KR102087258B1 - 세포 배양 상청액의 여과법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 세포로부터 유체 상청액을 분리하는 방법에 관한 것이다: 세포와 액체의 혼합물을 제공하는 단계, 상기 혼합물로 제1 필터 하우징을 충전하는 단계로서, 필터 하우징에서, 4 μm 내지 50 μm의 기공 크기를 갖는 필터가 체와 같은 방식으로 구멍이 뚫린 평평한 바닥면 상에 제공되고, 필터 하우징의 벽면이 연결되어, 체와 같은 방식으로 구멍이 뚫린 평평한 바닥면으로 밀봉되는 단계, 상기 혼합물의 유체 부분이 필터를 통해 통과하고, 세포를 포함하는 필터 케이크가 필터 하우징에 잔류된 결과로서, 상기 혼합물에 적어도 0.5 bar의 차압을 적용시키는 단계 및 여과된 액체를 제거하는 단계.

Description

세포 배양 상청액의 여과법{FILTRATION OF CELL CULTURE SUPERNATANTS}
본 발명은 세포 배양 상청액의 여과 방법에 관한 것이다.
다른 방식, 예를 들어 화학 합성에 의할 경우, 제조가 불가능하거나 또는 비경제적인 물질 및 자연에서 충분한 양을 구할 수 없는 물질의 제조에 있어서, 제조 목적의 생명 공학 방법을 이용함으로써 상당한 기회가 제공된다. 식물 물질의 제조는 현재 이차 대사물에 촛점이 맞춰져 있고, 재조합 발현 생성물 부분이 꾸준히 증가하고 있다. 대규모 제조는 본질적으로 식물 세포 배양 또는 식물에 집중되고 있다. 또한 식물에서 DNA 형질전환 가능성은 식물 성분의 양적 및 질적 변형이 가능하다는 것을 의미한다. 또한, 이종 단백질의 제조에서 식물들 및 식물 세포 배양에 관심이 모아지고 있다 (Fischer et al. Current Opinion in Plant Biology 2004, 7: 1-7).
한 가지 전략은 형질전환된 전체 식물에서의 이종 단백질의 제조를 포함한다. 일 예로서 전술된 바와 같은 전체 식물 이용의 본질적인 단점은 산업적 규모의 경작에 요구되는 대규모 부지 및 시간-소비 및 비용-집중적 경작의 필요성에 있다. 또한, 특히, 약학적 또는 영양 생리학적 목적에 사용되는 물질의 경우와 같이, 생성물의 외형 및 질에 대해 높은 요구가 존재하는 경우, 목적 표적 물질의 전체 식물로부터의 정제에는 일반적으로 복잡한 공정 단계가 포함된다.
두 번째 전략에서, 항체 생성에 형질전환 식물 세포 배양이 사용되었다. 공지된 예는 항체 또는 다른 포유동물 단백질의 발현 (Huether et al, Plant Biol. 2005, 7: 292-299) 및 그의 배지로의 분비이다. 세포로부터 이종 단백질을 정제하는 방법은 매우 고비용이기 때문에, 표적 단백질의 배지로의 분비는 상당한 개선으로 여겨지고 있다. 또한, 안전성에 대한 고려로서, 세포 배양에서의 약학적 관련 재조합 단백질의 제조는, 형질전환 식물 세포가 생물 반응기에서 배타적으로 배양될 수 있고, 배출시킬 필요가 없기 때문에 선호되고 있다. 대규모의 종속영양 식물 세포 배양을 위한 생물 반응기의 개발이 필요한 경작 규모를 가능하게 하였다.
