TWI758660B - 細胞培養系統及使用其之方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種細胞培養自動化系統，其提供封閉培養條件，可減小污染風險且以大規模自動培養細胞。特別地，該細胞培養系統包含(i)一或多個可移除之微流體微井，及(ii)培養裝置，該培養裝置容納該等微流體微井，其中各微流體微井具有一或多個經分隔之中空單元，且該培養裝置在整個微流體微井中含有無底部之微流體通道，其中該等微流體通道含有一或多個細胞入口。

Description

細胞培養系統及使用其之方法

本發明係關於細胞培養之領域。詳言之，本發明提供用於使細胞培養自動化之微井陣列。

聚焦於細胞移植之許多臨床試驗已報導有前景之結果。與習知實驗室實驗相比，臨床試驗通常需要大量細胞，其可在培養細胞時產生新挑戰。考慮到安全及效率兩者，現有細胞生產技術仍然為不成熟的。臨床細胞生產涉及許多複雜且基於經驗之步驟，其包括手術組織收集、樣本處理(解剖、解離及色散)及細胞接種。鑒於患者細胞之間的大量個體偏差，極難以使用標準化方案穩定地進行細胞生產之此等步驟中之每一者。在大多數臨床案例中，用於再生細胞療法之細胞加工很大程度上視專家之技能及經驗而定。因此，需要用於工業化再生藥品的顯著技術進展。

US 10,233,415B1提供用於培養細胞(諸如心肌細胞或心肌細胞祖細胞)之微流體裝置；及使用該裝置培養細胞之方法。US 20190185808提供一種細胞培養系統，其包括：培養單元，該培養單元包括用於在培養液中培養細胞之培養槽；自動細胞培養裝置，其自動地控制細胞在培養單元中之培養；及用於運輸之細胞培養裝置，其控制在運輸培養單元時細胞在培養單元中之培養。然而，該等細胞培養裝置無法實現細胞培養之自動化。

在一個態樣中，本發明提供一種細胞培養系統，其包含(i)一或多個可移除之微流體微井及(ii)培養裝置，該培養裝置容納微流體微井，其中各微流體微井具有一或多個經分隔之中空單元，且該培養裝置在整個微流體微井中含有無底部之微流體通道，其中微流體通道含有一或多個細胞入口。

在一個實施例中，細胞培養系統包含(i)多個可移除之微流體微井及(ii)培養裝置，該培養裝置容納微流體微井，其中各微流體微井具有一或多個經分隔之中空單元，且該培養裝置在整個微流體微井中含有無底部之微流體通道，其中微流體微井之微流體通道之表面積逐漸增大；其中相對於具有最小表面積之多個微流體微井之微流體通道，多個微流體微井之微流體通道之表面積的尺寸以2ⁿ 、3ⁿ 或4ⁿ 升高，其中n為小於多個微流體微井之數目的整數；且其中微流體通道含有一或多個細胞入口。

在一些實施例中，培養裝置為培養盤或培養燒瓶。

在一個實施例中，中空單元呈圓形或具有3至8個角之多邊形之圖案。在一些實施例中，中空單元呈三角形、四邊形、五邊形、六邊形、八邊形或九邊形之圖案。在另一實施例中，中空單元呈六邊形之圖案。

在一個實施例中，存在至少3個可移除之微流體微井。在一個實施例中，存在至少5個可移除之微流體微井。在一些實施例中，存在3至15個可移除之微流體微井。

在一個實施例中，多個可移除之微流體微井在培養裝置中彼此連接。

在一個實施例中，微流體通道含有多個細胞入口。

在一個實施例中，中空單元之微流體通道彼此流體連通。

本發明提供一種用於培養細胞之方法，其包含(i) 將細胞裝載至細胞培養系統之可移除之微流體微井的微流體通道上之細胞入口，及(ii)在適合於細胞增殖之條件下培養細胞。

在一個實施例中，細胞為固著-依賴性細胞。在一些實施例中，細胞為幹細胞、神經細胞或纖維母細胞。

在一個實施例中，將細胞裝載至具有最小表面積之多個微流體微井之微流體通道上的細胞入口。

在一個實施例中，細胞以30%滿度之密度經裝載。

在一個實施例中，細胞在培養裝置經傾斜之情形下經裝載至微流體通道上之細胞入口。在一些實施例中，針對三角形及六邊形之傾斜角為120度、240度或360度，或針對四邊形及八邊形之傾斜角為90度、180度、270度、360度。

