KR102079633B1 - 식물 세포 팩의 생성 및 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료의 생성 및 배양, 그리고 원하는 산물의 축적 또는 수확을 위한 그 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 배지가 제거된 다공성 구조 및 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법을 제공한다: (i) 식물 세포 현탁 배양물로부터 세포들을 분리하여 세포 팩을 제공하는 단계, 여기서 상기 세포 팩에 포함되는 액체의 함량은 세포 팩 밀도가 0.1 내지 0.9g의 습식 세포 중량/cm³에 해당하도록 감소되고 조정되어 배지가 제거된 다공성 구조 성질의 상기 세포 팩을 구축하며, (ii) 상기 배지가 제거된 다공성 구조의 세포 팩을 비액체 환경 중에 상대 습도 50 내지 100% 하에서 인큐베이션하는 단계.

Description

식물 세포 팩의 생성 및 배양 방법{METHOD FOR THE GENERATION AND CULTIVATION OF A PLANT CELL PACK}

본 발명은 식물 생물공학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료의 생성 및 배양, 그리고 원하는 산물의 축적 또는 수확을 위한 그 용도에 관한 것이다.

지난 세기들 동안 천연 또는 이종성 단백질들 및 이차 대사물질들의 축적 및 수확을 위한 식물 기반 시스템들을 구축하고 배양하기 위해 엄청난 노력들을 기울여왔다. 문헌에서는 생산 세포들, 조직들, 소기관들 또는 심지어 전체 식물들 또는 이들의 일부들로부터 단리되거나 배양 배지 내로 분비된 다양한 원하는 물질들을 생산하기 위한 식물 기반 시스템들의 유용성을 입증하는 엄청난 양의 증거 자료를 제공한다. 마찬가지로 안정적으로 또는 일시적으로 형질변환된 식물 재료의 구축을 보장하는 광범위한 형질변환 프로토콜들이 존재한다. 그러나 식물 세포들로부터 고수율의 원하는 산물을 수득하기 위해 신뢰할 수 있고 상대적으로 비용 효율적이며 신속한 기술이 여전히 필요하다.

따라서 본 발명은 선행 기술의 문제들, 특히 배양 동안에, 및 산물 제거, 추출 및 정제를 포함하는 후속 처리 동안에 많은 양의 배양 배지의 취급 필요성에 관한 문제들을 극복하고 식물 세포 현탁 배양물로부터의 세포들을 이용해서 고수준의 원하는 천연 또는 재조합 산물들을 생산하기 위한 식물 기반 시스템의 제공에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 천연 또는 재조합 단백질들 및 대사물질들의 발현 또는 생성에 관한 것이며, 생산 숙주로서 일반적으로 구축된 식물 세포 현탁 배양물들로부터 유래된 특정 식물 세포 재료를 이용한다.

온전한 식물들 또는 적어도 온전하고 분화된 식물 조직의 이용에 기반을 두는 현재 이용되는 여러 개발 시스템들과는 대조적으로, 현탁 세포들의 사용은 동종성 재료가 조절되고 무균이며 봉쇄되는 조건들 하에서 재현성 있게 생산될 수 있다는 장점을 갖는다.

현재는 식물들에서 재조합 단백질들을 발현하기 위한 2개의 주요 전략들이 존재한다, 즉 (i) 안정한 유전자삽입 식물들 또는 현탁 세포주들의 생성 또는 (ii) 숙주가 이종성 유전 정보(DNA 또는 RNA)를 발현할 수 있도록 박테리아(예로, 아그로박테리움), 바이러스(예로, 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X/Y, 카우피 모자이크 바이러스 등), 또는 이 둘의 조합(예로, 증폭감염)으로 식물 발현 숙주들(식물, 조직 또는 세포들)을 감염시킨 후 이종성 유전자(들)의 일시적 발현이 그것이다.

본 발명은 또한 안정적으로 형질변환된 식물 세포 재료의 사용도 포함하지만, 일시적 발현을 위한 시스템들은 속도(유전자부터 산물까지, 시장 출시까지의 시간, 응급 반응)뿐만 아니라 안정적으로 형질변환된 유전자삽입 식물들 또는 이들의 일부들, 예컨대 세포들에서 전형적으로 수득될 수 있는 것에 비해 훨씬 더 높은 축적 수준의 달성 가능성의 장점을 갖는다.

따라서 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 식물 현탁 배양들에 내재적인 장점들을 일시적 발현 시스템들의 장점들과 조합한다.

식물 현탁 배양물로의 아그로박테리움들 첨가 후 현탁액 중 식물 세포들 및 박테리아의 추가 배양은 이미 시도되었고 공개되었으나(US 6,740,526 B1 참고) 기재된 접근들은 낮은 형질변환 효율을 겪는다. 또한, 아그로박테리움들은 박테리아를 사멸시키는 항생제들의 사용 또는 성장을 억제하는 영양 요구성 균주들의 사용과 같은 유효 조치들을 취하지 않으면 식물 현탁 세포들보다 빠르게 과성장한다. 다른 연구자들은 식물 현탁 세포들에서 공동 배양 박테리아의 직접적인 유해 효과들(세포 사멸, 과감수성 반응)을 기재하였다. 그 결과, 현재 온전한 식물들 또는 조직의 일시적 아그로 침윤/바이러스 감염의 효율과 식물 현탁 배양물들의 장점들을 조합하고 동종성 생물질(biomass)의 생산을 바람직하게는 GMP 준수 생산을 구축하기 위해 엄청난 장점인 무균 조절 조건들 하에서 가능케 하는 식물 기반 생산 시스템이 존재하지 않는다. 위에서 언급된 바와 같이, US 6,740,526 B1에 개시된 바와 같은 공동 발효 접근은 낮은 형질변환 효율 및 수반되는 박테리아 과성장의 어려움을 겪지만, 잎 기반 시스템들은 높은 형질변환 효율을 구현하고, 그러나 스케일 업의 문제들에 맞닥트리며 초기 생물질 생산을 위핸 낮은 공간-시간 수율들의 어려움을 겪고, 식물 생물질 생산을 위해 조절되지만 무균이 아닌 조건들에 의존한다. 미생물 시스템들에 비해 높은 생산 비용들은 이들 시스템들이 널리 관심을 얻지 못하고 생물학제제들을 위한 생산 시스템들로 사용되지 못한 주요 이유이다. 그 결과, 연구 및 개발은 속도 및 생산 강도의 조합된 장점이 중요한 더 특화된 응용분야들, 즉 응급 반응(예로 독감 백신들, 신생 질환들, 개인별 의약 등)을 표적으로 한다. 이러한 문제들뿐만 아니라 임의의 주어진 식물 숙주 재료의 유전적 배경을 조작하기 위한 개선된 수단들의 제공이 본 발명에 의해 해소되고 해결된다.

본 발명에 따르면, 하기 단계들을 포함하는, 배지가 제거된(medium-deprived) 다공성 구조(porous structured) 및 비조직 다층(non-tissue multilayer) 세포 팩 형태의 식물 세포 재료의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법이 제공된다: (i) 식물 세포 현탁 배양물로부터 세포들을 분리하여 다공성 구조를 갖는 세포 팩을 제공하는 단계, 여기서 세포 팩에 포함되는 액체의 함량은 세포 팩 밀도가 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.2 내지 0.85, 가장 바람직하게는 0.4 내지 0.8g의 습식 세포 중량/cm³에 해당하도록 감소되고 조정되어 배지가 제거된 다공성 구조 성질의 상기 세포 팩을 구축하며, (ii) 상기 배지가 제거된 다공성 구조의 세포 팩을 상기 세포 팩의 다공성 구조를 유지 또는 복구하는 조건들 하에 비액체 환경 중에 식물 재료의 심각한 건조를 예방하기 위해 충분한 습도, 즉 상대 습도 50 내지 100%를 제공하면서 인큐베이션 또는 배양하는 단계.

당분야 숙련자에게 인지될 바와 같이, 조직 내의 세포들은 전형적으로 밀접한 연결들을 가지며, 통상 분화되어 있고 종종 특정한 형태들 및 극성화된 세포들을 나타낸다. 또한 조직 내의 세포들은 통상 서로에 대해 특징적인 배향들을 갖는다.

대조적으로, 본 발명에 따른 세포 팩들은 식물 세포 현탁 배양물들로부터 생성된다. 식물 세포 현탁 배양물들의 특정한 특성은 개별 세포들 또는 일부 세포들의 응집물들이 서로에 대해 이동하고 있거나 이동할 수 있으며 더 높은 조직 수준을 나타내지 않는다는 것이다.

그 결과, 본 발명에 따른 세포 팩들은 서로에 대해 특정한 상대적 배향을 갖지 않는 개별 세포들 및 세포 클러스터들을 포함한다. 이들 세포들은 집괴(conglomerate) 팩들을 상당한 공극들을 갖는 3차원 다공성 구조로 생성하는 방식으로 캐스팅된다. 세포 팩의 밀도 및 공극들의 존재 간에는 명확한 상관관계가 존재한다. 공극들은 여러 이유들로 중요하다. 첫 번째로 이들은 충분한 양의 산소가 세포들에 쉽게 공급될 수 있도록 하여 효율적인 기체 교환을 가능케 한다. 두 번째로 공극들은 액체들(=처리들)로 일시적으로 그리고 쉽게 침지될 수 있다. 이러한 일시적 처리들은 다양한 제제들을 세포 팩의 모든 세포들과 밀접하게 접촉하도록 함으로써 유전 형질변환, 생체형질변환, 세포 팩의 용출 또는 세척을 통한 산물 회수, 진단 목적들(예로, 세포 팩 기반 면역분석들)을 위한 기질들 또는 분석물질들의 적용을 위한 효율적인 방법을 제공할 수 있다. 이러한 처리들이 단지 일시적이고, 세포 팩의 다공성 구조가 재구성되고 세포 팩의 밀도가 후속 인큐베이션 단계들 동안 높은 생활성을 보정하도록 확인된다는 것이 중요하다. 세포 팩의 다공성 성질로 인해, 세포/공극 계면에서 기체상과 접촉하는 높은 표면적으로 인해 특정 용도들에서는 세포 팩이 건조되는 것을 예방하기 위해 습도가 충분히 높은 것이 또한 중요하다.

특히, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예는 (i) 동종성 식물 생물질의 제공을 위해 바람직하게는 조절되고/되거나 무균 조건들 하에 식물 세포 현탁액이 배양되는 첫 번째 배양 단계, (ii) 다공성 세포 팩이 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.2 내지 0.85, 가장 바람직하게는 0.4 내지 0.8g 습식 세포 중량/cm³의 밀도를 갖도록 액체 배지가 식물 세포들로부터 분리되는 분리 단계, 및 (iii) 세포 팩이 적어도 또 다른 날 동안 조절되는 조건들(상기 참고) 하에 비액체 환경 중에서 추가 인큐베이션되는 두 번째 배양 단계를 포함한다. 실제 상황 및 실습자의 의도에 따라, 상기 두 번째 배양 단계는 수일 동안 수행될 수 있다. 전형적으로는 두 번째 배양 단계는 2 내지 7, 바람직하게는 3 내지 5일 동안 수행된다.

현재의 모든 당분야 기술의 배양 방법들에서, 식물 세포 재료는 영양소 함유 배지와 연속적으로, 즉 대부분의 시간 동안 직접 또는 간접(다공성 지지체 또는 막 매개) 접촉된다. 연속 배지 접촉은 세포들이 하나의 배지에서 다른 배지로 옮겨질 때에만 잠시(즉 짧은 시기들만) 중단된다. 세포들은 여과 또는 세척되어 "기존" 배지를 제거한 뒤 새 배지로 빠르게 옮겨질 수 있다.

선행 기술과는 대조적으로, 본 배양 단계는 세포들의 생활성을 유지하고 감소되거나 최소의 세포 성장 및 분할을 가지며 산물 축적을 촉진하는 조건들 하에 수행된다. 이는 수분 환경에서, 바람직하게는 성분들 또는 영양소들이 세포 팩 내로 확산되는 액체 또는 겔화 성장 배지와 접촉하지 않고 잘 통기되는 팩화 세포들을 배양함으로써 달성되었다(US2002/092037 A1; WO2005/103271 A1). 선행 기술에서는 세포들에 영양소들을 공급하기 위해 세포들의 박층들이 배지 상에 배치된 지지 막들 상에 접종되거나 스팟팅(spotting)된다. 그러나 성장 배지 상 세포층들의 배양은 배지에 대한 접촉 필요성으로 인해 소량의 생물질만이 처리될 수 있다는 단점을 갖는다. 대조적으로, 본 발명의 세포 팩 방법은 지지 배지와 무관하며, 스케일 조정이 가능하여 산업적 용도들에 적합하다. 따라서 상기 인큐베이션 또는 배양 단계 (ii)는 배지가 제거된 다공성 구조의 세포 팩을 비액체 환경 중에, 바람직하게는 (액체 또는 겔 고화된) 유지 또는 성장 배지 상이나 내에 접촉하게 배치하지 않고 수행된다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 따르면, 두 번째 배양 단계는 수 주 또는 수 개월 동안 수행된다. 이러한 경우들에서, 세포들의 생활성을 유지하도록 배양 조건들이 개질되어야 할 수 있다. 이는, 예를 들어 일시적으로(즉 3시간, 바람직하게는 1시간까지의 시기 동안) 영양소들을 세포 팩에 제공하고/하거나 인큐베이션 온도를 낮춤으로써 달성될 수 있다.

선행 기술에서, 현탁 배양물은 배양물에 포함되는 세포 내에 유지되거나 배양 배지 내로 분비되는 원하는 산물을 축적하는데 사용된다. 생산 기간이 넘어가면, 세포들은 축적된 산물을 수확하기 위해 파괴되거나 폐기된다. 현탁액 중, 즉 액체 배지 중에 침지된 안정적으로 형질변환된 식물 세포들은 광범위하고 상이한 치료적 재조합 단백질들을 생산하는데 사용되었다(S. Hellwig 등, "Plant cell cultures for the production of recombinant proteins", Nature Biotechnol 22: 1415-1422, 2004).

본 발명에 따르면, 현탁 배양물에 포함되는 세포들은 상기 언급된 바와 같이 특정 밀도를 갖는 것으로 추가 정의된 다공성 구조의 세포 팩 형태의 배지가 제거된 비조직 식물 세포 재료를 생성하는데 사용된다. 선택적으로 사용자 정의 형태로 제공될 수 있는 상기 세포 팩은 액체 배양물 중에 성장시킨 미분화된 식물 세포들로 구성된 인공 생성된 다층 세포 집괴 또는 세포 케이크로 간주될 수 있다. 원천 세포들은 원하는 산물을 축적할 수 있는 안정적으로 및/또는 일시적으로 형질변환된 유전자삽입 세포들, 돌연변이된 세포들 또는 야생형(천연) 세포들일 수 있다. 주변 액체 배지의 대부분을 제거하면서 세포 팩의 구조 내로 세포 현탁액을 캐스팅함으로써 3차원적 다공성 식물 세포 재료가 생성된다. 진공 여과, 가압 여과 및 필터를 통한 원심분리와 같은 여과 기법들이 바람직하지만, 액체 배지는 상기 세포 팩 밀도가 보장되는 한 당분야에 공지된 다른 수단들(예로, 식품 산업에서 사용되는 분리기들, 연속 원심분리)에 의해 제거될 수도 있다. 세포 팩에 포함되는 개별 세포들 또는 세포 클러스터들 간의 공극들의 구축, 유지 및/또는 재구축은 다공성 구조의 세포 팩을 제공하여 두 번째 배양 단계(phase) 동안 팩화 식물 재료의 생활성 및 생산성을 위한 결정적 요인인 우수한 통기(기체 교환)를 보장한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 배양 조건은 고화된(겔화된) 또는 액체 배지 상에, 현탁액 중에, 또는 상기 언급된 바와 같이 필요한 통기를 방해할 수 있는 임의의 액체 환경과 접촉하여 세포 팩을 배양하는 것을 포함하지 않는다. 상기 배양이 본질적으로 상기 세포 팩에 포함되는 각 세포를 둘러싸는 임의의 배지 또는 액체의 부재 하에 수행되므로, 충분한 상대 습도가 보장되어야 한다. 당분야 숙련자에게 이해될 바와 같이, 세포 팩의 밀도(습식 세포 중량 g/cm³), 액체 함량 및 통기(충분한 양 및 부피의 공극 구성에 의해 부여됨) 간에는 엄격한 상관관계가 존재한다. 그러나 이후 보다 상세히 설명될 바와 같이, 통기된 세포 팩은 (일시적으로) 이를 영양소들, 기질들, 호르몬들, 효소들, 대사물질들 및 전구체들을 비제한적으로 포함하는 적은 부피의 형질변환 벡터들 또는 물질들과 접촉시켜 처리될 수 있다. 상기 맥락에서, "일시적으로"는 장기(즉 수주 또는 수개월)의 인큐베이션 과정에서 영양소들의 제공을 포함하는 이들 처리들이 단시기(최대 3h, 바람직하게는 최대 1h) 동안만 수행되며, 이후 액체 배지가 다시 인취되고 다공성 세포 팩들의 공극들이 재구성되어 본원에 정의된 바와 같은 세포 팩 밀도가 생성됨을 의미한다.

