ES2644262T3 - Método para la generación y cultivo de un bloque de células vegetales - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la generacion y cultivo de un bloque de celulas vegetales

La presente invencion se refiere al campo de la biotecnolog^a de las plantas. En particular, la presente invencion se refiere a la generacion y el cultivo de material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas multicapa no tejido y su uso para la acumulacion o recogida de un producto deseado.

Durante las ultimas decadas, se han dedicado enormes esfuerzos al establecimiento y cultivo de sistemas basados en plantas para la acumulacion y recogida de protemas nativas o heterologas y metabolites secundarios. La bibliograffa proporciona una amplia cantidad de material basado en evidencia que demuestra la utilidad de los sistemas basados en plantas para producir una gran variedad de sustancias deseadas que son o bien secretadas en el medio de cultivo o bien se afslan de las celulas, tejidos, organulos productores o incluso plantas completas o partes de las mismas. Asimismo, existe una amplia variedad de protocolos de transformacion que garantizan el establecimiento de material de planta o bien establemente o bien transitoriamente transformado. Sin embargo, todavfa existe la necesidad de una tecnologfa fiable, relativamente rentable y rapida para obtener altos rendimientos de un producto deseado de celulas vegetales.

La presente invencion se refiere asf a la provision de un sistema basado en plantas para producir altos niveles de productos nativos o recombinantes deseados que hace uso de celulas de un cultivo de celulas vegetales en suspension y vence los problemas del estado de la tecnica, en particular con respecto a la necesidad de manipular grandes volumenes de medio de cultivo durante el cultivo y el posterior procesamiento, que incluye eliminacion, extraccion y purificacion de productos.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a la expresion o generacion de protemas nativas o recombinantes y metabolitos y material de celulas vegetales espedfico de uso derivado de cultivos en suspension de celulas vegetales comunmente establecidos como hospedador de produccion.

Al contrario de muchos sistemas actualmente usados y desarrollados que se basan en el uso de plantas intactas o al menos tejido de planta intacto y diferenciado, el uso de celulas en suspension tiene la ventaja de que el material homogeneo puede ser reproduciblemente producido bajo condiciones controladas, asepticas y contenidas.

Actualmente hay dos estrategias principales para expresar protemas recombinantes en plantas, concretamente (i) la generacion de plantas transgenicas estables o lmeas celulares en suspension o (ii) la expresion transitoria de gen(es) heterologo(s) despues de infectar los hospedadores de expresion en la plantas (planta, tejido o celulas) con una bacteria (por ejemplo, Agrobacterium), un virus (por ejemplo, virus del mosaico del tabaco, virus de la patata X/Y, virus del mosaico del frijol y muchos otros), o una combinacion de ambos (por ejemplo, magnifeccion) para permitir que el hospedador exprese la informacion genetica heterologa (ADN o ARN).

Aunque la invencion tambien comprende el uso de material de celulas vegetales establemente transformado, sistemas para la expresion transitoria tienen la ventaja de velocidad (gen a producto, tiempo de comercializacion, respuesta de emergencia), ademas de la posibilidad de lograr niveles de acumulacion que son muy superiores a aquellos que pueden normalmente obtenerse en plantas transgenicas establemente transformadas o partes de las mismas, tales como celulas.

Segun una realizacion preferida, asf, la presente invencion combina las ventajas inherentes a los cultivos en suspension de plantas con las ventajas de los sistemas de expresion transitorios.

La adicion de Agrobacteria a cultivo en suspension de plantas seguido de cultivo adicional de las celulas vegetales y las bacterias en suspension ya se ha probado y publicado (vease el documento US 6.740.526 B1), pero los enfoques descritos padecen baja eficiencia de transformacion. Ademas, las Agrobacterias crecieron demasiado rapidamente las celulas vegetales en suspension, a menos que se tomaran medidas eficaces como el uso de antibioticos para destruir las bacterias o el uso de cepas auxotroficas para suprimir el crecimiento. Otros han descrito efectos perjudiciales directos (muerte celular, respuesta hipersensible) de las bacterias co-cultivadas en las celulas vegetales en suspension. Como consecuencia, actualmente no existe un sistema de produccion basado en planta que combine la eficiencia de la Agroinfiltracion/infeccion viral transitoria de plantas intactas o tejidos con las ventajas de los cultivos en suspension de plantas y permita la produccion de biomasa homogenea, preferentemente bajo condiciones controladas asepticas que es de tremenda ventaja para establecer una produccion conforme a GMP. Como se ha mencionado anteriormente, el enfoque de la co-fermentacion como se desvelo en el documento US 6.740.526 B1 padece baja eficiencia de transformacion y crecimiento en exceso bacteriano concomitante, mientras que los sistemas basados en hojas alcanzan alta eficiencia de transformacion pero, sin embargo, encuentran problemas con el aumento de escala, padecen bajos rendimientos espacio-tiempo para la produccion de biomasa inicial y se basan en condiciones controladas, pero no asepticas, para la produccion de biomasa vegetal. Los altos costes de produccion en comparacion con los sistemas microbianos son el principal motivo por el que estos sistemas no han ganado interes generalizado y uso como sistemas de produccion para productos biologicos. Como consecuencia, la investigacion y desarrollo se dirige a aplicaciones mas especializadas donde la ventaja combinada de velocidad y robustez de produccion son importantes, es decir, respuesta de emergencia (por ejemplo, vacunas contra la gripe, enfermedades nuevas-emergentes, medicina personalizada, etc.). Se desvelan estos problemas,

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ademas de la provision de medios mejorados para manipular los antecedentes geneticos de cualquier material hospedador de planta.