在一個實施例中，當細胞達到所需量時，移除先前微流體微井且添加後續微流體微井至本發明之細胞培養系統之培養裝置中。

在一個實施例中，在無菌條件下且與未滅菌環境無任何接觸的情況下進行細胞裝載。

在一個實施例中，該方法可以大規模自動培養細胞。

在一個實施例中，該方法可用於臨床規模細胞擴增。

除非另外指示，否則本說明書及申請專利範圍中所使用之表示成分之量、反應條件等所有數目在所有情況下均應理解為經術語「約」修飾。因此，除非有相反指示，否則本發明之說明書及申請專利範圍中所闡述之數值參數可大致視本發明試圖獲得之所需特性而變化。

除非上下文另外清楚指示，否則如本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」、及「該(the)」包括複數個指示物。

如本文所使用，術語「與……流體連通」或「以流體耦合至/以流體與……耦合」係指兩個空間區域經組態使得液體可在兩個空間區域之間流動。

考慮到細胞加工所需之安全性及穩定性，細胞培養之自動化為細胞療法提供巨大優勢。首先，在安全性領域中，可幾乎消除人為誤差、感染性污染或樣本交叉污染之風險。其次，細胞加工之自動化允許每次操作中降低變異性。第三，由於自動化硬體變得較普及，因此操作成本將降低至小於雇用熟練技術者之成本且將導致更有效製造初代細胞。

因此，本發明提供一種細胞培養自動化系統，其提供封閉培養條件，可減小污染風險且以大規模自動培養細胞。特別地，該細胞培養系統包含(i)一或多個可移除之微流體微井，及(ii)培養裝置，該培養裝置容納微流體微井，其中各微流體微井具有一或多個經分隔之中空單元，且該培養裝置在整個微流體微井中含有無底部之微流體通道，其中微流體通道含有一或多個細胞入口。

若多個可移除之微流體微井用於該細胞培養系統中，該系統包含(i)多個可移除之微流體微井，及(ii)培養裝置，該培養裝置容納微流體微井，其中各微流體微井具有一或多個經分隔之中空單元，且該培養裝置在整個微流體微井中含有無底部之微流體通道，其中微流體微井之微流體通道之表面積逐漸增大；其中相對於具有最小表面積之多個微流體微井之微流體通道，多個微流體微井之微流體通道之表面積顯示尺寸以2ⁿ 、3ⁿ 或4ⁿ 增加，其中n為小於多個微流體微井之數目的整數；且其中微流體通道含有一或多個細胞入口。

現參看圖1，顯示微流體裝置之實施例之三維示意圖。所描繪之裝置包括容納四個微流體微井2、3、4及5之培養裝置1。在微流體微井2、3、4及5中之每一者中，其具有多個經分隔之六邊形中空單元21、31、41、51，且在整個微流體微井中含有無底部之微流體通道22、32、42、52。微流體微井2中之微流體通道22具有最小表面積；微流體微井3、4及5中之微流體通道32、42、52之表面積分別為微流體微井2中之微流體通道22之表面積的2倍、4倍及8倍。在各微流體通道之表面上存在多個細胞入口；細胞入口23之實例描繪於微流體微井2中。

現參看圖2，顯示多個可移除之微流體微井2、3、4及5之頂視圖。各微流體微井含有多個六邊形中空單元21、31、41、51及多個微流體通道22、32、42、52。在各微流體通道之表面上存在多個細胞入口；細胞入口23之實例描繪於微流體微井2中。

現參看圖3，顯示微流體裝置之實施例之裝配圖。所描繪之裝置包括容納四個微流體微井2、3、4及5之培養裝置1。

用於容納微流體微井之培養裝置可為任何適合之裝置。培養裝置用於容納一或多個可移除之微流體微井。可移除之微流體微井具有一或多個經分隔之中空單元，且含有在整個微流體微井中無底部之微流體通道。微流體通道在其頂部含有一或多個細胞裝載入口。可自入口將細胞裝載至微流體通道。微流體通道彼此流體連通，使得通道充滿用於支持細胞生長及增殖之培養基。