따라서 본 발명에 따른 방법은 선택적으로 유기체, 화학적 및/또는 생물학적 물질 또는 분자를 각각 포함하거나 나타내는 기체, 증기, 연무, 분진, 및/또는 에어로졸 등의 존재 하에 세포 팩을 배양하는 것을 포함한다.

바람직한 구현예에 따르면, 세포 현탁 배양물에 포함되는 세포들은 두 번째 배양 단계를 수행하기 전에 바람직하게는 기능성 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 이종성 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터로 형질변환된 천연(예로, 야생형) 또는 비유전자삽입 세포들로, 여기서 상기 적어도 하나의 이종성 핵산 서열은 본 발명에 따른 방법의 단계 (ii)에서 축적 및 수확될 원하는 산물을 코딩한다.

본원에서 사용되는 용어 "형질변환"은 식물 세포 내로의 임의의 핵산 또는 핵산 유사체들의 전달에 관한 것이다. 형질변환 후, 핵산은 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있다. 대안적으로 전달된 핵산은 게놈 내로 통합되지 않을 수 있고 세포질 내 또는 핵 내 또는 임의의 세포성 소기관 내에서 그 효과를 나타낼 수 있다.

핵산은 바이로이드, 바이러스 또는 해체된 바이러스 또는 둘 이상의 바이러스로부터의 필요한 요소들의 조합과 같은 자가 복제 요소일 수 있다. 대안적으로 전달된 핵산은 바이로이드, 바이러스 또는 해체된 바이러스와 같은 자가 복제 요소의 성분에 불과할 수 있다. 다른 성분들은 숙주 세포에 의해 또는 유전자삽입 숙주 세포에 의해 제공/보충될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "이종성"이란 해당 뉴클레오티드들의 유전자/서열이 유전 조작을 이용하여 식물 세포들 내로 도입되었음을 나타낸다. 이종성 유전자는 내인성 동등 유전자, 즉 보통 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 것으로부터 관심 단백질의 발현을 증강시킬 수 있거나, 또는 삽입된 서열은 내인성 유전자 또는 다른 서열에 추가적인 것일 수 있다. 추가 가능성은 핵산 서열 또는 그 동족체가 자연적으로 발견되는 배양된 표적 세포 내에 배치될 핵산 서열이 발현 조절을 위한 하나 이상의 조절 서열들, 예컨대 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 것과 같이, 해당 유형 또는 종들 또는 다양한 식물의 세포 또는 세포들 내에서 천연 생성되지 않는 핵산에 연결되고/되거나 인접한다는 것이다. 또 다른 가능성은 핵산 서열이 안티센스 및/또는 침묵화(silencing)(원하는 산물이 달성되는 결과)에 의해 기존 유전자의 침묵화를 유도하는 것이다. 또 다른 가능성은 miRNA(원하는 산물)와 같은 조절 기능을 갖는 핵산에 대한 것이다. 또 다른 가능성은 리보자임 또는 앱타머(aptamer; 원하는 산물)인 핵산에 대한 것이다.

"벡터"는 특히 자가 전달 가능 또는 이동 가능하거나 가능하지 않을 수 있고, 원핵 또는 진핵 숙주를 형질변환시키고 염색체 외로(예로 복제 기원을 갖는 자가 복제 플라스미드로) 존재할 수 있는 이중쇄 또는 단일쇄의 선형 또는 원형 형태인 임의의 플라스미드, 코스미드, 파지, 또는 바이러스 벡터를 포함하는 것으로 정의된다.

"발현 벡터"는 핵산이 미생물 또는 식물 세포와 같은 숙주 세포에서의 전사를 위한 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소들에 작동 가능하게 연결되고 조절 하에 있는 벡터를 나타낸다. 벡터는 여러 숙주들에서 기능하는 이중 기능성 발현 벡터일 수 있다. 게놈 또는 서브게놈 DNA의 경우 이는 그 자체 프로모터 또는 다른 조절 요소들을 함유할 수 있고, cDNA의 경우 이는 숙주 세포에서 발현을 위해 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소들의 조절 하에 있을 수 있다. "작동가능하게 연결된"이란 프로모터로부터 개시될 전사를 위해 적합하게 배치되고 배향되어 동일한 핵산 분자의 일부로 연결됨을 의미한다.

"생물학적 벡터"는 식물 숙주 세포를 형질변환할 수 있는, 즉 핵산을 식물 세포 내로 전달할 수 있는 임의의 미생물 또는 바이러스이다. "생물학적 벡터들"에 대한 예들은 감염성 미생물들, 예컨대 아그로박테리움, 라디오박터 및 리조비움에 속하는 것들 또는 바이러스들, 예컨대 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 x 및 카우피 모자이크 바이러스에 속하는 것들이다. 보다 구체적으로, A. 투메파시엔스가 "생물학적 벡터"이다.

세포들의 형질변환에 있어서, 유전 정보를 함유하는 생물학적 벡터 또는 상이한 생물학적 벡터들의 혼합물의 현탁액이 상술된 바와 같이 생성된 세포 팩에 적용된다. 벡터는 식물 세포들을 감염시키고 유전 정보를 전달한다. 세포 팩 형태의 식물 세포 재료의 스폰지 구조로 인해 벡터는 온전한 잎들 또는 식물들에서 세포들에 도달하기 위해 필요한 주입 또는 진공 침윤과 같은 특수 처리들이 필요 없이 단지 모세관력들에 의해 개별 표적 세포들에 접근할 수 있게 된다. 또한, 세포 팩의 느슨한 다공성 성질은 벡터에 대해 접근 가능한 큰 표면적을 생성하여 높은 형질변환 효율들을 구현한다. 이는 세포들이 훨씬 더 단단한 세포 대 세포 접촉들을 가져서 세포 표면에 대한 벡터의 제한된 접근을 일으켜 형질변환 효율들 및 산물 축적이 더 낮은 캘러스(callus) 재료 및 분화된 식물 조직들과는 상이하다. 전형적으로 세포 팩 내 세포들의 50% 초과가 형질변환되며, 이는 선행 기술에서에 비해 상당히 더 높다. U.S. 특허 6,740,526 B1에 형질변환 효율들에 대해 상세한 데이터가 보고되지는 않았으나, 거기에 개시된 바와 같은 방법은 본 발명에 따른 세포 팩 방법들에 비해 더 낮은 것으로 나타났다(예로, 실시예 1, 도 6C, 6D 참고). 상기 발견은 또한 10- 내지 100-배 더 높은 항체 수율들이 달성될 수 있다는 관찰에 의해 뒷받침된다(예로, 실시예 1 참고). 벡터 현탁액은, 예로 단순 적하 또는 분무에 의해 쉽게 적용될 수 있다. 그러나 크고/크거나 두꺼운 세포 팩들 및 특정한 사용자 정의 형태들은 본원에 정의된 바와 같은 원하는 세포 팩 밀도를 달성하기 위해 진공- 또는 압력-보조 적용 및 생물학적 벡터 현탁액의 제거를 필요로 할 수 있다. 잎-조직의 진공-보조 침윤과 대조적으로, 기재된 방법은 과량의 생물학적 벡터 현탁액이 제거 및 재사용될 수 있으며, 세포 팩의 다공성 성질이 즉시 재구축될 수 있다는 장점을 갖는다. 침윤된 잎들의 생활성은 세포 간 공간에서 기체상을 복구하기 위한 과량의 액체 흡수 및/또는 제거에 크게 의존한다. 이것은 조절하기 어려우므로, 잎-조직의 진공-보조 침윤은 더 높은 편차 및 실패율의 어려움을 겪는다. 취급, 자동화, 봉쇄, 스케일 업 및 노폐물 생산 및 제거에 관해 여러 실제적인 장점들을 가지므로, 바람직한 구현예는 세포 팩에 대해 벡터 현탁액을 적용하는 것이다. 대안적으로 식물 세포들의 현탁액은 세포 팩 형성 전에 벡터 현탁액과 혼합될 수 있다. 아그로박테리움과 같은 생물학적 벡터로 침윤된 세포 팩의 배지 제거 배양 및 공극들의 복구는 미생물 벡터가 이들보다 과다성장하여 식물 세포들을 파괴하지 않도록 한다.

생물학적 벡터 현탁액 대신, 핵산들 또는 핵산 유사체들을 함유하는 용액, 또는 핵산들을 함유하거나 이로 코팅된 에멀션 또는 입자들의 현탁액이 사용될 수 있다.

생물학적 벡터의 적용 후, 세포 팩은 개별 세포들 또는 세포 클러스터들 간의 공극들을 복구하여 식물 세포 팩이 그 다공성 구조를 재구축하도록 하고 식물 세포들이 재조합 단백질들을 발현하여 원하는 산물(들)을 축적하도록 조절되는 조건들 하에 일정 시간 동안 인큐베이션되거나 배양된다. 인큐베이션 조건들(예로, 시간, 온도, 습도, 광 강도)은 특정한 원하는 산물의 합성을 선호하도록 용이하게 조정될 수 있다. 세포 팩을 지지하기 위해 특수 설비가 필요하지 않고, 저렴한 일회용 플라스틱 트레이들이 이들의 유지를 위해 충분하다. 첫 번째 배양 기간 동안, 생물학적 벡터와 적용되는 액체의 증발 및 흡수로 인해 공극들이 재구성된다. 대안적으로 공극들은 진공- 또는 압력-보조 방법들에 의해 과량의 액체를 제거하여 재구성될 수 있다. 배양이 완료된 후, 세포 팩들이 수확되고 당분야에 공지된 적절한 정제 절차들을 적용함으로써 산물이 생물질로부터 분리/단리된다. 분석 또는 진단 결과가 원하는 산물임을 의미하는 경우들에서, 수확은 또한 인큐베이션/배양 기간 동안 일어날 수 있다. 전체 공정은 자동화될 수 있고, 쉽게 스케일 업 또는 다운될 수 있다. 용이한 설치 및 복잡한 방법론의 부재로 인해, 이 잘 조절되는 공정이 GMP 요건들 및/또는 고처리량 적용들 및/또는 산업적 대규모 생산을 충족하도록 설계하기에 타당하다.

전체 공정이 완벽한 봉쇄 하에 수행되어 높은 생물안전성을 제공할 수 있으므로, 이 방법은 특히 인간들, 동물들 및/또는 환경에 독성인 산물들에 적합할 수 있다. 이는 또한 생산 공정에 사용되는 화합물들, 벡터들 및/또는 핵산들에도 적용된다.

본원에서 사용되는 용어 "수확된"이란 원하는 산물의 발현 및 축적에 근거하는 임의 작용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상술된 바와 같이 원하는 산물의 분리/단리를 포함하는 수확에 부가하여, 수확은 일반적으로 자연적으로 또는 재조합적으로 축적된 원하는 산물에 근거하는 임의의 진단 또는 분석 결과를 보장하는 것에 관한 것이다. 당분야 숙련자에게는 이러한 경우들에서 원하는 산물의 분리/단리 자체가 생략될 수 있음이 자명하다.

대안적으로 세포 팩은 또한 예로 복제 시스템 또는 대사 경로의 성분을 제공하거나 특정 숙주 인자들을 하향 조절함으로써 원하는 산물(예로, 재조합 단백질, 대사물질)의 생산을 증가시키기 위해 유전자삽입 세포들을 포함하는 현탁 배양물로부터 생성될 수 있다.

추가 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는, 밀도 0.1 내지 0.9g, 바람직하게는 0.2 내지 0.85, 가장 바람직하게는 0.4 내지 0.8g의 습식 세포 중량/cm³인, 배지가 제거된 다공성 구조 및 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료를 제공한다. 다시 말하면, 본 발명은 밀도가 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.2 내지 0.85, 가장 바람직하게는 0.4 내지 0.8g의 습식 세포 중량/cm³인, 배지가 제거된 다공성 구조 및 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료를 제공한다.

세포 팩은 또한 벡터 현탁액에 부가하거나 대신하여, 재조합 및/또는 내인성(천연) 단백질들 또는 대사물질들의 생산을 위한 전구체들, 유도제들, 호르몬들, 안정화제들(예로, 상용성 용질들), 저해제들, RNAi/siRNA 분자들, 신호전달 화합물들, 효소들(예로, 펙티나아제), 및/또는 유발제들로 처리되거나 그 존재 하에 배양될 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 적용된 물질들은 세포 팩에 포함된 미분화된 세포들의 분화를 유도한다. 이는, 예를 들어 호르몬들 또는 호르몬들의 정의된 조합의 적용에 의해 또는 전사 인자들에 대한 유전자들로 세포들을 형질변환하여 달성될 수 있다.

세포 팩은 임의 시리즈들 및/또는 조합의 벡터 현탁액들, 핵산 용액들 또는 전술된 물질들을 이용하여 반복 처리될 수 있다. 이는 세포 팩의 다공성 성질이 유지되고 각 처리 후 공극들이 복구되는 한, 본 발명의 방법이 본질적으로 되풀이될 수 있음을 의미한다. 특히, 여기에는 또한 세포 팩의 세포들을 상이한 핵산들로 동시에 공동-형질변환하기 위한 상이한 벡터 현탁액들의 혼합물의 사용이 포함된다.

세포 팩은 또한 둘 이상의 상이한 종들의 세포들 및/또는 상이한 클론들 및/또는 상이한 유전자삽입 및/또는 비유전자삽입 세포주들을 포함할 수 있다. 또한, 이종성 세포 팩은 본질적으로 다른 세포들, 예로 효모, 진균, 동물 및 인간 세포들을 공동 배양하기 위한 다공성 지지체로서 식물 세포들을 이용하여 상이한 종들 또는 심지어 상이한 계들의 세포들을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 다공성 세포 팩은 공동 배양된 유기체들의 성장 및/또는 생명력을 평가하는 분석들을 위한 높은 재현성의 동종성 지지체로서 사용되며, 여기서 상기 평가가 원하는 산물을 나타내는 것을 의미한다. 바람직하게는 세포 팩은 공동 배양된 유기체에 대한 이들의 활성에 대해 세포 팩에 의해 생산되는 분자들(대사물질들, 펩티드들 및/또는 단백질들)을 시험하고/하거나 스크리닝하는데 사용된다. 이러한 분석들은 일반적으로 하기 단계들을 포함한다: (1) 본 발명에 따른 다공성 세포 팩이 생성되고, (2) 화합물, 벡터 및/또는 핵산이 상기 세포 팩으로 첨가되고 선택적으로 상기 세포 팩이 적합한 기간 동안 인큐베이션되고, (3) 상기 다공성 세포 팩의 선택된 면적에 두 번째 유기체가 접종되고, (4) 접종된 다공성 세포 팩은 두 번째 유기체가 성장할 수 있도록 하는 조건들 하에 인큐베이션되고, (5) 예를 들어 성장 및/또는 생명력으로 두 번째 유기체 상에 세포 팩에서 합성된 산물들의 효과들(원하는 산물들)이 적합한 인큐베이션 시간 후 평가된다. 예로, 유전자삽입 현탁 세포주가 사용되는 경우 두 번째 단계는 생략될 수 있다.

따라서 본 발명은 분석 또는 진단 목적들을 위해 상기 정의된 바와 같은 밀도를 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 식물 세포 재료를 이용하여 제공된다. 예를 들어, 세포 팩에 포함되는 세포들은 분석 또는 진단될 물질 또는 유기체의 존재 하에 인큐베이션될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 배지가 제거된 다공성 구조 및 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료를 포함하는 진단 또는 분석 도구를 제공한다.

