JPH03117476A - 物質を生物学的細胞中に挿入する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、推進可能な物質を加速する装置および方法に
関する。さらに詳しくは、本発明は、圧力下での予定さ
れた体積の気体と前辺て決定した体積の推進可能な物質
の懸濁液とを接触させ、その後、この懸濁液を選択され
た標的物質に加速する装置および方法に関する。

生物学者は、普通、広い範囲の生物学的物質を生きてい
る細胞の中に導入しようとする。生きている細胞の遺伝
子の形質転換に関する非常に多くの現在の研究が存在す
る。生物学的物質を生きている細胞の中に導入する従来
の技術は、ゴレクトロボレイション、直接のＤＮＡ摂取
機構、融合機構、マイクロインジェクション機構、およ
び感染因子の使用を包含する。しかしながら、これらの
技術の各々はある種の実際的欠点に悩まされる。

エレクトロボレイションは、種々の分子に短時間の高い
電圧の電気パルスをかけて、それらを細胞の中に導入す
る方法である。エレクトロボレイションの一般的説明は
、次の文献を参照のこと：８５：８５６−８６０；　お
よびＰｏｗｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、　Ａ
ｐｐｌ。

Ｅｎｖ＋ｒｏｎ、　Ｍ＋ｃｒｏｂｉｏ１．　５４：６５
５−６６０．）エレクトロボレイションの一般的制限は
、（１）高い印加し、た電圧により引き起こされる全体
の細胞の生存能力の減少、および（ｉｉ）、ことに複雑
な多細胞の器官における、特定の細胞を特異的に標的す
ることができないことを包含する。

そのうえ、エレクト・ロボレイション法はキメラ遺伝子
の構成体の摂取の効１率を大きく増加するが、このよう
な方法は、植物とともに使用するとき、植物において生
体外の杉濁液系に制限される。そのうえ、単子葉ならび
に双子葉植物において有効に使用される（Ｆｒｏｍｍ　
ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２：５８２４−５８
２８）が、エレク）・ロポレイションは、一般に、植物
の細胞壁を除去するという比較的労力を要し、時間を消
費する］二程を必要とする。

摂取機構は、一般に、単細胞の懸濁液を包含し、そして
ことに植物細胞に適用するとき、細胞壁物質の酵素的除
去を必要とする。結局、摂取機構は時間を消費し、そし
て処理量が比較的低い。

摂取についての１つの技術は、膜の透過性を、例えば、
カルシウム（Ｍａｎｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７２
）、　−Ｊ。

！、ｌｏｌ、Ｂｉｏｌ１．５３：１５９−１６２）；お
よび温度衝撃（Ｄｉｔｙａｔ、ｋｉｎｅｔ　ａｌ、、　
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　
Ａｃｔａ、　２８１：３１９−３２３）を使用すること
によって増強することである。

摂取についての第２の技術は、表面結合剤、例えば、ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用である。表面結
合剤の使用の一般的説明は、次の文献を参照のこと：　
１．４ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｃｔ、　、　１６８：
１１１−１１５：Ｋｒｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
２）、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９６：７２）　またはリン
酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、（１９７３
）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

５２８４５６；Ｗｌｏｌｅｒ（１９７９）、　　Ｃｅ１
ｌ、　　１６：７７７゜摂取の第３の技術は、細胞中へ
の粒子の食作用である。適切な粒子は、次のものを包含
する：リボソー、ｂ、　（Ｉｌｃｈｉｍｉｙａ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８２）。Ｐｒｏｃ、５ｔｈ。

１ｎｔｌ、Ｃｏｇ、Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ
　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ。

Ｆｕｊｉｗａｒａ（編）、　　ｐｐ、５０７−５０８；
オルカ゛ネラ（ＰｏｔｒｙｋｕｓＰｈｙｓｉｏｌ、２３
：２９−５０）。

融合機構は、新し、１い遺伝ｒ物質を細胞の中に、細堕
膜を他の細胞、オルガネラまたはリポソームの膜と融合
するＪ−１とによって絹み込む。摂取機構を使用すると
きのように、植物細胞の融合技術は生体外懸濁液系の使
用に頼り、ここで細胞は酵素的に細胞壁物質を除去され
る。

融合は電流、ＰＥＧ、およびセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）
ウィルス粒子で誘発することができる。細胞融合の一般
的説明は、次の文献を参照のこと：　ＩＪｃｈｉｄａｚ
（１）、　　１ｊ１６９−１８５；およびＨａｒｒｉｓ
（１９７０）、　　Ｃｅ１ｌＦｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　Ｄ
ｕｎｈａｍ　Ｌｅｃｔ、ｒｕｅｓ。

融合技術は、影響を受けろ細胞の数においてツ゛ぐれた
効率を有することができるが、細胞の選択の問題は複雑
である。例えば、細胞対細胞の場合、生ずる細胞はしば
しば倍数性を増大しており、これが細胞の有用性を制限
することがある。

マイクロインジェクションは、染色体をマイクロインジ
ェクションにより転移する直接的方法である。マイクロ
インジェクションは、極めて細いドロランアウト（Ｄｒ
ａｗｎ−ｏｕｔ）毛細管を使用し、この毛細管は生物学
的物質をある種の型の個々の細胞の中に直接注入するた
めの注射針とし２て使用することができる。小さい細胞
を注入することが必要であるとき、非常に鋭い毛管を使
用することを要し、その先端は容易に破壊したりあるい
は詰まることがある。そのうえ、１ミクロンより小さい
毛管装置を通して体積流れを引き起こすために、非常に
高い圧力を必要とし、そしてこのような体積流れの調節
は困難であることがある。全体のブロセスはむしろ実験
的であり、異なる細胞の型について異なる修飾を必要と
する。

マイクロインジェクション技術の一般的説明は、次の文
献を参照のこと：　Ｄ　ｉａｃｕｍａｋｏｓ　（１９７
３）。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　
Ｐｒｅｓｃｏｔｔ　（編）、　ｐｐ。

２８７−３１１　；ＧｒａｅｓｓｍａｎおよびＧｒａｅ
ｓｓｍａｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８６）、　Ｂｉｏ
ｔｅｃｂｎｉｑｕｅｓ、　４：３２０−３３４；Ｒｅ１
ｃｈ　ｅｔａｌ、　（１９８６）、　Ｃａｎ、　Ｊ、　
Ｂｏｔ、　；　およびＲｅ１ｃｈ　ｅｔ、　ａｌ。

（１９８６）、　Ｂｉｎ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　４
：１００１−１００４゜マイクロインジェクション技術
は、細胞の回収における制限に悩まされる。植物細胞の
直接のマイクロインジェクションは、さらに、硬質細胞
壁の存在により複雑となる。細胞壁を欠く原形質体を形
成することができるが、植物細胞のマイクロインジェク
ションはそれらの極端な虚弱さにより困難となる。

こうして、マイクロインジェクションの欠点は、マイク
ロインジェクションが単細胞の操作を要求され、したが
って細胞の塊の処理のために不適切であるということで
ある。この方法は、一般に、非常に時間を要し、そして
困難である。結局、それは非常に低い効率および低い処
理量を有する傾向がある。

前述のシステムに加えて、核酸を細胞の中に送出すこと
ができる、いくつかの感染因子が存在する。植物の病原
体のアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｅｉｅｎｓ）は、そ
の中に収容するＴｉ（腫瘍誘発性）プラスミドからＤＮ
Ａの一部分を感染した植物細胞の中に転移するという先
天的能力を有する。Ｔ１プラスミドからのある種の配列
を有するアグロバクテリウム（八ｇｒｏｂａｃｔｅｒ　
ｉｕｍ）中のプラスミドの中に外来遺伝子を挿入するこ
とによって、バクテリアの形質転換の特性を使用して、
外来遺伝子を感染した植物細胞のゲノムの中に輸送する
ことができる。

双子葉植物細胞のためのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　（Ｆｒａｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、
　（１９８６）、　ＣＲ（：　Ｃｒ１ｔ。

ロウイルスのベクター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９８４）
、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２６：４０１−４０９）は、主として重要である。

レトロウィルス（ＲＮＡウィルス）を使用して、遺伝子
を動物細胞の中に送出すことができる。ウィルスが細胞
の中に入るとき、そのＲＮＡは宿主細胞のゲノムの中に
組み込む相補的ＤＮＡの逆転写のための鋳型として作用
する。このＤＮＡは分離し、そしてプラスミドの中に挿
入することができる。このプラスミドは、添加された追
加の遺伝子ヲモち、ヘルパーレトロウィルスの助けによ
り、細胞の形質転換に使用することができる。

しかしながら、これらのシステムはしばしば制御が困難
である。感染因子、例えば、Ｄ　Ｎ　Ａ送出し系を使用
するときの問題は数倍である。第１に、感染因子は制限
された宿主範囲を有する。仲介は個々の細胞レベルで典
型的には体組織を使用して、のみ実施することができ、
次いでこれは全体の植物に人工的に再生しなくてはなら
ない。これは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒ　ｉｕｍ）の感染に対して感受性である組織の型か
ら容易に再生することができる、作物の種へのアグロバ
クテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）介在の遺
伝子の形質転換の適用を制限する。アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ　ｉｕｍ）の自然の宿主範囲は
、双子葉植物および制限された数のりリアセアエ（Ｌｉ
ｌｉａｃｅａｅ）族の単子葉種にのみを包含する。同様
に、レトロウィルス、およびそれらが送出すＤＮＡの発
現は、宿主および組織特異性である傾向がある。

第２に、感染因子は、第２の生きている系を導入するこ
とによって、すべてのその同時の複雑さとともに、送出
しプロセスに追加のレベルの複雑性を付加する。例えば
、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｅｔｅｒ　ｉｕｍ
）介在の形質転換は、モノクローナル変異型を発生する
ことがあり、これらは植物組織中に組織培養において生
じ、そして形質転換体の同定を複雑にすることがある。

さらに、感染因子、例えば、レトロウィルスは潜在的に
危険であるーそれらは修飾される有機体を損傷すること
があるか、あるいは、組み換えにより、新しい病原体を
発生することがある。

比較的最近、サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）　　らは
、完全な組織の細胞の中に物質を送出すことができる方
法を開発した。（Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
７）、　Ｎａｔｕｒｅ。

３３７；および５ａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８ｇ＞、　ＰａｒｔｉｃｕｌａｒＳｃｉ、ａｎｄ　　Ｔ
ｅｃｈｎｏｌ、、　　５　二２７−３７）　。