中空單元可呈任何適合之形狀。例如，該單元可經圖案化為圓形、三角形、四邊形、五邊形、六邊形、八邊形或九邊形。

在一較佳實施例中，多個可移除之微流體微井用於細胞培養系統中。在此情況下，微流體微井之微流體通道之表面積相對於具有最小表面積之多個微流體微井之微流體通道逐漸增大，多個微流體微井之微流體通道之表面積的尺寸以2ⁿ 、3ⁿ 或4ⁿ 升高。n之數目小於多個微流體微井之數目。多個可移除之微流體微井在培養裝置中彼此連接。在將細胞裝載至可移除之微流體微井之微流體通道中之後，傾斜或離心裝置以使細胞均勻地分佈於微流體通道中，及隨後生長及增殖至所需量或密度，可將可移除之微流體微井逐層移除以使得可收集細胞。照此，可自動培養細胞且無需用獨立機械方化案替代各單獨手動步驟。

使用雷射切割技術可產生圖案化微流體微井以形成視使用者之需要具有各種尺寸之各種圖案(圓形、三角形、正方形、六邊形或八邊形)。

提供以下實例來說明而非限制所主張之發明。實例

材料及方法

細胞培養系統

細胞培養系統包括多個可移除之微流體微井(諸如四個微井)及容納微流體微井之培養裝置。容納微流體微井之培養裝置為已知用於細胞培養領域中之培養皿。用聚二甲基矽氧烷(PDMS)製得本發明之可移除之微流體微井。使用雷射切割技術，在微流體微井之底層中產生各種尺寸之各種圖案(圓形、三角形、正方形、六邊形或八邊形)。具有用於細胞裝載入口之中心孔之薄蓋板固定於圖案之上。

細胞接種製程應在高度無菌條件下且在不必與未滅菌環境接觸的情況下發生。外徑為150 mm，高度為10 mm，且細胞培養基體積為1 mL。進行離心以將經分離之個別及經分組之初代培養細胞截獲於同一培養皿中。藉由利用此非侵入性系統，使得在截獲之後立即進行長期連續監測為有可能的，且在細胞培養系統中成功地觀測到細胞生長及動力學。培養基及液體替代物不需要進一步離心而僅利用毛細流動代替。將支架插入腔室內部。細胞接種腔室充滿培養基，細胞經由細胞培養入口注入培養基中。整個系統可被固定於常規潮濕培育箱內。在接種之後，包括細胞-聚合物構築體之系統在不使構築體暴露於未滅菌環境之情況下轉變為動態組織培養系統。

細胞

間葉幹細胞(MSC)為人類眶脂肪幹細胞且保持於其用於生長之培養基套組中(MesenPro)。根據產品說明書，細胞具有三系分化能力且針對CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166呈陽性且針對CD14、CD31、CD45呈陰性。如圖4中所示，本發明之細胞培養系統及習知(對照)培養燒瓶兩者均維持MSC針對CD90、CD105、CD73具有高陽性之表型及針對CD45、CD34、CD11b、CD19及HLA-DR具有陰性之表型。

細胞培養腔室及裝載

用於細胞培養之六邊形微井。將一千個MSC接種於層1圖案(L1)內之15 cm培養皿中。將相同數目之MSC同樣接種於作為對照(對照)之習知15-cm培養皿中。如圖4中所示，在相同接種細胞數目之情況下，細胞培養系統上之總細胞數目超過彼等習知培養燒瓶中之細胞數目(A)。在相同初始接種密度(30%滿度)下，圖案培養燒瓶獲取之接種細胞數目較低，且在5天培養之後，經圖案化之培養燒瓶中之細胞數目的倍數超出彼等習知燒瓶中之細胞數目的倍數(B)。