생성물의 추가 정제를 위해, 제1 단계로, 생물질을 상청액으로부터 분리해야 한다. 마지막으로, 다양한 여과 방법이 공지되어 있다. 재조합 분비 단백질의 경우, 배양 상청액에 생성물이 존재한다. 따라서, 생성물의 손실을 피하기 위해, 분리된 생물질 부분에 가능한 한 적은 양의 잔류 수분/상청액을 유지시키는 것이 목표이다. 다양한 실험실 규모의 여과 방법이 공지되어 있다. Buettner-Mainik Annette 등 (Plant Biotechnology Journal 9 (3) (2011): 373-383)은 P. patens에서 인간 인자 H의 제조방법에 대해 기술하였다. 수성 세포 배양물은 진공 하에 흡입 필터를 사용한 직물 방식에 의해 분리한다. 수득된 생성물은 수분이 포함되어 있으므로, 건조해야 한다. Lucumi 등 (Process Biochemistry 41 (10) (2006): 2180-2187)은 P. patens 생물 반응기에서 rh VGEF의 제조 과정 동안의 십자류 여과법에 대해 기술하고 있다. Marta Fernandez Nunez (E-dissertation, Hamburg University (2010), p 48, Chapter 2.11.1)는 P. patens에서 시토키닌 특성화 과정 동안의 진공 여과에 대해 기술하고 있다. Fischer Rainer 등 (Journal of Immunological Methods 226 (1-3) (1999): 1-10)은 여과 후 수분을 포함하는 담배 캘러스 배양물의 진공 여과를 다루고 있다. WO 2005/108596 AI는 식물 세포에서 시스틴 매듭을 포함하는 고리형 펩티드의 발현에 의한 시험관내 합성에 관한 것이다. 세포 현탁액을 진공 하에 흡입 필터에 의해 분리하였다. 김선태 등 (Proteomics 9 (5) (2009): 1302-1313)은 현탁액 중에서 균류 M. grisea로의 쌀 세포의 공생 배양에 대해 기술하였다. 진공 여과 방식에 의해 분비 단백질의 분리를 수행하였다. Ndimba Bongani K. (Proteomics 3 (6) (2003): 1047-1059)는 현탁액 배양에서 아라브도프시스에서 세포외 매트릭스에서의 변화 조사에 대해 언급하였다. 배양 상청액 조사에 진공 여과를 이용하였다.
동물 세포 및 박테리아와 달리, 식물들 및 식물 세포 배양에서는, 고체 잔여물, 예를 들어 여과의 경우 필터 케이크가 큰 부피를 차지한다는 점에 특히 문제가 있다. 따라서, 상청액의 대부분은 이와 관련된 것이고, 이것을 함유하고 있다. 따라서 본 발명의 한 가지 목표는 배양 상청액으로부터 고체 생물질의 분리를 개선하는 것이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 세포로부터 유체 상청액을 분리하는 방법에 관한 것이다:
a) 유체와 세포의 혼합물을 제공하는 단계;
b) 상기 혼합물로 필터 하우징을 충전하는 단계로서, 필터 하우징에서, 4　μm 내지 50　μm 범위의 기공 크기를 갖는 제1 필터가 평평한 바닥면 상에 제공되고, 체와 같은 방식으로 구멍이 뚫린 평평한 바닥면으로 밀봉되도록 필터 하우징의 벽면부가 연결되는 단계;
c) 상기 혼합물에 적어도 0.5 bar (500 hPa)의 차압 (differential pressure)을 적용하여, 상기 혼합물의 유체 부분이 필터를 통해 통과되고, 세포를 포함하는 필터 케이크가 필터 하우징에 잔류되도록 하는 단계;
d) 여과된 유체를 제거하는 단계.
본 발명의 필터로의 여과는 또한 평평한 바닥 필터 (예를 들어, 백 필터 (bag filter))를 사용하지 않고, 또한 압력 없이, 즉 순전한 중력에 의한 여과로 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 유형의 여과에는 필터 케이크 내에 잔여 수분이 많다는 단점이 있다. 원하는 정제 생성물이 유체 내에 존재하지 않는 한, 이것은 생성물의 상당한 손실을 의미한다.
바닥면은 바람직하게는 체와 같은 방식으로 구멍이 뚫려 있다. 바닥면은 자체 내에서 필터를 구성할 수 있거나 또는 분리 필터의 시트 (seat) 및 지지체로서 기능할 수 있다.