Segun la invencion, se proporciona un metodo para la generacion de material de celulas vegetales en forma de un bloque privado de medio, estructurado poroso y de celulas multicapa no tejido y para el posterior mantenimiento de dicho bloque de celulas, que comprende las etapas de (i) proporcionar un bloque de celulas que tiene una estructura porosa separando las celulas de un cultivo de celulas vegetales en suspension, en el que las celulas separadas de dicho cultivo de celulas vegetales en suspension son nativas o transgenicas y capaces de acumular un producto deseado, y en el que el contenido de lfquido comprendido por el bloque de celulas se reduce y ajusta para corresponderse con una densidad del bloque de celulas entre 0,1 y 0,9 en peso de celulas humedas por cm3, estableciendo asf la naturaleza privada de medio y estructurada porosa de dicho bloque de celulas, y (ii) incubar dicho bloque de celulas privado de medio y estructurado poroso en un entorno no lfquido bajo una humedad relativa del 50 al 100% para acumular dicho producto deseado sin poner dicho bloque de celulas sobre o en cualquier contacto con un medio de mantenimiento o de crecimiento.

Como sera reconocido por un experto, las celulas dentro de un tejido normalmente tienen conexiones mtimas, estan normalmente diferenciadas y frecuentemente presentan morfologfas particulares y celulas polarizadas. Ademas, las celulas dentro de un tejido normalmente tienen orientaciones caractensticas las unas con respecto a las otras.

A diferencia, los bloques de celulas segun la invencion se generan a partir de cultivos de celulas vegetales en suspension. Una propiedad particular de los cultivos de celulas vegetales en suspension es que las celulas individuales o agregados de varias celulas estan moviendose o son moviles los unas con respecto a los otros y no presentan un nivel de organizacion superior.

Como consecuencia, bloques de celulas segun la invencion comprenden celulas individuales y agrupaciones de celulas que no tienen orientacion relativa particular entre su Estas celulas son coladas de tal forma que el conglomerado resultante se empaqueta en una estructura porosa tridimensional que tiene huecos de aire significativos. Hay una clara correlacion entre la densidad del bloque de celulas y la presencia de huecos de aire. Los huecos de aire son importantes por varios motivos. Primero, permiten el eficiente intercambio de gas de forma que cantidades suficientes de oxfgeno puedan ser facilmente suministradas a las celulas. Segundo, los huecos de aire pueden ser temporalmente y facilmente inundados otra vez con lfquidos (= tratamientos). Tales tratamientos temporales pueden usarse para poner diversos agentes en estrecho contacto con todas las celulas del bloque de celulas, proporcionandose asf un metodo eficiente para la transformacion genetica, biotransformacion, recuperacion de producto mediante elucion o lavado del bloque de celulas, aplicacion de sustratos o analitos para fines de diagnostico (por ejemplo, inmunoensayos basados en bloques de celulas). Es importante que estos tratamientos sean solo temporales y que la estructura porosa del bloque de celulas se reconstituya y la densidad del bloque de celulas se confirme para garantizar la alta viabilidad durante las posteriores etapas de incubacion. Debido a la naturaleza porosa del bloque de celulas, es ademas importante en ciertas aplicaciones que la humedad sea suficientemente alta para prevenir que el bloque de celulas se seque debido al alta area superficial que esta en contacto con la fase gaseosa en la interfase celula / hueco de aire.

En particular, una realizacion preferida del metodo segun la invencion comprende (i) una primera etapa de cultivo en la que se cultiva una suspension de celulas vegetales, preferentemente en condiciones controladas y/o asepticas, para la provision de una biomasa de planta homogenea, (ii) una etapa de separacion en la que los medios lfquidos se separan de las celulas vegetales de tal forma que se genere un bloque de celulas poroso con una densidad entre 0,1 y 0,9, preferentemente entre 0,2 y 0,85, lo mas preferentemente entre 0,4 y 0,8 g en peso de celulas humedas por cm3, y (iii) una segunda etapa de cultivo en la que el bloque de celulas se incuba ademas en un entorno no ifquido en condiciones controladas (vease anteriormente) durante al menos otro dfa. Dependiendo de la situacion actual y la intencion del medico, esta segunda etapa de cultivo puede realizarse durante varios dfas.

Normalmente, la segunda etapa de cultivo se realiza durante 2 a 7, preferentemente durante 3 a 5 dfas.

En todos los metodos de cultivo del estado de la tecnica actual, el material de celulas vegetales esta en contacto directo o indirecto (soporte poroso o mediado por membrana) con un medio que contiene nutriente continuamente, es decir, la mayona de las veces el contacto con medio continuo solo se interrumpe brevemente (es decir, cortos periodos de tiempo) cuando las celulas se transfieren de un medio a otro. Las celulas pueden filtrarse o lavarse para eliminar medio "antiguo", pero entonces se transfieren rapidamente a un medio nuevo.

A diferencia del estado de la tecnica, esta etapa de cultivo se realiza en condiciones que mantienen la viabilidad de las celulas y promueve la acumulacion de producto con crecimiento y division celular reducida o minima. Esto se logro cultivando celulas empaquetadas bien aireadas en un entorno humedo, preferentemente sin contacto con un medio de crecimiento lfquido o gelificado del que difunden componentes o nutrientes en el bloque de celulas (documentos US2002/092037 A1; WO2005/103271 A1). En el estado de la tecnica, se siembran en placa capas de celulas delgadas o se transfieren sobre membranas de soporte dispuestas sobre medio con el fin de suministrar nutrientes a las celulas. Sin embargo, el cultivo de capas de celulas sobre el medio de crecimiento tiene la desventaja de que solo pequenas cantidades de biomasa pueden ser tratadas debido a la necesidad de contacto con el medio. A diferencia, el metodo de bloques de celulas de la invencion es independiente de un medio de

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soporte, es escalable y asf adecuado para aplicaciones industrials. Por consiguiente, la etapa de incubacion o de cultivo anterior (ii) se lleva a cabo en un entorno no lfquido, preferentemente sin poner el bloque de celulas privado de medio y estructurado poroso sobre o en cualquier contacto con un medio de mantenimiento o de crecimiento (solidificado en lfquido o gel).