これらの参考文献は、小さく、高い密度のタングステン
粒子（マイクロ投射体）は粒子のガン装置により高い速
度の加速することができることを教示している。サンフ
ォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）　　らは、マイクロ投射体を
十分な速度に加速して、植物細胞を次の実施態様を経て
浸透させることができることを教示している：　（１）
マクロ投射体くプラスチックの弾丸）および停止板、（
２）転移した機械的パルス、（３）気体（例えば、空気
）の排出、および（４）中心に向かう加速系。

粒子のガン装置はこの分野においである提案された進歩
を表すが、粒子の衝突のプロセスのその種々の実施態様
はある種の欠点を有する。例えば、種々の実施態様の各
々において、タングステン荷重の懸濁量は容易には再現
することができず、そして培養物を反復して接種するこ
とはむしろ労力を要する手順である。さらに、マクロ投
射体の実施態様（１）および気体排出の実施態様（３）
において、速度は発射特性における避けられない差とと
もに変化させなくてはならない。最後に、マクロ投射体
の実施態様（１）は次の追加の欠点を有するニブラスチ
ックの弾丸は速度を害し一強力な爆発を必要どする；速
度は容易には変化または制御することができない；そし
て火薬からの燃焼ガスは問題の物質となりうる。

したがって、非細胞の生物学的物質を生きている細胞お
よび組織の中に直接に効率よく送出すことができる技術
の開発は、有益であろう。１つの観点において、本発明
は、（ａ）気体出口を有する圧力下の気体源、（ｂ）入
口および出口を有する推進可能な物質の溜、および（ｃ
）多目的弁、からなり、ここで多目的弁は圧力下の気体
源の出口と推進可能な物質の溜の入口との間の選択的連
絡を提供することができる設計のものである装置を提供
する。第２の観点において、本発明は、工程＝　（ａ）
前以て決定した体積の気体を気体溜内に前以て決定した
圧力において準備し、（ｂ）前以て決定した量の推進可
能な物質を推進可能な物質の潔白に準備し、前記推進可
能な物質はキャリヤー媒体中の推進可能な物質の懸濁液
からなり、前記溜は気体出口と選択的連絡した溜入口、
およびオバーフロー入口および送出し入口と選択的連絡
した溜出口を有し、（ｃ）前記推進可能な物質と前以て
決定した体積の気体とを接触させ、そして（ｄ）推進可
能な物質を送出し手段を通して標的物質で加速する、か
らなる、生物学的物質を標的物質の中に導入する方法を
提供する。

本発明のそれ以上の特徴および利点は、図面を参照する
以下の説明から、いっそう明らかとなるであろう。

本発明は、一般に、推進可能な物質を加速する方法およ
び装置に関する。本発明は、特定の物質の推進のための
方法または装置に限定されず、むしろ多数のタイプの物
質の推進に使用することができることを理解すべきであ
る。しかしながら、本発明は、生物学的物質の懸濁液の
加速の方法および装置に原理的には適合する。

生物学的物質は、細胞または非細胞であることができる
。生物学的物質は、比較的小さく、好ましくは１ミクロ
ンより小さく、より好ましくは０．１ミクロンより小さ
くあることができる。一般に、使用する生物学的物質の
量は５Ｎまでであり、特定の量は使用する細胞物質のタ
イプに基づいて多分変化する。

“非細胞の生物学的物質°とは、次の物質を包含するこ
とを意味する：ウィルス（タバコモザイク病ウィルス（
ＴＭＶ）　、カリフラワーモザイク病ウィルス（ｃＡＭ
Ｖ）　、）ウモロコシ茎ウィルス（ＭＳＶ））など）、
オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、核、緑葉体また
は色素体）；遺伝子物質く例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）
またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プラスミドまたは
一重鎖または二本鎖の形態）；タンパクＸ（抗生物質ま
たは酵素）、または着色剤。

ＤＮＡが非細胞の生物学的物質であるとき、ＤＮＡは細
胞中の外因性遺伝子の発現のために適切なベクター中で
構成することができる。適切な形質転換ベクターは発現
ベクターを包含する。

発現のために適切なベクターは、一般に、所望の外因性
遺伝子のコー・ド配列の外に、適切なフランキング副筋
配列を包含する。このようなフランキング配列は、細胞
中で生体内の転写および発現を促進することができる適
切なプロモーター、およびタンパク質合成のためのメツ
センジャーＲＮＡの適切な翻訳を可能とする方法で、Ｒ
ＮＡの転写または適当な処理の終わりをシグナルするこ
とができる翻訳ターミネータ−を包含する。

ＤＮＡを生きている細胞の中に挿入するとき、ある段階
で子孫をスクリーニングして形質転換体について選択す
ることは好ましい。なぜなら、細■包のすべてがそれら
の中に挿入されたキャリヤー粒子を有するわけでなく、
そしてすべての細胞または子孫がＤＮＡをそれらのゲノ
ムの中に摂取するわけでないからである。次いで、細胞
中の所望のＤＮＡの存在を、ＤＮＡの性質に依存して、
広範な種類の方法で確立することができる。

形質転換ベクターは選択可能なマーカーを含有して、形
質転換された細胞の選択を可能とすることができる。選
択可能なマーカーは、生化学的にアッセイすることがで
きる特性または観測することができる表現型の特性を決
定することができる。

このような選択可能なマーカーの使用の別法は、形質転
換された子孫についてスクリーニングする形態学的また
は生化学的試験を包含する。形態学的スクリーニング試
験は、子孫における優生の表現型の特性についてである
ことができる。適切な生化学的スクリーニング試験は、
微生物、植物または動物の細胞のゲノム中の、形質転換
するＤＮＡそれ自体１ごハイブリダイゼーションするプ
ローブを使用する、いわゆる「サザン」プロットである
。

外因性産生物を産生ずる遺伝子の存在は、また、細胞の
分離および溶解、外因性産生物の細胞質および非細胞の
外因性遺伝子についての分析により、検出することがで
きる。外因性産生物は、電気泳動、クロマトグラフィー
、イムノアッセイ、ザザンブロツティングなどにより検
出することができる “細胞の生物学的物質”とは、細胞の微生物、植物細胞
または動物細胞の個々または多細胞の塊を意味する。

ここで使用するとき、用言吾“細胞の微生物”とは、バ
クテリアおよび原生動物を意味する。

ここで使用するとき、用語“植物細胞”とは、次のもの
を包含する：植物または植物の一部分、例えば、花、仁
、穂、穂軸、葉、殻、茎の中の完全な細胞；細胞壁また
は他の保護皮膜をもつか、あるいはもたない、植物の細
胞または組織、例えば、原形質体：植物のカルス；植物
の組織の塊；細胞レベル以下の構造体：花粉粒；植物の
分裂組織；卵；受精卵；発芽して植物になることができ
る種子。

植物細胞は、任意の植物種から誘導することができる。

用語“植物種”とは、次のものを包含することを意味す
る二車子葉（例えば、草、および穀類を生ずる生物、例
えば、トウモロコシ、ライムギ、オオムキ、コムキ、モ
ロコシ、カラスムギ、キビおよびイネ）；および双子葉
（例えば、広葉植物、例えば、タバコ、ジャガイモおよ
びアルファルファ）。

ここで使用するとき、用語“動物細胞”とは、哺乳動物
、魚、鳥、爬行動物、および両生類からの組織を包含す
る。

生物学的物質は、担体粒子の表面上に、種々の技術によ
り吸着させることができる。例えば、生物学的物質は、
後述するように、適当なキャリヤー粒子上で単に乾燥さ
せることによって調製することができる。

キャリヤー粒子は、細胞へ全体の物理的損傷を引き起こ
さないで、細胞膜および／または細胞壁を浸透するため
に十分な大きさ、形状および密度を有するべきである。

小さすぎるか、あるいは十分に密でないキャリヤー粒子
はある種の細胞壁を浸透することができないが、大きす
ぎるか、あるいは密であり過ぎるキャリヤー粒子は他に
対して致死的であろう。細胞の大きさ以外の因子、例え
ば、細胞壁の存在または細胞内の非細胞の豊富さは、ま
た、選択された大きさまたは密度により形質転換の効率
に影響を与えることがある。

一般に、キャリヤー粒子は０．１〜１００ミクロン、好
ましくは０．５〜５ミクロンの直径を有する。−般に、
キャリヤー粒子は１〜２５ｇ／ｃｒｌ好ましくは１０〜
２５ｇ１ｃｔｌの密度を有する。

キャリヤー粒子は生物学的に不活性の密な材料から作る
ことができる。材料の例は、次のものを包含する：ある
種の金属、例えば、タングステン、金、白金、パラジウ
ム、銀およびニツケノペラテックス、ガラス、セラミッ
ク、外科用合金、およびフェライトの結晶。

他の実施態様において、キャリヤー粒子は不活性材料に
よりカプセル化された生物学的物質であることができる
。例示のカプセル化剤はポリリジン（分子量２００．０
００）である。カプセル化剤は、キャリヤー粒子をカプ
セル化剤の溶液中ですすぎ、次いでこうして被覆された
粒子を空気乾燥または加熱乾燥することによって、キャ
リヤー粒子へ適用する。いったんキャリヤー粒子がカプ
セル化剤で被覆され、そして乾燥されると、生物学的物
質をキャリヤー粒子に付加することができる。あるいは
、生物学的物質のカプセル化は粒子上への生物学的物質
の沈澱と組み合わせて達成することができる。

さらに、細胞の生物学的物質は、原核または真核生物で
あり、凍結し、キャリヤー媒体中に懸濁させることがで
き、そして標的物質に直接加速するための投射体として
使用することができる。

しかしながら、本発明は、推進された生物学的物質とと
もに、キャリヤー粒子を使用することに限定されない。

推進された生物学的物質は、凍結し、キャリヤー媒体中
に懸濁させ、そして標的物質に直接加速するための投射
体として使用することができる。

推進された生物学的物質に対して有害でない任意の媒体
は、キャリヤーとして適切である。

生物学的物質は、生物学的物質を維持しおよび／または
細胞の代謝および増殖を支持することができる任意の媒
体であることができる。例示的培養は、次の文献中に教
示されている：　ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ
（１９５２）、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔａｒｕｍ
、　１５：４７３−４９６；および５ｅｈｅｎｋおよび
旧１ｄｅｂｒａｒ＋ｄｔ　（１９７９）　。

Ｃａｎａｄｉａｎ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｏ
ｔａｎｙ、　　５０８１９９−２０４゜キャリヤー媒体
は、キャリヤー粒子をその中に運ぶために有効な流れ性
質を有するように選択すべきである。キャリヤー媒体の
流れ性質は、推進可能な物質の密度、表面張力、有効体
積、および粘度に依存する。好ましくは、キャリヤー媒
体は細胞または非細胞の生物学的物質、および必要に応
じてキャリヤー粒子を懸濁することができるであろう。