본 발명에 따르면, 놀랍게도, 압력을 증가시키면서, 일정 부분의 바닥면 상에 평평한 필터를 사용함으로써, 필터 케이크 내의 잔여 수분이 예상 밖의 최소치로 감소될 수 있다. 0% (중량 %)의 세포 외 잔여 수분 함량이 수득될 수 있다. 이 경우, 세포 내 유체는 잔여 수분에 포함되지 않는다. 본 발명에 따르면, 세포 내 잔여 수분이 선별 단백질의 생성물의 손실을 구성하지 않기 때문에, 상기 잔여물의 분리는 세포 내 유체 없이 개선되고, 또한 세포 내 세포 집단이 오염된 혼합물을 구성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 바람직한 실시형태에서, 필터 케이크 내에 3% (중량 %) 미만, 바람직하게는 2% 미만, 특히 바람직하게는 1% 미만 또는 0%의 세포 외 잔여 수분이 수득 될 때까지, 상기 차압이 유지된다. 잔여 수분 함량은 비교 실시예 1에서 기술된 바와 같이 측정할 수 있다. 특히, 본 발명의 필터 하우징은 식물 세포에 의해 형성된 필터 케이크로부터의 수분 제거 - 특히 잔여 수분 함량의 감소를 위해 상기 필터와 함께 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 필터는 평막이다. 이것은, 예를 들어 평평한 형태로 사용할 수 있는 부직포, 세라믹 주조 또는 고분자 막이다. 이들은 일반적으로 대규모 적용에는 거의 사용되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 식물 세포 여과에서, 평 필터가 특히 압력 여과와 함께 매우 효과적으로 사용될 수 있고, 심지어, 예를 들어 더욱 일반적인 백 또는 색 (sack) 필터 보다 저 함량의 잔여 수분을 생성시킬 수 있다는 것을 제시하였다.
본 발명의 방법을 위한 본 발명의 여과 시스템은 특히 대규모 적용을 위해 개발되었다. 이러한 방식으로, 바람직한 실시형태에서 상기 필터 하우징의 치수는 다량의 유체를 여과하기 위해 설계되었다. 특히 바람직하게는, 상기 필터 하우징의 내부 용적은 적어도 2 L (dm3), 특히 적어도 5 L, 적어도 8 L, 적어도 10 L, 적어도 20 L, 적어도 30 L, 적어도 40 L 또는 적어도 45 L이다.
상기 하우징의 내부는 여과를 위해 더 많은 상청액으로 연속적 또는 불연속적으로 충전될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 2 L (dm3)의 상청액이 여과되고, 특정 실시형태에서, 적어도 5 L, 적어도 8 L, 적어도 10 L, 적어도 20 L, 적어도 40 L, 적어도 50 L, 적어도 75 L 또는 적어도 100 L가 여과된다.
바람직하게는, 상기 방법 과정 동안, 세포는 파열되지 않는다. 이것은 저압에서 이들을 부드럽게 다룸으로써 성취될 수 있다. 세포 함량이 여과 생성물을 오염시키지 않고, 또한 세포가 더욱 효과적으로 여과될 수 있기 때문에, 세포의 파열을 피하는 것이 유리하다.
바람직하게는, 여과 생성물 제거 위치의 절대압은 적어도 0.7 bar (700 hPa)이다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는, 진공 여과를 수행하지는 않으나, 여과물은 적어도 0.7 bar, 적어도 0.8 bar, 적어도 0.9 bar 또는 적어도 1 bar의 높은 대기압 하에 유지된다. 이러한 방식으로, 유체 (특히, 수성) 여과물의 증발 과정이 회피된다. 이것은, 특히 상기 필터 하우징의 주입구에서, 본 발명에 따른 혼합물에 적용되거나 또는 필터 하우징 내의 압력의 증가가 절대 양압 (positive pressure), 즉 주위 압력 보다 더 높은 압력을 초래한다는 것을 의미한다.
본 발명의 양압 (충전된 상청액과 여과된 유체 사이의 차압)은 다른 방식으로도 생성될 수 있다. 예를 들어, 압축 공기 (예를 들어, 필터 하우징의 주입구 또는 개별 공기 공급 개구부에 공급됨)를 사용하여 압력을 생성시킬 수 있다. 추가의 실시형태에서, 예를 들어 유체 축적 압력으로서 또는 펌프 방식에 의한 수압에 의해 압력을 생성시킬 수 있다. 또 다른 경우는 원심분리에 의해 압력을 증가시키는 것이다. 또한, 예를 들어 플런저를 사용한 물리적 압력의 이용이 가능하다. 명백하게, 모든 이러한 대안들을 또한 서로 조합할 수 있다. 바람직하게는, 처음에 유체와 세포의 혼합물을 압력 하에 공급하고, 여과할 전체 혼합물의 도입 후, 더 많은 유체가 압축 공기를 이용하여 도입된다. 압축 공기는 유체 압력과 동일한 동일 압력에서 또는 유체 압력과 다르게 공급될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 차압은 적어도 0.8 bar (800 hPa), 바람직하게는 적어도 1 bar (1000 hPa) 또는 심지어 적어도 1.2 bar (1200 hPa)이다. 특정 실시형태에서, 압력은 최대 8 bar, 최대 5 bar, 최대 3 bar, 최대 2 bar 또는 최대 1.5 bar이다. 압력 차는 본질적으로 사용 필터 (기공 크기, 직경)에 의해 결정되고, 여기서 필터 하우징 주입구의 선택 양압에 대한 일정한 반대-압력이 발생한다. 예를 들어, 유출구가 폐쇄되고, 바람직하게는 적어도 1.8 bar (1800 hPa), 바람직하게는 적어도 2 bar (2000 hPa), 또는 심지어 적어도 3 bar (3000 hPa)의 절대압인 경우, 선택 양압이 측정될 수 있다.
