TW201538719A - 一種具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種具環狀微流道晶片，包含一基板，具有一表面，其中該表面包含一腔室、一第一微流道、一第二微流道及一第三微流道。該腔室用以供放置一第一細胞，以及上端具有該第一微流道，以供該第一細胞流入至該腔室。該第二微流道環繞於該腔室之外側，該第二微流道包含一細胞外基質(ECM)輸入端，以及一細胞外基質(ECM)輸出端。該第三微流道環繞於該第二微流道之外側，該第三微流道具有一輸入口以及二輸出口。一上蓋覆蓋於該基板上，該上蓋包含一第四微流道，以供一預定流速培養液流入或流出該腔室。
Description
本發明係關於一種組織培養裝置，特別係關於一種具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置及其使用方法。
現代人身受著癌症的影響，複合式治療被認為是癌症治療的希望，也就是透過傳統療法與標靶治療的結合來提高腫瘤的治癒率。當癌症腫瘤生長超過2mm時，會因缺氧釋放血管新生因子，使新生血管朝腫瘤生長，因此，使用細胞分子抑制腫瘤血管生成，即為標靶治療，已成為癌症治療的新方向。醫學研究上，體內測試限制較多，故，體外重建體內組織所處之微環境更具有意義，且臨床上治療效果佳，同時降低體內測試之成本。
傳統實驗係採用平面基板(如玻璃或培養皿)以培養細胞，然而，一般細胞培養方法昂貴且操作複雜，且現今細胞培養基本上為靜態的培養形式，對於仿造體內動態微環境及物理應力具有一定的難度，因而活體組織內細胞的功能及反應無法有效地在一般體外細胞培養中表現出來。再者，一般細胞培養的方法不適合用於單層細胞，且平面培養癌症細胞會失去其惡性表型與對抗癌藥物之抗藥性等異常特徵；相反地，三維基質之培養呈現了腫瘤血管新生、腫瘤惡性轉移相似的基因表達模式與病理現象，近年來研究顯示，三維基質培養除可有效創造維度梯度分布外，另外在體外實驗中更能創造出接近真實之細胞維環境。
微流體系統具有許多優點，如：低耗能、低製作成本、較少量的樣品及試劑等，且微流體系統更具備穩定層流(laminar flow)之優點，經由微流體系統的設計可精確地控制流體空間及時間。
為解決上述之習知問題，本發明提供一新穎微流道晶片，以重建體內腫瘤細胞組織所處之環境，誘使新生血管朝腫瘤生長的過程，並將其應用在血管新生的研究，進一步能對腫瘤研究與臨床癌症標靶治療上提供更多相關
資訊。
本發明之目的，提供一種環狀微流道晶片，可廣泛地應用於各腫瘤細胞之體外培養。
本發明之目的，提供晶片之操作，以定義出細胞的圖形化，亦提供細胞精準定位，實現腫瘤細胞之體外維環境重建。
本發明之目的，提供一具有預定流速之培養液輸入及輸出，以形成動態流體，俾使細胞能充分得到養分並提高細胞的存活率。
本發明之目的，提供新穎之微型共培養系統，可有效且可調整的生物工具，探討細胞與細胞間或細胞與細胞外基質(ECM)對調整腫瘤血管新生的相互作用，有助於組織工程的革新與提供臨床藥物或治療的資訊。
為達上述之目的，本發明包含一基板，具有一表面，其中該表面包含一該腔室、一第一微流道、一第二微流道及一第三微流道，其中該腔室形成於該基板之表面上，以供放置一第一細胞，以及上端具有該第一微流道，以供該第一細胞流入至該腔室；該第二微流道，環繞於該腔室之外側，該第二微流道包含一細胞外基質(ECM)輸入端，以供一細胞外基質(ECM)輸入，以及一細胞外基質(ECM)輸出端，以供該細胞外基質(ECM)輸出；該第三微流道，環繞於該第二微流道之外側，該第三微流道具有一輸入口，以供一第二細胞輸入，以及二輸出口，以供該第二細胞輸出；以及一上蓋，覆蓋於該基板上，該上蓋包含一第四微流道，以供一預定流速培養液流入或流出該腔室。