一般に、キャリヤー媒体は、それが動くときその中に粒
子を維持するために有効な密度を有すべきである。好ま
しくは、キャリヤー媒体の密度は０．５〜２．０ｇ／ｅ
ｅであるべきである。

一般に、キャリヤー媒体はその凝集性の推進可能な物質
を維持するために有効な表面張力を有すべきである。好
ましくは、キャリヤー媒体の表面張力は２０〜８０ダイ
ン／　ｃｔｎであるべきである。

一般に、キャリヤー媒体は所望の数のキャリヤー粒子を
懸濁させるために有効な体積を有すべきである。好まし
くは、キャリヤー媒体の体積は０、５〜１０００Ｊ７、
より好ましくは５〜１００Ｉであるべきである。

一般に、キャリヤー媒体は凝集性の推進可能な物質を維
持しかつ粒子を懸濁させるために有効な粘度を有すべき
である。好ましくは、キャリヤー媒体の粘度は０．５〜
１０センチポアズ（ｃｐ）　、最も好ましくは０．５〜
２ｃｐであるべきである。

例示的キャリヤー媒体は、次のものを包含する：液体、
例えば、水、エタノール；緩衝液、例えば、リン酸塩、
クエン酸塩および酢酸塩の緩衝液；塩溶液、例えば、カ
リウム、ナトリウムおよびカルシウムの塩化物；および
細胞または非細胞の生物学的物質を凍結するとき、液体
窒素。

適切な標的物質は、細胞の生物学的物質、または非細胞
の生物学的物質であることができ、それらの各々は前述
した。生物学的物質は、前述したように、生物学的物質
を懸濁することができる任意の媒体中で培養／懸濁して
、それを微小粒子の衝撃の間支持することができる。

油層を細胞の上に適用して、媒体の液圧を制御しかつ、
浸透後の滲出をシールすることを促進することによって
細胞の生存能力を改良することができる。例えば、生き
ている細胞を等張溶液中に入れて、膜の穿刺の瞬間にお
いて、細胞膜の穿刺のゾーンにおいて細胞内物質および
細胞外溶液の浸透圧のバランスを維持することができる
。カルシウムイオンは、すべてのこれらの溶液中に膜安
定化剤として存在して、膜の損傷した部分が急速に回復
できるようにすることができる。例示的等張溶液は、次
のものを包含する一植物細胞についてのマイクロインジ
ェクション技術のために普通に使用する溶液；冷血動物
、原生動物および微生物の細胞のたんめのリンガ−溶液
；および動物細胞のためのリンがｍ−ロツク、リンガー
ータイロードおよび他の溶液。

標的物質のボンバード（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　）は
、推進可能な物質および標的物質の衝撃のときの分散の
ために、試料の一部分を失わさせることかできる。

標的物質を所定位置に保持するための例示的支持手段は
、濾紙、寒天媒質、金属スクリーン、および金スクリー
ンのかごを包含する。例えば、細胞の生物学的物質の引
き続くインキ１．ベーションおよび染色は、濾紙」二で
直接実施することができる。

他の実施態様において、標的物質および推進可能な物質
のビオチンを溶液の中に入れ、そしてキャリヤー媒体中
に懸濁した未被覆のキャリヤー粒子でボンバードするこ
とができる。このようなキャリヤー粒子は、それらの伴
流において、非細胞の生物学的物質を含有する所定の体
積の外部の溶液を細胞の生物学的物質の中に引き入れる
ことができる。

本発明の好ましい実施態様は、ここで図面を参照して説
明する。本発明の装置は、選択された気体圧力を有する
前以て決定された選択された体積の気体を、前以て決定
した量の推進可能な物質と接触させ、そして選択した標
的物質に向けて加速させることができる。

本発明の範囲内の、図面に示す、種々の実施態様を下に
説明する。

第１図において、参照数字１０で全体的に表示される、
装置が橙略的に描かれている。この装置１０は、入口お
よび出口を有する多目的弁７０、出口を有する圧力下の
気体源３０、出口を有する任意の推進可能な物質源２０
、入口および出口を有する推進可能な物質の溜４０、入
口および出口を有する任意の送出し手段５０、および入
口および出口を有する任意の回収手段６０からなる。

多目的弁７０は、圧力下の気体源３０または、必要に応
じて、推進可能な物質源２０、および推進可能な物質の
溜４００間の選択的連絡を提供するように調節すること
ができる設計を有するように、選択される。多目的弁７
０は、また、推進可能な物質の溜４０、および送出し手
段５０または、必要に応じて、回収手段６０のの間の選
択的連絡を提供するように調節することができる設計を
有するように、選択される。

第２図において、多目的弁７０の１つの実施態様は、第
１補助弁７０ａおよび第２補助弁７０ｂからなる。第１
補助弁７０ａは、圧力下の気体源３０の出口または推進
可能な物質源２０の出口、および推進可能な物質の溜４
００Å口の間の選択的連絡を提供する。第２補助弁７０
ｂは、推進可能な物質の溜４０の出口、および送出し手
段５０の入口または回収手段６０の入口の間の選択的連
絡を提供する。

例示的第１補助弁７０ａおよび第２補助弁７０ｂは、各
々、１つの３０弁または２つの２０弁であることができ
、ただし２つの２０弁は必要に応じて適切な手段を経て
操作的に結合している。操作的に協力して２つの２０弁
を維持するだめの例示的手段は、普通のアクチュエータ
ーまたは異なるアクチュエーター（図示されていない）
を包含する。

第１補助弁および第２補助弁は、適切な手段を経て操作
的に協力している。操作的に協力して２つの２０弁を維
持するための例示的手段は、普通のアクチユエーター（
７０Ｃで示すような）または異なるアクチュエーター（
図示されていない）を包含する。

第１補助弁および第２補助弁のアクチュエーターは、弁
への加圧した供給物のスイッチングを提供するように選
択する。例示的アクチュエーターは、ラックおよびピニ
オンのギヤで作動される二重作動の空気ユニットを包含
する。異なるアクチュエーターを使用するとき、アクチ
ュエーターはタイミング手段（図示されていない）によ
り同廂させることができる。例示的なタイミング手段は
、パイロットソレノイドまたは普通の作動軸と組み合わ
せた多極スイッチを包含する。

好ましくは、アクチュエーターはフットペダル（図示さ
れていない）と操作的に協力しており、これにより作動
を簡素化しそして装置の相対的処理１を増加させる。

推進可能な物質の溜４０は、好ましくは、推進可能な物
質の均一な射出を保証しかつ最小のハングアップ、すな
わち、推進可能な物質の溜４０の内壁への付着または濡
れ、を保証するために十分なアスペクト比で、内部の空
間を定めるように選択した内表面を有する。例示的推進
可能な物質の溜４０は、０．００５〜１００ｍ１の推進
可能な物質を保持することができるであろう。

一般に、推進可能な物質の溜４０は、物理学的に変形す
るようにならないで、推進可能な物質源２０から推進可
能な物質および／または圧力下の気体Ｒ３０から気体を
、供給するために十分に物理学的に強い材料から製作さ
れるであろう。好ましくは、推進可能な物質の溜４０は
、生理学的温度において少なくとも１０００ｐｓｉの圧
力に耐えることができる材料から製作されるであろう。

推進可能な物質の溜の製作において使用するための例示
的材料は、ステンレス鋼である。

第２図に示すように、推進可能な物質の溜４０内の温度
は、温度制御手段温度制御手段４２により制御すること
ができる。例示的温度制御手段は、推進可能な物質の溜
４０を取り囲むブロックヒーターの中に埋め込まれた熱
電対を包含する。

第１図および第２図における概略的表示はただ１つの推
進可能な物質の使用を示すが、装置ＩＯの操作において
記載した原理は、複数の推進可能な物質源からの２また
はそれ以上の推進可能な物質の推進に容易に適用するこ
とができる。

一般に、推進可能な物質の溜４０中の推進可能な物ｊｔ
源２０の体積は、推進可能な物質源２０の測定した再現
性ある試料を提供する手段により制御することができる
。管などを使用するとき、第１体積を保持することがで
きる１つの管を第２体積を保持することができる他の管
で３換することができる。しかしながら、装置はそのよ
うに限定されることを意図しない。例えば、レベルセン
サー（図示されていない）を、推進可能な物質の溜４０
中の推進可能な物質の体積の正確な再現性ある測定を提
供するために有効な任意の位置に、配置させることがで
きる。

第１図に示されるように、圧力下の気体Ｒ３０は気体供
給手段３１および、必要に応じて、気体調節手段３２か
らなる。圧力下の気体源は、前辺て決定した体積の気体
を推進可能な物質の溜４０の中に供給するように選択さ
れる。気体圧力は使用する気体の型および体積に依存す
る。一般に、気体圧力は１５〜１５０気圧であろう。

圧力下の気体源３０は、所望の圧力において推進可能な
物質の溜４０の中に気体を供給できる任意の手段により
調節することができる。気体調節手段は手動または自動
的に操作することができる。

好ましくは、圧力下の気体源３０は、装置１０の比較的
に急速に反復した作動を可能とする、体積の気体を推進
可能な物質の溜４０に連続的に提供することができるで
あろう。

例示的圧力下の気体源３０は、さらに第３図に記載す。

第３図に示すように、圧力下の気体源３０は（１）出口
を有する気体供給槽３１ａの形態の気体供給手段３１、
（２）入口および出口を有する気体供給ライン３３、お
よび（３）気体弁３３ａ１および入口および出口を有す
る気体溜３２ｂの形態の気体調節手段３２からなる。

気体供給槽３１ａの出口は、気体供給ライン３３０入口
と空気連絡している。次いで、気体供給ライン３３の出
口は、気体弁３２ａを経て、気体溜３２ｂと選択的空気
連絡している。

例示的気体供給手段３１は円筒および槽を包含する。

気体溜３２ｂは、任意の数の容器、例えば、管から選択
することができる。例示的気体溜は、１７！〜１００ｍ
！！の気体を保持することができるであろう。

一般に、気体溜３２ｂは、物理学的に変形するようにな
らないで、圧力下の気体源からの気体を供給するために
十分な強さの材料から製作することができる。好ましく
は、気体溜３２ｂは１５０気圧までの気体圧力に耐える
ことができるであろう。気体供給ラインの製作における
使用のための例示的材料は、ステンレス鋼を包含する。

気体は、要求される粒子の速度を生成するために十分に
急速な膨張を可能とする、十分に低い分子量を有するよ
うに選択すべきである。一般に、気体の分子量は２〜４
０気圧質量単位（ａｔｏｍｉｃ　ｍａｓｓｕｎｉｔ）で
あるべきである。例示的気体は、ヘリウム、水素および
空気を包含する。