Segun una realizacion preferida del metodo segun la invencion, la segunda etapa de cultivo se realiza durante semanas o meses. En tales casos, las condiciones de cultivo pueden tener que ser modificadas para mantener la viabilidad de las celulas. Esto puede lograrse, por ejemplo, proporcionando temporalmente (es decir, durante un periodo de tiempo de hasta 3 horas, preferentemente de hasta 1 hora) nutrientes al bloque de celulas y/o reduciendo la temperatura de incubacion.

En el estado de la tecnica, se usa un cultivo en suspension para acumular un producto deseado que queda dentro de las celulas comprendidas por el cultivo o es secretada en el medio de cultivo. Cuando el periodo de produccion ha terminado, las celulas son o bien destruidas con el fin de recoger el producto acumulado o bien desechadas. Se han usado celulas vegetales en suspension establemente transformadas, es decir, sumergidas en medios lfquidos, para producir un amplio espectro de diferentes protemas recombinantes terapeuticas (S. Hellwig et al., "Plant cell cultures for the production of recombinant proteins", Nature Biotechnol 22: 1415-1422, 2004).

Segun la invencion, las celulas comprendidas por el cultivo en suspension se usan para generar un material de celulas vegetales no tejido privado de medio en una forma de un bloque de celulas estructurado poroso definido ademas por tener una densidad espedfica como se ha mencionado anteriormente. Este bloque de celulas que opcionalmente puede proporcionarse en una forma definida por el usuario puede considerarse un conglomerado de celulas multicapa artificialmente generado o torta de celulas que consiste en celulas vegetales no diferenciadas que han sido cultivadas en cultivo lfquido. Las celulas fuente pueden ser celulas transgenicas establemente y/o transitoriamente transformadas, celulas mutadas o celulas no mutadas (nativas) capaces de acumular un producto deseado. Colando la suspension de celulas en la estructura de un bloque de celulas mientras que se elimina la mayona del medio lfquido circundante, se genera un material de celulas vegetales poroso tridimensional. Aunque se prefiere tecnicas de filtrado tales como filtracion a vado, filtracion a presion y centrifugacion a traves de un filtro, el medio lfquido tambien puede eliminarse por otros medios (por ejemplo, separadores usados en la industria alimentaria, centrifugacion continua) conocidos en la tecnica, en tanto que se garantice la anterior densidad del bloque de celulas. El establecimiento, mantenimiento y/o restablecimiento de huecos de aire entre las celulas individuales o agrupaciones de celulas comprendidas por el bloque de celulas proporciona una estructura porosa del bloque de celulas que asegura la buena aireacion (intercambio de gases), que es un factor crucial para la viabilidad y la productividad del material de celulas vegetales empaquetado durante la segunda fase de cultivo. En el contexto de la invencion, esta condicion de cultivo no comprende cultivar el bloque de celulas sobre medios solidificados (gelificados) o lfquidos, en suspension o en contacto con cualquier entorno lfquido que pueda dificultar la aireacion necesaria como se ha mencionado anteriormente. Como dicho cultivo se realiza esencialmente en ausencia de cualquier medio o lfquido que rodee cada celula comprendida por dicho bloque de celulas, tiene que asegurarse una humedad relativa suficiente. Como sera apreciado por un experto, hay una correlacion rigurosa entre la densidad (en g en peso de celulas humedas por cm3), el contenido de lfquido y la aireacion (conferida por la constitucion de huecos de aire en cantidad y volumen suficientes) del bloque de celulas. Sin embargo, como se explicara en mas detalle en lo sucesivo, el bloque de celulas aireado puede tratarse (temporalmente) poniendo en contacto el mismo con un pequeno volumen de vectores de transformacion o sustancias que incluyen, pero no se limitan a, nutrientes, sustratos, hormonas, enzimas, metabolitos y precursores. En este contexto, temporalmente significa que estos tratamientos que incluyen la provision de nutrientes en el transcurso de una incubacion a largo plazo (es decir, durante semanas o meses) son solo realizados durante un corto periodo de tiempo (hasta 3 h, preferentemente hasta 1 h), despues de que el medio lfquido se extraiga otra vez y los huecos de aire de los bloques de celulas porosos se reconstituyan, produciendo una densidad del bloque de celulas como se define en el presente documento.

Por consiguiente, el metodo segun la invencion comprende opcionalmente cultivar el bloque de celulas en presencia de un gas, vapor, niebla, polvo y/o aerosol, etc., que comprende o que representa un organismo, una sustancia qrnmica y/o biologica, o molecula, respectivamente.

Segun una realizacion preferida, las celulas comprendidas por el cultivo en suspension de celulas son celulas nativas (por ejemplo, no mutadas) o no transgenicas que, antes de realizar la segunda etapa de cultivo, se transforman con al menos un vector de expresion que comprende al menos una secuencia de acidos nucleicos heterologa que preferentemente esta operativamente unida a un promotor funcional, en la que dicha al menos una secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica un producto deseado que va a acumularse y ser recogido en la etapa (ii) del metodo segun la invencion.

El termino "transformacion", como se usa en el presente documento, se refiere a la administracion de cualquier acido nucleico o analogo de acido nucleico en la celula vegetal. Despues de la transformacion, el acido nucleico puede ser establemente integrado en el genoma de la celula hospedadora. Alternativamente, el acido nucleico administrado puede no integrarse en el genoma y puede ejercer su efecto o bien en el citosol o bien en el nucleo o en cualquier organulo celular.