따라서, 필터 하우징은 바람직하게는 압력 용기, 특히 적어도 2 bar (2000 hPa), 특히 바람직하게는 적어도 5 bar (5000 hPa) 또는 심지어 적어도 8 bar (8000 hPa)의 압력을 위해 설계된 압력 용기이다.
제1 필터의 기공 크기는 4 μm 내지 50 μm의 범위이다. 바람직한 실시형태에서, 제1 필터의 기공 크기는 6 μm 내지 40 μm의 범위 또는 8 μm 내지 30 μm의 범위, 특히 9 μm 내지 250 μm의 범위이다.
본 발명에 따르면, 체와 같은 방식으로 구멍이 뚫린 바닥면은 평평하고, 곡률이 없거나 또는 거의 없다. 바람직하게는, 체-유사 구멍은 원형이다. 이들은 바람직하게는 용기 벽면에 직접 연결된 바닥면의 모서리로부터 적어도 2 cm의 거리에 위치한다. 체-유사 구멍은 0.001 mm 내지 5 mm, 바람직하게는 0.005 mm 내지 3 mm 또는 0.01 mm 내지 1.5 mm, 가장 바람직하게는 0.03 mm 내지 0.06 mm의 크기일 수 있다.
상기 방법 과정 동안의 온도는 세포의 부드러운 여과를 위해, 바람직하게는 0℃ 내지 40℃의 범위, 특히 10℃ 내지 30℃의 범위이다.
본 발명에 따르면, 필터 케이크의 잔여 수분 함량의 효과적인 감소를 위해, 임의의 추가의 세척이 요구되지 않는다. 이 단계가 확실하게 수행될 수 있다할지라도, 바람직한 실시형태에서, 필터 케이크는 추가의 유체로 세척하지 않는다. 다른 실시형태에서, 예를 들어 상청액 부피의 최대 1% 또는 최대 0.1% 및/또는 필터 케이크 부피의 최대 5% 또는 최대 2%의 단지 소량의 세척 유체가 사용된다.
특히 바람직한 실시형태에서, 상술된 여과는 추가의 여과, 특히 집중 여과 (intense filtration) 및/또는 멸균 여과를 수반한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 e1) 제1 필터 보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제2 필터로, 단계 d)에서 수득된 여과 유체를 추가로 여과하는 단계로서, 여기서 제2 필터의 기공 크기가 1 μm 내지 20 μm의 범위인 추가의 단계를 포함한다. 바람직하게는, 제2 필터의 기공 크기는 2 μm 내지 15 μm의 범위, 특히 3 μm 내지 10 μm의 범위, 특별히 4 μm 내지 8 μm의 범위이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 e2) 제2 필터 보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제3 필터로, 단계 d) 또는 e1)에서 수득된 여과 유체를 추가로 여과하는 단계로서, 여기서 제3 필터의 기공 크기가 0.25 μm 내지 10 μm의 범위인 추가의 단계를 포함한다. 바람직하게는, 제3 필터의 기공 크기는 0.3 μm 내지 5 μm의 범위, 특히 0.35 μm 내지 2 μm의 범위, 특별히 0.4 μm 내지 1.5 μm의 범위이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 f) 제3 필터 보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제4 필터로, 단계 e1) 또는 e2)에서 수득된 여과 유체를 추가로 여과하는 단계로서, 여기서 제3 필터의 기공 크기가 0.05 μm 내지 2 μm인 추가의 단계를 포함한다. 바람직하게는, 제4 필터의 기공 크기는 0.08 μm 내지 1.5 μm의 범위, 특히 0.1 μm 내지 1 μm의 범위, 특히 0.15 μm 내지 0.6 μm 또는 0.4 μm의 범위이다.