為達上述之目的，本發明之第一微流道及第四微流道具有預定流速之培養液輸出及輸入，使該裝置具有動態流體。
10‧‧‧具環狀微流道晶片
11‧‧‧表面
12‧‧‧基板
122‧‧‧腔室
124‧‧‧第一微流道
126‧‧‧第二微流道
128‧‧‧第三微流道
13‧‧‧電極
14‧‧‧上蓋
142‧‧‧第四微流道
30‧‧‧第一細胞
32‧‧‧肺癌細胞
34‧‧‧纖維母細胞
40‧‧‧內皮細胞
AB‧‧‧剖面線
C‧‧‧箭頭
D‧‧‧箭頭
202~212‧‧‧步驟
50‧‧‧孔隙
第一圖係根據本發明之最佳實施例顯示環狀微流道晶片之立體分解圖。
第二圖係根據本發明之最佳實施例顯示環狀微流道晶片之立體圖。
第三圖係根據本發明之最佳實施例顯示環狀微流道晶片之正面圖以及剖面圖。
第四圖係根據本發明之最佳實施例顯示肺癌細胞A549以及纖維母細胞3T3經由介電泳力所排成之圖案。
第五圖係根據本發明之最佳實施例顯示動態流體。
第六圖係根據本發明之最佳實施例顯示微流道與微流道間之孔隙。
第七圖係根據本發明之最佳實施例顯示環狀微流道晶片之操作步驟。
藉由參考下列詳細敘述，將可以更快地瞭解上述觀點以及本發明之優點，並且藉由下面的描述以及附加圖式，更容易了解本發明之精神。
本發明將以較佳之實施例及觀點加以詳細敘述。下列描述提供本發明特定的施行細節，俾使閱者徹底瞭解這些實施例之實行方式。然該領域之熟習技藝者須瞭解本發明亦可在不具備這些細節之條件下實行。此外，文中不會對一些已熟知之結構或功能或是作細節描述，以避免各種實施例間不必要相關描述之混淆，以下描述中使用之術語將以最廣義的合理方式解釋，即使其與本發明某特定實施例之細節描述一起使用。
第一實施例：
第一圖與第二圖係根據本發明之最佳實施例顯示環狀微流道晶片之立體圖。該裝置10包含一基板12，具有一表面11，該表面11包含一腔室122、一第一微流道124、一第二微流道126及一第三微流道128。該腔室122形成於該基板12之表面11上，以供放置一第一細胞30，以及上端具有該第一微流道124，以供該第一細胞30流入至該腔室122。該第二微流道126環繞於該腔室122之外側，該第二微流道126包含一細胞外基質(ECM)輸入端，以供一細胞外基質(ECM)輸入，以及一細胞外基質(ECM)輸出端，以供該細胞外基質(ECM)輸出。該第三微流道128環繞於該第二微流道126之外側，該第三微流道128具有一輸入口，以供一第二細胞40輸入，以及二輸出口，以供該第二細胞40輸出。一上蓋14，覆蓋於該基板12上，該上蓋14包含一第四微流道142，以供一培養液流入或流出該腔室122。
此實施例中，上蓋14之長度小於基板12之長度。腔室122中包含一串聯電極13，任何材料的物質均有介電特性，受到不同極化程度下，會順著外加電場的方向以排列各種圖案。於最佳實施例中，利用介電泳力(Dielectrophoresis Force,DEP)使細胞在玻璃基板上排列成特定圖案。
另一實施例中，於腔室122內更包含一光鉗元件(optical
tweezer)(未顯示於圖中)，利用單光束雷射光(或其他光源)聚焦和光子動量轉移所
產生的反作用力，以操控微米等級物體，如細胞或微生物等，光鉗可在不破壞細胞的前提下，自由地操控細胞，進而將細胞排列成特定圖案。於另一實施例中，結合光鉗元件和介電泳力之技術，即為光電鑷夾(optoelectronic tweezers)，於非晶矽光導材料上，透過即時可調的光圖形來影響空間中電場的分部，進而利用介電泳力來操控粒子，進而將細胞排列成特定圖案。於另一實施例中，該腔室122內更包含一微流體元件(未顯示於圖中)，可藉由操控該微流體元件之條件，如流速，以培養單一細胞組織。本領域具有通常知識者應當理解，本裝置10可藉由光、電、流體或及其結合方式以排列細胞組織。