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El acido nucleico puede ser un elemento autonomamente replicante tal como un viroide, un virus o virus deconstruido, o una combinacion de elementos necesarios de mas de un virus. Alternativamente, el acido nucleico administrado puede solo ser un componente de un elemento autonomamente replicante tal como un viroide, un virus o virus deconstruido. Los otros componentes pueden proporcionarse/complementarse por la celula hospedadora o por una celula hospedadora transgenica.

El termino "heterologo", como se usa en el presente documento, indica que la secuencia de genes/ nucleotidos en cuestion ha sido introducida en celulas vegetales usando ingeniena genetica. Un gen heterologo puede aumentar la expresion de una protema de interes a partir de un gen equivalente endogeno, es decir, uno que normalmente realiza la misma funcion o una similar, o la secuencia insertada puede ser adicional al gen endogeno u otra secuencia. Una posibilidad adicional es poner una secuencia de acidos nucleicos dentro de una celula diana cultivada en la que ella o un homologo se encuentra naturalmente, pero en la que la secuencia de acidos nucleicos esta unida y/o es adyacente al acido nucleico que no se produce naturalmente dentro de la celula, o celulas de ese tipo o especie o variedad de planta, tal como operativamente unida a una o mas secuencias reguladoras, tales como una secuencia promotora, para el control de expresion. Otra posibilidad mas es una secuencia de acidos nucleicos para inducir el silenciamiento de un gen existente por antisentido y/o silenciamiento (siendo el producto deseado el resultado a lograr). Otra posibilidad es un acido nucleico con funcion reguladora, tal como un miARN (producto deseado). Otra posibilidad mas es un acido nucleico que es una ribozima o un aptamero (producto deseado).

Se define que "vector" incluye, entre, otros, cualquier plasmido, cosmido, fago o vector viral en forma lineal o circular doble o monocatenaria que puede o puede no ser auto-transmisible o movilizable, y que puede transformar un hospedador procariota o eucariota y existe extracromosomicamente (por ejemplo, plasmido de replicacion autonoma con un origen de replicacion).

"Vector de expresion" se refiere a un vector en el que un acido nucleico esta bajo el control de, y operativamente unido a, un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripcion en una celula hospedadora tal como una celula microbiana o vegetal. El vector puede ser un vector de expresion bifuncional que funciona en multiples hospedadores. En el caso de ADN genomico o subgenomico, este puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y en el caso de ADNc este puede estar bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la expresion en la celula hospedadora. "Operativamente unido" significa unido como parte de la misma molecula de acido nucleico, adecuadamente situado y orientado para la transcripcion que va a ser iniciada a partir de un promotor.

Un "vector biologico" es cualquier microorganismo o virus capaz de transformar una celula hospedadora vegetal, es decir, capaz de suministrar un acido nucleico en la celula vegetal. Ejemplos de "vectores biologicos" son microorganismos infecciosos tales como aquellos que pertenecen a Agrobacterium, Radiobacter y Rhizobium, o virus tales como virus del mosaico del tabaco, virus de la patata x y virus del mosaico del frijol. Mas espedficamente, A. tumefaciens es un "vector biologico".

Para la transformacion de las celulas, una suspension de un vector biologico o una mezcla de diferentes vectores biologicos que contienen la informacion genetica se aplica al bloque de celulas generadas como se explica resumidamente anteriormente. El vector infecta las celulas vegetales y transmite la informacion genetica. Debido a la estructura esponjosa del material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas, el vector puede acceder a las celulas diana individuales precisamente por fuerzas capilares sin tratamientos especiales como inyeccion o infiltracion a vacfo que se necesitan para llegar a las celulas en hojas o plantas intactas que son necesarias. Por tanto, la naturaleza suelta y porosa del bloque de celulas produce un gran area superficial accesible al vector y asf permite altas eficiencias de transformacion. Esto es diferente al material de callo y tejidos vegetales diferenciados donde las celulas tienen contactos celula a celula mucho mas apretados que producen acceso limitado del vector a la superficie celular y asf en eficiencias de transformacion mas bajas y acumulacion de producto. Normalmente, mas del 50 % de las celulas dentro de un bloque de celulas se transforman, que es sustancialmente superior a en el estado de la tecnica. Aunque se informaron datos no detallados sobre las eficiencias de transformacion en la patente de EE.UU. N.° 6.740.526 B1, se ha encontrado que el metodo como se desvelo en su interior es inferior a los metodos de bloques de celulas segun la invencion (veanse, por ejemplo, Ejemplo 1, fig. 6C, 6D). Este hallazgo esta adicionalmente soportado por la observacion de que podnan lograrse rendimientos de anticuerpo de 10 a 100 veces mas altos (vease, por ejemplo, el Ejemplo 1). La suspension de vector puede aplicarse facilmente, por ejemplo por simple goteo o pulverizacion. Sin embargo, bloques de celulas grandes y/o gruesos y ciertas formas definidas por el usuario pueden requerir la aplicacion asistida por vacfo o presion y la eliminacion de la suspension de vector biologico con el fin de lograr la densidad de bloques de celulas deseada como se define en el presente documento. A diferencia de la infiltracion asistida por vacfo de tejido de hoja, el metodo descrito tiene la ventaja de que el exceso de suspension de vector biologico puede eliminarse y reutilizarse y que la naturaleza porosa del bloque de celulas puede ser restablecida inmediatamente. La viabilidad de hojas infiltradas depende drasticamente de la captacion y/o eliminacion del exceso lfquido para restaurar la fase gaseosa en el espacio intercelular. Como esto es diffcil de controlar, la infiltracion asistida por vacfo de tejido de hoja sufre variabilidad y tasa de fallos mas altas. La realizacion preferida es aplicar la suspension de vector al bloque de celulas, ya que esto tiene varias ventajas practicas con respecto a la manipulacion, automatizacion, contencion, aumento de escala y produccion y eliminacion de residuos. Alternativamente, la suspension de las celulas vegetales puede mezclarse con la suspension de vector antes de formar el bloque de celulas. La restauracion de los huecos de aire y el cultivo privado de medio de un bloque de

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celulas infiltrado con un vector biologico como Agrobacterium garantiza que el vector microbiano no destruya las celulas vegetales que crecen en exceso.