流式細胞測量術

進行流式細胞測量術分析以表徵第N代細胞中MSC之比例。用含1 mM EDTA之PBS收集經培養之細胞，以1,500 rpm離心5分鐘，且再懸浮於1 mL Memsen PRO中。將1×10⁵ 個細胞轉移至聚苯乙烯圓底管(BD Biosciences)中，以1,500 rpm離心3分鐘，且再懸浮於100 μL含有單株抗體(mAb)之FACS緩衝液中。在4℃下培育20分鐘後，細胞經1 mL FACS緩衝液洗滌且在300 μL含1%多聚甲醛之PBS中固定。每樣本獲取五十萬個細胞且使用FACSCanto II儀器(BD Biosciences)及Flow Jo分析。CD標記物(CD44、CD73、CD90、CD105、CD11 b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR；BD Stemflow hMSC分析套組；BD Biosciences, San Jose, CA, USA)之表現。如圖5中所示，圖案及傳統燒瓶培養(對照)兩者均維持MSC針對CD90、CD105、CD73具有高陽性之表型及針對CD14、CD34、CD11及HLA-DR具有陰性之表型。

MSC 多重潛能之確認

對於脂肪生成來說，將第1代或第2代1.9×10⁴ 個細胞塗於24孔盤中且在1 mL Memsen PRO中培養。一旦細胞100%滿度，隨後將培養基轉變為1 mL完全STEMPRO成脂分化培養基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。將細胞維持於成脂培養基中3週，其中培養基每週更換兩次。將成脂培養物於室溫固定在10%福馬林(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中1 h且於室溫用新鮮油紅O溶液(儲備液：0.3%於異丙醇中，混合三份儲備液與兩份水且經0.2 m過濾器過濾；Sigma-Aldrich)染色1 h。接著用水洗細胞直至洗液變透明為止。用光學顯微鏡觀測細胞且拍攝。為了定量成脂分化，藉由於室溫添加100%異丙醇(Sigma-Aldrich)10 min來溶離油紅O染色。一式三份讀取於490 nm之吸光度。對於成骨來說，將1×10⁴ 個細胞塗於24孔盤中且在1 mL Memsen PRO中培養。一旦細胞50%至70%滿度，則用1 mL完全STEMPRO成骨分化培養基(Invitrogen)替換培養基。將細胞維持於成骨培養基中3週，其中培養基每週更換兩次。將成骨培養物於4℃固定在1 mL冰冷70%乙醇(Sigma-Aldrich)中1 h且於室溫用含4 mM茜素紅S之蒸餾水(用氫氧化銨將pH調節至4.2；Sigma-Aldrich)染色10 min。移除過量染料且用水洗四次。用光學顯微鏡拍攝細胞。為了定量成骨分化，將400 mL 10% (體積/體積)乙酸添加至各孔中且在震盪下培育30分鐘。用細胞刮刀輕刮細胞且以10% (體積/體積)乙酸(Sigma-Aldrich)轉移至1.5-mL微量離心管中。該管用封口膜(parafilm)密封，劇烈渦旋30秒，加熱至85℃持續10分鐘且接著轉移至冰中5分鐘。在20,000 g離心15分鐘之後，將上清液轉移至新1.5 mL微量離心管中。用10% (體積/體積)氫氧化銨(Sigma-Aldrich)將pH調節至4.1至4.5。一式三份讀取於415 nm之吸光度。對於成軟骨來說，將1.65×10⁵ 個細胞置於15 mL錐形管中，且在1500 rpm離心5分鐘。將沉澱物在0.5 mL完全STEMPRO成軟骨分化培養基(Invitrogen)中培養1週。拍攝沉澱物之照片用尺進行尺寸分析。將沉澱物固定在4%多聚甲醛中達2天及隨後於4℃置於1 mL 30%蔗糖中1天。將冷凍切片(10 μm)封固於載玻片上且用甲苯胺藍O (Sigma-Aldrich)染色。用光學顯微鏡拍攝照片。為了定量成軟骨分化，用4%多聚甲醛固定沉澱物15分鐘，用1倍PBS洗兩次，且用甲苯胺藍O染色15分鐘。再用1倍PBS洗細胞以移除未結合之染料。用1% SDS萃取染料且一式三份讀取於595nm之吸光度。如圖6中所示，隨後刺激圖案內培養之MSC分化。圖案化及習知(對照)燒瓶培養兩者均維持MSC之三系分化能力。細胞分別(A)在成骨誘導21天後經鹼性磷酸酶及茜素紅，(B)在成脂誘導21天後經油紅O，及(C)在成軟骨誘導6天後經艾爾遜藍(alcian blue)染色為陽性。