參閱第三圖，該圖係根據本發明最佳實施例顯示環狀微流道晶片之正面圖以及剖面圖。於此實施例中，第一細胞30包含人類肺癌細胞32以及纖維母細胞34，第二細胞40係為人類臍帶血管內皮細胞，但不以此為限。將上述細胞分別進行培養，培養至固定數量後，藉由泵浦(spring pump)將肺癌細胞32和纖維母細胞34經由第一微流道124載入至腔室中且固定於基板12上，以及培養液經上蓋14之第四微流道142載入至腔室122中；接續進行介電泳力(Dielectrophoresis Force,DEP)效應，將正DEP和負DEP參數設定為Vpk-pk=5V之相對應頻率1MHz以及1kHz，以進行細胞排列，如第四圖所示，該圖顯示肺癌細胞32以及纖維母細胞34經由介電泳力所排成具島狀分布的圖案，其中細胞排列圖案主要取決於電極13於玻璃基板12上的排列方式，電極參數亦會影響細胞排列圖案。待肺癌細胞32排列完成且開始分泌血管新生因子(未顯示於圖中)並往第二微流道126移動(箭頭D所示)，再將內皮細胞40注射至第三微流道128中，而內皮細胞40因受到血管新生因子(或化學因子)之濃度梯度影響，使得內皮細胞40往第二微流道126移動(箭頭C所示)，血管新生因子與內皮細胞40會在第二微流道126中產生新血管。
此實施例中，腔室122呈現一圓形形狀，但並不以此為限，圓形結構用以增加與第二微流道126之接觸面積，進一步地可藉由該裝置10以探討腫瘤細胞所釋放出來的化學因子是否具有方向性。另外，也可藉由該裝置10應用於藥物檢測方面，將腫瘤癌細胞固定於中央腔室122，而藥物注入環繞於腔室外側之第二微流道126，以形成多方向性之檢測。
此實施例中，微流道與微流道間之材料係高分子膜層，其中該高分子膜層係軟性可撓區材料，最佳實施例之材料為聚二甲基矽氧烷(PDMS)，但
並不以此為限。經實驗結果以及電腦模擬證實，藉由調控微流道之流速，進一步地調控微流道與微流道間孔隙之流速，以利於新血管生長。為增加細胞對微流道之附著力，可採用膠原蛋白或其他具生物相容性之材料，以輔助細胞貼附，此實施例於微流道內表面上塗佈膠原蛋白，除用以增加細胞之貼附力外，另外可作為內皮細胞之生長支架，但不以此為限。
第二實施例：
參閱第五圖，該圖係根據本發明最佳實施例顯示動態流體。此實施例中，第一微流道124及第四微流道142分別作為具有預定流速之培養液輸入及輸出；或是第四微流道142同時作為預定流速之培養液輸出及輸入。一細胞(未顯示於圖中)經由第一微流道124載入腔室122且固定於基板12上後，培養液可從第四微流道142輸入至腔室122，以供給細胞所需要的養分，此實施例中該細胞包含任一可培養之細胞。在細胞培養的過程中，細胞所釋放出代謝物或毒素以及不新鮮的培養液可從第一微流道124或第四微流道142輸出，同時新鮮的培養液經由第四微流道142輸入，使該裝置10呈現預定流速的動態流體培養裝置，以確保細胞充分得到新鮮的養分，提高細胞存活率。培養液之輸入及輸出流速依照實際流場流速所需而調控。
此實施例中，微流道與微流道間之材料係高分子膜層，其中該高分子膜層係軟性可撓區材料，最佳實施例之材料為聚二甲基矽氧烷(PDMS)，但並不以此為限。經實驗結果以及電腦模擬證實，藉由調控微流道之流速，進一步地調控微流道與微流道間孔隙之流速，以利於新血管生長。為增加細胞對微流道之附著力，可採用膠原蛋白或其他具生物相容性之材料，以輔助細胞貼附，此實施例於微流道表面上塗佈膠原蛋白，除用以增加細胞之貼附力外，另外可作為內皮細胞之生長支架，但不以此為限。
第三實施例：
參閱第六圖，該圖細根據本發明最佳實施例顯示微流道與微流道間之孔隙。此實施例中，以纖維母細胞作為測試對象，將纖維母細胞和第一細胞培養基(未顯示於圖中)注入至第三微流道128中，此實施例係採用EBM-2 Basal Medium作為第一細胞培養基，而將具有胎牛血清的第二細胞培養基(未顯示於圖中)載入至腔室122中。實驗經過16小時後，纖維母細胞因受到具有胎牛血清的濃度梯度影響，纖維母細胞會往第二微流道126遷徙且貼附於第二微流