第１図および第２図を参照して上に述べたように、本発
明の装置は、好ましくは、推進可能な物質の溜４０と選
択的流体連絡している推進可能な物質源２０からなる。

推進可能な物質源２０が存在しないとき、推進可能な物
質の溜４０は手動的に充填し、そして装置と流体連絡し
て付加することができる。

第１図に示されるように、そしてとくに第４Ａ図および
第４Ｂ図に示されるように、推進可能な物質源２０は、
前辺て決定された体積の推進可能な物質を推進可能な物
質の溜４０の中に提供することができるように選択され
る。

好ましくは、推進可能な物質源２０は、装置１０の比較
的に急速な作動を可能とするために、選択された体積の
推進可能な物質を推進可能な物質の溜４０に連続的に提
供することができるであろう。推進可能な物質源２０は
、推進可能な物質の供給手段２１からなる。例示的推進
可能な物質の供給手段２１は、注射器、槽、管または他
の導管を包含する。

一般に、推進可能な物質の供給手段２１は滅菌すること
ができる物質から製作することができるてあろう。例示
的材料は、ステンレス鋼およびポリテトラフルオロエチ
レンを包含する。

推進可能な物質供給手段に固有の調節能力に依存して、
装置は推進可能な物質の流れを調節することができる手
段、すなわち、推進可能な物質の調節手段２２からなる
ことができる。推進可能な物質の調節手段は、推進可能
な物質の供給手段２１揉作的に結合して、選択した体積
の推進可能な物質を推進可能な物質の溜４０中に供給す
ることができる。例示的推進可能な物質の調節手段は、
弁およびポンプを包含する。

前に示したように、推進可能な物質源２０の例示的実施
態様は第４Ａ図および第４Ｂ図に記載されている。これ
らの実施態様は、それから排出される選択された体積の
推進可能な物質を有することができる推進可能な物質源
を描写する。

１つの実施態様において、第４Ａ図に示すように、推進
可能な物質源は、（１）出口を有する注射器２１ａの形
態の推進可能な物質の供給手段２１、および（２）入口
および出口を有する推進可能な物質の供給ライン２３か
らなる。注射器２１ａの出［−１は、推進可能な物質の
供給ライン２３の入口と選択的流体連絡している。推進
可能な物質の供給ライン２３の出口は、推進可能な物質
の溜４０に導かれろ多目的弁７０の入口と流体連絡して
いる。

他の実施態様において、第４Ｂ図に見られるように、推
進可能な物質源は、（１）出口を有する推進可能な物質
の供給槽２１ｂの形態の推進可能な物質の供給手段２１
、（２）推進可能な物質の弁２２ａの形態の推進可能な
物質の調節手段２２、および（３）入口および出口を有
する推進可能な物質の供給ライン２３からなる。槽２１
ｂの出口は、推進可能な物質の弁２２を経て、推進可能
な物質の供給ラインと選択的流体連絡している。次いで
、推進可能な物質の供給ライン２３の出口は、推進可能
な物質の溜４０の導かれる弁７０の入口と連絡している
。

推進可能な物質が推進可能な物質の供給ＦＷ２１ｂ中で
維持される時間に依存して、推進可能な物質の供給槽２
１１）は、第４Ｂ図の別の実施態様に示すように、温度
制御手段２５操作的に結合して、推進可能な物質を所望
の温度に維持することができる例示的温度制御手段は、
推進可能な物質の供給槽２１ｂを取り囲むブロックヒー
ターの中に埋め込まれた熱電対を包含する。

キャリヤー媒体の相対粘度に依存して、推進可能な物質
の供給槽２１ｂは撹拌手段２４と操作的に結合して、粒
子をキャリヤー媒体の中に懸濁して維持することができ
る。例示的撹拌手段は、推進可能な物質の供給槽２１ｂ
内に交互する流れの方向をつる、往復する注射器ポンプ
、磁気撹拌棒の撹拌弁の配置およびポンプを包含する。

好ましくは、撹拌手段は、また、推進可能な物質の溜４
０内に交互する流れの方向をつくるように選択され、例
えば、往復注射器ポンプであろう。

第１図および第２図に示すように、推進可能な物質の溜
４０の出口は、多目的弁７０を経て、回収手段６０の入
口と選択的に連絡することができる。

回収手段６０は、推進可能な物質の溜４０からの過剰の
推進可能な物質のオーバーフローを可能とする。回収手
段６０は、推進可能な物質を捕捉する任意の手段を包含
する。好ましい回収手段は、物質が引き出されないよう
にシールされた管からなる。

このような設計は、また、オーブンシステムがらなり、
これに撹拌手段、例えば、往復注射器ポンプを選択的に
結合して、推進可能な物質の溜４０内に交互する方向の
流れを提供することができる。

回収手段６０は、推進可能な物質を含有しかつそれに対
して悪影響を及ぼさない、任意の材料から製作すること
ができる。好ましくは、推進可能な物質の溜から有意な
量の適当な推進可能な物質のオーバーフローを回避する
ために、回収手段６０は透明材料から作って、その中に
含有される物質の容易な測定を可能とする。オーバーフ
ローの視的検査を可能とする例示的材料は、ポリテトラ
フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）を包含する。

送出（２手段 第１図、第２図および第７図に見られるように、推進可
能な物質の溜４０の出口は、多目的弁７０を経て、送出
し手段５０と選択的に連絡することができる。

第５Δ図および第５Ｂ図にとくに示す送出し手段５０は
、マクロエイミング（ｌＴｌａｃｒｏａｉｍｉｎｇ）手
段５１および／またはミクロエイミング（ｍｉｃｒｏａ
ｉｍｉｎｇ）手段５２からなる。推進可能な物質の溜４
０（第１図および第２図に示す）から出る推進可能な物
質の力のために、送出し手段５０がミクロエイミング手
段５２からなるとき、それは、また、マクロエイミング
手段からなることが好ましい。

第５Ａ図に見られるように、マクロエイミング手段５１
はミクロエイミング手段５２と流体連絡している。

一般に、マクロエイミング手段５１は内表面を有し、こ
の内表面は推進可能な物質をバイパスする気体のために
、推進可能な物質の加速の実質的な損失を防止するた給
に十分な長さ、形状寸法および直径の孔を定めるように
選択する。好ましくは、マクロエイミング手段５１は、
５００〜２００ミクロン、好ましくは７５０〜１２５０
ミクロンの内径をもつ、−般に円筒形の孔を定める内表
面を有するように選択された管である。

マクロエイミング手段５１は、送出し条件下にその形状
を維持できる任意の材料から作ることができる。例示的
材料は、ガラス、プラスチックおよびステンレス鋼を包
含する。

送出し手段がマクロエイミング手段５１のみからなると
き、それはいわゆる「ショットガン」の点火のパターン
で推進可能な物質を加速するために使用できる。送出し
手段がミクロエイミング手段５２からなるとき、それは
推進可能な物質の比較的より正確な狙いを可能とする。

第１実施態様において、第５Ａ図に示すように、ミクロ
エイミング手段５２は次の構成成分からなる：ピペット
５２ａ１これはマクロエイミング手段５１と流体連結し
ている；三方マイクロマニ１、フレーター５２　ｅの可
動工具５２ｄにしっかり接続されたホルダー５２ｃ内に
配置されたマイクロインストルメント５２ｂ、マイクロ
マニュブレータ−５２６は、ビペッ）５２ａの位置を制
御する操作レバー（図示されていない）からなる。

ピペット５２ａは、推進可能な物質を通過させるために
十分な孔大きさの内径を有するように選択されるべきで
ある。ピペットの内径は、一般に、約１０〜約５００　
　ミクロン、好ましくは約１００〜約２５０ミクロンで
ある。ピペットは、普通に、よく知られた技術に従い毛
管から調製される（一般に参照、Ｇｒａｅｓｓｍａｎ　
　ｅｔ　　ａｌ、（１９８０）、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ　　ｙ６５８８１６−８２
５）。

例示的ミクロエイミング手段５２は、有益には、普通の
マイクロインジェクション装置から構成することができ
る。マイクロインジェクション装置は、ここに提供され
た教示が与えられると、比較的容易に変更してミクロエ
イミング手段を定めることができる。

普通のマイクロインジェクション装置および技術は、次
の８考文献中に教示されている：米国特許第４．７４３
．５４８号；Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８２）、　ＢＸＩ）。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　１４２ニア９−８４（１９８１
）；Ｐｕｒｒｅｓ（１９８１）。

！Ｊｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａ
ｒ　Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ　ａｎｄｌｏｎｏｐｈｏｒｅｓ
；０ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）、＾ｃｔａ　
Ｍｅｄ、Ｏｋａｙａｍａ。

３５：３８１−３８４；Ｌａｗｒｅｎｃｅおよびｎａｖ
ｉｅｓ（１９３５）、　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐ、
　４：３３−３５；５ｔｅｉｒ＋ｂｉｓｓ　ｅｔ　ａｌ
、　（１９８４）。

ａｎｄ　Ｐｙｓｉｏｌｏｇｙ；５ｔｅｉｎｂｉｓｓおよ
び５ｔａｂｅｌ　（１９８３）。

Ｐｒｏｔｏｐ）ａｓｍａ、　　１１６：２２３−２２７
；ＭｏｒｉｋａｗａおよびＹａｍａｄａ（１９８１）、
　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　２６：
２２９−２３６；Ｇｒａｅｓｓｒｎａｎ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、（１９８０＞、　　Ｍｅｔ、ｈｏｄｓ　　ｉｎ　　
Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

６５：８１６−８２５；　およびＬｉｎおよびＲｕｄｄ
ｌｅ（１９８１）。

［Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　　１３４：４８５−
４８８　。

さらに、視的に見ることができるが、送出し手段は好ま
しくは観測手段５８からなる。観測手段は標的物質に焦
点を合わすために有効な倍率、好ましくはＩＯＸ〜２０
０×を提供すべきである。例示的観測手段は、解剖顕微
鏡およびボロスコープ（ｂｏｒｏｓｃｏｐｅ　）を包含
する。

第２実施態様において、第５Ｂ図に見られるように１、
ミクロエイミング手段５２は観測手段５８操作的に結合
しているピペット５２ａからなる。

第１図、第５Ａ図、第５Ｂ図、および第７図に見られる
ように、送出し手段の出口は、標的物質をその中に配置
できる、推進ゾーン８０の中に開口している。

標的物質は適切なプラットホーム上に配置することがで
きる。例えば、ペトリ皿５９ａを使用して、標的物質を
含有することができる。マクロエイミング手段５１の狙
いを促進するために、標的物質は好ましくはＸ−Ｙ並進
段階５９ｂ上に配置することができる。