自 OFSC 細胞株之培養基提取胞外體

根據製造商之方案，使用分離試劑(來自培養基之胞外體分離套組；Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)自培養基分離胞外體。以含有10%之無胞外體之FBS的MesenPro(System Biosciences)將細胞以1×10⁶ 個細胞/培養皿之濃度接種至10 cm培養皿上。在48小時培育之後，收集條件培養基用於胞外體提取。將培養基以2,000×g離心30分鐘以移除細胞及碎片。隨後，使上清液穿過220 nm過濾器且轉移至新試管中，且添加試劑。培育之後，樣品在10,000×g下離心1小時且棄去上清液。使胞外體在試管底部粒化且使沉澱物再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以用於螢光成像。

定量 PCR

使用QPCR偵測自分泌及旁分泌相關基因之表現。SDF-1 (F: 5'-GCCAAAAAGGACTTTCCGCT-3'(SEQ ID NO:1), R: 5'-GCCCGATCCCAGATCAATGT-3'(SEQ ID NO:2))。

S1PR1(F:5'-TTTCCTGGACAGTGCGTCTC-3'(SEQ ID NO:3), R: 5'-ACTGACTGCGTAGTGCTCTC-3'(SEQ ID NO:4))。CXCR4 (F:5'-CGTCTCAGTGCCCTTTTGTTC-3'(SEQ ID NO:5), R:5'- TGAAGTAGTGGGCTAAGGGC-3' (SEQ ID NO:6))。VEGF (F:5'-TACCGGGAAACTGACTTGGC-3'(SEQ ID NO:7)，R: 5'-ACCACATGGCTCTGCTTCTC-3'(SEQ ID NO:8))。圖7顯示(A)當改變微流體微井時收集條件培養基。關於習知燒瓶，在相同時序收集條件培養基。當改變微流體微井時，相比於習知燒瓶中之條件培養基中的胞外體濃度，本發明之細胞培養系統中之條件培養基中的胞外體濃度在各時間點顯著地增加，且在改變微流體微井4次之後，細胞培養系統中之條件培養基中的胞外體總濃度超過習知燒瓶中之條件培養基中的胞外體總濃度的2倍(7(A)-1及7(A)-2)。(B)用QPCR偵測旁分泌及自分泌相關基因SDF-1、S1PR1、CXCR4及VEGF之表現。

1:培養裝置 2:微流體微井 3:微流體微井 4:微流體微井 5:微流體微井 21:六邊形中空單元 22:微流體通道 23:細胞入口 31:六邊形中空單元 32:微流體通道 41:六邊形中空單元 42:微流體通道 51:六邊形中空單元 52:微流體通道

圖1顯示微流體裝置之實施例之三維示意圖。

圖2顯示多個可移除之微流體微井之頂視圖。

圖3顯示微流體裝置之實施例之裝配圖。

圖4顯示在本發明之細胞培養系統中以相同細胞數目(A)或以相同密度(30%)-2個單元(B)接種之MSC。(A)在相同接種細胞數目之情況下，細胞培養系統上之總細胞數目高於彼等習知培養燒瓶中之細胞數目。(B)在相同初始接種密度(30%滿度)之情況下，培養燒瓶獲取之接種細胞數目較少，且在5天培養之後培養燒瓶中之細胞數目的倍數高於習知燒瓶中之細胞數目的倍數。

圖5顯示本發明之細胞培養系統中MSC之表型。本發明之細胞培養系統及習知(對照)培養燒瓶兩者均維持MSC針對CD90、CD105、CD73具有高陽性之表型及針對CD45、CD34、CD11b、CD19及HLA-DR具有陰性之表型。

圖6顯示本發明之細胞培養系統中MSC之三系分化能力。在本發明之細胞培養系統內培養之MSC隨後受刺激分化。本發明之細胞培養系統及傳統(對照)燒瓶培養兩者均維持MSC之三系分化能力。細胞分別(A)在成骨誘導21天後經鹼性磷酸酶及茜素紅，(B)在成脂誘導21天後經油紅O，及(C)在成軟骨誘導6天後經艾爾遜藍染色為陽性。