道126與第三微流道128間。由此實施例應當理解，該裝置10中的細胞，因受到濃度梯度的影響，使細胞遷徙至微流道與微流道間之孔隙50，進一步有利於新血管生成。
此實施例中，微流道與微流道間之材料係高分子膜層，其中該高分子膜層係軟性可撓區材料，最佳實施例之材料為聚二甲基矽氧烷(PDMS)，但並不以此為限。經實驗結果以及電腦模擬證實，藉由調控微流道之流速，進一步地調控微流道與微流道間孔隙之流速，以利於新血管生長。為增加細胞對微流道之附著力，可採用膠原蛋白或其他具生物相容性之材料，以輔助細胞貼附，此實施例於微流道表面上塗佈膠原蛋白，除用以增加細胞之貼附力外，另外可作為內皮細胞之生長支架，但不以此為限。
第四實施例：
參閱第七圖，該圖係根據本發明最佳實施例顯示環狀微流道晶片之操作步驟。
步驟202：於腔室122和第一、三、四微流道底部注入一層膠原蛋白，同時於第二微流道126中注滿膠原蛋白，膠原蛋白用以支持細胞和固定細胞。
步驟204：藉由泵浦，將第一細胞30經由第一微流道124注射至腔室122中，此實施例中，第一細胞30包含肺癌細胞32和纖維母細胞34。
步驟206：第四微流道142具有預定流速培養液之輸入或輸出，使第一細胞30能充分得到新鮮的養分，如第五圖所示。流速之設定係依據實驗而調控。
步驟208：利用介電泳力以排列細胞組織，如第四圖所示。此實施例中，正DEP和負DEP參數設定為Vpk-pk=5V之相對應頻率1MHz以及1kHz，但並不以此為限。
另一實施例中，於腔室122內更包含一光鉗元件(optical tweezer)(未顯示於圖中)，利用單光束雷射光(或其他光源)聚焦和光子動量轉移所產生的反作用力，以操控微米等級物體，如細胞或微生物等，光鉗可在不破壞細胞的前提下，自由地操控細胞，進而將細胞排列成特定圖案。於另一實施例中，結合光鉗元件和介電泳力之技術，即為光電鑷夾(optoelectronic tweezers)，於非晶矽光導材料上，透過即時可調的光圖形來影響空間中電場的分部，進而
利用介電泳力來操控粒子，進而將細胞排列成特定圖案。於另一實施例中，該腔室122內更包含一微流體元件(未顯示於圖中)，可藉由操控該微流體元件之條件，如流速，以培養單一細胞組織。本領域具有通常知識者應當理解，本裝置10可藉由光、電、流體或及其結合方式以排列細胞組織。
步驟210：於第三微流道128中注射第二細胞40，此實施例中第二細胞40為內皮細胞。
步驟212：內皮細胞40因受肺癌細胞32所分泌化學因子的濃度梯度影響，於第二微流道126中產生新血管。
此實施例中，微流道與微流道間之材料係高分子膜層，其中該高分子膜層係軟性可撓區材料，最佳實施例之材料為聚二甲基矽氧烷(PDMS)，但並不以此為限。經實驗結果以及電腦模擬證實，藉由調控微流道之流速，進一步地調控微流道與微流道間孔隙之流速，以利於新血管生長。為增加細胞對微流道之附著力，可採用膠原蛋白或其他具生物相容性之材料，以輔助細胞貼附，此實施例於微流道表面上塗佈膠原蛋白，除用以增加細胞之貼附力外，另外可作為內皮細胞之生長支架，但不以此為限。
本說明書所述的基板材質包含晶矽光導材料、非晶矽光導材料或其他高分子聚合物等。本說明書中所述之微流道之寬度係依照實驗所需而定，不同微流道之寬度可為相同或可為不同。本文說明書所述的腔室寬度可小於、等於或大於微流道之寬度，實際上仍依照實驗所需而定。
本說明書之微流道晶片裝置除可作為多細胞共培養之平台，亦可作為單一細胞培養之平台。本說明書中所述之“動物組織細胞”、“癌症細胞”或“細胞”包含能釋放化學因子的細胞，並非侷限於來自人體細胞或人體某器官癌細胞。本說明書中所述的細胞外間質(ECM)包含膠原蛋白(collagen)和纖維連接蛋白(fibronctin)等，用以支持細胞和固定細胞。本發明所述之裝置可廣泛應用於任一細胞培養，並非侷限於培養癌症細胞，應當理解，本發明所述之裝置亦可應用於藥物對細胞之檢測或其他生物檢測。