En lugar de una suspension de vector biologico puede usarse una disolucion que contiene acidos nucleicos o analogos de acido nucleico, o una suspension de partmulas o una emulsion recubierta con o que contiene acidos nucleicos.

Despues de la aplicacion del vector biologico, el bloque de celulas se incuba o cultiva durante un cierto tiempo en condiciones controladas para permitir que el bloque de celulas vegetales restablezca su estructura porosa restaurando los huecos de aire entre las celulas individuales o agrupaciones de celulas y para permitir que las celulas vegetales expresen las protemas recombinantes y asf acumulen el (los) producto(s) deseado(s). Las condiciones de incubacion (por ejemplo, tiempo, temperature, humedad, intensidad de la luz) pueden ser facilmente ajustadas para favorecer la smtesis de un producto deseado espedfico. No se necesita equipo especial para soportar el bloque de celulas, bandejas de plastico desechables de bajo precio son suficientes para su mantenimiento. Durante un primer periodo de cultivo, los huecos de aire se reconstituyen debido a la evaporacion y absorcion del lfquido aplicado con el vector biologico. Alternativamente, los huecos de aire pueden reconstituirse eliminando el exceso de lfquido por metodos asistidos por vado o presion. Despues de completarse el cultivo, los bloques de celulas se recogen y el producto se separa/afsla de la biomasa aplicando procedimientos de purificacion apropiados conocidos en la tecnica. En casos en los que se indica que un resultado analftico o de diagnostico es el producto deseado, la recogida tambien puede tener lugar durante el periodo de incubacion/cultivo. El proceso completo puede ser automatizado y puede ser facilmente aumentado o reducido de escala. Debido a la facil configuracion y la falta de metodologfa compleja, es factible disenar este proceso altamente controlado para cumplir los requisitos de GMP y/o aplicaciones de alto rendimiento y/o produccion industrial a gran escala.

El metodo puede ser especialmente apto para productos que son toxicos para los seres humanos, animales y/o el entorno, debido a que el proceso entero puede realizarse bajo contencion completa, proporcionando, por tanto, alta bioseguridad. Esto se aplica tambien para compuestos, vectores y/o acidos nucleicos usados en el proceso de produccion.

El termino "recogido", como se usa en el presente documento, debe entenderse que comprende cualquier accion que se basa en la expresion y acumulacion del producto deseado. Ademas de la recogida que comprende la separacion/aislamiento del producto deseado como se ha mencionado anteriormente, la recogida en general tambien esta relacionada con asegurar cualquier resultado de diagnostico o analftico que se basa en el producto deseado nativamente o recombinantemente acumulado. Es evidente para un experto que en estos casos la separacion/aislamiento del propio producto deseado puede ser omitida.

Alternativamente, el bloque de celulas tambien puede generarse a partir de un cultivo en suspension que comprende celulas transgenicas con el fin de aumentar la produccion de un producto deseado (por ejemplo, protema recombinante, metabolito), por ejemplo, proporcionando un componente de un sistema replicativo o una via metabolica o regulando por disminucion ciertos factores hospedadores.

Tambien se desvela material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas privado de medio, estructurado poroso y multicapa no tejido que tiene una densidad entre 0,1 y 0,9 g, preferentemente entre 0,2 y 0,85, lo mas preferentemente entre 0,4 y 0,8 g en peso de celulas humedas por cm3, obtenido u obtenible por un metodo segun la invencion como se desvela en el presente documento. En otras palabras, la presente divulgacion proporciona material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas privado de medio, estructurado poroso y multicapa no tejido que tiene una densidad entre 0,1 y 0,9, preferentemente entre 0,2 y 0,85, lo mas preferentemente entre 0,4 y 0,8 g en peso de celulas humedas por cm3.

El bloque de celulas tambien puede tratarse con o cultivarse en presencia de precursores, inductores, hormonas, estabilizadores (por ejemplo, solutos compatibles), inhibidores, moleculas de iARN/ARNip, compuestos de senalizacion, enzimas (por ejemplo, pectinasa) y/o desencadenantes, ademas de o en lugar de la suspension de vector, para la produccion de protemas o metabolitos recombinantes y/o endogenos (nativos).

En una divulgacion particular, las sustancias aplicadas inducen la diferenciacion de las celulas no diferenciadas comprendidas en el bloque de celulas. Esto puede lograrse, por ejemplo, por la aplicacion de hormonas o combinacion definida de hormonas, o por la transformacion de las celulas con genes para factores de transcripcion.

El bloque de celulas puede tratarse repetidamente usando cualquier serie y/o combinacion de suspensiones de vector, soluciones de acido nucleico o las sustancias mencionadas previamente. Esto significa que el metodo de la presente divulgacion puede ser esencialmente reiterado en tanto que la naturaleza porosa del bloque de celulas se mantenga y los huecos de aire sean restaurados despues de cada tratamiento. En particular, esto tambien incluye el uso de una mezcla de diferentes suspensiones de vector para co-transformar simultaneamente las celulas del bloque de celulas con diferentes acidos nucleicos.

El bloque de celulas tambien puede comprender mas de una especie diferente de celulas y/o diferentes clones y/o diferentes lmeas celulares transgenicas y/o no transgenicas. Ademas, un bloque de celulas heterogeneo tambien

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puede comprender celulas de diferentes especies o incluso reinos, esencialmente usando las celulas vegetales como soporte poroso para co-cultivar las otras celulas, por ejemplo levadura, hongos, celulas animales y humanas.