따라서 당분야의 숙련자들은 본 발명에 따른 세포 팩들이 세포 팩과 접촉("처리")되는 표본 중에서 분석물들을 검출하기 위해 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 또한 관심 분석물을 함유하는 표본을 이용한 세포 팩의 처리는 일시적으로만, 즉 단시간 내에(최대 3시간) 수행된다. 처리 후, 공극들은 다시 재구성되어야 한다, 즉 세포 팩의 해당 밀도 및 다공성이 복구되어야 한다. 이어서 세포 팩은 임의 액체 또는 겔화/고화 배지(영양소들의 공급)와의 연속 접촉의 부재 하에 인큐베이션된다. 표본 중에 존재하는 분석물은 세포 팩의 측정 가능한 변화 또는 이에 포함되는 세포들의 조작을 야기하는 신호 전달, 유전자 발현 또는 임의의 다른 사건을 유도할 수 있다. 측정 가능한 변화들 또는 조작들에는 세포 팩 중 또는 용출액들, 추출물들 또는 세포 팩에서 유래되는 다른 표본들 중 직접적으로 검출 가능한 신호를 생성하는 추가 시약들과 세포 팩을 인큐베이션하거나 세포 팩을 분석하여 드러날 수 있는 형광 보고 단백질들, 형광 리포터 분자들, 효소들, 세포사로 이어지는 변화들, 자가 형광의 생성, 생리학적 또는 형태학적 변화들이 비제한적으로 포함된다. 야생형 및 안정한 유전자삽입 세포들 및 일시적으로 형질변환된 세포들을 포함하는 유전적으로 조작된 식물 세포들이 모두 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 특히, 후자는 야생형 세포들에서 생성된 세포 팩의 사전 형질변환 처리에 의해 유래될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 팩은 상이한 종류의 조작들을 수행하기 매우 쉽다. 현탁액들 중 세포들 또는 원형질체들과는 대조적으로, 세포 팩 중 세포들의 밀도가 더 높다. 결과적으로 동일한 유효 농도를 수득하기 위해 더 적은 양들이 필요하므로, 화합물들(예로, 대사물질 생산을 위한 유발제들)이 보다 경제적으로 적용될 수 있다. 또한, 고농축 물질들의 적용이 가능하며, 이는 생체전환/생체형질변환에 매우 유용하다. 온전한 식물들, 식물 조직 및/또는 캘러스에 대비한 장점은 더 큰 접근 가능 세포 표면적으로, 이는 세포 팩의 다공성 및 폭신폭신한 구조 그리고 그 느슨한 세포 접촉들에 기인한다. 현탁 배양들 및 온전한 식물 조직들 모두에 비해, 물질들이 보다 쉽게 그리고 효율적으로 세포 팩으로 적용될 수 있고 또한 이로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 전구체들 또는 독성 화합물들이 단기간만 적용될 수 있고, 펄스 추적 실험들이 수행될 수 있다. 유도제들은 보다 조절되고 시간이 정의되는 방식으로 적용되어 최적 유전자 발현 및 다른 산물 축적 조건들의 추가 정련을 허용할 수 있다. 일련의 전구체들 및 기질들이 순차적으로 적용되어 완전 전환을 달성하고 대사 경로들을 규명할 수 있다. 또한, 축적된 분비 산물들은 적합한 완충 용액으로 세포 팩을 단순 세척하여 수확될 수 있다. 흥미롭게도, 이는 산물 분해 및/또는 피드백 저해를 회피하는 산물들의 반복 제거("밀크화")를 허용한다. 상기 전략은 또한 숙주 세포들에 대한 해로운 효과들을 회피하고/하거나 감소시켜서 생산성을 최대화하는데 이용될 수 있다.

영양소들(예로, 암모니아, 카르복실산, 이산화황, 히드로겐 설피드, 포스핀들 및 유기 아민들)을 포함하는 휘발성 물질들의 세포 팩으로의 제공은 또한 현재 구축된 시스템들에 비해 여러 장점들을 갖는다. 현탁 세포 배양물들에 있어서 이러한 물질들의 기체 형태 전달은 달성하기 어렵다. 먼저 기체가 용액 중에 용해되어야 하며, 이는 용해도 및 수송에 의해 제한되는 절차이다. 온전한 식물들 및 식물 조직들을 이용하는 경우, 다시 수송이 문제가 되지만, 더 중요하게는 훨씬 더 큰 인큐베이션 부피들이 사용되고 조절되어야 한다. 이는 연구 목적들을 위해 소규모들로 수행되었으나, 대규모의 산업적 적용들은 일반적으로 너무 고가이다. 또한, 산물 자체가 휘발성 화합물인 경우, 산물을 축적하고/하거나 수확하는데 공기압의 조절을 이용할 수 있다. 여기서 현탁 세포 배양물들에 비해 더 높은 세포 밀도(즉 세포들/부피) 및 사용자 정의된 형태들 및 기하구조들에 대한 가능성은, 예를 들어 임의의 현존 생산 시스템들로 가능하지 않은 공정 엔지니어링을 위한 저압 배양의 독특한 가능성들을 제공한다. 따라서 본 발명은 이들 유형의 적용들을 위해 경제적이고 스케일 조정이 가능한 수단을 제공한다.

대안적으로 용해된 화합물들은 에어로졸 및/또는 연무 및/또는 증기의 형태로 다공성 세포 팩으로 전달될 수 있다. 상기 전달 방식은 현탁 세포들에 대해서는 가능하지 않다. 이는 온전한 식물들에 대해 사용되지만, 적용되는 화합물의 대부분은 그 표적에 도달하지 못하여 더 높은 용량들, 부피들 및 처리 횟수들을 필요로 한다. 표피를 통한 화합물들의 흡수는 매우 제한되어 기공들을 통한 전달을 필요로 한다. 따라서 이러한 적용들은 매우 효과적인 화합물들로 제한된다. 여기에서, 본 발명은 세포 팩에 유의미한 양들로 거의 모든 화합물을 효율적으로 전달하기 위한 방식을 제공한다.

스케일 업은 병렬 처리, 즉 필요한 갯수의 세포 팩들을 단순 생성함으로써 시행될 수 있다. 대안적으로 스케일 업은 또한 적합하게 배치된 큰 세포 팩들 또는 시트들, 컬럼들 또는 유사한 3D 구조들을 이용하여 수행될 수 있다.

세포 팩의 수직 크기는 팩 저부에서 세포들에 작용하는 힘 그리고 개구들의 결과적인 압축에 의해서만 제한된다. 그러나 이 문제는 중간 지지체들을 사용함으로써 해결될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 세포 팩의 전형적인 수직 크기들은 수 mm, 즉 3 내지 5mm에서 수 cm, 즉 3 내지 15cm 또는 그 이상의 범위이다. 수평 크기는 제한되지 않는다. 10mm³ 내지 10m³의 치수들이 타당하다. 예로, 적절한 산소 및 이산화탄소 수준들을 유지하기 위해 충분한 통기/기체 교환이 보장되어야 한다. 또한, 예로 고수준의 에틸렌은 세포들에 해로울 수 있으므로, 휘발성 일차 및 이차 대사물질들의 축적도 조절되어야 한다. 작은 두께(약 3-5cm)의 세포 팩들에 있어서는 확산에 의한 기체 교환이 보통 충분하다. 더 두꺼운 세포 팩들은 능동 통기 및/또는 추가적인 공기 채널들의 도입이 필요할 수 있다. 이러한 측면에서, 현탁 세포들이 실제로 모든 사용자 정의 형태로 캐스팅될 수 있으므로, 본 발명은 독특한 솔루션들을 제공한다.

바람직한 구현예에 따르면, 원하는 산물은 내인성(즉 천연) 및 이종성 단백질들 또는 폴리펩티드들, 이차 대사물질들, 마커들, 및 분석/진단 결과물들로 구성된 군으로부터 선택된다.

관심 유전자들에는 스스로가 천연 약제들, 예컨대 약학 또는 수의학 제품들인 단백질들을 인코딩하는 것들이 포함된다.

이종성 핵산들은 특히 박테리아, 진균, 식물, 비식물 또는 동물 기원의 유전자들을 인코딩할 수 있다. 본 발명의 공정에서 생산될 수 있는 단백질들에는 이종이량체들, 예컨대 FSH, 면역글로불린들, 융합 항체들, 단일쇄 항체들 및 다른 항체 형태들 또는 유도체들이 포함된다.

이러한 단백질들에는 망막모세포종 단백질, p53, 안지오스타틴, 및 렙틴이 비제한적으로 포함된다. 마찬가지로 본 발명의 방법들은 포유류 조절 단백질들을 생산하는데 사용될 수 있다. 다른 관심 서열들에는 단백질들, 호르몬들, 예컨대 여포 자극 호르몬, 성장 인자들, 시토카인들, 혈청 알부민, 헤모글로빈, 콜라겐, 타우마틴, 타우마틴 유사 단백질들, 표피 성장 인자들, 예컨대 VEGF, 인슐린, 단량체성 또는 이량체성 또는 분비성 면역글로불린 A, 트랜스페린 또는 트랜스페린 융합 단백질들, 및 수용체들, 예컨대 CD16, CD32, CD64, CD89, 신생아 Fc-수용체가 포함된다.

당분야 숙련자에게 인지될 바와 같이, 본 발명은 매우 다양한 원하는 산물들, 예컨대 약학적으로 중요한 (재조합) 단백질들(예로, 백신들, 항체들, 치료 효소들, 알레르기원들 및 저자극알레르기원들, 항미생물 펩티드들, 구조 단백질들, 예컨대 생체적합성 코팅 재료들로 사용하기 위한 엘라스틴 및 콜라겐, 바이러스-유사 입자들, 단백질체들 등), 영양적 가치를 갖는 (재조합) 단백질들(식품 및 사료 첨가제들), 진단 용도들을 위한 (재조합) 단백질들(예로, 효소들, 항체들 및 조작 항체들, 다른 효소들 또는 형광 융합 단백질들, 양성 대조군들로 사용될 항원들, 단백질 어레이들을 위한 결합 리간드들) 및 기술적으로 중요한 (재조합) 단백질들(예로, 친화도 흡착제들을 위한 결합 리간드들, 고가치 효소들, 생체촉매들)을 포함하는 단백질들 및 폴리펩티드들의 생산을 가능케 한다.

따라서 본 발명은 또한 바람직하게는 천연 또는 이종성 단백질들 또는 폴리펩티드들, 이차 대사물질들, 마커들, 및 분석/진단 결과물들로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 원하는 산물의 생산 방법을 제공한다. 본 방법은 식물 세포 현탁 배양물로부터 밀도가 0.1 내지 0.9, 바람직하게는 0.2 내지 0.85, 가장 바람직하게는 0.4 내지 0.8g의 습식 세포 중량/cm³인, 배지가 제거된 다공성 구조 및 비조직 다층 세포 팩의 생성, 원하는 산물의 생산을 유도하거나 변경하기 적합한 세포 팩으로의 용액, 현탁액 및/또는 기체의 적용, 필요한 경우 세포 팩 밀도의 상기 나타낸 범위 내로의 조정, 그리고 세포 팩이 원하는 산물을 생산하고 축적할 수 있도록 세포 팩을 상대 습도 50 내지 100% 하에 배양하는 것을 포함한다. 선택적으로, 본 방법은 세포 팩에 포함되는 생산 세포들로부터 축적된 원하는 산물을 수확 또는 단리하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명의 세포 팩 기반 시스템은 또한 분자 진화, 단백질 조작, 대사 조작 및 합성 생물학 적용들을 위한 스크리닝 플랫폼으로 적합하며, 무엇보다도 사용되거나 사용되기 위한 유전자 발현 카세트들, 플라스미드들의 최적화를 가능케 한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 세포 팩들을 사용함으로써, 본 발명은 고처리량, 고재현성 및 자동화 가능 방식으로 유전자 발현 구축물들 및 조작된 표적 단백질들을 평가하기 위한 분석 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 그리고 상기 언급된 바와 같이, 이들 적용들의 표적은 두 번째 배양 기간 동안 '수확되는' 원하는 산물들을 그대로 나타내는 정보 및 결과들을 수집하는 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 관련 효소들의 일시적 발현을 통해 번역 후 단백질 개질들의 조작을 제공하며, 이에 따라 예로 당단백질들의 당화 패턴의 개질을 가능케 한다. 또한, 내인성 효소들은 산물 품질 및 양에 영향을 미치기 위해 침묵화(예로 글리코실트랜스퍼라아제들, 프로테아제들, 유비퀴틴 리가아제들)를 통해 녹아웃될 수 있다.

또한, 본 발명은 관련 경로 효소들 및/또는 이들의 전사 인자들의 일시적 발현을 통해 원하는 산물들로서 이차 대사물질들의 생산을 제공한다. 생화학적 경로들도 대응 효소들의 침묵화를 통해 경쟁 경로들 및/또는 이화작용을 차단함으로써 조작될 수 있다. 마찬가지로 본 발명에 따른 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 세포 팩들의 생성 및 배양에 의해 유전적으로 개질되지 않은 (천연) 세포 배양물들로부터의 개선된 대사물질 생산에 매우 적합하다. 궁극적으로, 본 발명은 또한 대응 유도제의 존재 하에 유도성 프로모터 및/또는 항상성 프로모터를 수반하는 유전자삽입 현탁 세포주로부터 생성되는 세포 팩을 배양하는데 사용될 수 있다.

일반적으로 말해서 이종성 핵산들은 당분야에서 이용되는 임의의 적절한 절차에 의해 발현되거나 또는 이들은 하기와 같이 전사 또는 발현될 수 있다:

(i) 예로 관심 이종성 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 '네이키드' DNA의 일시적 발현;

(ii) 발현 벡터, 예컨대 복제 벡터로부터의 발현. 일반적으로 말해서 당분야 숙련자들은 일시적 재조합 유전자 발현을 위해 벡터들을 구축하고 프로토콜들을 디자인할 수 있다. 적절한 바에 따라 프로모터 서열들, 종료자 단편들, 폴리아데닐화 서열들, 인핸서 서열들, 마커 유전자들 및 다른 서열들을 포함하는 적절한 조절 서열들을 함유하는 적합한 벡터들이 선택되거나 구축될 수 있다. 추가 상세내용들에 대해서는, 예를 들어 [Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook 등, l989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 또는 Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel 등 eds., John Wiley & Sons, 1992]를 참고하라;

(iii) 비삽입 벡터로부터의 발현;

(iv) 전달된 T-DNA로부터의 발현.

예를 들어 비삽입 벡터는 또한 발현 벡터일 수 있는 등, 이들 범주들이 상호 배타적인 것이 아님이 이해될 것이다.

이러한 발현을 달성하기 위한 방법들은 본원에서 다른 곳에서 논의된다.

구축물(constructs)들은 구축물이 게놈 내로 삽입된 안정한 형질변환체를 선택할 때 일어날 수 있는 내재적인 온건한 효과 없이 강한 프로모터들을 이용해서 상대적으로 높은 카피수로 도입될 수 있다. 그 결과, 생산되는 단백질의 수준들 및 농도들은 선행 기술의 식물 세포 기반 시스템들(유전자삽입 현탁 배양물들 또는 현탁액 중 일시적 발현)에서 단백질 생산을 위한 방법들을 이용하여 수득될 수 있는 것보다 훨씬 더 높을 수 있다.

따라서 본 발명의 하나의 측면에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 도입된 핵산 구축물로부터 전사에 의해 생성되는 표적 단백질을 인코딩하는 mRNA를 생성할 수 있는 일시적으로 형질변환된 식물 세포의 사용이 개시된다.

따라서 "도입된 핵산"에는 보통 상기 DNA 서열의 안정적인 삽입유전자 발현에 연관된 단백질 생산 수준에 비해 상승된 수준으로 세포외 단백질 생산을 일으킬 수 있는 구축물 형태로 제공되는 DNA 서열로서의 이종성 핵산 서열이 포함될 것이다.

따라서 본 발명의 바람직한 측면에서, 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 첫 번째 핵산 서열을 표적 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물 세포 팩 내에서 이종성 뉴클레오티드 서열의 발현 달성 방법이 개시된다.

하나의 구현예에서, 하기 단계들을 포함하는, 적어도 세포외 이종성 단백질을 생성하는 방법이 제공된다:

(i) 세포 팩에 포함되는 표적 세포 내로 이종성 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 첫 번째 핵산을 일시적으로 도입하는 단계,

(ii) 적절한 배양 조건들을 제공함으로써 핵산으로부터 일정 시기에 걸쳐 이종성 단백질의 발현을 유도하거나 허용하는 단계,

(iii) 생산 세포들로부터 축적된 이종성 단백질을 수확하는 단계.

단리는 완전히 종래 수단에 의할 수 있고, 부분 또는 전체 정제를 수반할 수도 수반하지 않을 수도 있다.

세포 팩 배양을 위한 시기는 세포 재료가 생활성으로 유지되는 임의 시기까지 또는 그 이상이거나, 또는 이것이 산물로 포화될 때까지일 수 있다; 일반적으로 약 1 내지 10일, 보다 바람직하게는 약 1 내지 6일인 것이 바람직할 수 있다.

자연적으로 당분야 숙련자들은 둘 이상의 유전자가 구축물에서 또는 각각의 구축물에서 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 복수의 벡터들(각각 선택한 이종성 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열들을 포함함)이 본원 또는 다른 곳에 기재된 바와 같이 표적 세포들 내로 도입될 수 있다. 이는, 예로 효소의 다중 서브유닛들 또는 예로 생화학적 경로의 다중 효소들을 생산하는데 유용할 수 있다. 이는 또한, 예로 siRNA 매개 유전자 침묵화를 통한 내인성 유전자들의 동시적 녹다운 및/또는 산물의 번역 후 개질 및/또는 마커들의 발현 및/또는 동일하거나 상이한 유형들의 다중 산물들의 생산을 위한 이종성 효소들의 녹인(knock-in)에 유용할 수 있다.