若文中有一元件“A”耦接(或耦合)至元件“B”，元件A可能直接耦接(或耦合)至B，亦或是經元件C間接地耦接(或耦合)至B。若說明書載明一元件、特徵、結構、程序或特性A會導致一元件、特徵、結構、程序或特性B，其表示A至少為B之一部分原因，亦或是表示有其他元件、特徵、結構、
程序或特性協助造成B。在說明書中所提到的“可能”一詞，其元件、特徵、程序或特性不受限於說明書中；說明書中所提到的數量不受限於“一”或“一個”等詞。
本發明並未侷限在此處所描述之特定細節特徵。在本發明之精神與範疇下，與先前描述與圖式相關之許多不同的發明變更是可被允許的。因此，本發明將由下述之專利申請範圍來包含其所可能之修改變更，而非由上方描述來界定本發明之範疇。
10‧‧‧環狀微流道晶片
11‧‧‧表面
12‧‧‧基板
122‧‧‧腔室
124‧‧‧第一微流道
126‧‧‧第二微流道
128‧‧‧第三微流道
13‧‧‧電極
14‧‧‧上蓋
142‧‧‧第四微流道
Claims (10)
- 一種具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，包含：一基板，具有一表面，其中該表面包含一腔室、一第一微流道、一第二微流道及一第三微流道，其中該腔室，形成於該基板之表面上，以供放置一第一細胞，以及上端具有該第一微流道，以供該第一細胞流入至該腔室，該第二微流道，環繞於該腔室之外側，該第二微流道包含一細胞外基質(ECM)輸入端，以供一細胞外基質(ECM)輸入，以及一細胞外基質(ECM)輸出端，以供該細胞外基質(ECM)輸出，該第三微流道，環繞於該第二微流道之外側，該第三微流道具有一輸入口，以供一第二細胞輸入，以及二輸出口，以供該第二細胞輸出；以及一上蓋，覆蓋於該基板上，該上蓋包含一第四微流道，以供一預定流速培養液流入或流出該腔室。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該腔室內包含二電極，藉由調整施加偏壓，以排列細胞組織。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該腔室內更包含一光鉗(optical tweezers)元件，以排列細胞組織。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該腔室內更包含一微流體(microfluidics)元件，以培養細胞組織。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該腔室之形狀包含圓形、橢圓形等。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該第二微流 道之該細胞外基質(ECM)包含一膠原蛋白，以作為該第二細胞之生長支架。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該基板上塗佈一膠原蛋白，以增加該第一細胞於該基材之貼附力。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該第一細胞係包含一腫瘤細胞以及一纖維母細胞。
- 如請求項8所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該腫瘤細胞係包含一動物之器官組織。
- 如請求項1所述之具環狀微流道晶片以供細胞培養之裝置，其中該第二細胞係為一內皮細胞。
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