En otro aspecto, el bloque de celulas poroso se usa como un soporte altamente reproducible y homogeneo para ensayos de evaluacion del crecimiento y/o la vitalidad de organismos co-cultivados, en el que dicha evaluacion se indica para representar el producto deseado. Preferentemente, el bloque de celulas se usa para probar y/o cribar moleculas (metabolitos, peptidos y/o protemas) que se producen por el bloque de celulas para su actividad contra el organismo co-cultivado. Tales ensayos generalmente comprenden las siguientes etapas, (1) se genera un bloque de celulas poroso segun la invencion, (2) se anade un compuesto, vector y/o acido nucleico a dicho bloque de celulas y opcionalmente dicho bloque de celulas se incuba durante un periodo adecuado, (3) se inocula un area seleccionada de dicho bloque de celulas poroso con un segundo organismo, (4) se incuba el bloque de celulas poroso inoculado en condiciones que permiten que crezca el segundo organismo y (5) los efectos (productos deseados) de productos sintetizados en el bloque de celulas sobre el segundo organismo, como, por ejemplo, sobre el crecimiento y/o la vitalidad, se evalua despues de un tiempo de incubacion adecuado. La segunda etapa puede ser omitida, por ejemplo, si se usa una lmea celular transgenica en suspension.

Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona el uso de material de celulas vegetales obtenido u obtenible por un metodo como se desvela en el presente documento y/o que tiene una densidad como se ha definido anteriormente para fines analfticos o de diagnostico. Por ejemplo, las celulas comprendidas por el bloque de celulas pueden incubarse en presencia de un organismo o de una sustancia que va a analizarse o diagnosticarse. Por lo tanto, la divulgacion tambien proporciona una herramienta de diagnostico o analttica que comprende material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas privado de medio, estructurado poroso y multicapa no tejido como se desvela en el presente documento.

Por consiguiente, aquellos expertos en la materia apreciaran facilmente que los bloques de celulas segun la divulgacion tambien pueden usarse para detectar analitos en una muestra que se pone en contacto con el bloque de celulas ("tratamiento"). Otra vez, el tratamiento del bloque de celulas con la muestra que contiene el analito de interes solo se realiza temporalmente, es decir, dentro de un corto periodo de tiempo (hasta 3 horas). Despues del tratamiento, los huecos de aire tienen que reconstituirse otra vez, es decir, la densidad y porosidad correspondientes del bloque de celulas tienen que restablecerse. El bloque de celulas se incuba entonces en ausencia de un contacto continuo con cualquier lfquido o medio gelificado/solidificado (suministro de nutrientes). El analito que esta presente en la muestra puede inducir la transduccion de senales, expresion genica o cualquier otro evento que conduzca a un cambio medible del bloque de celulas o manipulacion de las celulas comprendidas por el. Cambios o manipulaciones medibles incluyen, pero no se limitan a, protemas informadas fluorescentes, moleculas indicadoras fluorescentes, enzimas, cambios que conducen a muerte celular, generacion de auto-fluorescencia, cambios fisiologicos o morfologicos que pueden ser revelados analizando el bloque de celulas o incubando el bloque de celulas con reactivos adicionales que producen una senal detectable directamente en el bloque de celulas o en eluatos, extractos u otras muestras derivadas del bloque de celulas. Debe entenderse que pueden usarse tanto celulas vegetales no mutadas como geneticamente manipuladas, que incluyen celulas transgenicas estables y celulas transitoriamente transformadas. En particular, las ultimas pueden derivarse por un tratamiento de transformacion previo de un bloque de celulas generado a partir de celulas no mutadas.

El bloque de celulas segun la presente divulgacion es altamente susceptible a diferentes tipos de manipulaciones. A diferencia de las celulas o protoplastos en suspensiones, la densidad de las celulas en el bloque de celulas es mas alta. Por consiguiente, los compuestos (por ejemplo, desencadenantes para la produccion de metabolitos) pueden aplicarse mas economicamente, ya que se necesitan cantidades mas bajas para obtener la misma concentracion eficaz. Ademas, la aplicacion de sustancias altamente concentradas es posible, que es extremadamente util para bioconversion/biotransformacion. Una ventaja en comparacion con las plantas intactas, tejido vegetal y/o callo es el area superficial de celulas accesibles mas alta, que es debido a la estructura porosa y esponjosa del bloque de celulas y sus contactos de celulas sueltos. En comparacion con tanto los cultivos en suspension como los tejidos vegetales intactos, las sustancias pueden ser mas facilmente y eficientemente aplicadas a y tambien eliminadas del bloque de celulas. Por ejemplo, pueden aplicarse precursores o compuestos toxicos durante solo un corto periodo y pueden realizarse experimentos de radiomarcado y seguimiento. Los inductores pueden aplicarse de una manera mas controlada y oportunamente definida, permitiendo el refino adicional de la expresion genica opcional y otras condiciones de acumulacion de producto. Pueden aplicarse secuencialmente una serie de precursores y sustratos para lograr la conversion completa y para elucidar vfas metabolicas. Ademas, pueden recogerse productos secretados acumulados lavando simplemente el bloque de celulas con una solucion de tampon adecuada. De forma interesante, esto permite la eliminacion repetida ("ordeno") de productos para evitar la degradacion de productos y/o la inhibicion de la retroalimentacion. Esta estrategia tambien puede utilizarse para evitar y/o reducir efectos perjudiciales sobre las celulas hospedadoras, maximizando asf la productividad.