하기 실시예들에 나타낸 바와 같이, 이러한 방식으로 도입되는 경우 이종성 서열의 일시적 발현은 채용되는 정확한 방법들 및 재료들에 따라 일반적으로 수일이 될 두 번째 인큐베이션 기간에 걸쳐 높은 수준의 표적 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법들을 이용함으로써, 이종성 폴리펩티드 축적이 달성된다.

따라서 세포 팩에 포함되는 세포들에서의 일시적 발현은 이전에는 부적합한 것으로 간주될 수 있던, 예로 불안정한 발현, 즉 생산 세포들 내에서 축적되는 일시적으로 발현되는 이종성 단백질 또는 폴리펩티드 서열들에 의존할 수 있는 여러 맥락들에서 유용한 도구를 나타낸다.

본 방법은 고수준의 발현이 필요하지만 바이러스 구축물들(식물 '감염'에 필요) 또는 안정한 유전자삽입 식물들이 바람직하지 않은 적용들, 예로 신속한 분석이 중요한 경우 또는 해당 서열이 치명적이거나 바람직하지 못한 표현형을 부여하는 경우의 적용들에서 특히 바람직할 수 있다.

리포터는 임의의 검출 가능한 단백질, 예컨대 GUS와 같이 당분야에서 일반적으로 사용되는 마커 유전자, GFP 또는 DsRed와 같은 형광 단백질들, 루시퍼라아제 등일 수 있다. 바람직하게는 리포터는 비침습성 마커, 예컨대 DsRed 또는 루시퍼라아제이다. 본 발명의 추가 측면에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 수득되거나 수득될 수 있는 배지가 제거된 비조직 다층 세포 팩의 형태의 식물 세포 재료는 분석 목적들을 위해 사용된다. 예를 들어, 세포 팩에 포함되는 세포들은 분석될 물질의 존재 하에 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 스크리닝 가능한 마커 유전자(GFP, DsRed, 루시퍼라아제, GUS, 분비된 알칼리성 포스파타아제, 또는 세포내 검출 가능한 화합물을 생산할 수 있는 효소)를 함유하는 유전자삽입 현탁 세포주에서 생성된 세포 팩이 시험 표본들에서 유도제를 검출하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 유도성 리포터 유전자 발현 구축물은 또한 첫 번째 단계에서 야생형(비유전자삽입) 현탁 세포주에서 생성되는 세포 팩 내로 형질변환될 수 있고, 이어서 시험 표본들이 두 번째 단계에서 분석된다. 바람직하게는 1-5일의 인큐베이션 시간이 2 단계들 사이에 수행된다. 이어서 적합한 부피의 액체 시험 표본 또는 비액체 시험 표본의 액체 추출물이 팩화된 세포에 적용된다. 그 단계에서 적절한 비의 시험 표본의 부피 및 세포 팩의 중량을 이용함으로써 또는 적합한 접촉 시간 후 시험 표본의 과량 액체를 제거함으로써 세포 팩의 다공성 구조를 유지하도록 하는 것이 중요하다. 적합한 접촉 시간들은 1분 내지 2h, 바람직하게는 5분 내지 1h, 보다 바람직하게는 10 내지 30분이다. 액체 시험 표본들의 적합한 부피들은 최대 0.75ml/세포 팩g, 바람직하게는 0.5ml/세포 팩g, 보다 바람직하게는 0.4ml/세포 팩g이다.

유도성 프로모터들의 예들에는 에스트로겐-, 에탄올-, 당-유도성 프로모터가 비제한적으로 포함된다. 당분야 숙련자들은 또한 억제물질들 및 억제를 이용하는 유전 회로들이 마찬가지로 사용될 수 있음을 이해한다. 예를 들어, tet-억제물질로의 테트라사이클린의 결합은 테트라사이클린 프로모터의 억제로 이어진다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 조작의 용이성, 높은 형질변환 효율 및 세포 팩의 세포들 내로 핵산들 및/또는 화합물들을 전달하기 위한 여러 가능성들로 인해 재조합 사건들의 연구 및 최적화에 매우 유용한 방법들을 제공한다.

당분야 숙련자에게 인지될 바와 같이, 본 발명에 따른 세포 팩은 잎 기반 일시적 시스템들, 액체 배양물 중의 일시적 시스템들, 야생형 및/또는 안정한 유전자삽입 현탁 배양 및 야생형 및/또는 유전자삽입 전체 식물들 또는 이들의 일부들의 사용에 비해 더 우수하다.

본 발명과는 대조적으로, 잎 기반 일시적 발현 시스템들은 상이한 세포 유형들로 구성된(이종성) 분화된 식물 조직을 채용하는 반면, 현탁 세포들은 탈분화 또는 미분화된 것으로 알려져 있다. 잎-기반 시스템들에 비해, 본 발명은 하기 장점들을 제공한다:

·생물질 생산을 위해 공간을 소비하는 성장 설비들이 필요하지 않음;

·외부 기후 조건들과 무관함;

·식물 병원체 감염 위험이 없음;

·고도의 동종성 생물질을 다량으로 신속히 공급 - 이는 약학 산물들을 위해 특히 중요함(규제 우려들이 감소됨);

·생물질 수확이 훨씬 더 쉬움(특수 수확 설비가 필요 없음);

·더 낮은 부피-생물질 비로 인해 동결 및/또는 건조 보존이 더 쉬움;

·생물질 가공이 더 쉽고 산물 정제가 더 쉬움(리그닌, 섬유들, 숙주 단백질들, 염료들이 더 적음);

·생물질이 고도로 조절되는 무균 조건들 하에 생산됨(규제 우려들이 감소됨);

·전체 식물들에 대비한 속도 장점, 생물질의 용이한 스케일 업(0.1ℓ 초기 배양물은 15일 내에 1000ℓ 현탁 배양에서 100kg의 생물질을 제공하도록 스케일 업될 수 있음; 5d 2.5ℓ→5d 50ℓ→5d 1000ℓ);

·더 우수한 공간-시간 수율들/공간 활용(생물질/m²; 생산 및 인큐베이션에 보통 조명이 필요 없어서 조밀한 세포 팩들의 적층을 허용함);

·동량의 생물질을 감염시키는데 더 적은 부피의 생물학적 벡터 현탁액들이 필요함(탱크 침윤들에 비해 더 적은 "노폐물");

·잎- 및 식물-기반 방법들에 비해 완전 봉쇄의 시행이 더 쉬움;

·"세포 팩" 방법을 이용한 박테리아 또는 바이러스들의 적용이 더 쉬움;

·개별 세포에서 유발되는 원치 않는 전사 후 침묵화가 세포 간교에 의해 연결된 소수의 인접 세포들에만 국한되며, 전체적으로 퍼지지 않음;

·추가적인 화학적 화합물들(예로, 대사물질 생산을 위한 유발제들, 유도제들, 호르몬들 또는 전구체들)이 더 쉽고 더 경제적으로 적용될 수 있음;

·팩화된 세포들로부터 분비된 단백질들만 용출하는 것이 가능함(더 적은 숙주 단백질들, 완전 가공된 분비 단백질들에만 접근);

·봉쇄로 인해 유해 산물들도 생산될 수 있음(높은 생체안전성 수준);

·고처리량 스크리닝이 가능함(멀티웰 필터 플레이트들);

·더 유연한 사용자 정의 크기들 및 형태들이 구현될 수 있음;

·자동화가 더 용이함;

·고처리량 스크리닝 및 실험 설계 접근들을 가능케 하는, 식물 병원체들 또는 다른 유기체들의 표준화 성장 분석들에 사용될 수 있는 고도의 동종성 식물 세포 재료;

·단일 포맷으로 동시적으로 및/또는 순차적으로 상이한 방법들, 기술들 및 조작 단계들을 쉽게 조합할 수 있음.

액체 배양에서의 일시적 시스템들에 대비한 장점들은 다음과 같이 요약될 수 있다:

·바이오리액터들 중(진탕 플라스크들 또는 발효기들 중) 현탁 배양물들 또는 고체 배지 상에 성장시킨 캘러스들에 비해 일시적으로 전달된 삽입유전자의 발현 증가;

·식물 세포들의 과성장을 배제하기 위해 박테리아 성장을 조절 또는 억제할 필요 없음(항생제들, 영양요구체 균주들);

·"세포 팩들"의 사용은 바이오리액터-현탁액에 비해 더 높은 아그로박테리움들 대 식물 세포 비를 허용함;

·세포 팩의 세포들은 교반되지 않으므로, 보다 친밀한 벡터 대 세포 접촉이 달성되며 전단이 없음;

·두 번째 배양 상 또는 기간에 고도로 농축된 생물질로 인해, 고가의 화합물들이 더 적은 양으로 필요함(예로, 대사물질 생산 등을 위한 유도제들(아세토시링곤), 호르몬들, 전구체들);

·두 번째 배양상은 식물 세포들의 생산에 이용되는 바이오리액터 외부에서 일어남. 이것은, 예로 현탁 세포들의 일정 공급을 보장하기 위한 첫 번째 배양상에서 연속 발효 전략들의 이용을 가능케 한다. 이는 상대적으로 고가인 바이오리액터의 더 우수하고 더 경제적인 활용을 야기하며 더 높은 용량들을 구현한다;

·세포 팩의 다공성 구조로 인해, 산소 공급의 제한이 덜 결정적임.

유전자삽입 식물들의 이용에 비해, 본 발명에 따른 시스템은 원하는 산물을 보다 신속히 회수할 수 있도록 하며 먹이 사슬을 뒤섞지 않도록 하면서 환경적 우려들이나 위험들이 없이 완벽한 봉쇄를 제공한다.

안정한 유전자삽입 현탁 세포들의 이용에 비해, 본 발명은 유전자로부터 산물까지 더 높은 속도, 더 높은 생산성을 제공하며, 안정적으로 형질변환된 세포주의 재생을 방해할 수 있는 독성 산물들의 생산을 가능케 한다.

이제 본 발명은 하기 비제한적 도면들 및 실시예들을 참조로 더 기재될 것이다. 본 발명의 다른 구현예들은 이들의 견지에서 당분야 숙련자들에게 얻어질 것이다.

도면들의 간략한 설명

도 1은 상이한 표적화 신호들을 갖는 상이한 형광 단백질들의 서열들을 함유하는 pTRA, pUTA 및 TRBO 시리즈들에 기반을 둔 발현 벡터들로부터의 T-DNA들을 나타낸다. (A) 분비된 DsRed의 발현을 위한 pTRAc rfp-AH, (B) ER-보유된 DsRed의 발현을 위한 pTRAc rfp-ERH, (C) 세포질 DsRed의 발현을 위한 pTRAc rfp-H, (D) 색소체 표적화된 DsRed의 발현을 위한 pTRAc rTPrfp-H, (E) 단백질체 표적화된 DsRed의 발현을 위한 pTRAkc glyDS-zenH, (F) 색소체 표적화된 GFP의 발현을 위한 pTRAc rTPgfp, (G) 색소체 표적화된 DsRed의 발현을 위한 pUTA TPrfp, (H) 담배 모자이크 바이러스 복제단위를 이용한 세포질 GFP의 발현을 위한 TRBO-G. pTRA의 벡터 골격은 pPAM(GenBank AY027531)에 기반을 둔다. pUTA의 벡터 골격은 RK2 ori로부터의 숙주 균주와 독립적인 플라스미드 복제를 위한 복제 개시 단백질 trfA를 함유한다. TRBO의 골격은 pCB301(GenBank AF139061)에서 유래한다. LB 및 RB, T-DNA의 좌측 및 우측 경계; SAR, 골격 부착 영역; P 및 pA, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 유전자의 이중 복사된 인핸서 및 종료자를 갖는 35S-프로모터; CHS, 칼콘 합성효소 유전자(P. 호르텐스)의 5' UTR; TL, 담배 에치 바이러스(TEV)의 5' UTR; SP, 쥐과 mAb24의 코돈 최적화된 신호 펩티드; TP, H. 불가레의 GBSSI의 이동 펩티드; rTP, S. 투베로섬의 GBSSI의 이동 펩티드; DsRed, 디스코소마 종으로부터의 적색 형광 단백질; glyDs, N-글리코실화 부위를 갖는 DsRed 변이체; zen, 제아 메이스의 감마-제인의 N-말단; GFP, 애쿠오레아 빅토리아의 녹색 형광 단백질(S65C 돌연변이체, 사이클 3 돌연변이체); RK2 ori, 광범위한 숙주 범위의 복제 ori; bla, 베타-락타마아제 유전자; ColE1 ori, 복제 ori(대장균); His6, 히스티딘 태그; KDEL, ER-보유 태그; RBS, 리보솜 결합 부위; Pnos 및 pAnos, 노팔린 합성효소의 프로모터 및 종료자; npt II, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자; 레플리카아제, 담배 모자이크 바이러스(TMV) 126K/183K 단백질; MP, TMV 이동 단백질; Rib, 리보자임.

도 2는 상이한 항체들의 서열들을 함유하는 pTRA 시리즈의 발현 벡터들의 T-DNA 영역들을 나타낸다. (A) 2G12 항체 중쇄, 2G12 항체 경쇄 및 색소체 표적화된 DsRed의 공동 발현을 위한 pTRAp 2G12F-Ds; (B) ER-보유 2G12 항체 중쇄, ER-보유 2G12 항체 경쇄 및 색소체 표적화된 DsRed의 공동 발현을 위한 pTRAp 2G12F-Ds; (C) M12 항체 중쇄, M12 항체 경쇄 및 ER-보유된 DsRed의 공동 발현을 위한 pTRAk MTAD. SPg, 인간 Ig 감마 사슬의 신호 펩티드; 2G12HC, 인간 항-HIV-1 gp120 Ig 2G12 감마 중쇄; SPk, 인간 Ig 카파 사슬의 신호 펩티드; 2G12LCF, 인간 항-HIV-1 gp120 Ig 2G12 카파 경쇄; pat, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제; M12HC, 인간 Ig M12 감마 중쇄; M12LC, 인간 Ig M12 람다 경쇄(도 1도 참고).

도 3은 상이한 표적화 신호들을 갖는 트립토판 데카르복실라아제의 서열들을 함유하는 pSS 시리즈에 기반을 두는 발현 벡터들의 T-DNA를 나타낸다(S. Di Fiore 등, "Targeting tryptophane decarboxylase to selected subcellular compartments of tobacco plants affects enzyme stability and in vivo function and leads to a lesion-mimic phenotype", Plant Physiol 129: 1160-1169, 2002). 벡터 골격은 pPCV002에서 유래된다. (A) 세포질 트립토판 데카르복실라아제(TDC)의 발현을 위한 pT-CYT; (B) 색소체 표적화된 TDC의 발현을 위한 pT-CHL. Ω, 담배 모자이크 바이러스의 5' UTR; 태그들, c-myc/His6 태그들; pAocs, 옥토핀 합성효소의 종료자(도 1, 2도 참고).

도 4는 플라스모디움 팔시파룸 3D7 낭충 표면 단백질 1(GenBank XM_001352134)의 단편을 함유하는 발현 pTRAkc Msp1(383319)ERH-Ds의 T-DNA를 나타낸다.

도 5는 백색 광(A) 및 DsRed 형광의 가시화를 위한 녹색 여기 광(B) 하의 색소체 표적화된 적색 형광 단백질(DsRed)에 대한 발현 카세트 및 인간 항체(2G12)의 중쇄 및 경쇄에 대한 발현 카세트들을 함유하는 아그로박테리움을 이용한 감염 5일 후 BY-2 세포들의 거시적 사진들을 나타낸다. 상부: 침윤된 "세포 팩". 저부: 최종 OD 0.05(좌측) 및 최종 OD 0.1(우측)에서 아그로박테리움과의 공동 배양으로부터의 수확된 현탁 세포들.

도 6은 백색 광(A, B) 및 DsRed 형광의 가시화를 위한 녹색 여기 광(C, D) 하의 색소체 표적화된 적색 형광 단백질(DsRed)에 대한 발현 카세트 및 인간 항체(2G12)의 중쇄 및 경쇄에 대한 발현 카세트들을 함유하는 아그로박테리움을 이용한 감염 5일 후 BY-2 세포들의 대표적 미시적 사진들을 나타낸다. 아그로-감염된 "세포 팩"으로부터의 세포들(A, C). 최종 OD 0.1에서 아그로박테리움과의 공동 배양으로부터의 수확된 현탁 세포들(B, D).