好ましくは、推進ゾーン８０は環境的に制御することが
できる。一般に、推進ゾーンはチャンバーにより定める
ことができる。

例えば、推進ゾーンを真空にすることができる。

真空の程度は、空気抵抗により引き起こされるのために
、粒子の速度の減少を回避しかつ推進可能な物質の散乱
を防止するために十分であるべきである。好ましくは、
推進ゾーンにおける真空の程度は０〜０．５気圧の間で
変化することができる。

適当な環境的に制御されるチャンバーは、次の文献中に
教示されている：　ｒＦｉｓｈｅｒ　８８Ｊ　。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　　Ｃａ
ｔａｌｏｇ　　ｏｆ　　ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ、　Ｉｎｃ、　、　　ペンシルベニア州ピッツバー
グ。

速度測定手段 他の実施態様において、装置１０は第１図、第６図およ
び第７図に示されているように速度測定手段９０からな
る。推進可能な物質の速度を監視することができる任意
の装置は、速度測定手段として使用するために適する。

一般に、速度測定手段は、加速される推進可能な物質の
速度を再現可能に測定できる任意の位置に配置すること
ができる。好ましくは、速度測定手段９０は送出し手段
５０上に配置することができる。

第６図に示すように、例示的速度測定手段９０は第１速
度センサー９２および第２速度センサー９４からなり、
前記センサーは送出し手段５０を横切る連続的位置に配
置する。

第１速度センサー９２は、源平段９２ａおよびセンサー
手段９２ｂからなる。第２速度センサー９４は、源平段
９４ａおよびセンサー手段９４ｂからなる。

例示的源手段９２ａおよび９４ａは、赤外エミッター、
例えば、赤外線発生ヂオード（ＬεＤ）、または他の同
様な光源を包含する。源取り付は手段が赤外エミッター
からなるとき、送出し手段は有益には透明材料、例えば
、ガラスまたは透明プラスチックから構成されている。

例示的センサー手段９２ｂおよび９４ｂは、フォトダイ
オード、フォトトランジスターまたは光電池を包含する
。

一般に、第１および第２のセンサーは、電気回路を経て
、多目的弁７０操作的に結合している。

一般に、回路は第１および第２のセンサーの間に飛行時
間（下の「実施例」の節、および第９図に見られるよう
に）を測定すべきである。好ましくは、回路は、速度測
定手段９０のすべての部分が推進可能な物質の加速と同
調することを確保するために「シーケンスタイミング（
ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔｉｍｉｎｇ）を提供することがで
きる。回路はタイミングの状態を確保した後、回路は速
度測定手段９０および多目的弁７０の間の操作的連絡を
提供することができ、これにより多目的弁７０を操作す
るために有効な１力の前辺て選択した時間間隔は圧力下
の気体源３０および推進可能な物質の溜４００間の連絡
を提供する。

任意の数の回路を当業者は案出して、前述の要件を達成
することができる。速度検出手段の例示的回路は、第８
Ａ図および第８Ｂ図に示されており、そして後述する。

同調手段 第７図に示すような他の実施態様において、装置１０は
推進可能な物質を装填しかつ加速する少なくともある要
素を同調するために有効な手段と操作的に協力すること
ができる。少なくともある装置の要素の同調は、実施し
なくてはならない工稈の数を減少し、結局作動の間に必
要な時間を減少しそして処理量を増加することを意図す
る。

同調手段の例示的実施態様は第７図に記載する。

同調手段１００は、装置１０操作的に結合しているコン
ピューター１１０からなる。

コンビコーター１１０は、ライン１０１を経て、ボック
ス１０２　と連絡しており、ボックス１０１は１系列の
センサーおりそれからのコマンドリード線を有する。

第１リード線１０２ａは、温度制御手段２５とセンサー
およびコマンド連絡することができ、これにより推進可
能な物質の供給槽２１ｂの温度は自動的に調節される。

第２リード線１０２ｂは、撹拌手段２４とセンサーおよ
びコマンド連絡することができ、これにより推進可能な
物質は選択した速度で撹拌される。

第３リード線１０２Ｃは推進可能な物質の調節手段２２
とコマンド連絡している。リード線は推進可能な物質源
を開いたまたは閉じた位置に維持する。

第４リード線１０２ｄは、第３リード線１０２ｃとセン
サ一連絡しており、そして多目的弁７０ａとコマンド連
絡している。推進可能な物質源が開いた位置維持されて
いるとき、多目的弁７０は推進可能な物質源２０および
推進可能な物質の溜４０の間の選択的流体連絡、および
推進可能な物質の溜４０および回収手段６０の間の選択
的流体連絡を提供する。

第５リード線１０２ｅは温度制御手段４２センサーおよ
びとコマンド連絡しており、これにより推進可能な物質
の溜の温度は調節される。

第６リード線１０２ｆは、第４リード線１０２ｄとセン
サ一連絡し、そして速度測定手段９０．！：コマンド連
絡している。選択した体積の推進可能な物質が推進可能
な物質の溜４０中に存在するとき、装置１０の点火のタ
イミングサイクルは開始される。

第７リード線１０２　ｇは第６リード線１０２ｆおり、
気体弁３２ａとセンサ一連絡している。速度検出手段の
タイミングサイクルが保証されるとき、気体調節手段は
開いた位置に維持される。第８リード線１０２ｈは第７
リード線１０２ｇおよび多目的補助弁７０ｂとセンサ一
連絡し手要る。圧力下の気体源が開いた位置にあるとき
、多目的弁７０は、推進可能な物質の溜４０を経て、圧
力下の気体源３０および送出し手段５０の間の選択的空
気連絡を提供する。

第９リード線１０２１は速度測定手段９０．１！：セン
サ一連絡している。選択した体積の圧力下の気体が推進
可能な物質の溜４０の中に放射され、そして加速された
体積の推進可能な物質が速度測定手段９０を通過した後
、推進可能な物質の速度はデイスプレィされる。

一般に、同調手段は、種々のセンサーのリード線により
提供されるデータを同化し、そして種々のコマンドリー
ド線を経て装置操作することができる任意の制御システ
ムであることができる。例示的同調手段は、単一のマイ
クロコントローラーまたはＣＡＭＩＬＥ■（Ｔｈｅ　Ｄ
ｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙの商標）デー
タ獲得およびプロセス制御システム（ＴｈｅＤｏｗ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手可能
である）を包含する。

操作 第１図に見られるように、装置は次のようにして操作す
ることができる。標的物質を推進ゾーンにおいて送出し
手段から前辺て決定した距離で選択的に配置することが
できる。

推進可能な物質標的物質が細胞の生物学的物質を包含す
るとき、標的物質は実質的な数の細胞の生物学的物質に
対して致死的でないであろう推進可能な物質と接触させ
るために有効な距離で選択的に配置するくしかし多少の
細胞は死亡することがある）。

一般に、標的物質は送出し手段の出口から１〜１００　
ｃｍの距離で配置されるであろう。

送出し手段がマクロエイミング手段のみからなる、すな
わち、ミクロエイミング手段ヲモたないとき、標的物質
は送出し手段の出口に対して５〜２０ｃｍの距離で配置
されるであろう。送出し手段がミクロエイミング手段か
らなるとき、標的物質は送出し手段の出口に対して１叩
〜１　ｃｍの距離で配置されるであろう。

第１図に一般に示し、そして選択した図面に詳しく描か
れている装置は、次のようにして操作することができる
。第１図、第２図および第４Ｂ図に見られるように、多
目的弁７０および推進可能な物質の調節手段２２ａをセ
ットして、推進可能な物質の供給手段２１および推進可
能な物質の溜４ｏの間の流体連絡を形成する。結局、推
進可能な物質は推進可能な物質源２０から推進可能な物
質の溜４ｏの中に行くことができる。

第１図および第２図に見られるように、多目的弁７０は
、また、推進可能な物質の溜４０および回収手段６００
間の流体連絡を形成するようにセットする。推進可能な
物質の溜４００体積を越える任意の体積の推進可能な物
質を回収手段６０の中に解放する。

第１図、第２図および第３図に見られるように、次いで
多目的弁７０および気体調節手段３２ａをセットして、
気体供給手段３１および推進可能な物質の溜４０の間の
流体連絡を形成する。結局、所望の速度で推進可能な物
質を加速するために十分な圧力下に選択された体積の気
体は、圧力下の気体源３０から推進可能な物質の溜４０
の中に入ることができる。

多目的弁７０を、また、セットして推進可能な物質の溜
４０および送出し手段５０の間の空気連絡を形成する。

いったん気体が推進可能な物質の溜４０の中に排出され
ると、それは推進可能な物質に対して接触し、推進可能
な物質は、存在する場合、送出し手段５０の中に加速さ
れる。第１図および第６図にみられるように、送出し手
段５０において推進可能な物質は第１センサー９２およ
び第２センサー９４を通るであろう。第１および第２の
センサー９２および９４は推進可能な物質の速度を記録
し、推進可能な物質の再現性ある加速を可能とする手段
を提供する。

好ましくは、推進可能な物質は有効な速度に加速される
。“有効な”速度は所望の結果に依存して変化するであ
ろう。

一般に、生物学的物質を細胞の生物学的物質の中に導入
する目的で、推進可能な物質の速度は生物学的物質を細
胞の膜、および存在する場合、壁を浸透させるために有
効であるべきである。好ましくは、このようなシステム
について、推進可能な物質は送出し手段を出る時点で２
００マイル／時間（＋ｍｐｈ）〜１２００ｍｐｈの速度
を有するべぎである。

明らかなように、推進可能な物質の速度は種々ノ既知の
パラメーターに依存する。このようなパラメーターは、
次のものを包含するが、これらに限定されない：送出し
手段の長さおよび内径；気体圧力；気体の流れの性質：
推進可能な物質の流れの性質；送出し手段の出口と標的
物質との間の距離；および標的物質が培養される媒体の
体積および性質。

推進可能な物質の流れ特性はとくに臨界的ではない。こ
うして、推進可能な物質は栓流、または乱流で加速する
ことができる。“栓流”とは、推進可能な物質が一般に
連続の塊として動き、そして気体および推進可能な物質
のゾーンは実質的に相互に混合されないことを意味する
。“乱流”とは、所定の点における速度の大きさおよ方
向が不定に変化し、結局気体および推進可能な物質の多
少の混合が起こる流体の流れを意味する。乱流が起こる
場合、推進可能な物質および気体は相互作用して分散を
つくり、結局装置から排出されるとき、推進可能な物質
のより広いカラムのビームを形成する。