La provision de sustancias volatiles, que incluyen nutrientes (por ejemplo, amoniaco, acidos carboxflicos, dioxido de azufre, sulfuro de hidrogeno, fosfinas y aminas organicas) al bloque de celulas tambien tiene varias ventajas con respecto a los sistemas actualmente establecidos. La administracion de tales sustancias en forma gaseosa es diffcil de lograr para los cultivos celulares en suspension. El gas necesita primero ser disuelto en la disolucion, un proceso que esta limitado por la solubilidad y el transporte. Si se usan plantas intactas y tejidos vegetales, otra vez el transporte es un problema, pero, lo que es aun mas importante, necesitan usarse y controlarse volumenes de

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incubacion mucho mas grandes. Aunque esto ha sido hecho para fines de investigacion a escalas pequenas, aplicaciones industriales a gran escala son generalmente demasiado caras. Ademas, si el propio producto es un compuesto volatil, el control de la presion de aire puede usarse para acumular y/o recoger el producto. Aqm, cuanto mas alta sea la densidad celular (es decir, celulas por volumen) en comparacion con los cultivos celulares en suspension y la posibilidad de sus formas y geometnas de uso definido ofrece posibilidades unicas, por ejemplo cultivo a baja presion, para ingeniena de procesos que no son posibles con ninguno de los sistemas de produccion actualmente existentes. Por lo tanto, la presente divulgacion proporciona un medio economico y escalable para estos tipos de aplicaciones.

Alternativamente, los compuestos disueltos pueden administrarse al bloque de celulas poroso en forma de un aerosol y/o niebla y/o vapor. Este modo de administracion no es posible para celulas en suspension. Se usa para plantas intactas, sin embargo, la mayona del compuesto aplicado no llega a su diana, requiriendo dosis mas altas, volumenes y numero de tratamientos. La captacion de los compuestos a traves de la cutmula esta muy limitada, requiriendo la administracion a traves de los estomas. Por consiguiente, tales aplicaciones estan limitadas a compuestos altamente eficaces. Aqm, la presente divulgacion ofrece una forma de administrar eficientemente casi cualquier compuesto en cantidades significativas al bloque de celulas. El aumento de escala puede implementarse facilmente por paralelizacion, es decir, generando simplemente el numero requerido de bloques de celulas. Alternativamente, el aumento de escala tambien puede hacerse usando bloques de celulas grandes adecuadamente dimensionados u hojas, columnas o estructuras 3D similares.

El tamano vertical de un bloque de celulas esta solo limitado por la fuerza que actua sobre las celulas en el fondo del bloque y la compactacion resultante de los poros. Este problema, sin embargo, puede ser tratado usando soportes intermedios. Por consiguiente, tamanos verticales tfpicos de un bloque de celulas segun la divulgacion oscilan de algunos mm, es decir, 3 a 5 mm, a varios cm, es decir, 3 a 15 cm, o incluso mas. El tamano horizontal no esta limitado. Dimensiones de 10 mm3 a 10 m3 son factibles. Tiene que garantizarse aireacion/intercambio de gas suficiente, por ejemplo para mantener niveles de oxfgeno y dioxido de carbono apropiados. Tambien tiene que controlarse la acumulacion de metabolitos primarios y secundarios volatiles, ya que, por ejemplo, altos niveles de etileno pueden ser perjudiciales para las celulas. Para bloques de celulas de pequeno espesor (aproximadamente 35 cm), el intercambio de gas por difusion es normalmente suficiente. Bloques de celulas mas gruesos pueden requerir aireacion activa y/o integracion de canales de aire adicionales. A este respecto, la presente divulgacion proporciona disoluciones unicas debido a que las celulas en suspension pueden ser coladas en practicamente cualquier forma definida por el usuario.

Segun un aspecto de la divulgacion, el producto deseado esta seleccionado del grupo que consiste en protemas endogenas (es decir, nativas) y heterologas o polipeptidos, metabolitos secundarios, marcadores y resultados analfticos/de diagnostico.

Genes de interes incluyen aquellos que codifican protemas que ellas mismas son medicamentos naturales, tales como productos farmaceuticos o productos veterinarios.

Los acidos nucleicos heterologos pueden codificar, entre otros, genes de origen bacteriano, fungico, planta, no planta o animal. Protemas que pueden producirse en un proceso de la invencion incluyen heterodfmeros, tales como FSH, inmunoglobulinas, anticuerpos de fusion, anticuerpos monocatenarios y otros formatos o derivados de anticuerpo.

Tales protemas incluyen protema de retinoblastoma, p53, angiostatina y leptina. Asimismo, los metodos de la invencion pueden usarse para producir protemas reguladoras de mairnfero. Otras secuencias de interes incluyen protemas, hormonas, tales como hormona estimulante del folmulo, factores de crecimiento, citocinas, albumina de suero, hemoglobina, colageno, taumatina, protemas similares a taumatina, factores de crecimiento epidermicos tales como VEGF, insulina, inmunoglobulina A monomerica o dimerica o secretora, protemas de fusion de transferrina o transferrina, y receptores tales como CD16, CD32, CD64, CD89, receptor de Fc neonatal.

Como sera apreciado por el experto, la divulgacion permite producir una gran variedad de productos deseados tales como protemas y polipeptidos que incluyen protemas (recombinantes) de relevancia farmaceutica (tales como, por ejemplo, vacunas, anticuerpos, enzimas terapeuticas, alergenos e hipoalergenos, peptidos antimicrobianos, protemas estructurales tales como elastina y colageno para su uso como materiales de recubrimiento biocompatibles, partmulas similares a virus, cuerpos de protema, etc.), protemas (recombinantes) de valor nutritivo (aditivos alimenticios y para piensos), protemas (recombinantes) para aplicaciones de diagnostico (tales como, por ejemplo, enzimas, anticuerpos y anticuerpos manipulados, otras enzimas o protemas de fusion fluorescentes, antfgenos que van a usarse como controles positivos, ligandos de union para matrices de protema) y protemas (recombinantes) de relevancia tecnica (tales como, por ejemplo, ligandos de union para sorbentes de afinidad, enzimas de alto valor, biocatalizadores).

