞营养液接触实现电场的传递。
实施例1
如图1,本实施例一种器官芯片,包括底盖1、PDMS薄膜2和3、顶盖4,所述底盖1和顶盖4内设有空腔,所述PDMS薄膜2和3内设置有序纤维支架21;所述底盖1、PDMS薄膜2和3、顶盖4依次层叠设置,其中底盖1和顶盖4的空腔围合形成细胞培养腔室,所述有序纤维支架21位于所述细胞培养腔室内,所述顶盖4内还集成有电激励元件。
所述电激励元件为两根铂丝41电极,所述铂丝41插入细胞培养腔室内且外部连接有电刺激器。
如图2,本实施例的PDMS薄膜为两层,单层厚度为300μm且各层的有序纤维支架21堆叠形成三维有序纤维支架21。所述有序纤维支架21由若干纤维间隔平行排列而成,所述三维有序纤维支架21的有序度方向与微流体流场方向一致。所述有序纤维支架21采用亲水处理后的纤维,接种细胞之前在有序纤维支架21表面包被人纤连蛋白。
本实施例中,所述底盖1、PDMS薄膜2和3、顶盖4通过氧等离子体对准键合。如图3,每层附有相应的微流道结构:所述底盖1内设有细胞培养液灌注流道,所述PDMS薄膜2和3内设有细胞悬浮液灌注流道,所述顶盖4内设有细胞废液流道,各流道相互连通。顶盖4统一设置细胞接种入口42、培养液出口44和培养液入口43,培养液的流场方向由下向上灌注可保证培养液更换得更加充分,同时避免流体冲击对细胞的损伤,中间两层带有微流道的PDMS薄膜2和3为细胞悬浮液的灌注流道,保证接种时细胞能够均匀铺展在各层纤维支架上,另一方面,300μm厚的PDMS薄膜2和3使层间细胞有相互通讯作用。
如图6,本实施例还提供了所述器官芯片的制备方法,包括如下步骤:
1)光固化3D打印:通过摩方S-240光固化3D打印机(打印精度10μm)打印器官芯片的各层模具;
2)浇筑成型:顶盖4与底盖1较厚采用传统PDMS浇筑成型,抽真空30min去除气泡,鼓风干燥箱60℃放置30min待其固化后脱模:
3)压印成型:由于中间两层PDMS薄膜2和3的厚度为300μm,传统浇筑脱模的工艺难以实现,因此将PDMS滴覆于硅片上,抽真空30min去除气泡,将带有微结构的模具压印在硅片上,鼓风干燥箱60℃放置30min待其固化后脱模;
4)滚筒静电纺丝:将300μm厚的PDMS贴附与滚筒上,用3M胶带作为掩膜并固定,仅保留培养空腔位置的纤维;通过静电纺丝技术,将高度柔性的PDMS薄膜2和3贴附于滚筒上纺出有序纤维,控制纺丝时间和工艺参数调控纤维密度。纤维有序度方向与微流体流场方向一致,使流体能够充分顺着纤维方向流动,避免了流体的长期流动对纤维造成破损。
5)等离子体清洗:使用氧等离子处理有序纤维支架2170s,去除加工过程中不必要的杂物,并对芯片内部流道进行亲水处理;
纤维亲水处理:滴覆0.5%SDS溶液使纤维支架保持长期亲水状态,增加细胞与纤维的粘附;
6)PDMS对准键合:对各层PDMS氧等离子处理,逐层对准键合,放置在60℃恒温想12hr保证芯片的键合强度;
7)在顶盖4的电激励路径内插入铂丝41,连接处涂覆PDMS进行密封,留出接触点用于连接外部电刺激器。铂丝41电极直径300μm,电极间距为2.2mm,与外部电刺激器连接为细胞提供平行于有序纤维的均匀电场。
实施例2
一种器官芯片阵列化集成模组,包括基片52,所述基片52上设有多通道流体灌注器53、多通道电刺激集成器55和实施例1的器官芯片,所述器官芯片阵列排布。
如图4,所述器官芯片集成于微流控导流板56内,所述多通道流体灌注器53通过培养液毛细管57的入口54与微流控导流板56连接。所述多通道电刺激集成器55包括若干电刺激连接孔59,所述电刺激连接孔59用于接入电源且孔内设有若干导线,所述导线分别与各器官芯片的铂丝41连接。所述器官芯片通过定位夹具58固定于基板上。所述基板的外周还设有橡胶支撑框架51。
电激励元件通过基片52上的多通道电刺激集成器55与外部信号发生器相连接,规范了阵列化器官芯片的电路排布,同时减少电路间的相互干扰,为芯片提供稳定、独立、有序的电刺激。微流控导流板56作为多通道流体灌注器53与器官芯片的中间连接器,避免多根微流体毛细管在芯片上的杂乱排序,便于细胞培养期间的实时观察。
实施例3
如图5,一种器官芯片自动灌注集成系统,包括控制器、空气压力源61、储液管、器官芯片阵列化集成模组和废液池;所述空气压力源61连接储液管用于提供出液动力,所述储液管连接至器官芯片阵列化集成模组,所述器官芯片阵列化集成模组为实施例2的一种器官芯片阵列化集成模组,连接有外部电刺激器69,所述废液池用于收集细胞培养废液。所述控制器设有上位机控制界面68,方便操控。
所述空气压力源61和储液管之间设有压力调节器62。
所述储液管包括细胞培养液储液管65和细胞悬浮液储液管63,二者与器官芯片阵列化集成模组的连接管路上设有切换阀和流量传感器66,所述切换阀和流量传感器66连接至所述控制器。
所述切换阀包括一转多切换阀(M-Switch)67和体积定量切换阀(L-switch)64,所述一转多切换阀用于控制细胞培养液在不同器官芯片间的切换灌注,所述体积定量切换阀配合流量传感器66用于接种时细胞悬浮液的定量循环灌注。本实施例中,L-switch64是一个6口2位阀,外围端口两两相连,同一端口,通过切换,可分别与其相邻端口相连;用于接种时细胞悬浮液的循环灌注,搭配特定长度的毛细管,可实现单次流体的体积定量。M-Switch67是一个11口/10路旋转阀,阀外围的10个端口与1个中间端口相连,通过电机旋转,实现每外围端口和中间端口的分别相连;在上位机界面输入相应灌注参数,可实现营养液在芯片间自动切换并灌注。阵列化芯片与底部微流控导流板56结合,培养液入口43连接切换阀,培养液出口44则连接外部废液池70。流量传感器66与压力调节器62形成反馈闭环系统,可保证培养期间流量的基本恒定,为细胞提供理想的流体剪切应力刺激。