용어 "제1", "제2", "제3" 및 "제4" 필터는 본 발명의 방법이 이러한 수의 필터로 한정되거나 또는 이러한 수의 필터가 필터로서 반드시 사용되어야 한다는 것을 의미하는 것은 아니다. 이것은 단지 기공 크기가 다른 다양한 필터를 구별하기 위한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 1, 2, 3, 4의 더 많은 여과 단계가 수행되고, 여기서 바람직한 실시형태에서, 다음 단계의 필터는 이전 단계의 필터 보다 더 작은 기공 크기를 갖는다.
세포 여과에 적합한 임의의 필터는 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 필터에 적합한 필터 물질이다. 물질의 예에는 셀룰로오스 또는 고분자 막으로부터 형성된 것들이 있다. 예로는 폴리에테르술폰 막 (예를 들어, Sartopore 필터) 또는 셀룰로오스/규조토/펄라이트 필터 (예를 들어, Seitz K 시리즈 필터)가 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 세포는 바람직하게는 식물 세포, 바람직하게는 특히 흙 이끼 및 우산이끼로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이끼이고, 여기서 Physcomitrella, Funaria, Sphagnum 및 Ceratodon, 또는 Marchantia 및 Sphaerocarpos 속의 종류들이 특히 바람직하다. Physcomitrella patens가 특히 바람직하다. 가장 특히 바람직하게는, 본 발명의 방법은 흙 이끼 Physcomitrella patens의 원사체와 같은 세포, 식물들 또는 식물 조직을 사용하여 수행된다. 추가의 바람직한 식물에는 담배, 콩 또는 렌틸콩이 있다. 바람직하게는, 식물에는, 예를 들어 Lemna, Spirodela, Landoltia, Wolffia 또는 Wolffiella 속의 수중식물이 있다.
본 발명의 방법은 세포벽이 있는 세포의 여과에 특히 적합하다. 진성 식물 세포 (genuine plant cell)에 추가하여, 상기 세포는 또한 균등한 실시형태로 볼 수 있는 균류 세포 또는 조류 세포 (algal cell)로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "세포"는 다세포 유기체에서 분리된 세포들, 세포 덩어리 또는 하나의 세포를 의미한다고 할 수 있다. "식물 세포"는 하나의 식물 또는 하나의 식물 조직의 각각의 식물 세포 또는 하나의 세포일 수 있다. 유사한 방식으로, "균류 세포"는 하나의 균류 또는 하나의 균류 조직의 각각의 세포 또는 하나의 세포일 수 있다. "조류 세포"는 바람직하게는 녹조류 세포이다. 상기 조직은, 예를 들어 체관부, 물관부, 엽육, 문 (phylum), 잎, 엽상체, 원사체, 녹사체, 분지체, 헛뿌리 또는 배우자 낭체 조직으로부터 선택될 수 있다. 상기 세포는 프로토플라스트 또는 실질 세포, 특히 캘러스 세포로 이루어지거나 또는 이를 포함할 수 있다.
추가의 적합한 세포는 박테리아 세포이다. 본 발명이 먼저 최우선으로 식물 세포에 최적화된 것이라 할지라도, 높은 유체 분리 비율에서 세포의 부드러운 처리와 같은 동일한 이점이 박테리아 세포에서도 관찰될 수 있다.
바람직하게는, 식물 세포에 의해 생성된 재조합 단백질은 유체 상청액에 존재한다. 이와 관련하여, 동일하게 또는 조합하여, 유체의 여과에 의해 상청액의 재조합 단백질을 정제하는 것이 또한 가능하다. 식물에서 단백질의 재조합 생성은 도입부에서 전술된 바와 같이 잘 공지되어 있으며, 식물에서의 형질전환 및 발현의 일반적인 방법이 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 전술된 바와 같은 필터 하우징 및 예를 들어, 4 μm 내지 50 μm의 범위의 기공 크기를 갖는 전술된 바와 같은 제1 필터를 포함하는 키트 또는 시스템에 관한 것이다. 상기 키트 또는 시스템은 유리하게는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 제2, 제3 및/또는 제4 필터와 함께 제공될 수 있다. 이러한 키트 또는 시스템은 본 발명의 방법을 수행하는데 적합하거나 또는 이러한 목적을 위해 사용된다.