圧力下の気体は推進可能な物質と直接接触し、そしてそ
れ自体推進ゾーンの中に解放されるので、溜の中に入れ
られる推進可能な物質は再現的に推進ゾーンの中に排出
される。小さいが再現性ある比率の推進可能な物質は送
出し手段中に止まる。

基本的には、推進ゾーンの中に排出されない唯一の推進
可能な物質は、弁および排出手段の内壁に付着またはそ
れを濡らすものである。このような推進可能な物質は“
ハングアップ”と呼ぶ。ハングアップの量は、特定の推
進可能な物質の速度に依存し、そしてそれとともに変化
する。

推進可能な物質の速度は、速度検出手段をそれが通ると
きに測定する。さらに詳しくは、送出し手段上に位置す
る速度検出手段の第１および第２のセンサーの間の飛行
時間は、推進可能な物質の速度を示す。

推進可能な物質の飛行時間の再現性測定を提供すること
によって、当業者は推進可能な物質の速度に影響を与え
る種々のパラメーターを調節することができる。パラメ
ーターの調節により、推進可能な物質の最適な速度を選
択することができる。

所望の体積の推進可能な物質は送出し手段から出て推進
ゾーンの中に入る。

操作は多目的弁７０を選択的にセットして、気体溜３２
から推進可能な物質の溜の中への気体の流れを遮断する
ことによって完結する。

正確な説明は、本発明による装置の操作において考慮さ
れる基準の一般的考えを提供することを意図する。上の
教示が与えられると、使用する各システムのための操作
条件の選択は当業者とって明らであろう。

本発明は、植物細胞、動物細胞および微生物を包含する
、種々の生物学の科学において使用することができる。

本発明の主張する特徴は、細胞壁が完全である植物細胞
の処理を可能とすることである。原形質体からの再生す
る全植物の障害を回避することができるので、重要な穀
物種の遺伝子操作を促進することができる。

植物の生殖系列の形質転換のための２つの重要標的は、
花粉または卵、および分裂組織のドーム（ｄｏｍｅ）ま
たは組織培養細胞（完全な植物および胚から、または組
織培養物から）である。花粉、卵、または分裂組織のド
ームの形質転換は、性的に増殖する作物について可能な
方法であるが、組織培養細胞または分裂組織のドームの
形質転換は無性的に増殖する作物について可能な方法で
ある。

これらのアプローチの各々は形質転換された全植物を産
生ずることができる。

組織培養細胞を形質転換し、次いで培養して体胚または
分裂組織のドームを提供し、次いでこれらを転移された
植物に再生することができる。

例えば、分裂組織の形質転換は、分裂組織のドームを外
科的に露出し、そしてそれをＤＮＡを有する粒子で衝撃
し、多数の分裂組織の細胞を形質転換させることによっ
て達成することができる。

形質転換された分裂組織はキメラ性の新芽に成長し、こ
れらから安定した形質転換されたセクター（ｓｅｃｔｏ
ｒ）を選択する。

遺伝子を未熟の胚の軸の中に挿入し、次いでこれを使用
して植物を再生する方法の一般的説明は、次の文献に記
載されている：　ＭｅＣａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８８）。

Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　６８９２３−９２
６　　。

最後に、クラミドモナス（ｃｈ　Ｉａｍｙｄｏｍｏｎａ
ｓ）、単細胞の藻類、における葉緑体の投射体のボンバ
ードを使用する形質転換が、また、報告されている（Ｂ
ｏｙｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）、　Ｓｃｉ
、、　２４０：１５４３−１５３７）。

タラミドモナス・レインハードチイ（ｃｈ　ｌａｍｙｄ
ｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体ａｔｐ
Ｂの遺伝子の３つの突然変異体を、野生型遺伝子を含有
する葉緑体ＤＮＡで形質転換した。光合成能力は形質転
換体において復帰された。

動物組織における細胞の小さい群の遺伝子形質転換は、
本発明の方法および装置を使用して、今回可能となった
。このような治療は非感染性であるが、高度に効率よい
、そして組織のその場の形質転換の機構を提供する。一
般的説明については、上の５ａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ
、を参照。

投射体のボンバードによる酵母菌中のミトコンドリアの
形質転換が、報告されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅｔ　
ａｌ、　（１９８８）、　Ｓｃｉ、、　２４０：１５３
８（５４１）。この参考文献は、０×ｌ　３欠失を補正
することができるＤＮＡ配列をもつミトコンドリアのｏ
ｘｉ　　３遺伝子における欠失のために、呼吸欠損であ
る酵母菌の非復帰株の形質転換を教示している。欠損の
ｏｘｉ３遺伝子の相同性置換を含有する呼吸コンピテン
ト形質転換体が得られた。

外来のバイオポリマー、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、
脂質および有機および無機の両者の化学物質の運命は、
これらの分子または分子の組み合わせで被覆した粒子を
発射することによって分析することができる。

さらに、分離細胞以下のオルガネラ、例えば、ミトコン
ドリアまたは葉緑体を形質転換し、次いで形質転換され
たオルガネラを植物細胞または原形質体の中に再挿入す
ることができる。

実施例 次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

これらの実施例は本発明を限定しない。すべての部およ
び百分率は、特定しない限り、重量による。

推進可能な物質は次のようにして調製した。

ＤＮＡを含有するプラスミドで被覆（７たキャリヤー粒
子をキャリヤー媒体中に懸濁した。さらに詳しくは、プ
ラスミドを金粒子の表面に吸着させた。プラスミドはあ
る遺伝子を含有し、この遺伝子は酵素のベーターグルク
ロニダーゼをコードしくＧｔｌＳ遺伝子）そして３５８
カルフオルニアモザイクウイルス（ｃａＭＶ）のプロモ
ーターの制御下にあった（ｃ１ｏｎｔｅｅｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、米国カリフォルニア州
バロアルトから得られた遺伝子、プロモーターおよび調
節配列）。金粒子は直径が１．５〜３．０ミクロンであ
る球の粉末であった（ＡｌｆａＰｒｏｄｕｃｔｓ、マザ
チュセッツ州ダンバース、から商業的に入手可能である
）。

吸着を達成するために、プラスミドの溶液（１６８趨の
ＤＮＡ／ＩＩＩの０．０１モルのトリス緩衝液、ｐＨ８
，０，０，００１モルのエチレンジアミンテトラ酢酸（
ＥＤＴＡ））を、４００　ｄの金キャリヤー粒子の懸濁
液（３００■の全担体粒子／ｒｄ、の蒸留水）に添加し
た。ＤＮＡを１４ｄの２．５モルの塩化カルシウム溶液
および３０８１００．１モルのスパーミジン溶液の添加
により沈澱させた。被覆したキャリヤー粒子をエッベン
ドルフ管の底に沈降させ、そして生ずる透明な液体を完
全に排出した。キャリヤー粒子を５００４のエタノール
（１００％）（担体媒質）中に再懸濁した。１つのキャ
リヤー粒子をほぼ１０コピーのプラスミドで被覆した。

標的物質は次のようにして調製した。栽培変種植物のメ
キシカン・ブラックスイウィート（ＢｌａｃｋＭｅｘｉ
ｃａｎ　Ｓｗｅｅｔ＞　（ＢＭＳ＞　？メの細胞の懸濁
培養物を、バージニア・ワルボット（Ｖｉｒｇｉｎｉａ
　Ｗａｌｂｏｔ）教授（スタンフォード大学）から得た
。ＢＭＳは５ｈｅｒｉｄａｎ（１９７５）、　Ｊ、Ｃｅ
１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　６７：３９６９に記載されている
。これらの培養物は、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２■／ｉ）を補充した液体のムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ）およびスクーグ（Ｓｋｏｏｇ）（ＭＳ）培地（
Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、　１９６２．１
５：４７３−４９６）中で日常的に維持した。

キャリヤー粒子のボンバードのための調製において、１
００　ｍｇの細胞の試料を７ｃｍのワットマンＮα１濾
紙上にブフナー漏斗上の真空濾過により懸濁液から集め
た。細胞を有する濾紙を、固体の形態の前述のＭＳ培地
を含有する９ｅｍベトリ皿５９ａの中に配置した。

８ＭＳマメ細胞に被覆した金粒子を加速するために使用
した装置は、第１図、第２図、第３図および第４Ａ図に
記載する、次ぎの要素から成っていた。

（１）ヘリウムガスを充填したＩＡの大きさの気体シリ
ンダー（すなわち、気体供給手段３１）は、寸法７’　
Ｘｏ、０２”内径を有するステンレス鋼の毛管（気体供
給ライン３３）と流体連絡していた。気体供給ラインは
標準の２段階圧力側節弁（ＶｉｃｔｏｒＥｑｕｉｐｍｅ
ｎｔ　Ｃｏ、から商業的に入手可能である）（すなわち
、気体調節弁３２ａ）と操作的に結合していた。気体供
給ラインは、１／８”外径×３″長さの寸法を有する高
い圧力のステンレス鋼の気体チャンバー（すなわち、気
体溜３２ｂ）と連絡していた。

（２）　３ｃｎ　（ｃｅ）のルエル・ロック（Ｌｕｅｒ
　Ｌｏｋ）の無菌の注射器（すなわち、推進可能な物質
の供給手段２１ａ）は、１／１０”のテフロン（Ｔｅｆ
ｌｏｎ）（Ｅ、　１．ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏ
ｕｒｓ　＆　Ｃｏ、、プラウエア州つイルミントンの商
標）ＦＥＰ管（すなわち、推進可能な物質の供給ライン
２３）と流体連絡していた。この管はレオジン（Ｒｈｅ
ｄｙｎｅ）　７０３０型の３方弁（すなわち、多目的弁
７０）操作的に結合していた。

（３）透明な１／１０”外径のＦＥＰ管（すなわち、回
収手段６０）。

（４）ｌＯｃｍｘｌ。２市外径Ｘ　０．８　ｍｍ内径の
寸法を有するパイレックスガラス管（すなわち送出し手
段５０）　、。

（５）送出し手段５０上に互いにに関して隣接して位置
する２つのセンサーから構成された速度検出手段。各セ
ンサー（第１センサー９２および第２センサー９４）は
、光ダイオードおよび赤外エミッターから構成されいた
。光ダイオードは商業的に入手可能であり（Ｍｏｔｒｏ
ｌａ　Ｓｅｍ１ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
。

Ｉｎｃｌ、米国アリシナ州から、商品名ＭＲＤ５００）
　、そして赤外エミッターも商業的に入手可能である（
Ｇｅｎｅｒａｌ　ＢｌｅｅｔｒｉＣから、商品名ＬＥＤ
５５［：）。