实施例4
本实施例提供了实施例1器官芯片在高通量药物检测中的应用,用于再现体内ECM微环境,以促进细胞生长、沿外加刺激电场方向排列,进而诱导组织成熟。针对来源于人类多能干细胞的心肌细胞的电刺激参数设计:施加3-4V/cm的双相电场,频率从1Hz增加到6Hz,每天30分钟持续刺激6天。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (19)
1.一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:包括基片,所述基片上设有多通道流体灌注器、多通道电刺激集成器和器官芯片,所述器官芯片阵列排布;
所述器官芯片包括底盖、PDMS薄膜、顶盖,所述底盖和顶盖内设有空腔,所述PDMS薄膜内设置有序纤维支架;所述底盖、PDMS薄膜、顶盖依次层叠设置,其中底盖和顶盖的空腔围合形成细胞培养腔室,所述有序纤维支架位于所述细胞培养腔室内,所述顶盖内还集成有电激励元件。
2.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述电激励元件包括铂丝,所述铂丝插入细胞培养腔室内且外部连接有电刺激器。
3.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述PDMS薄膜为至少一层,单层厚度为100~300μm且各层的有序纤维支架堆叠形成三维有序纤维支架。
4.根据权利要求3所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述有序纤维支架由若干纤维平行排列而成。
5.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述有序纤维支架采用亲水处理后的纤维且有序纤维支架表面包被人纤连蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述底盖内设有细胞培养液灌注流道,所述PDMS薄膜内设有细胞悬浮液灌注流道,所述顶盖内设有细胞废液流道,各流道相互连通。
7.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述底盖、PDMS薄膜、顶盖通过氧等离子体对准键合。
8.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述器官芯片集成于微流控导流板内,所述多通道流体灌注器通过培养液毛细管与微流控导流板连接。
9.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述多通道电刺激集成器包括若干电刺激连接孔,所述电刺激连接孔用于接入电源且孔内设有若干导线,所述导线分别与各器官芯片的铂丝连接。
10.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述器官芯片通过定位夹具固定于基片上。
11.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述基片的外周还设有支撑框架。
12.根据权利要求1所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述器官芯片的制备方法包括如下步骤:
1)通过PDMS浇筑成型制备底盖及其空腔、顶盖及其空腔和电激励路径;
2)通过纳米压印方法制备厚度为100~300μm且带有微流道结构的PDMS薄膜;
3)在所述PDMS薄膜的原位上滚筒静电纺丝制备有序纤维,并进行亲水处理;
4)PDMS对准键合:氧等离子体处理后逐层对准键合,键合后压紧加热60℃放置12hr;
5)在顶盖的电激励路径内插入铂丝,连接处涂覆PDMS进行密封,留出接触点用于连接外部电刺激器。
13.根据权利要求12所述的一种器官芯片阵列化集成模组,其特征在于:所述4)中亲水处理为对所述有序纤维氧等离子体处理后,滴覆0.5%的SDS。
14.一种器官芯片自动灌注集成系统,其特征在于:包括控制器、空气压力源、储液管、器官芯片阵列化集成模组和废液池;所述空气压力源连接储液管用于提供出液动力,所述储液管连接至器官芯片阵列化集成模组,所述器官芯片阵列化集成模组为如权利要求1~11任一项所述的一种器官芯片阵列化集成模组,所述废液池用于收集细胞培养废液。
15.根据权利要求14所述的一种器官芯片自动灌注集成系统,其特征在于:所述空气压力源和储液管之间设有压力调节器。
16.根据权利要求14所述的一种器官芯片自动灌注集成系统,其特征在于:所述储液管包括细胞培养液储液管和细胞悬浮液储液管,二者与器官芯片阵列化集成模组的连接管路上设有切换阀和流量传感器,所述切换阀和流量传感器连接至所述控制器。
17.根据权利要求16所述的一种器官芯片自动灌注集成系统,其特征在于:所述切换阀包括一转多切换阀和体积定量切换阀,所述一转多切换阀用于控制细胞培养液在不同器官芯片间的切换灌注,所述体积定量切换阀配合流量传感器用于接种时细胞悬浮液的定量循环灌注。
18.一种应用,其特征在于:在高通量药物检测中,采用如权利要求1~11任一项所述的一种器官芯片阵列化集成模组或权利要求14~17任一项所述的一种器官芯片自动灌注集成系统,再现体内ECM微环境,以促进细胞生长、沿外加刺激电场方向排列,进而诱导组织成熟。
19.根据权利要求18所述的应用,其特征在于:针对来源于人类多能干细胞的心肌细胞的电刺激参数设计:施加3-4V/cm的双相电场,频率从1Hz增加到6Hz,每天30分钟持续刺激6天。
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