본 발명은 또한 (식물) 세포로부터 생성된 필터 케이크로부터 수분을 제거하기 위해, 본 발명의 키트 또는 그의 요소의 사용에 관한 것이다.
지금부터 본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 설명될 것이다: 본 발명의 이러한 구체적인 실시형태는 임의의 방식으로 제한하는 것은 아니다.
도 1은 바닥 플레이트 (2), 뚜껑 (3) 및 필터 물질의 시트로서 충전 챔버의 체-유사 바닥면 (4)을 포함하는 본 발명에 따른 필터 하우징의 단면을 제시한다. 상기 뚜껑은 분리가능한 나사 연결부 (5)에 의해 원통형의 하우징 벽 (1)으로 밀폐 밀봉된다. 또한 상기 하우징은 유입구 (6) 및 유출구 (7)를 갖는다.
도 2는 집중 여과 과정 동안 Supradisc 시스템으로의 생성물 손실 (적정농도 [mg/L]; B) 및 탁도 측정 (NTU [-]; A)에 의한 현탁 물질의 정제 후 분석 결과를 제시한다. (1 = 배양 상청액, 2 = 이끼-부재 K900 여과물, 3 = K700 여과물, 4 = KS50 여과물, 5 = 멸균 여과물).
도 3은 집중 여과 과정 동안 Supracap 시스템으로의 생성물 손실 (적정농도 [mg/L]; B) 및 탁도 측정 (NTU [-]; A)에 의한 현탁 물질의 정제 후 분석 결과를 나타낸다. (1 = 배양 상청액, 2 = 이끼-부재 K900 여과물, 3 = K700 여과물, 4 = KS50 여과물, 5 = 멸균 여과물).
실시예:
비교 실시예 1:
소규모로, 재조합 생성 항체를 포함하는 상청액 (암배아 항원 (CEA) 특이적 IgGl H10)을 생성된 원사체 이끼 조직으로부터 7 g/L 이하의 세포 밀도로 분리하였다. 100 μm 기공 크기의 체를 이 목적을 위해 사용하였다: 남아있는 잔여 수분 함량은 대략 50%이었다.
생성 규모 확대 시, 적절한 필터 방법을 조사하였다. 이와 관련하여, 제1 여과 단계는 비교적 거친 필터 상에서 수행해야 했다. 이렇게 함으로써, 필터가 막히는 것을 방지할 수 있으며, 이것은 일차적으로 이끼 및 상청액의 분리를 위한 것이다. 청징 여과 (clarifying filtration) 과정 동안 집중 여과 효과는 매우 현저하지는 않았다.
제1 여과 단계에서, 백 필터를 사용하였다 (Eaton; 하우징 유형: TBF-0101-AD10- 050D, 백 필터 제품: F5869549; 용적 13 L). 필터를 곡면 바닥면을 갖는 하우징 인서트 내에 위치시키고, 여기서 인서트의 바닥면 및 인서트 벽에 체와 같은 방식으로 구멍을 뚫었다. 여과는 성공적이었으나, 분리된 이끼의 잔여 수분 함량이 매우 높았고, 압축 공기 (1-3 bar)를 사용하여 이끼로부터 배출시킬 수 없었다.
필터 케이크를 제거하여, 손으로 제거함으로써 여과 과정을 완료한 후, 세포 외 잔여 수분 함량을 측정하였다. 배출된 유체 및 잔여 이끼 물질의 비교 용적은 대략 50%이었다. 이것은 높은 생성물 손실과 관련된 것으로서, 개별적으로 측정된 것은 아니다.
비교 실시예 2:
규모 확대 실험에서 비교 실시예 1과 유사한 방식으로, 재조합 생성 항체가 포함된 상청액을 여과에 의해 이끼 조직으로부터 분리하였다. 곡면 바닥면의 대안적 하우징 인서트를 사용하였고; 이 때, 인서트의 바닥면에 체와 같은 방식으로 구멍을 뚫기만 하였다. 이것은 압축 공기가 필터 케이크 상에서 균일하게 배출되고, 잔여 수분이 이끼 잔여물로부터 제거되는 것을 확실히 하는 것이다. 그러나, 실제 경우는 그렇지 않았다. 비교 실시예 1에 기술된 바와 같이, 잔여 수분 함량을 측정하였으며, 이 또한 대략 50% (중량 %)이었다.