도 7은 백색 광(A) 및 DsRed 형광의 가시화를 위한 녹색 여기 광(B) 하의 색소체 표적화된 DsRed에 대한 발현 카세트 및 플라스모디움 팔시파룸 Msp1 단편(p38-p33-p19)에 대한 발현 카세트를 함유하는 아그로박테리움들을 이용한 감염 6일 후 BY-2 세포 팩들의 사진들을 나타낸다. 상이한 광학 밀도들(1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625)을 페트리 접시에 나타낸다(A). (C)는 도트 블롯을 통한 플라스모디움 팔시파룸으로부터의 Msp1-p19의 면역검출을 나타낸다.

도 8은 백색 광(A) 하에, GFP 필터 세트를 이용하여(B) 그리고 DsRed 필터 세트를 이용하여(C) 상이한 아그로박테리움 균주들을 세포들 상에 도트화한 4일 후 편평한 BY-2 세포 팩의 사진들을 나타낸다. (1-3) pTRBO-G로 형질변환된 EHA105 아그로박테리움들의 세 클론들, (4-6) pTRBO-G로 형질변환된 GV2260 아그로박테리움들의 세 클론들, (7) pUTA-TPrfp를 함유하는 EHA105, (8) pUTA-TPrfp를 함유하는 GV3101::pMP90RK 및 pTRA-rTPgfp를 함유하는 (+)양성 대조군 GV3101::pMP90RK.

도 9는 아그로-감염 5일 후 세포 팩들에서 상이하게 표적화된 형광 단백질들의 축적을 나타낸다. 마이크로 컬럼들 중 0.3g의 새로운 중량의 세포 팩들(A) 및 14ml 컬럼들 중 3g의 세포 팩들(B)이 일시적으로 형질변환되었다. (1) 색소체 표적화된 GFP, (2) 비형질변환된 세포들, (3) 분비된 DsRed, (4) ER-보유된 DsRed, (5) 세포질 DsRed, (6) 색소체 표적화된 DsRed, (7) 단백질체 표적화된 DsRed, (8) ER-보유된 DsRed 및 색소체 표적화된 GFP를 이용한 공동 형질변환. 사진들은 백색 광(좌측) 하에, DsRed 필터 세트를 이용해서(중앙) 그리고 GFP 필터 세트를 이용해서(우측) 찍었다. DsRed의 추출량은 (C)에 나타낸다.

도 10은 일시적으로 DsRed를 발현하는 상이한 치수들의 컬럼들 중 BY-2 세포 팩들의 사진들을 나타낸다. (A) 백색 광 하, (B) DsRed 필터 세트를 이용.

도 11은 각각 일시적으로 발현된 DsRed 및 2G12의 발현에 대한 통기 조건들의 영향을 나타낸다. (A, B) 컬럼들 중 상이하게 통기된 세포 팩들의 사진들을 (A) 백색 광 하에, (B) DsRed 필터 세트를 이용하여 나타낸다. (C)는 아그로 감염 140시간 후 컬럼 팩화된 BY-2 세포들에서 DsRed 및 2G12의 축적 수준들을 나타낸다. 세포 팩들의 중량 손실을 도표에서 아래에 나타낸다.

도 12는 유전자삽입 아그로박테리움을 이용한 침윤 5일 후 컬럼 팩화된 세포들의 총 추출물들 및 용출액들의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔들을 나타낸다. (A) DsRed를 형성하는 단백질체(대조군) 또는 분비된 M12 항체에 대한 발현 구축물들로의 감염. (B) 분비된 또는 ER-보유된 DsRed에 대한 발현 구축물들로의 감염. 겔들 상의 추출물 표본들은 대략 10mg의 새로운 세포 중량(FCW)에 해당하며, 겔들 상의 용출액 표본들은 대략 20mg의 FCW로부터의 용출액들에 해당한다.

도 13은 상이하게 표적화된 트립토판 데카르복실라아제 또는 GFP를 이용한 아그로 감염 후 상이한 시점들에서의 일시적으로 형질변환된 팩화 세포들에서의 트립타민 축적을 나타낸다. 추가적인 트립토판(trp)을 아그로 감염 18h 후에 첨가하였다.

도 14는 분비된 DsRed(rAH) 또는 ER-보유된 DsRed(rERH)에 대한 식물 발현 벡터들을 함유하는 아그로박테리움들을 이용한 침윤 4일 후 상이하게 사전 배양된 현탁 배양물들로부터 생성된 카타란투스 로세우스 세포 팩들의 사진들을 나타낸다. 사진들은 백색 광 하에(A) DsRed 필터 세트를 이용하여(B) 찍었다. 현탁 세포들은 각각 MS67 배지 또는 BY-2 배지 중에 성장시켰다.

도 15는 상이한 아스퍼르길러스 종들의 포자들이 팩 상에 스폿팅된 11일 후 BY-2 세포 팩의 사진을 나타낸다. (A) A. 나이거, (B) A. 니둘란스, (C) A. 플라부스, (D) A. 파라시티쿠스.

도 16은 5일령의 BY-2 야생형 현탁 배양물에서 생성된 4일령 컬럼 팩화 세포들의 용출액(1) 및 대응하는 9일령의 BY-2 야생형 현탁 배양물의 배양 배지(2)의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.

실시예 1

세포 팩들에서의 일시적 발현과 현탁액에서의 일시적 발현의 비교

본 발명에 따른 세포 팩 중에서의 일시적 재조합 단백질 생산을 평가하기 위해, 아그로박테리움-침윤된 세포 팩 중 DsRed 및 항체 2G12의 일시적 발현을 액체 배양 중 아그로박테리움을 이용한 공동 배양 현탁 세포들의 선행 기술 방법과 비교하였다.

인간 항체(2G12)의 중쇄 및 경쇄에 대한 발현 카세트들 및 색소체 표적화된 적색 형광 단백질(DsRed)에 대한 발현 카세트를 동일한 T-DNA 상에 함유하는 이원성 벡터 pTRAp-2G12FER-Ds를 보유하는 재조합 아그로박테리움(균주 GV3101::pMP90RK)을 이용하였다. 두 2G12 유전자들은 항체의 ER-보유를 위한 KDEL 서열을 함유한다(도 2B). 항체 분비를 배제하기 위해 KDEL 서열을 의도적으로 사용하여 세포 팩 및 현탁 세포들의 생산성을 직접 비교할 수 있도록 하였다.

일시적 형질변환을 위한 아그로박테리움 균주들을 하기와 같이 제조하였다. 글리세롤 스톡들로부터 50㎕를 5ml YEB-배지(5g/l 소 추출물, 1g/l 효모 추출물, 5g/l 펩톤, 0.5g/l MgSO₄, pH 7.4, 50mg/l 카르베니실린 및 25mg/l 카나마이신이 보강됨) 중에 접종하여 배양들을 개시하였다. 박테리아 배양물들을 광학 밀도(OD) 약 5까지 3일 동안 26℃에서 성장시켰다. 박테리아를 원심분리에 의해 펠렛화하고 침윤 배지(50g/l 수크로오스, 2g/l 글루코오스, 0.5g/l Ferty® 2 Mega(Planta Duengemittel, Germany), pH 5.3, 200μM 아세토시링곤으로 보강됨)로 OD 1이 되도록 재현탁하였다. 이어서 박테리아 현탁액을 적용 전에 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

니코티아나 타바쿰 L. cv. 담황색 2의 세포들(BY-2)을 26℃의 회전 진탕기(180rpm) 상에서 암소에서 액체 배지(3% 수크로오스, 4.3g/l Murashige 및 Skoog 염들, 100mg/L 이노시톨, 1mg/L 티아민, 0.2mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산, 200mg/L KH₂PO₄, pH 5.6) 중에 배양하였다. 세포들을 4% 접종물들을 이용하여 새로운 배지 내로 매주 후속 배양하였다.

식물 세포들 및 아그로박테리움을 멸균 설비를 이용해서 무균 조건들 하에 취급하였다. 4일령의 400ml BY-2 현탁 배양물의 50ml 분취물을 5.5cm 지름의 셀룰로오스 필터(MN615)가 장착된 75ml Buechner 깔때기 내로 붓고 진공(1분 동안 약 500mbar)을 적용하여 배양 배지를 완전 제거하였다. 생성 세포 팩을 페트리 접시 내로 옮기고 새로운 세포 중량(FCW)을 결정하였다(중량 = 4.5g, 지름 = 5.5cm, 높이 = 0.3cm, 밀도 = 0.63 g/cm³). 이어서 OD 1의 2.5ml 아그로박테리움 현탁액(0.55ml/세포 팩g)을 세포 팩 상에 균일하게 적하하여 완전 침윤시켰다. 적용된 액체의 양은 세포 팩이 균일하게 수화되지만 완전 범람하지는 않아서 공극들의 빠른 회복이 가능하도록 조정하였다. 아그로 침윤된 세포 팩을 암소에서 26℃ 및 95% 상대 습도(RH)에서 5일 동안 배양하였다.

공동 배양을 위해 OD 1의 2.5ml 및 5ml 아그로박테리움 현탁액을 50ml BY-2 현탁 배양물에 첨가하여 세포 팩에서와 동일한 및 2배의 아그로박테리움-대-식물 세포비를 얻었다.

공동-배양 배양물들을 암소에서 26℃에서 180rpm으로 회전 진탕기 상에서 배양하였다. 공동 배양 배양물들로부터의 BY-2 세포들을 5일 후 진공 여과에 의해 수확하고, 생성 세포 팩들을 페트리 접시들로 옮겼다. 두 실험들로부터의 세포들을 녹색 여기 광 하에 DsRed 발현에 대한 적색 방출 필터를 통해 거시적으로 조사하였다(도 5). 본 발명에 따라 제조된 아그로 감염 세포 팩에서 적색 형광을 뚜렷이 볼 수 있었다. 놀랍게도 현탁액 중 아그로박테리움과 공동 배양된 세포들에서는 적색 형광을 볼 수 없었다. 세포들의 미시적 분석은 현탁액 중 공동 배양의 선행 기술 방법에 비해 본 발명에 따른 세포 팩 방법으로 세포 별로 더 높은 감염율과 더불어 더 높은 DsRed 발현이 달성되었음을 뚜렷이 나타내었다(도 6).

두 접근들로부터 가용성 단백질들을 추출하고, DsRed 및 항체 축적을 정량하였다. 간략하게, 세포들을 2 부피들(w/v)의 추출 완충액(50mM 칼륨 포스페이트, 500mM NaCl, 10mM 나트륨 비설페이트, pH 7.5) 중 초음파 분쇄(Bandelin, Sonopuls, 0.9s 간격, 40W, 2 x 30초)에 의해 균질화하였다. 세포 파편을 원심분리(15분, 13000g, 4℃)로 펠렛화하고, 투명 상청액을 추가 분석에 사용하였다. 추출된 가용성 단백질들의 형광(여기 530±12.5nm; 방출 590±17.5nm)을 측정하여 DsRed를 정량하였다. 항체 정량은 CM5 센서칩에 커플링된 단백질 A를 갖는 BIACORE™ T200 기구를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 분광측정에 의해([T. Holland 등, "Optimal nitrogen supply as a key to increased and sustained production of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspension culture", Biotechnol Bioeng 107: 278-289, 2010]에 기재된 바와 같이) 수행하였다.

공동 배양된 현탁 세포들에서 유래된 추출물들에서는 DsRed도 2G12 항체도 검출되지 않았다. 대조적으로 아그로-감염 세포 팩으로부터 유래된 추출물들은 55㎍ DsRed 및 47㎍ 2G12 항체를 FCWg 당 함유하였다.

상기 실시예는 본 발명에 따른 세포 팩을 이용함으로써 현탁 배양에 비해 실질적으로 더 높은 수율들의 재조합 단백질들이 세포 팩 중 재조합 아그로박테리움들과의 공동 배양 후 일시적 발현으로 달성될 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기 실시예는 세포 팩에서의 더 높은 생산성이 세포 내에서의 실질적으로 더 높은 형질변환 효율(전형적으로 50%-80%)뿐만 아니라 더 높은 산물 축적에 기인함을 뚜렷이 나타낸다.

실시예 2

세포 팩들에서의 플라스모디움 팔시파룸 항원들의 일시적 발현

세포 팩들이 말라리아 항원들의 생산을 위해 사용될 수 있는지를 시험하기 위해, 플라스모디움 팔시파룸의 상이한 단백질들을 일시적으로 생산하였다.

플라스모디움 팔시파룸으로부터의 Msp1의 ER-보유 카르복시 말단 단편(p38, p33 및 p19)에 대한 발현 카세트 및 색소체 표적화된 DsRed에 대한 두 번째 발현 카세트를 갖는 이원성 벡터를 함유하는 재조합 아그로박테리움 균주(도 4). 박테리아를 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시키고 제조하였다. 아그로박테리움 침윤 현탁액을 식물 세포들 감염 전에 OD 1에서 OD 0.0625로 연속 희석하였다.

3일령 BY-2 현탁 배양물을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포 팩을 생성하였다. 세포 팩을 대략 5mm x 5mm x 10mm의 조각들로 절단하였다(도 7A). 6개 조각들을 페트리 접시 내로 옮기고 포화하도록 상이한 광학 밀도들의 아그로박테리움 현탁액들로 액적 침윤시켰다(대략 150㎕/세포 팩). 음성 대조군은 침윤 배지만으로 침윤시켰다(도 7). 20℃ 및 95% RH에서 인큐베이션 6일 후, 팩 조각들을 DsRed 형광 및 항원 발현에 대해 분석하였다. DsRed를 녹색 여기 광 하에 적색 방출 필터를 통해 거시적으로 관찰하였다(도 7B). 플라스모디움 단백질의 검출을 위해, 가용성 단백질들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 추출하고, 각 추출물의 분취량을 니트로셀룰로오스 막 상에 도트화하였다. 플라스모디움 단백질의 존재는 p19 도메인에 대한 모노클로날 항체 5.2 및 AP-콘쥬게이션된 이차 항체를 이용한 면역검출 뒤 NBT/BCIP(니트로-블루 테트라졸리움/5-브로모-4-클로로-3'-인돌리포스페이트)와의 인큐베이션으로 가시화하였다.

강력한 DsRed 형광이 모든 감염된 세포 팩들에서 검출되었다(도 7B). OD 1의 아그로박테리움 농도로 침윤된 세포 팩들 및 10배 이상 희석된 OD 0.0625의 아그로박테리움 현탁액으로 침윤된 세포 팩들 간에는 약간의 형광 강도 차이만이 검출되었다. 모든 침윤된 세포 팩들에서의 공동 형질변환된 플라스모디움 단백질의 뚜렷한 면역학적 검출은 또한 아그로박테리움의 10배 희석을 반영하지 않았다(도 7C). 최고 축적 수준은 OD 1의 아그로박테리움 현탁액을 이용한 침윤으로 수득되었다.

추가 실험들에서, 플라스모디움 팔시파룸으로부터의 다른 단백질들(Pfsp25 단독 및 DsRed와 함께; 및 몇몇 상이한 말라리아 단백질들로부터의 도메인들로 구성된 또 다른 융합 단백질)이 상이한 BY-2 세포 팩 포맷들에서 성공적으로 발현되었다(데이터는 나타내지 않음). 상기 실시예는 세포 팩이 더 낮은 양의 아그로박테리움들로 침윤되는 경우에도 재조합 단백질 축적이 높음을 나타낸다. 따라서 본 발명은 특히 대규모 산업적 적용들에 중요한 보다 경제적인 생산을 위한 방법을 제공한다. 이는 또한 상이한 말라리아 단백질들이 효율적으로 발현 및 생산될 수 있고 개시된 방법이 일반적으로 말라리아 백신들 및 다른 감염성 질환들에 대한 백신들의 개발 및 생산에 적합함을 나타낸다.

실시예 3

스크리닝 용도들을 위한 세포 팩들의 이용

세포 팩들은 고도로 동종성이므로, 이들은 스크리닝 목적들을 위해서도 이상적이다. 따라서 본 실시예에서는 일시적 산물 축적에서 채용된 아그로박테리움 균주 및 상이한 발현 벡터들의 영향을 평가함으로써 이것을 나타내었다. 두 상이한 발현 벡터들이 사용되었다. 35S-프로모터 유도 색소체 표적화된 DsRed(도 1G)를 함유하는 이원성 벡터 pUTA-TPrfp, 및 피막 단백질 서열이 GFP로 대체된 담배 모자이크 바이러스(TMV)의 35S-프로모터 유도 cDNA를 함유하는 이원성 벡터 pTRBO-G(도 1H)(J.A. Lindbo, "TRBO: a high-efficiency tobaco mosaic virus RNA-based overexpression vector", Plant Phys 145: 1232-1240, 2007). 각각의 벡터를 두 상이한 아그로박테리움 균주들 내로 도입하였다. 표준 벡터 pUTA-TPrfp를 GV3101::pMP90RK 및 EHA105 내로; 바이러스 벡터 pTRBO-G를 GV2260 및 EHA105 내로 도입하였다(R. Helens 등, "A guide to Agrobacterium binary Ti vectors", TIBS 5: 446-451, 2000).