第１および第２のセンサーは、第８Ａ図および第８Ｂ図
の概略的表示に示すような設計を有する電気回路を経て
、操作的に結合していた。

速度測定手段９０および多目的弁７００間の操作的組み
合わせを描写する、第８Ａ図および第８Ｂ図について下
に詳細に説明する。

ブロック１１３はシーケンスタイミングを提供し、作動
ｍｎｄ（すなわち、点火ボタンｉｉａ　ａ　＞が押され
た後、回路のすべての部分はタイミングサイクルのため
に調製された。ブロック１１３は信号１１３　ｂ　’を
同時に、ブロック１１２を経て（信号１１３ｂ”として
受は取られる）、フリップフロップ１１５ａ（信号１１
２ｂとして受は取られる）に間接的に送り、タイマーを
停止させ、そして信号１１３　ｂ　’を直接プリップフ
ロップ１１５ｂ（信号１１３　ｂ　’として受は取られ
る）に送り、ブロック１１５をリセットして１つのみの
開始信号（ｌｌｌｂ＞を受は取り、そしてカウントタイ
マーブロック１１６をゼロにクリアーする。間接の信号
は、第２センサー９４のオブチクス（Ｒ手段９４ａおよ
びセンサー手段９４ｂにより描写されている）が推進可
能な物質の通過を記録しなかった場合、フェイルセイユ
として供給されてタイマーを停止する。次いで、ブロッ
ク１１３は信号１１３ｃを提供して、ブロック１１４に
おけるタイマー（すなわち、第８Ａ図の１１４ａの作動
を開始させる。

ブロック１１４はブロック１１３から信号１１３ｃを受
は取り、次いでソリッドステートのリレー（すなわち、
第８Ａ図において１１４　ｃ　）を経て前置て選択した
時間間隔を提供して、４方弁（すなわち、第８Ａ図にお
いて１１４　ｂ　）を操作し、この弁は選択した体積の
空気圧力を多目的弁７０上の空気アクチュエーター（図
示せず）に送る。これは多目的弁ＴＯを操作して、圧力
下の気体源および推進可能な物質の溜の間の連絡を提供
した。

ブロック１１１は、第１速度センサー９２の源手段およ
びセンサー手段（源手段９２ａおよびセンサー手段９２
ｂにより描写されている）の間を通る推進可能な物質に
より発生される信号１１１ａを受は取り、そして信号を
コンディショニングし、そして信号１１１　ａ　％すな
わち、タイマーを始動することができる「開始」信号１
１１ｂ、の電圧の低下に時間が相当する、鋭く上昇する
電圧の信号を生成した（第８Ｂ図におけるブロック１１
６）。

ブロック１１２は、第２速度センサー９４の源平段およ
びセンサー手段の組み合わせの間を通る推進可能な物質
により発生される信号１１２ａを受は取り、そして信号
１１２　ａ　、すなわち、タイマーを停止することがで
きる「停止」信号１１２　ｂ　、の電圧の低下に時間が
相当する、鋭く上昇する電圧の信号を生成した（第８Ｂ
図におけるブロック１１６）。

フリップフロップ１１５ａはブロック１１１から「開始
」信号１１１ｂ、ブロック１１２から「停止」信号１１
２ｂを受は取り、そしてフリップフロップ１１５ｂはシ
ーケンスブロック１１３から「クリアータイマー」信号
＜１１３ｂ”）を受は取り、そしてタイマーの状態を維
持し、すなわち、推進可能な物質の１つの送出しサイク
ル当たり１つのみのタイミングサイクルを可能とした。

フリップフロップ１１１ａは信号１１５Ｃを発生し、こ
の信号はブロック１１６へ送られる。

ブロック１１Ｇは、クロック集積回路１１６ａおよびデ
ィジタルカウンター１１６ｂからなる、石英結晶安定化
タイマーから構成された。ブロック１１７は、７つのセ
グメントのデイスプレィデコーダー（すなわち、第８Ｂ
図において１１７　ａ　）へのマルチブレツクスト・バ
イナリ−・コーテッド・デジーｒル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｘｅｄ　ｂｉｎａｒｙ　ｃｏｄｅｄ　ｄｅｃｉｍａｌ）
　（ＢＣＤ）およびＬＥＤデイスプレィ　（すなわぢ、
第８図において１１７　ｂ　）から構成された。こうし
て、ブロック１１７は最も最近の飛行時間をデイスプレ
ィする。

ディジタルカウンター１１６ｂは、タイミングの状態の
信号１１３ｂ”および１１５Ｃをブロック１１５から受
は取った。これらのタイミングの状態の信号は、「タイ
マー〇ラン」　（すなわち、１１５ｃ）および「タイマ
ーのクリアー」　（ずなわら、１１３ｂ”）であった。

タイマー〇ランの信号がΦであるとき、タイマーのブロ
ックはゼロからマイクロセカンドまでをカウントする。

タイマー〇ランの信号が１２ボルトであるとき、タイマ
ーは停止し、そして最後のカウントを保持した。タイマ
ーのクリアーの信号がΦボルトであるとき、タイマーは
作動した。タイマーのクリアーの信号が１２ボルトであ
るとき、タイマーはゼロにクリアーされた。デイスプレ
ィブロック１１７はブロック１１６からＧＣＤの数の信
号をブロック１１６から受は取り、こうしてフロントパ
ネルのデイスプレィに推進可能な物質の最も最近の飛行
時間をμ秒で表示した。

例示的回路を示したが、多数の回路は同一の結果を達成
することができた。

（６）２つの補助弁（補助弁７０ａおよび７０ｂ）を有
する二重の３方弁（多目的弁７０）　（Ｒｈｅｏｄｙｎ
ｅ。

Ｉｎｃ、、　　カリフォルニア州から商品名７０３０Ａ
ＲＶ型で商業的に入手可能である）。二重３方弁７０の
補助弁は、空気アクチュエーター（キット１４１６８゜
Ａｎｓｐｅｃ　Ｃｏ、、　　ミシガン州アンアーバー、
から商業的に入手可能である）と操作的に結合していた
。

空気アクチュエーターは４方ソレノイド弁（Ａｕｔｏｍ
ａｔｉｃＳｗｉｔｃｈ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　（ＡＳＣＯ
）、ニュージャーシイ州フロルハムバーク、から商業的
に入手可能である）から供給される空気により駆動され
た。

（７）ステンレス鋼から作られた外部のループ４０．１
／１６”外径（すなわち、推進可能な物質の溜）は、第
１および第２の３０弁と操作的に結合していた。

第１の３０弁は、推進可能な物質の供給手段または気体
溜、および推進可能な物質の溜の間の選択的流体連絡を
提供した。

第２の３０弁は、推進可能な物質の溜および回収手段ま
たは送出し手段の間の選択的流体連絡を提供した。

多目的弁は、最初にセットして、注射器および推進可能
な物質の流体連絡を提供し、そして気体溜および推進可
能な物質の溜の間の空気連絡を遮断した。

１艷の推進可能な物質（被覆した粒子のキャリヤー媒体
の懸濁液）を送出すことができる注射器を、推進可能な
物質の供給ラインと流体連絡して配置した。推進可能な
物質の供給ラインは、推進可能な物質の溜と流体連絡し
ていた。

推進可能な物質の調節弁２２ａを開いて、推進可能な物
質の調節手段および推進可能な物質の溜の間の流体連絡
を提供した。選択された体積の推進可能な￥ｙＪ質は推
進可能な物質の溜の中に入れた後、推進可能な物質の弁
を閉じた。

推進可能な物質の（留の体積に対して過剰の任意の体積
の推進可能な物質は、回収手段を通して解放した。

気体調節体積３２ａを開いて、気体供給手段および気体
溜の間の空気連絡を提供した。約１０００ｐｓｉの気体
圧力が気体溜において得られた。次いで、気体調節弁を
閉じた。

操作の残りは、第８Ａ図および第８Ｂ図に記載する回路
を経て制御した。回路は次のようにして操作した。

点火ボタン１１３ａを押した後、ブロック１１３は０．
０５秒のシーケンスタイミングを提供して、ブロック１
１６のディジタルタイマーを一時的に停止させた。ブロ
ック１１５はブロック１１６の状態を保持し、すなわち
、誤差により、ディジタルタイマーが、装置の以前の作
動の後、なおタイミングしている場合、ディジタルタイ
マーを次のタイミングサイクルのための準備においてゼ
ロにクリアーした。ディジタルタイマーが停止した後、
ブロック１２５のタイマーの状態をセットして、ブロッ
ク１１１から１つのみの開始信号を受は取った。

次に、間隔のタイマーブロック１１４を始動した。

間隔のタイマーブロック１１４は、１２０ボルトの交流
（ＶＡＣ）の０．８秒のプリセット時間間隔を供給して
、弁１１４　ｂを作動し、６５〜７５ボンド／平方ゲー
ジ（ｐｓｉｇ）の空気を供給して多目的弁７０上の空気
アクチュエーター（図示せず）を駆動して、多目的弁を
セットして、気体源および推進可能な物質の溜の間の選
択的連絡を提供し、これは加圧された気体および推進可
能な物質を第１および第２のセンサーを過ぎて加速させ
た。

推進可能な物質の前縁が速度検出手段の第１センサーを
過ぎたとき、電気信号（１１１ａ　）が発生した。ブロ
ック１１１　によりコンディショニングされたとき、電
気信号はブロック１１５により使用されてディジタルタ
イマーのブロック１１６を始動する信号であった。

同様に、推進可能な物質の前縁が速度検出手段の第２セ
ンサーを過ぎたとき、電気信号（ｌｌｌｂ）が発生した
。ブロック１１２によりコンディショニングされたとき
、電気信号はブロック１１５により使用されてディジタ
ルタイマーのブロック１１６を始動する信号であった。

第１センサー手段および第２センサー手段の間の推進可
能な物質の前縁の飛行時間は、ブロック１１７のマルチ
セグメントのＬＥＤインジケーターの（３デイジツト、
７セグメント）、ＬＥＤデイスプレィ（すなわち、１１
７ｂ）上に表示された。

第９図は装置の操作の生のデータを記載する。

電気信号１１１ａをセンサー９２から誘導し、そして電
気信号１１２ａをセンサー９４から誘導した。センサー
は２．８　ａｍで離した。推進可能な物質がいずれかの
センサーの間を通るとき、電気信号は基線からシフトす
るであろう。電気信号１１１ａについて、このシフトは
線１０点に示し、そして電気信号１１２ａについて、こ
のシフトは線２の点に示される。第１および第２のセン
サーの間の移動時間は、線１および２の間の距離として
示したとき、６μ秒であった。これが示すように、推進
可能な物質は約６０５１ｍ／秒（１０４４マイル／時間
）の速度で移動していた。