圖7(A)及(B)顯示在本發明之細胞培養系統中之旁分泌及自分泌之MSC增強。(A)當改變微流體微井時收集條件培養基。關於習知燒瓶，同時收集條件培養基。量測細胞培養系統及習知燒瓶中之條件培養基中之胞外體的濃度((A)-1及(A)-2)。(B)用QPCR偵測旁分泌及自分泌相關基因SDF-1、S1PR1、CXCR4及VEGF之表現。

1:培養裝置

2:微流體微井

3:微流體微井

4:微流體微井

5:微流體微井

21:六邊形中空單元

22:微流體通道

23:細胞入口

31:六邊形中空單元

32:微流體通道

41:六邊形中空單元

42:微流體通道

51:六邊形中空單元

52:微流體通道

Claims (23)

1. 一種細胞培養系統，其包含(i)一或多個可移除之微流體微井，及(ii)培養裝置，該培養裝置容納該等微流體微井，其中各微流體微井具有一或多個經分隔之中空單元，且該培養裝置在整個微流體微井中含有無底部之微流體通道，其中該等微流體微井之微流體通道之表面積逐漸增大；其中相對於具有最小表面積之多個微流體微井之微流體通道，該多個微流體微井之微流體通道之表面積顯示尺寸以2ⁿ、3ⁿ或4ⁿ增加，其中n為小於該多個微流體微井之數目的整數；其中該等微流體通道含有一或多個細胞入口。
2. 如請求項1之細胞培養系統，其中該培養裝置為培養盤(plate)或培養燒瓶。
3. 如請求項1之細胞培養系統，其中該中空單元呈圓形或具有3至8個角之多邊形之圖案(pattern)。
4. 如請求項1之細胞培養系統，其中該中空單元呈三角形、四邊形、五邊形、六邊形、八邊形或九邊形之圖案。
5. 如請求項1之細胞培養系統，其中該中空單元呈六邊形之圖案。
6. 如請求項1之細胞培養系統，其中該系統包含至少3個可移除之微流 體微井。
7. 如請求項1之細胞培養系統，其中該系統包含至少5個可移除之微流體微井。
8. 如請求項1之細胞培養系統，其中該系統包含3至15個可移除之微流體微井。
9. 如請求項1之細胞培養系統，其中該多個可移除之微流體微井在該培養裝置中彼此連接。
10. 如請求項1之細胞培養系統，其中該微流體通道含有多個細胞入口。
11. 如請求項1之細胞培養系統，其中該等中空單元之微流體通道彼此流體連通。
12. 一種用於培養細胞之方法，其包含(i)將細胞裝載至如請求項1之細胞培養系統之可移除微流體微井的微流體通道上之細胞入口，及(ii)在適合該等細胞增殖之條件下培養該等細胞。
13. 如請求項12之方法，其中該等細胞為固著-依賴性細胞。
14. 如請求項12之方法，其中該等細胞為幹細胞、神經細胞或纖維母細 胞。
15. 如請求項12之方法，其中將該等細胞裝載至具有最小表面積之多個微流體微井之微流體通道上的細胞入口。
16. 如請求項12之方法，其中該等細胞以30%滿度(confluence)之密度裝載。
17. 如請求項12之方法，其中在該培養裝置傾斜或離心之情形下將該等細胞裝載至微流體通道上之細胞入口。
18. 如請求項12之方法，其中針對三角形及六邊形之傾斜角為120度、240度或360度，或針對四邊形及八邊形之傾斜角為90度、180度、270度、360度。
19. 如請求項12之方法，其中當細胞達到高於50%滿度時，移除先前微流體微井且添加後續微流體微井至如請求項1之細胞培養系統之培養裝置中。
20. 如請求項12之方法，其中細胞裝載係在無菌條件下進行，與未滅菌(unsterile)環境無任何接觸。
21. 如請求項12之方法，其中細胞裝載係在無菌條件下進行，與未滅菌 環境無任何接觸。
22. 如請求項12之方法，其中該方法能夠以大規模自動培養細胞。
23. 如請求項12之方法，其中該方法能夠用於臨床規模細胞擴增。

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