GV3101::pMP90RK 중 pTRA-rTPgfp를 양성 대조군으로 사용하였다(도 1F). GV-pUTA-TPrfp, EHA-pUTA-TPrfp 및 GV-pTRA-rTPgfp의 액체 배양물들을 글리세롤 스톡들로부터 개시하였다. GV-pTRBO-G 및 EHA-pTRBO-G 배양물들에 있어서, 플라스미드 DNA를 이용한 새로 만든 전자-형질변환으로 수득한 3개의 미확인 콜로니들을 각 균주에 대해 접종하였다. 아그로박테리움 균주들을 GV-pUTA-TPrfp, GV-pTRBO-G 및 GV-pTRA-rTPgfp에 대해 50mg/l 카르베니실린 및 25mg/l 카나마이신을 포함하여, EHA-pUTA-TPrfp에 대해 50mg/l 카르베니실린을 포함하여 그리고 EHA-pTRBO-G에 대해 25mg/l 카나마이신을 포함하여 표준 조건(실시예 1) 하에 배양하였다. 3일 후, 박테리아를 원심분리로 펠렛화하고, 침윤 배지로 OD 1이 되도록 재현탁하였다. 적용 전에 박테리아 현탁액들을 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 표준 조건들(실시예 1) 하에 배양한 5일령 BY-2 배양물 25ml을 이용하여 세포 팩(중량 = 4 g, 지름 = 5.5cm, 높이 = 0.3cm, 밀도 = 0.56g/cm³)을 생성하였다. 세포 팩을 페트리 접시에서 위 아래를 뒤집어 놓은 뒤 40㎕의 각각의 아그로박테리움 현탁액을 매끄러운 표면 상에 도트화하였다. 침윤된 세포 팩을 26℃에서 95% RH로 인큐베이션하였다. 4일 후, 세포 팩을 GFP 발현에 대해 청색 여기 광 하에 녹색 필터를 통해(도 8B) 그리고 DsRed 발현에 대해 녹색 여기 광 하에 적색 필터를 통해(도 8C) 조사하였다. 바이러스 벡터뿐만 아니라 표준 이원성 벡터의 형광 단백질 발현은 EHA105가 식물 세포들 내로 발현 구축물들을 전달하는데 이용되는 경우 확실히 덜 효율적이었다. 상기 결과는 컬럼들에 3g 세포 팩들을 감염시킴으로써 그리고 동일한 아그로박테리움 현탁액들로 니코티아나 벤타미아나 잎들의 일시적 형질변환에 의해 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 이 취급이 용이한 소규모의 "아그로-도트" 방법은 또한 표적 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있는 다른 파라미터(예로, 아그로박테리움들의 성장 조건들 및 전처리, 침윤된 세포 팩의 침윤 배지 조성 또는 배양 조건들)를 평가하는데 사용될 수 있다. 수백여 개의 표본들이 기술적 설비를 필요로 하지 않고 병렬 분석될 수 있으며, 400ml BY-2 배양물을 포함하는 1L 진탕 플라스크는 5일 내에 16배의 4g 세포 팩을 제공할 것이며, 11일령 400ml 배양물로부터 30개 세포 팩들이 생성될 수 있다.

실시예 4

컬럼들에서의 세포 팩들의 일시적 발현

세포 팩들을 컬럼들에서 생성하고, 침윤시키고, 유지할 수 있는지를 시험하기 위해, 몇몇 실험들을 수행하였다. 상기 실시예에서, 적색 형광 단백질 DsRed 및 녹색 형광 단백질 GFP의 상이하게 표적화된 형태들을 팩화 세포들의 컬럼 형태에서 일시적으로 발현하였다.

분비된 DsRed(도 1A), ER-보유된 DsRed(도 1B), 세포질 DsRed(도 1C), 색소체 표적화된 DsRed(도 1D), 단백질체 표적화된 DsRed(도 1E) 및 색소체 표적화된 GFP(도 1F)에 대한 이원성 발현 벡터들을 수반하는 상이한 아그로박테리움 균주들을 이용하였다. 아그로-감염을 위한 아그로박테리움 현탁액들은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 적용 전에 박테리아 현탁액들을 22℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 공동 감염 실험들에 있어서, OD 1의 두 아그로박테리움 균주들(각각 ER-보유된 DsRed 및 색소체 표적화된 GFP 함유)을 혼합하여 각 균주들에 대해 OD 0.5로 만들었다.

표준 조건들(실시예 1) 하에 배양된 11일령 BY-2 현탁 세포들을 두 상이한 유형들의 멸균 폴리프로필렌 컬럼들에서 세포 팩들을 생성하는데 사용하였다. 둘 다 20㎛ 폴리에틸렌 필터 프릿이 장착된 부피 0.7ml의 마이크로 스핀-컬럼들(Receiver 컬럼 20㎛, MACHEREY-NAGEL, Germany, 도 8A) 및 14ml 부피의 미디 컬럼들(QIAGEN-tip 100 컬럼, QIAGEN, Germany, 도 9B)을 이용하였다. 현탁 배양물을 진공에 연결된 컬럼 내로 부어 세포 팩들을 생성하였다. 배지를 진공 여과에 의해 완전 제거한 후, 생성 세포 팩의 치수들을 결정하였다. 1ml 현탁 배양물을 마이크로 컬럼들에 대해 사용하여 지름 0.68cm, 높이 1.5cm 및 밀도 0.54g/cm³을 갖는 0.3g 중량의 세포 팩을 얻었다. 미디 컬럼들에서 10ml 현탁액으로 생성된 세포 팩들은 중량 3g, 지름 1.4cm, 높이 3.6cm 및 밀도 0.54g/cm³였다.

아그로박테리움 현탁액을 세포 팩들 상에 피펫팅하여(1ml/세포 팩g) 세포 팩들을 컬럼에서 침윤시켰다. 완전 침윤을 달성하기 위해, 첫 번째 액적들이 컬럼을 떠날 때까지 그러나 세포 팩의 상부는 여전히 현탁액으로 덮여 있도록 짧게 진공을 걸었다. 침윤된 세포 팩들을 22℃에서 30분 동안 인큐베이션한 뒤, 공극들을 복구하기 위해 컬럼에 진공을 적용하여 잔여 액체를 완전히 제거하였다. 처리된 컬럼 팩화 세포들의 중량을 결정하여 적용된 액체의 제거를 조절하였다. 뒤따르는 인큐베이션 상 동안 세포들의 높은 생활성을 보장하기 위해, 세포 팩 또는 세포들에 의한 액체 흡수에 기인하는 중량 증가가 바람직하게는 예로 팩의 원래 새로운 세포 중량(FCW)의 15%를 초과해서는 안 된다. 세포 팩들을 26℃ 및 92% 상대 습도에서 컬럼에서 배양하였다. 아그로 감염 5일 후, 전체 가용성 단백질들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포 팩들로부터 추출하였다.

형광 단백질 발현은 모든 침윤된 세포 팩들에서 거시적으로 검출 가능하여(도 9) 세포 팩의 세포들의 상이한 구획들을 재조합 단백질 생산에 이용할 수 있음을 나타내었다. 세포 팩들은 동종성 형광을 나타내어 세포 팩의 각 영역으로의 아그로박테리움들의 효율적 전달을 시사하였다. 표적 구획에 따라 색소체 표적화된 DsRed에 대한 약 40㎍/FCWg 내지 세포질 DsRed에 대한 약 160㎍/FCWg 범위로 축적 수준들의 뚜렷한 차이가 관찰되었다(도 9C). 단백질체로 표적화된 DsRed는 생체 내에서 높은 형광을 나타내었지만, 단백질체들의 불용성으로 인해 추출할 수 없었다. DsRed 및 GFP의 동시적 발현(도 9A8 및 9B8)은 2개의 구분된 아그로박테리움 균주들을 이용한 공동 감염이 가능함을 나타내었다. 마이크로 컬럼들에서의 0.3g 또는 14ml 컬럼들에서의 3g의 세포 팩 크기는 발현 수준들에 영향을 미치지 않았다. 따라서 마이크로 세포 팩들은 스크리닝 및 분석 목적들을 위해, 예를 들어 대규모 생산을 위한 최적 파라미터들(예로 전 배양, 감염 및 공동 배양 조건들)을 결정하거나, 상이한 발현 구축물들을 평가하거나, 또는 대사 경로들을 개발 및 연구하는데 매우 유용함이 포함된다. 세포 팩들의 높은 동종성으로 인해, 이들은 통계적 설계들 및 다변수 실험들에 특히 유용하다. 고처리량 분석에 있어서, 자동화 시스템들과 호환되는 96웰 필터 플레이트들(예로, Receiver 플레이트 20㎛, Chromabond® MULTI 96 필터 플레이트, 둘 다 MACHEREY-NAGEL, Germany)을 이용할 수 있다. 이들 필터 플레이트들의 웰들은 상기 실시예에서 세포 팩들의 생성 및 침윤에 사용되는 마이크로 컬럼들과 유사하다. 현탁 배양물들에서의 고처리량 분석에 비해, 96웰 플레이트들에서의 마이크로 세포 팩들은 일시적 발현이 더 효율적이며(실시예 1 참고) 더 많은 생물질을 분석에 이용할 수 있다는 장점을 갖는다. 상기 이용된 컬럼들에 부가하여, 더 큰 컬럼들도 시험하였다(도 10). 70ml 컬럼(GenElute™ HP 플라스미드 미디프렙 키트 필터 주사기, SIGMA, USA) 중의 12g 세포 팩(2.8cm 지름, 3.5cm 높이), 및 150ml 컬럼(Chromabond® 폴리프로필렌 컬럼 150ml, MACHEREY-NAGEL, Germany) 중의 87g 세포 팩(3.7cm 지름, 11cm 높이)에서 아그로-감염 4일 후 DsRed 발현을 관찰하였다. 색소체 표적화된 DsRed에 대한 발현 구축물을 수반하는 아그로박테리움으로 침윤된 4일령 BY-2 현탁 배양물로부터 12g 세포 팩을 생성하였다(도 2B). ER-보유된 DsRed에 대한 발현 구축물을 수반하는 아그로박테리움으로 침윤된 11일령 배양물로부터 87g 세포 팩을 생성하였다(도 1B). 상술된 표준 절차들에 대한 유일한 차이는 87g 세포 팩을 OD 0.25의 아그로박테리움 현탁액으로 침윤시켰다는 것이었다. 세포 팩의 밀도 결정 및 공극들을 복구하기 위해 충분한 액체가 제거되었는지에 대한 확인은 중량 측정으로 달성하였다. 상이한 실험들은 또한 상이한 연령, 즉 후속 배양 후 일수의 세포들이 본 발명에 따른 세포 팩의 생성에 적합하다는 것을 나타내었다. 또한, 상이한 형태들 및 크기들의 세포 팩들도 가능하다. 상기 실시예는 멸균 및 봉쇄 조건들 하에 더 큰 세포 팩들도 형질변형하고 인큐베이션하는 것이 타당함을 나타낸다. 이는 일반적으로 멸균성이 아닌 잎 기반 시스템들과는 대조적이다.

실시예 5

일시적 단백질 생산에 대한 증가된 통기의 효과

형질변환된 팩화 세포들의 성능에 대한 통기의 영향을 조사하기 위해, 상이한 설정들을 시험하였다: (1) 능동 통기된 세포 팩, (2) 수동 통기된 세포 팩, (3) 중앙 공기 채널을 갖는 세포 팩, (4) 천공 컬럼 중의 세포 팩(도 11A).

이원성 벡터 pTRAp-2G12FER-Ds를 수반하는 아그로박테리움 균주(도 2B)를 실시예 1에 기재된 바와 같이 표준 조건들 하에 성장시키고 제조하였다.

표준 조건들 하에 성장시킨 4.5일령 BY-2 현탁 세포들을 사용하여 14ml 미디 컬럼들 중에 세포 팩들을 생성하였다(실시예 4). 실험들 1, 2, 4에서는 고체 세포 팩들을 생성하고, 천공 컬럼을 파라필름®으로 밀봉하였다. 실험 3에서는 지름 2.5mm의 플라스틱 스틱을 컬럼 중앙에 두었다. 세포 팩들은 지름들이 1.4cm 및 중량들이 2.1-2.5g, 높이들이 2.5-2.7cm 및 밀도들이 약 0.57 g/cm³이었다. 아그로박테리움 현탁액의 침윤 및 액체 제거 후(실시예 4), 컬럼 3의 스틱 및 컬럼 4의 파라필름® 밀봉을 제거하여 각각 중앙 공기 채널을 갖는 세포 팩 및 측면들로부터 추가적인 공기 공급을 갖는 세포 팩을 얻었다. 컬럼들을 26℃에서 92% RH의 인큐베이터에서 배양하였다. 컬럼 1을 공기 펌프로 연결하고, 26℃ 및 92% RH의 공기를 공급하는 인큐베이터 내부에 넣었다. 펌프의 용량은 50l/h였으며, 주기적 펌핑으로 설정하였다(15분 온, 45분 오프). 아그로-감염 6일 후, 세포 팩들의 중량을 결정하고 가용성 단백질들을 세포 팩들로부터 추출하여 DsRed 및 2G12 항체 발현에 대해 분석하였다(실시예 1에 기재된 바와 같이). 세포 팩들의 상이한 중량 손실로 인해, DsRed 및 항체 2G12의 양은 인큐베이터에서 배양 개시 시 FCW에 근거하여 계산하였다(도 11C). 결과들은 가압 통기(도 11C1) 또는 증가된 표면(도 11C4)으로 인한 증발에 기인하는 수분 손실이 팩화 세포들의 생산성에 부정적 영향을 미침을 나타낸다. 세포들에서 색소체 표적화된 DsRed의 축적뿐만 아니라 ER-보유 항체의 축적이 감소하여 20% 초과 중량 손실을 나타낸다. 따라서 세포 팩들의 건조를 최소화하는 배양 조건들을 이용해야 한다(예로, 상대 습도를 증가시키거나 또는 세포 팩들을 재수화함으로써). 반면, 결과들은 상기 치수에서 통기가 충분하며, 더 우수한 산소 공급 및 기체 교환을 위한 조치들은 필요하지 않음을 나타낸다.

실시예 6

팩화 세포들로부터 분비된 산물들의 비파괴적 수확

재조합 분비 단백질들이 세포들의 파괴 없이 용출될 수 있는지를 결정하기 위해, BY-2 현탁 세포들을 컬럼들 중에 팩화하고 아그로 감염을 통해 일시적으로 형질변환하였다. 분비성 모노클로날 항체 M12와 ER-보유된 DsRed(도 2C), 분비성 DsRed(도 1A), ER-보유된 DsRed(도 1B) 및 DsRed 형성 단백질체(도 1E)에 대한 발현 구축물들을 함유하는 상이한 아그로박테리움 균주들을 각각 실험에 이용하였다. M12 항체(150kDa) 및 DsRed(108 kDa)는 큰 분비 단백질에 대한 예들이다. ER-보유된 DsRed는 세포 내에 있으므로, 식물 세포들이 인큐베이션 또는 용출 동안 손상되는지를 검사하기 위해 적합한 대조군이다. DsRed를 형성하는 불용성 단백질체를 전체 세포 추출물들에 대한 대조군으로 채용하였다.