실시예 1: 대규모 여과
분리된 식물 세포에서 저 함량의 잔여 수분을 생성시키기 위한 신규의 필터 하우징을 개발하였다. 신규의 하우징은 도 1에 제시되어 있다. 상기 필터 하우징은 필터 물질의 평평한 시트로서 기능하는 체-유사 인서트 (4)를 특징으로 한다. 하우징 벽은 여과면으로서 기능하지 않는다. 모든 여과 유체가 평평한 바닥 플레이트를 통해 유출구로 통과되어야 한다. 동물 세포의 경우, 작은 면적의 여과면으로 인해, 필터가 빨리 막히는 경향이 있었다. 그러나 식물 세포의 경우에는, 고 용적 (> 5 L)의 여과가 가능할 뿐만 아니라, 놀랍게도, 저 함량의 잔여 수분이 생성되는 이점이 있음이 관찰되었다.
하우징에 Seitz K900 필터 디스크 (기공 크기 8 - 20 μm; Pall)를 장착시켰다. 500 L 이하의 규모를 위한 하우징을 설계하였고, 이것은 임의의 용적의 배양 상청액으로 그 규모가 확대될 수 있다. 이러한 필터 하우징의 시험은 양호한 데이타를 제공하였다. 500 L의 배양 액체 및 저농도의 생물질 (0.5 g/L)로의 시험 및 고농도의 생물질 (4 내지 7 g/L)을 포함하는 100 L의 배양 액체로의 다수 시험에서, 필터 케이크 내에 0%의 세포 외 잔여 수분 함량이 수득될 수 있었다 (비교 실시예 1에서 측정된 바와 같음). 이것은 이 모듈에서 배양액의 상청액이 전체 필터 케이크, 이어서 필터를 통하고, 필터 하우징 밖으로 연속적으로 통과되었다는 것을 의미한다. 또한 항체의 생성물 손실율 (mg/L)이 매우 낮은 것으로 나타났다 (4% 내지 13% - 표 1의 단계 1). 여기서 상기 손실율은 온전히 이끼 케이크 또는 필터 내의 생성물의 비특이적 정체로 인한 것이고, 필터 케이크 내에 정체된 배양 상청액에 의한 것은 아니었다.
실시예 2: 집중 및 멸균 여과
집중 및 멸균 여과를 수행하기 위해, 실시예 1의 여과물을 추가로 여과시키고, 집중 여과를 위해, Seitz K700 필터 디스크 (기공 크기 6 - 12 μm; Pall) 및 Seitz KS50 필터 디스크 (기공 크기 0.4 - 1 μm; Pall)로 여과를 수행하였다. 이 여과는 하나의 하우징 및 한 번의 통과로 연속적으로 수행되거나 또는 각각의 하우징에서 개별적으로 수행될 수 있다. 이끼 세포 또는 세포 분획에 충분한 공간이 확보될 수 있도록 필터 사이의 간격을 선택한다. 필터를 SUPRAdiscTM (Pall) 및 SupracapTM 100 (Pall) 시스템 (Supradisc 필터: 300P700S205SP 및 200P050S205SP; Supracap 필터: NP6P7001 및 NP6P0501)에 따라 2 개의 병행 작동기에 설치하였다.
멸균 여과를 위해, 여과물을 Sartopore 2 필터 디스크 (기공 크기 0.2 μm; Sartorius)에 의해 추가로 여과하였다.
실시예 3: 결과
개발된 필터 하우징은 최적의 고체-유체 분리를 보장한다. 잔여 수분이 거의 없는 고형 필터 케이크가 형성됨에 따라, 생성물 손실율이 낮게 유지된다. 전체 과정은, 필터가 막히는 일 없이, 추가의 정제 단계가 빠르게 수행될 수 있음을 보장한다.
도 2 및 3에 결과가 제시되어 있다. 상기 결과는 집중 여과 과정 동안, Supradisc 시스템을 사용한 정제 (도 2) 및 Supracap 시스템을 사용한 정제 (도 3)의 각 시점에, 여과에 의한 항체 손실 현상 및 탁도 측정 (NTU)을 통한 여과에 의한 현탁 물질의 정제의 분석을 나타낸다. 표 1은 생성물 손실율을 정리한 것이다.