推進可能な物質は、送出し手段から出て推進ゾーンにお
ける８ＭＳ細胞に向かって推進した。推進ゾーンは真空
にしたチャンバーにより定められ、その設計は前述のｒ
Ｆｓｈｅｒ８８Ｊ、　ｐ、１１４中に教示されていた。

推進ゾーンの圧力は約０．１絶対気圧であった。

操作は、弁をセットして気体溜から弁を通り送出し手段
の中に入る気体の通行を遮断し、そして注射器および推
進可能な物質のオーバーフローの溜の間の流体連絡を提
供することによって完結した。

ＭＳ培地のペトリ皿（すなわち、ペトリ皿５９ａ）上の
８ＭＳ細胞の単層を同時にボンバードした。

各ぺ）　ＩＪ型皿上１００　ｍｇの８ＭＳ細胞が存在し
た。

ＧＵＳを含有するプラスミドで被覆されたキャリヤー粒
子を８ＭＳ細胞の中に送出した。

８ＭＳ細胞のボンバードの後、培養物を暗所で２日間２
７℃１ごおいてインキユベーションした。２日後、細胞
をＧＵＳ活性についてアッセイした。

８ＭＳ細胞中のＧＵＳ遺伝子の発現は、ＧｔＪＳ組織化
学的アッセイを使用して観測した（ｃ１ｏｎｔｅｃｈＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　、　　カリフォ
ルニア州バロアルト、から入手した５−Ｂｒ　−４−Ｃ
１−３インドリル−ベーターＤ−１’ルクロン酸［Ｘ−
ｇｌｕ　］　基’Ｘおよび手順）。８ＭＳ細胞および細
胞の塊を、３７℃において２４〜４８時間の間、０．５
　ミ＋Ｊモルのフェリシアン化カリウム、０．５ミリモ
ルのフェロシアン化カリウムおよび１０ミリモルのεＤ
ＴＡを含有する１ミリモルのＸ−ｇｌｕの溶液中でイン
キュベーションした。このアッセイで青色になった細胞
および細胞の塊を、Ｇ　Ｌｌ’　Ｓ活性について陽性と
してスコアを付けた。

結果を表１に記載する。

表 潤 反復 反復 反復 反復 反復 反復 反復 反復 これらの発見が示すように、粒子のボンバードを使用し
て、ＤＮＡを完全な植物細胞の中に同時に送出され、そ
してこの方法により導入された遺伝子は引き続いて発現
されることができる。

上の説明から明らかなように、ここに示しそして記載し
たものに加えて本発明の種々の変更は上の説明および添
付図面から当業者には明らかとなるであろう。この理由
で、上の説明のすべては単なる例示であり、そして特許
請求の範囲に記載しかつ規定したもの除外して、本発明
の限定または制限するもと解釈すべきではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１つの実施態様に従う装置の概略的
表示である。 第２図は、第１図の装置を本発明に従い使用するための
弁の概略的表示である。 第３図は、第１図および本発明の装置とともに使用する
ための圧力下の気体源の電子顕微鏡の概略的表示である
。 第４Ａ図および第４Ｂ図は、第１図の装置とともに本発
明に従い使用するための推進可能な物質源の種々の実施
態様の概略的表示である。 第５Ａ図および第５Ｂ図は、第１図に示すような装置と
ともに本発明に従い使用するための推進および観測手段
の概略的表示である。 第６図は、本発明とともに使用するための速度検出手段
の例示的実施態様の概略的表示である。 第７図は、第１図に示すような装置とともに本発明に従
い使用するための同調手段の概略的表示である。 第８Ａ図および第８Ｂ図は、“実施例″のセクションに
記載した、第６図の速度検出手段とともに使用するとき
の、電気回路の概略的表示である。 第９図は、“実施例”のセクションに記載した、電気回
路により推進可能な物質のフライト時間を測定するため
に使用する生データのグラフの表示である。 ０ ０ １ １ａ １ｂ ２ ２ａ ３ ５ 装置 任意の推進可能な物質源 推進可能な物質の供給手段 注射器 推進可能な物質の供給槽 推進可能な物質の調節手段 推進可能な物質の弁 推進可能な物質の供給ライン 温度制御手段 ０ ３１ １ａ ２ ２ａ ２ｂ ３ ０ ２ ０ １ ２ ２ａ ２ｂ ２ｃ ２ｄ ２ｅ ８ ９ａ ９ｂ 圧力下の気体源 気体供給手段 気体供給槽 気体調節手段 気体弁 気体溜 気体供給ライン 推進可能な物質の溜、外部のループ 温度制御手段 任意の送出し手段 マクロエイミング手段、送出し手段 ミクロエイミング手段 ピペット マイクロインストルメント ホルダー 可動工具 マイクロマユニブレイター 観測手段 ベトリ皿 Ｘ−Ｙ並進段階 ０ ０ ０ａ ０ｂ ０ ０ ２ ２ａ ２ｂ ４ ４ａ ４ｂ ００ １０ ０１ ０２ ０２ａ ０２ｂ ０２Ｃ ０２ｄ 任意の回収子役 多目的弁 第１補助弁 第２補助弁 推進ゾーン 速度測定手段 第１速度センサー 源手段 センサー手段 第２速度センサー 源手段 センサー手段 同調手段 ］ンビコーター ライン ボックス 第１リード線 第２リード線 第３リード線 第４リード線 １０２ｅ　　第５リード線 １０２ｆ　　第６リード線 １０２ｇ　　第７リード線 １０２ｈ　　第８リード線 １０２１　　第９リード線 １１１　　　ブロック １１１ａ　　信号 １１１ｂ　　開始信号 １１２　　　ブロック １１２ａ　　信号 １１２ｂ　　信号 １１３　　　ブロック １１３ａ　　点火ボタン １１３　ｂ　’信号 １１３ｂ”信号 １１３Ｃ信号 １１４　　　ブロック １１４ａ　　タイマー １１４ｂ弁 １１４ｃ　　ソリトステートのリレー １５ａ １５ｂ １５Ｃ １６ １６ｂ １７ １７ａ １７ｂ フリップフロップ フリップフロップ 信号 ブロック ディジタルカウンター ブロック デコーダー ＬＥＤデイスプレィ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構成成分： （ａ）気体出口を有する圧力下の気体源、 （ｂ）入口および出口を有する推進可能な物質の溜、お
   よび （ｃ）多目的弁、 からなり、ここで多目的弁は圧力下の気体源の出口と推
   進可能な物質の溜の入口との間の選択的連絡を提供する
   ことができる設計のものである装置。 ２、さらに、構成成分： （ｄ）出口を有する推進可能な物質源、 からなり、そして 多目的弁は圧力下の気体源の出口または推進可能な物質
   源の出口と推進可能な物質の溜の入口との間の選択的連
   絡を提供することができる設計のものである請求項１記
   載の装置。３、さらに、構成成分： （ｅ）入口を有する回収手段、 からなり、そして 多目的弁は圧力下の気体源の出口または推進可能な物質
   源の出口のいづれかと推進可能な物質の溜の入口との間
   の選択的連絡を提供し、そして送出し手段の入口または
   回収手段の入口のいづれかと推進可能な物質の溜の出口
   との間の選択的連絡を提供することができる設計のもの
   である請求項２記載の装置。 ４、さらに、構成成分： （ｆ）入口および出口を有する送出し手段、からなり、
   ここで送出し手段の入口は推進可能な物質の溜の出口と
   流体連絡しており、そして多目的弁は圧力下の気体源の
   出口または推進可能な物質源の出口のいづれかと推進可
   能な物質の溜の入口との間の選択的連絡を提供し、そし
   て送出し手段の入口または回収手段の入口のいづれかと
   推進可能な物質の溜の出口との間の選択的連絡を提供す
   ることができる設計のものである請求項３記載の装置。 ５、前記圧力下の気体源は、構成成分： （ａ）出口を有する気体供給手段、および （ｂ）気体調節手段、 からなり、前記気体調節手段は気体供給手段と操作的に
   協力し、気体供給手段の出口と推進可能な物質の溜の入
   口との間の選択的連絡を提供する請求項１記載の装置。 ６、前記気体調節手段は気体弁および入口を有する気体
   溜からなり、ここで気体弁は気体供給手段の出口と気体
   溜の入口との間の選択的空気連絡を提供する請求項５記
   載の装置。７、さらに温度調節手段からなり、前記温度
   調節手段は推進可能な物質の溜と操作的に協力している
   請求項１記載の装置。 ８、前記推進可能な物質源は、構成成分： （ａ）出口を有する推進可能な物質供給手段、および （ｂ）推進可能な物質調節手段、 からなり、前記推進可能な物質調節手段は推進可能な物
   質供給手段と操作的に協力し、推進可能な物質供給手段
   の出口と推進可能な物質の溜の入口との間の選択的連絡
   を提供する請求項２記載の装置。 ９、前記推進可能な物質源は、さらに、撹拌手段からな
   り、前記撹拌手段は推進可能な物質供給手段と操作的に
   協力している請求項８記載の装置。 １０、前記送出し手段がマクロエイミング手段からなる
   請求項４記載の装置。 １１、前記送出し手段がミクロエイミング手段からなる
   請求項４記載の装置。 １２、前記装置が速度検出手段からなる請求項４記載の
   装置。 １３、前記装置が第１センサーおよび第２センサーから
   なる請求項１２記載の装置。 １４、前記推進可能な物質の溜が環境的に制御されたチ
   ャンバーと流体連絡しており、前記チャンバーが推進ゾ
   ーンを定める請求項１記載の装置。 １５、工程： （ａ）選択された気体圧力を有する予定された体積の気
   体を準備し、 （ｂ）予定された量の推進可能な物質を準備し、ここで
   推進可能な物質はキャリヤー媒体中に懸濁された細胞ま
   たは非細胞の生物学的物質であり、そして （ｃ）前記推進可能な物質と予定された体積の気体とを
   接触させ、ここで推進可能な物質は選択された標的で加
   速される、 からなる、非細胞性生物学的物質を生きている細胞の中
   に導入する方法。 １６、工程： （ａ）予定された体積の気体を気体溜内に予定された圧
   力で準備し、 （ｂ）予定された量の推進可能な物質を推進可能な物質
   の溜内に準備し、前記推進可能な物質はキャリヤー媒体
   中の生物学的な物質の懸濁液からなり、前記溜は気体出
   口と選択的連絡した溜入口、およびオバーフロー入口お
   よび送出し入口と選択的連絡した溜出口を有し、 （ｃ）前記推進可能な物質と予定された体積の気体とを
   接触させ、そして （ｄ）推進可能な物質を送出し手段を通して標的物質で
   加速する、 からなる、生物学的物質を標的物質中に導入する方法。