표준 조건들 하에 배양한 11일령 BY-2 현탁 세포들(실시예 1)을 이용하여 컬럼들 중에 세포 팩들을 생성하였다. 10ml 현탁 배양물을 20㎛ 폴리에틸렌 필터 프릿이 장착된 14ml 폴리프로필렌 컬럼(지름 1.4cm, 높이 9cm)에 부었다. 배지를 진공 여과에 의해 완전 제거하고 아그로박테리움 현탁액을 세포 팩 상에 피펫팅하여(1ml/세포 팩g) 생성 세포 팩(중량 = 3g, 지름 = 1.4cm, 높이 = 3.6cm, 밀도 = 0.54g/cm³)을 컬럼 내에서 침윤시켰다. 완전 침윤을 달성하기 위해, 첫 번째 액적들이 컬럼을 떠날 때까지 그러나 세포 팩의 상부는 여전히 현탁액으로 덮여 있도록 짧게 진공을 걸었다. 침윤된 세포 팩들을 22℃에서 30분 동안 인큐베이션한 뒤, 다공성 구조를 복구하기 위해 컬럼에 진공을 적용하여 잔여 액체를 완전히 제거하였다. 세포 팩들을 26℃ 및 92% 상대 습도에서 컬럼들 중에서 배양하였다. 아그로 감염 5일 후, 팩화 세포들의 200mg FCW 표본들에서 전체 가용성 단백질들을 2부피들의 추출 완충액(50mM 칼륨 포스페이트, 500mM NaCl, 10mM 나트륨 비설파이트, pH 7.5)으로 추출하였다. 분비된 단백질들만을 회수하기 위해, 잔여 컬럼 팩화 세포들을 하기와 같이 추출 완충액으로 세척하였다. 3ml 완충액을 컬럼에 적용하고 짧은 진공에 의해 세포 팩 내로 흡인하였다. 30분 인큐베이션 후, 완충액을 진공에 의해 수집하고 세포들 상에 다시 적용하였다. 3회의 연속 세척 단계들 후, 2.7ml 용출액을 회수하고 이어서 원심분리에 의해 청정화하였다. 총 추출성 단백질 제조물들 및 용출성 단백질들을 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔들 상에서 재조합 단백질 함량에 대해 분석하였다(도 12). 겔들에 로딩된 단백질 양들은 10mg 세포 팩의 총 추출성 단백질들 및 20mg 세포 팩의 용출성 단백질들에 해당하였다. 재조합 단백질 밴드들의 강도들은 항체(도 12A) 및 DsRed(도 12B) 각각에 대해 추출물 및 용출액 중에서 거의 동일하다. 이는 두 경우들에서 총 생산된 재조합 단백질의 약 50%가 용출될 수 있음을 의미한다. 그러나 오염 숙주 단백질들의 양은 용출 표본들에서 더 낮았다.

M12 항체의 양을 센서칩에 커플링된 단백질 A를 갖는 표면 플라즈몬 공명 분광측정에 의해 정량하고, DsRed의 양을 형광에 의해 결정하였다. 총 생산된 분비성 M12(175㎍/FCWg)의 약 55%(96㎍/FCWg) 및 분비성 DsRed(70㎍/FCWg)의 40%(28㎍/FCWg)가 용출되었다. 용출 표본들 중 총 생산된 ER-보유된 DsRed(120㎍/FCWg)의 단지 일부(1% 미만)의 존재는 세포들이 배양 동안 또는 분비된 단백질들의 용출 동안 손상되지 않았음을 나타낸다(도 12B를 또한 참고).

식물 잎들 또는 전체 식물의 일시적 형질변환의 선행 기술 방법을 이용하는 경우, 분비된 산물들의 선택적 제조는 세포 내 세척액들의 수집에 의한 분석 규모에서는 타당하지만 더 큰 규모에서는 비실용적이다. 따라서 대규모로 분비된 산물들을 전체 생물질 추출물들로부터 회수해야 한다. 따라서 원하는 산물은 숙주 화합물들(예로, 단백질들, 대사물질들, 리그닌들, 셀룰로오스들)의 복잡한 혼합물로부터 정제되어야 한다. 특히 페놀계 화합물들은 하류 가공 및 정제에 관해 문제가 된다. 이러한 측면에서, 분비된 산물들이 식물 세포들을 파괴하지 않고 최소의 오염 숙주 화합물들을 가지고 세포 팩으로부터 직접 용출될 수 있으므로 본 발명은 이러한 문제들을 회피한다. 또한, 스케일 조정 가능성으로 인해, 세포 팩 방법은 큰 산업적 규모에서 실시될 수 있다. 최적화된 용출 및 배양 조건들 하에서, 팩화 세포들로부터 분비된 산물들의 반복된 용출은 원하는 산물의 훨씬 더 높은 수율들로 이어질 것임을 인식할 수 있다.

실시예 7

대사 조작에 의한 신규한 이차 대사물질의 생산

팩화 세포들에서 새로운 생합성 경로를 구축하기 위해, N. 타바쿰에 존재하지 않는 효소 트립토판 데카르복실라아제(TDC; EC 4.1.1.28)를 BY-2 세포 팩들에서 일시적으로 발현하였다.

TDC는 l-트립토판의 탈카르복실화에 의해 프로토알칼로이드 트립타민을 생산하는 테르페노이드 인돌 알칼로이드 생합성 경로의 조기 단계를 촉매하는 세포질 효소이다. 트립타민은 치료적으로 관련된 이차 대사물질들 그룹(예로, 카타란투스 로세우스로부터의 항암 약물들 빈블라스틴 및 빈크리스틴)의 공통 전구체이다. 원하는 대사물질의 수율을 추가 증가시키기 위해, 전구체 트립토판을 형질변환 후 세포 팩들로 두 번째 단계에 공급하였다.

4일령 BY-2 현탁 세포들을 실시예 4에 기재된 바와 같이 14ml 컬럼들 중에 팩화하여 밀도 0.58g/cm³로 2g FCW의 세포 팩들을 얻었다. 세포 팩들을 2개씩 아그로-감염을 통해 일시적으로 형질변환하였다. 색소체-표적화된 녹색 형광 단백질(GFP)(도 1F), 색소체-표적화된 TDC(도 3A) 또는 세포질 TDC(도 3B)에 대한 식물 발현 구축물들로 형질변환된 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101::pMP90RK를 표준 조건들 하에 성장시켰다(실시예 1).

아그로박테리움 균주들을 원심분리에 의해 펠렛화하고, 재현탁하고, 침윤 배지로 OD 1로 조정하였다. 박테리아 현탁액을 식물 세포 팩들 상에 적용하기 전에 4시간 동안 22℃에서 인큐베이션하였다.

각각의 세포 팩을 2ml 아그로박테리움 현탁액으로 침윤하고, 30분 동안 22℃에서 인큐베이션하고, 진공에 의해 흡인 건조하고, 26℃ 및 92% 상대 습도에서 추가 배양하였다. 아그로-감염 18시간 후, 세포 팩들을 다시 2ml 트립토판 용액(절반 농축된 침윤 배지 중 50mM) 또는 2ml의 절반 농축된 침윤 배지로 다시 침윤시켰다. 침윤된 세포 팩들을 30분 동안 26℃에서 인큐베이션 후, 용액들을 다시 진공에 의해 완전 제거하고, 컬럼 팩화 세포들을 배양 캐비넷으로 다시 넣었다. 약 250mg FCW의 표본들을 아그로-감염 후 69h, 91h 및 112h에 취하고, -80℃에 보관하였다. [R.S. Sangwan 등, "Direct fluorometry of phase-extracted tryptamine-based fast quantitative assay of l-tryptophan decarboxylase from Catharanthus roseus leaf", Anal Biochem 255: 39-46,(1998)]의 방법에 따라 약간의 수정들을 이용해서 트립타민을 추출하고 분석하였다.

간략하게, 수용성 화합물들을 2부피(v/w)의 추출 완충액(50mM 칼륨 포스페이트, 500mM NaCl, 10mM 나트륨 비설페이트, pH 7.5) 중 초음파 분쇄에 의해 세포 표본들로부터 추출하였다(실시예 1 참고). 0.9ml 증류수를 0.1ml의 투명 추출물에 첨가한 뒤, 2ml 5M NaOH 및 3.5ml 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 에멀션을 10초 동안 볼텍싱에 의해 혼합한 뒤 상 분리를 위해 4℃에서 16h 동안 놔두었다. 상부 유기 상을 Aminco Bowman AB2 발광 분광측정기(Spectronic Instruments, Rochester, NY)를 이용하여 형광 분석하였다. 트립타민 형광을 여기 및 방출 광을 위한 4-nm 슬릿 폭으로 그리고 광전자 증배관 전압 설정 575V에서 280nm 여기 및 350nm 방출 파장들에서 측정하였다.

검출된 트립타민 수준들은 활성 TDC가 색소체들 및 세포질에서 각각 발현되었음을 나타낸다(도 13). 도입된 효소들은 내인성 트립토판을 신규한 물질 트립타민으로 전환하였다. 일시적으로 TDC를 발현하는 세포들에 대한 추가 트립토판 첨가는 트립타민 생산을 확실히 증가시켰다(색소체 표적화된 TDC에 대해 5배, 세포질 TDC에 대해 거의 10배).

상기 실시예는 또한 본 발명에 따른 방법이 대사물질의 생산에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이는 세포 팩이 예로 효소(TDC)를 생산하도록 형질변환될 수 있을 뿐만 아니라 기질들 및/또는 전구체들이 산물 수율을 증가시키기 위해 후속 단계에서 세포들에 쉽게 공급될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명에는 또한 예로 반복된 형질변환, 침윤 및 인큐베이션 단계들에 의해 산물 형성을 최적화하기 위해 세포들로 임의의 관심 물질(예로 추가적인 식물 영양소들, 유도제들, 저해제들)을 전달하는 가능성들이 포함된다. 세포 대사의 조작은 적용하는 적합한 화합물들 및 유전자들의 임의 조합에 의해 유전 정보 전달에 의해, 그 동안, 그 이전 및/또는 그 이후 일어날 수 있다.

당분야 숙련자들은 야생형, 돌연변이 및/또는 유전자삽입 현탁 배양물들로부터 제조된 세포 팩들이 또한 형질변환 없이, 즉 상이한 화합물들의 적용에 의해 조작될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다. 이는 특히 천연 생성 화합물들의 수율들이 본 발명에 따른 세포 팩들을 이용하고 적합한 기질들, 호르몬들, 저해제들 및/또는 전구체들을 이들에 첨가함으로써 증가될 수 있음을 의미한다.

실시예 8

상이한 식물종들의 현탁 배양물들로부터의 세포 팩들

N. 타바쿰 BY-2 현탁 세포들에 부가하여, 몇몇 다른 식물 세포 현탁액들을 세포 팩들을 생성하는데 사용하였다.

카타란투스 로세우스

C. 로세우스의 세포들을 26℃에서 회전 진탕기(180rpm) 상에 암소에서 MS67 배지(3% 수크로오스, 4.4g/L Murashige 및 Skoog 염들, 0.6mg/L 티아민, 0.2mg/L 키네틴, 1mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산, pH 5.8) 또는 BY-2 배지(실시예 1) 중에 배양하였다. 세포들을 새로운 배지 내로 매주 후속 배양하였다(20:100).

아라비답시스 탈리아나

A. 탈리아나의 세포들을 26℃에서 회전 진탕기(180rpm) 상에 16h 명/8h 암 조건으로 ARA 배지(3% 수크로오스, 4.4g/L Murashige 및 Skoog 염들, 0.5mg/L 나프탈렌 아세트산, 0.1mg/L 키네틴, pH 5.7) 중에 배양하였다. 세포들을 새로운 배지 내로 매주 후속 배양하였다(15:100).

니코티아나 벤타미아나

N . 벤타미아나의 세포들을 26℃에서 회전 진탕기(180rpm) 상에 암소에서 BY-2 배지(실시예 1) 중에 배양하였다. 세포들을 새로운 배지 내로 매주 후속 배양하였다(20:100).

상이한 형태들의 세포 팩들을 각 현탁 배양물로부터 제조하였다. 실험들에 있어서, 4 내지 5일령의 배양물들을 사용하였다. 상이한 두께(0.2-0.5cm)의 쿠키형 세포 팩들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하였다. 약 2 내지 4cm 높이의 세포 팩들을 실시예 4에 기재된 바와 같이 14ml 미디 컬럼들 중에 생산하였다. 식물 종들에 따라, 상이한 밀도들의 세포 팩들이 수득되었다. C. 로세우스 세포 팩들의 밀도는 전형적으로 0.65-0.75g/cm³였으며, A. 탈리아나 세포 팩들의 밀도는 약 0.55-0.67g/cm³였고, N . 벤타미아나 팩들의 밀도는 약 0.6-0.7g/cm³였다.

이원성 벡터 pTRAp-2G12FER-Ds(도 2B)를 수반하는 아그로박테리움들로 침윤된 C. 로세우스, A. 탈리아나 및 N . 벤타미아나의 세포 팩들은 거시적으로 검출 가능한 DsRed 발현을 나타내었다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명 분광측정에 의해 각각의 시험 식물종들에 대한 항체 2G12의 생성도 확인되었다.

흥미롭게도 C. 로세우스 현탁 배양에 사용된 배지에 따라 발현 수준들의 뚜렷한 차이가 관찰되었다. 이는 두 상이한 DsRed 발현 구축물들, pTRAc rfp-AH 및 pTRAc rfp-ERH(도 1A, B)로 MS67 배지 또는 BY-2 배지 중에 성장시킨 세포들로부터 생성된 C. 로세우스 세포 팩들의 형질변환에 의해 추가 분석되었다. 분비 및 ER-보유된 DsRed는 모두 BY-2 배지 중에 성장시킨 세포들에서 훨씬 더 높게 축적되었다(도 14). 이는 높은 형질변환 및/또는 높은 산물 합성을 달성하기 위한 전배양 조건들의 최적화의 중요성을 또한 나타낸다. 실험들은 본 발명이 상이한 종들의 식물 세포들에 적용될 수 있음을 나타내었다.

당분야 숙련자들에게는 배양 조건들(예로, 온도, 통기, 교반 속도, 광 조성 등) 및/또는 배양 배지 조성(예로, 영양소들, 호르몬들, pH, 전도성, 삼투압 등)이 식물 현탁 배양물의 형태학적 및 생리학적 특징들에 대한 결정 인자들임이 널리 알려져 있다. 각 인자의 변화는 후속 단계들에서 식물 세포들의 성능에 영향을 미칠 수 있다. 이는 배양 조건들 및/또는 배지 조성들이 임의의 생산을 위해 최적화되어야 함을 의미한다. 원료의 생산 최적화에 부가하여, 침윤 파라미터들(예로, 아그로박테리움 밀도, 접촉 시간, 침윤 배지 조성) 및 세포 팩 배양 조건들(예로, 기간, 온도, 통기, 영양공급, 첨가제들의 적용)이 임의의 식물 세포주 및 임의의 산물에 대해 최적화되어야 한다.

실시예 9

병원체들의 배양을 위한 기질로서의 팩화 세포들의 이용

표준 조건들(실시예 1) 하에 성장시킨 4일령 BY-2 배양물 50ml을 이용하여 3.64ml 세포 팩(중량 = 2g, 지름 = 5.5cm, 높이 = 0.15cm, 밀도 = 0.55g/cm³)을 생성하였다. 세포 팩을 빈 페트리 접시에 놓고 세포 팩(세포 팩 중량 = 3g; 밀도 = 0.825g/cm³)에 의해 완전 흡수된 1ml 침윤 배지(50g/l 수크로오스, 2g/l 글루코오스, 0.5g/l Ferty 2 Mega(Planta Duengemittel, Germany), pH 5.3)로 침윤시켰다. 상기 부피량(즉 세포 팩 2g 당 1ml 이하)은 공극들이 수 시간 내에 재생되므로 페트리 접시들에서의 세포 팩들의 인큐베이션 개시에 바람직한 것으로 나타났다. 이는 증발로 인해 0.6g/cm³ 미만으로 감소된 세포 팩 밀도의 대조군 측정들로 확인되었다. 중요하게는 액체의 양이 많을수록(즉 세포 팩 2g 당 1ml 초과) 과량의 액체로 인해 공극들이 재구성될 수 없어서 세포 생활성을 적절히 지지하거나 심지어 세포사를 예방하기에 너무 높은 밀도를 갖는 세포 팩이 생성되므로 크게 유해하였다.

다음 처리 단계는 세포 팩 표면 상에 4개의 상이한 아스퍼르길러스 종들의 포자 현탁액들(도 15; A - D)의 20㎕씩의 적은 부피를 스폿팅하는 것으로 구성되었다. 세포 팩을 11일 동안 인큐베이션한 뒤 사진을 찍었다(도 15).

상기 실시예는 식물 세포 팩이 상이한 아스퍼르길러스 종들을 위한 성질의 기재로 사용될 수 있음을 나타낸다. 아스퍼르길러스는 식물 병원체의 대표로서 그러나 또한 인간 및 동물 병원체의 대표로서 선택되었다.

상기 실시예에서, 세포 팩을 진균의 후속 배양을 위해 야생형 BY2 현탁 세포들로부터 제조하였다. 당분야 숙련자들은 유전자삽입 현탁 세포들도 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 특히, 항-진균 펩티드들, 단백질들 또는 화합물들을 생산하는 유전자삽입 세포 팩들이 이용될 수 있고, 진균의 성장 및 발달에 대한 이들의 효과들이 연구될 수 있다. 마찬가지로, 야생형 세포들로부터 생성된 세포 팩들은 먼저 형질변환 처리된 후 진균 병원체의 성장에 대한 산물들의 영향을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 당분야 숙련자들은 또한 방법이 항-박테리아 화합물들의 영향을 연구하는데도 사용될 수 있음을 수긍할 것이다. 고처리량 스크리닝 적용들을 위한 다중 역가 플레이트들에서의 세포 팩들의 사용은 하기 실시예 11에 기재되며, 이들 실시예들이 또한 조합될 수 있음이 자명하다.