[표 1]
Supradisc 및 Supracap 시스템을 사용한 정제 과정 동안의 생성물 손실율
Figure 112015004351755-pct00001

Claims (19)

  1. 하기 단계를 포함하는, 세포벽을 갖는 세포로부터 유체 상청액을 분리하는 방법:
    a) 유체와 세포의 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 상기 혼합물로 필터 하우징을 충전하는 단계로서, 상기 필터 하우징에서, 4　㎛ 내지 50　㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 제1 필터가 평평한 바닥면 상에 제공되고, 체와 같은 방식으로 구멍이 뚫린 평평한 바닥면으로 밀봉되도록 필터 하우징의 벽면부가 연결되는 단계;
    c) 상기 혼합물에 압축된 공기를 이용하여 적어도 0.5 bar의 차압 (differential pressure)을 적용하여, 상기 혼합물의 유체 부분이 필터를 통해 통과되고, 세포를 포함하는 필터 케이크가 필터 하우징에 잔류되도록 하는 단계로서, 추출 시점에서의 절대압은 적어도 0.7 bar인 단계;
    d) 여과된 유체를 제거하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 필터 하우징의 내부 용적이 적어도 2 L인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 10 L의 상청액이 여과되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 세포가 상기 방법 과정 동안 파열되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 추출 시점의 절대압이 적어도 0.8 bar인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 차압이 적어도 0.8 bar, 또는 적어도 1 bar인 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 필터 하우징이 압력 용기인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 압력 용기가 적어도 2 bar 또는 적어도 5 bar의 압력을 위해 설계된 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 방법 과정 동안의 온도가 0℃ 내지 40℃의 범위인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 필터 케이크가 추가의 유체에 의해 세척되지 않고/않거나 유체가 압축 공기를 이용하여 상기 필터 케이크로부터 배출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, e1) 제1 필터보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제2 필터로, 단계 d)에서 수득된 여과된 유체를 추가로 여과하는 단계로서, 여기서 제2 필터의 기공 크기가 1 ㎛ 내지 20 ㎛의 범위인 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, e2) 제2 필터보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제3 필터로, 단계 d) 또는 단계 e1)에서 수득된 여과된 유체를 추가로 여과하는 단계로서, 여기서 제3 필터의 기공 크기가 0.3 ㎛ 내지 10 ㎛의 범위인 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, f) 제3 필터보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제4 필터로, 단계 e1)에서 수득된 여과된 유체를 추가로 여과하는 단계로서, 여기서 제3 필터의 기공 크기가 0.05 ㎛ 내지 2 ㎛의 범위인 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, f) 제3 필터보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제4 필터로, 단계 e1) 또는 e2)에서 수득된 여과된 유체를 추가로 여과하는 단계로서, 여기서 제3 필터의 기공 크기가 0.05 ㎛ 내지 2 ㎛의 범위인 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 세포가 식물 세포, 이끼 세포, 흙 이끼 세포, 또는 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens) 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 세포에 의해 생산된 재조합 단백질이 상기 유체 상청액에 존재하고/하거나, 재조합 단백질이 여과에 의해 상기 상청액으로부터 정제되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제1항, 제2항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 정의되고, 적어도 2 L의 내부 용적을 가지며, 주입구 및 공기 공급 개구부를 갖는 압력 용기인 필터 하우징; 및 4 μm 내지 50 μm 범위의 기공 크기를 갖는 제1 필터를 포함하는 키트로서,
    제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 사용하기 위한 키트.
  18. 제17항에 있어서,
    제1 필터보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제2 필터로서, 여기서 제2 필터의 기공 크기가 1 ㎛ 내지 20 ㎛의 범위인, 제2 필터;
    제2 필터보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제3 필터로서, 여기서 제3 필터의 기공 크기가 0.3 ㎛ 내지 10 ㎛의 범위인, 제3 필터; 및/또는
    제3 필터보다 더 작은 기공 크기를 갖는 제4 필터로서, 여기서 제3 필터의 기공 크기가 0.05 ㎛ 내지 2 ㎛의 범위인, 제4 필터를 추가로 포함하는, 키트.
  19. 제17항에 있어서, 세포의 필터 케이크로부터 수분을 추출하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는, 키트.
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