실시예 10

유전자삽입 현탁 세포주로부터 생성된 세포 팩에서 분비된 산물의 비파괴적 수확

분비성 모노클로날 항체 M12와 ER-보유된 DsRed에 대한 발현 구축물(도 2C)을 이용한 형질변환 후 유전자삽입 BY2 현탁 배양물들을 생성하였다. 카나마이신을 함유하는 플레이트들 상에서의 선택 후, 유전자삽입 캘러스들을 액체 배지로 옮겨서 고도로 동종성인 현탁 배양물들을 구축하였다. 4% 현탁 배양물을 새로운 액체 배지로 옮겨서 현탁 배양물들을 매주 후속 배양하였다(실시예 1).

5일령 현탁 배양물의 현탁 세포들을 본 개시에 따른 세포 팩들의 생성을 위해 수집하거나 세포들을 현탁 배양물 중에 추가 배양하였다. 세포 팩들 및 현탁 배양물들을 모두 추가 4일 동안 인큐베이션하였다. 2g FCW(새로운 세포 중량)의 세포 팩들을 14ml 폴리프로필렌 컬럼들을 이용해서 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조하였다. 액체 배지가 제거된 캐스팅된 세포 팩의 밀도를 측정하여 또 다시 공극들의 구성을 인큐베이션/배양에 걸쳐 주의 깊게 모니터링하고 조절하였다. 이어서 세포 팩 내의 세포들의 건조를 방지하기 위해 26℃에서 세포 팩의 인큐베이션 동안 상대 습도 90%를 항상 보장하였다.

세포 팩들 또는 현탁 배양물로부터의 세포들(진공 여과에 의해 배지로부터 분리됨)의 400mg FCW 표본들로부터의 총 가용성 단백질들을 2부피들의 추출 완충액(50mM 칼륨 포스페이트, 500mM NaCl, 10mM 나트륨 비설파이트, pH 7.5)으로 추출하였다.

추출 완충액(실시예 6)으로 컬럼 팩화 세포들을 세척하여 컬럼 팩화 세포들에서 분비된 항체들을 회수하였다. 간략하게 2ml 완충액을 2g 컬럼으로 적용하고 짧은 진공에 의해 세포 팩 내로 흡인하였다. 30분의 인큐베이션 후, 완충액을 진공에 의해 수집하고 세포들 상에 다시 적용하였다. 3회 연속 세척들 후, 1.6ml 용출액을 회수하였다. 원래 현탁 배지로부터 수집한 표본들을 비교를 위해 사용하였다.

CHO 세포들에서 생산된 정제된 인간 항체 H10을 표준물로 이용하여 단백질 A 표면(아민-커플링에 의해 고정화됨) 상의 SPR에 의해 항체 농도들을 측정하였다. 모든 표본들을 용량-반응 곡선의 선형 범위에서 분석하였다. DsRed는 DsRed 표준을 이용하여 형광으로 결정하였다.

현탁 배양물이 높은 세포 생물질에 도달했다는 사실에도 불구하고, 현탁 배양 상청액에서는 항체가 검출되지 않았다. 따라서 분비된 재조합 산물 분획은 0%였다. M12 항체의 세포 내 축적은 유전자삽입 BY2 현탁 세포들의 FCWg 당 4.02㎍이었다. 따라서 총 수율(세포 상청액 중의 항체 + 세포들 내의 항체)도 g당 4.02㎍이었다.

대조적으로 M12의 총 수율은 세포 팩g 당 11.4㎍에 도달하여 284%의 실질적인 총 수율 증가에 해당한다. 중요하게는 세포 팩으로부터 분비된 항체를 용출할 수 있었다. 분비된 산물의 수율은 세포 팩g 당 1.4㎍ M12 항체로, 이는 총 수율의 12%에 해당한다.

상기 실시예는 유전자삽입 현탁 배양물로부터 생성된 세포 팩으로부터의 재조합 단백질 산물을 유도할 수 있고, 그 수율들이 현탁된 세포들의 대조군에 비해 284%로 크게 증가되었음을 나타낸다.

ER-보유된 DsRed의 수율은 세포팩의 세포들에서 현탁액 중 세포들에 비해 70% 증가하였다(각각 5.2㎍/FCWg 및 3.0㎍/FCWg).

상기 실시예는 또한 세포 팩 형태의 유전자삽입 현탁 세포들의 인큐베이션이 하류 가공을 위해 크게 유익한(공정 시간 및 비용들 모두의 감소 포함) 농축된 방식으로(현탁 세포 배양 상청액에 비해) 산물을 수집할 수 있도록 함을 뚜렷이 나타낸다.

중요하게는 세포 팩은 또한 산물(여기서는 세포들로부터 분비된 재조합 표적 단백질)의 용출을 최대화하는 세포 배양 배지와 상이한 완충액들을 이용하기 위한 뛰어난 진입점을 제공하여 세포 팩은 현탁 세포들에 비해 추가적인 이점들을 제공한다. 현탁 배양물의 상청액들은 컬럼 팩화 세포들로부터의 용출액들에 비해 훨씬 더 많은 양의 다당류들을 함유하였다. 젤라틴성 다당류들은 여과 및 초미세 여과와 같은 하류 공정들을 방해하므로, 다당류들의 양이 적은 것이 바람직하다.

또한, 분비된 수확 재조합 단백질의 백분율은 현탁 세포들에서의 0%에서부터 본 발명에 따라 생성된 세포 팩에서의 12%로 상당히 증가되었다.

마지막으로 상기 실시예는 세포 팩에서의 전체적 수율도 현탁 세포들로서 배양된 동일한 세포들에 비해 크게 증가됨을 나타낸다.

당분야 숙련자들은 또한 본 방법이 유전자삽입 세포들로부터의 재조합 단백질들의 생산 및/또는 단리에 제한되지 않고, 일차 대사물질들, 섬유들, 올리고당류들 및 다당류들(셀룰로오스, 전분, 헤미셀룰로오스들, 자일란들, 프룩탄들 등), 천연 펩티드들 및 단백질들, 염료들, 비타민들, 향료들, 과일산들, 또는 식물 세포들의 임의의 다른 산물들을 비제한적으로 포함하는 다른 관심 산물들 또는 비유전자삽입 또는 유전자삽입 세포들에서 생산되는 이차 대사물질들에도 동일하게 적용가능함을 쉽게 이해할 것이다.

실시예 11

다중 역가 플레이트들에서 생성된 세포 팩들의 이용

세포 팩들을 플레이트 저부에 액체 투과성 필터들을 함유하는 다중 역가 플레이트들(Receiver 플레이트 20㎛(No. 740686.4), MACHEREY-NAGEL, Germany)을 이용하기 전에 앞서 설명된 바와 같이 생성하였다.

리시버 플레이트 웰 당 1ml의 야생형(비유전자삽입) 담배 BY2 현탁 배양물을 캐스팅하여 96 마이크로 세포 팩들을 생성하였다. MACHEREY-NAGEL(Germany)의 NucleoVac 96 진공 매니폴드를 이용하여 진공으로 액체 배지를 완전히 제거하였다. 0.2g의 생성 세포 팩들을 공극들의 존재에 대해 미시적으로 분석하고, 독립적인 대조군 실험을 이용하여 생성 세포 팩의 밀도가 0.7g/cm³ 미만임을 확인하였다.

항체 M12(도 2C) 또는 항체 2G12(도 2A)에 대해 인코딩하는 pTRA 플라스미드들을 수반하는 재조합 아그로박테리움 투메파시엔스 현탁액 0.8ml(OD600nm = 0.1)를 각각의 세포 팩에 적용하였다. 각각의 항체 발현 구축물에 있어서, 32개의 마이크로 세포 팩들을 침윤시켰다. 30분 후, 모든 액체를 제거하여 공극들을 재구성하고 0.7g/cm³ 미만의 세포 팩 밀도를 재구축하였다. 이어서 다중 역가 플레이트 중의 세포 팩들을 4일 동안 25℃ 및 90% 상대 습도에서 인큐베이션하였다. 이어서 세포 팩들을 수확하고, 재조합 항체들을 추출하였다(실시예 1). 각각의 항체에 대해 32개 표본들에 있어서 BiacoreT200 장비를 이용하여 단백질-A 표면 상에서 표면 플라즈몬 공명 측정들에 의해(T=25℃, 수행 완충액 = HBS-EP) 항체 농도들을 측정하여 평균 항체 농도 및 변동 계수(CV)를 결정하였다.

항체 M12의 평균 수율은 세포 팩g 당 117.8±14.4㎍였고, 변동 계수는 12.2%였다. 항체 2G12의 평균 수율은 세포 팩g 당 32.3±3.6㎍이었고 변동 계수는 11.1%였다.

이들은 생물학적 분석들에 있어서 뛰어난 값들이며, 본 발명에 따라 제조된 세포 팩들에 기반을 둔 분석들의 뛰어난 재현성 및 강건성을 명확히 나타낸다.

이는 또한 상이한 크기들 및 기하구조들의 세포 팩이 상이한 적용들을 위해 사용될 수 있음을 나타내며, 상기 실험은 세포 팩들이 고해상도로 고처리량 적용들을 촉진하는 다중 역가 형식으로 생성될 수 있음을 나타낸다.

또한, 다중 역가 형식의 세포 팩들은 후속 정량 또는 분석을 위해 분비된 또는 세포외 산물들의 용출을 포함하여 컬럼들에 캐스팅된 것들과 동일하거나 유사한 방식으로 취급되고 처리될 수 있음도 명백하다.

당분야 숙련자들은 세포 팩들이 분석 목적들을 위해서도 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 유전자삽입 현탁 배양물로부터 생성된 세포 팩 또는 예를 들어 세포막(원형질막)에 부착되거나 삽입된 재조합 항체들 또는 셀룰로오스 결합 단백질에 대한 항체-융합 단백질들을 비제한적으로 포함하는 재조합 항체들에 대한 유전자들로 형질변환된 세포 팩을 항체에 결합하는 물질을 함유하는 용액(표본)과 접촉시킬 수 있다. 세포 팩의 다공성 성질은 큰 부피들을 세포 팩을 통해 쉽게 통과시켜서 감수성을 증가시킬 수 있으므로, 여기에서도 뚜렷한 장점이다. 또한, 세척 단계들, 완충액 교환들 및 효소 공액 항체들 또는 다른 검출 시약들의 적용도 세포 팩으로부터 쉽게 적용되고 제거될 수 있음이 자명하다. 최종 단계에서, 물질의 존재 및 농도를 드러내는 측정 가능한 산물로 효소적으로 변환되는 기질이 적용될 수 있다.

실시예 12

야생형 세포들에서 생성된 세포 팩에서 회수되는 내인성 단백질

5일령 BY-2 야생형 현탁 배양물의 현탁 세포들을 세포 팩들을 생성하기 위해 수집하거나 세포들을 현탁 배양물 중에 추가 배양하였다. 세포 팩들 및 현탁 배양물들을 모두 추가 4일 동안 인큐베이션하였다. 2.5g FCW(새로운 세포 중량)의 세포 팩을 14ml 폴리프로필렌 컬럼들을 이용하여 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조하였다. 액체 제거 후, 세포 팩을 26℃에서 상대 습도 90%로 인큐베이션하였다. 5일령 BY-2 현탁 배양물을 180rpm에서 회전 진탕기 상에 26℃에서 추가 배양하였다. 4일 후, 분비된 단백질들을 수확하였다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 팩을 2.5ml 완충액으로 세척하여 분비된 단백질들을 세포 팩으로부터 수확하였다. 진공 여과를 이용하여 세포들을 배양 배지에서 제거함으로써 9일령 현탁 배양물로부터 분비된 단백질들을 수확하였다. 용출 또는 분비 단백질들의 25㎕ 표본을 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다(도 16). 상기 실시예는 분비된 천연 단백질들이 본 발명에 따라 생성되고 인큐베이션된 세포 팩들로부터 회수될 수 있음을 나타낸다. 겔 상의 각 밴드는 상이한 천연 단백질을 나타낸다. 겔 분석은 또한 분비된 천연 단백질들의 양 및 순서가 세포 팩의 세포들 및 현탁액 중의 세포들 간에 상이함을 나타내었다. 특정 천연 단백질들의 분비는 세포 팩의 세포들에서 실질적으로 증가되었다(도 16, 화살표들로 나타냄).

당분야 숙련자들은 또한 본 방법이 식물 세포들로부터의 천연 단백질들의 회수에 제한되지 않고, 일차 대사물질들, 이차 대사물질들, 섬유들, 올리고당류들 및 다당류들(셀룰로오스, 전분, 헤미셀룰로오스들, 자일란들, 프룩탄들 등), 천연 펩티드들 및 단백질들, 염료들, 비타민들, 향료들, 과일산들, 또는 식물 세포들의 임의의 다른 산물들을 비제한적으로 포함하는 다른 내인성 관심 산물들에도 동일하게 적용가능함을 쉽게 이해할 것이다. 당분야 숙련자들은 세포 팩들이 카타란투스 로세우스, 탁수스 종, 스테비아 레바우디아나 및 아르테미시아 안누아를 비제한적으로 포함하는 광범위한 식물 종들로부터 선택되는 현탁 세포들에서 생성될 수 있음을 인지할 것이다.

Claims (14)

1. (i) 천연 또는 유전자 삽입된 식물 세포의 현탁 배양물로부터 액체 배지를 제거하여 다공성 구조를 갖는 세포 팩을 제공하는 단계, 및
   (ii) 상기 액체 배지가 제거된 다공성 구조의 세포 팩을 상대 습도 50 내지 100%의 비액체 환경에서 인큐베이션하는 단계를 포함하는,
   배지가 제거된(medium-deprived) 다공성 구조(porous structured) 및 비조직 다층(non-tissue multilayer) 세포 팩 형태의 식물 세포 재료의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법으로,
   상기 (i) 단계에서 상기 세포 팩에 포함되는 액체의 함량은 세포 팩 밀도가 0.1 내지 0.9g의 습식 세포 중량/cm³에 해당하도록 조정되고,
   상기 (ii) 단계에서 인큐베이션은 상기 액체 배지가 제거된 다공성 구조의 세포 팩을, 배지 상에 위치시키지 않거나 배지와의 접촉 없이 수행되는, 세포 팩 형태의 식물 세포 재료의 생성 및 상기 세포 팩의 후속 유지를 위한 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 팩에 포함되는 상기 액체의 함량은 세포 팩 밀도가 0.2 내지 0.85g의 습식 세포 중량/cm³에 해당하도록 조정되는 방법.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서, 상기 식물 세포 현탁 배양물로부터 분리된 세포들이 원하는 산물을 축적할 수 있는 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 유전자 삽입된 식물 세포가 상기 원하는 산물을 축적하기 위해 일시적으로 또는 안정적으로 형질변환되는 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자 삽입된 식물 세포는 적어도 하나의 이종성 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터로 일시적으로 형질변환된 것으로, 상기 적어도 하나의 이종성 핵산 서열이 목적하는 산물을 코딩하는, 방법.
7. 청구항 1, 2 및 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 단계 (ii)는 원하는 산물의 축적 및 수확을 추가로 포함하는 방법.
8. 청구항 4 내지 6 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 원하는 산물은 천연 단백질, 이종성 단백질, 폴리펩티드, 이차 대사물질, 마커, 분석 결과물, 및 진단의 결과물로 구성된 군으로부터 어느 하나 선택되는 방법.
9. 청구항 1, 2 및 4 내지 6 중 어느 하나에 정의된 방법으로 수득된, 밀도가 0.1 내지 0.9g의 습식 세포 중량/cm³이고 배지가 제거된 다공성 구조 및 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료.
10. 천연 또는 유전자 삽입된 식물 세포를 포함하며, 다공성 구조의 식물 세포 팩 형태인 식물 세포 재료로,
    상기 식물 세포 재료의 밀도가 0.1 내지 0.9g의 습식 세포 중량/cm³이고,
    상기 천연 또는 유전자 삽입된 식물 세포는, 배지 상에 위치시키지 않거나 배지와 접촉 없이 상대 습도 50 내지 100%의 비액체 환경에서 인큐베이션된 것인 식물 세포 재료.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 천연 또는 유전자 삽입된 식물 세포가 원하는 산물을 생성하며, 상기 산물이 분석 또는 진단 목적에 사용되는, 식물 세포 재료.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 천연 또는 유전자 삽입된 식물 세포가 분석되거나 진단을 위한, 물질 또는 유기체의 존재 하에 인큐베이션되는 식물 세포 재료.
13. 청구항 1, 2 및 4 내지 6 중 어느 하나에 정의된 방법으로 수득된, 배지가 제거된 다공성 구조 및 비조직 다층 세포 팩 형태의 식물 세포 재료를 포함하는 진단 도구.
14. 청구항 10에 따른 식물 세포 재료를 포함하는, 진단 도구.
    

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