Por consiguiente, la divulgacion tambien proporciona asf un metodo para la produccion de al menos un producto deseado seleccionado preferentemente del grupo que consiste en protemas nativas o heterologas o polipeptidos, metabolitos secundarios, marcadores, y resultados analtticos / de diagnostico. El metodo comprende la generacion de un bloque de celulas privado de medio, estructurado poroso y multicapa no tejido que tiene una densidad entre

0,1 y 0,9, preferentemente entre 0,2 y 0,85, lo mas preferentemente entre 0,4 y 0,8 g en peso de celulas humedas por cm3, de un cultivo de celulas vegetales en suspension, la aplicacion de una disolucion, suspension y/o un gas al bloque de celulas adecuado para inducir o alterar la produccion del producto deseado, el ajuste de la densidad del bloque de celulas dentro del intervalo como se indica anteriormente, si fuera necesario, y el cultivo del bloque de 5 celulas con una humedad relativa del 50 al 100% para permitir que el bloque de celulas produzca y acumule el producto deseado. Opcionalmente, el metodo comprende ademas recoger o aislar el producto deseado acumulado de las celulas productoras comprendidas por el bloque de celulas.

El sistema basado en el bloque de celulas de la divulgacion tambien es adecuado como plataforma de cribado para la evolucion molecular, ingeniena de protemas, ingeniena metabolica y aplicaciones de biologfa sintetica y, entre 10 otros, permite la optimizacion de casetes de expresion genica, plasmidos, etc., como se usa o pretende usarse. Ademas, usando bloques de celulas como se describe en el presente documento, la invencion proporciona un metodo analttico de evaluacion de construcciones de expresion genica y protemas diana manipuladas en un modo de alto rendimiento, altamente reproducible y automatizable. Segun la divulgacion y como se menciono antes, el objetivo de estas aplicaciones es reunir informacion y resultados que como tales representan productos deseados 15 que son 'recogidos' durante el segundo periodo de cultivo.

Segun otro aspecto, la divulgacion proporciona la manipulacion de modificaciones de protemas post-traduccionales mediante la expresion transitoria de las enzimas implicadas y asf permite, por ejemplo, la modificacion del patron de glucosilacion de glucoprotemas. Ademas, pueden ser inactivadas enzimas endogenas mediante silenciamiento (por ejemplo, glucosiltransferasas, proteasas, ubiquitina ligasas) para afectar la calidad y cantidad de producto.

20 Ademas, la divulgacion proporciona la produccion de metabolitos secundarios como productos deseados mediante la expresion transitoria de las enzimas de vfas implicadas y/o sus factores de transcripcion. Las vfas bioqmmicas tambien pueden manipularse bloqueando las vfas de competicion y/o el catabolismo mediante silenciamiento de las enzimas correspondientes. Asimismo, el sistema segun la invencion es muy apto para la produccion de metabolitos mejorada a partir de cultivos celulares geneticamente no modificados (nativos) generando y cultivando bloques de 25 celulas como se describe en el presente documento. Con el tiempo, la divulgacion tambien puede usarse para cultivar un bloque de celulas generado a partir de una lmea celular en suspension transgenica que aloja un promotor constitutivo y/o un promotor inducible en presencia de un inductor correspondiente.

En terminos generales, los acidos nucleicos heterologos pueden ser expresados por cualquier proceso apropiado usado en la materia o pueden sertranscritos o expresados del siguiente modo:

30 (i) expresion transitoria de ADN 'desnudo', por ejemplo, que comprende un promotor operativamente unido a la

secuencia heterologa de interes;

(ii) expresion de un vector de expresion, tal como un vector de replicacion. En terminos generales, aquellos expertos en la materia son muy capaces de construir vectores y disenar protocolos para la expresion genica recombinante transitoria. Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias 35 reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de

poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias segun convenga. Para mas detalles vease, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a edicion, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press o Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edicion, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992;

40 (iii) expresion de un vector no de integracion;

(iv) expresion de un T-ADN suministrado.

Se entendera que estas categonas no son mutuamente exclusivas, por ejemplo debido a que un vector no de integracion tambien puede ser un vector de expresion, etc.

Metodos para lograr tal expresion se tratan en cualquier parte en el presente documento.

45 Las construcciones pueden introducirse a numero de copias relativamente alto con promotores fuertes, y sin el efecto de moderacion inherente que puede producirse cuando se selecciona un transformante estable en el que una construccion se integra en el genoma. Como resultado, los niveles y concentraciones de protema producida pueden superar con creces aquellos obtenibles por el uso de metodos para la produccion de protemas en sistemas basados en celulas de planta del estado de la tecnica (cultivos en suspension transgenicos o expresion transitoria en 50 suspension).

Asf, en un aspecto se desvela el uso de una celula vegetal transitoriamente transformada capaz de generar ARNm que codifica una protema diana generada por la transcripcion de una construccion de acidos nucleicos introducida que incluye la secuencia de nucleotidos diana operativamente unida a un promotor.

El "acido nucleico introducido" incluira asf la secuencia de acidos nucleicos heterologa como una secuencia de ADN 55 proporcionada en forma de una construccion que es capaz de dar lugar a la produccion de protema extracelular a un

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nivel elevado con respecto al nivel de produccion de protemas normalmente asociado a la expresion transgenica estable de dicha secuencia de ADN.

As^ en un aspecto preferido se desvela un metodo de logro de la expresion de una secuencia de nucleotidos heterologa en un bloque de celulas vegetales, metodo que comprende la etapa de introducir en una celula diana al menos una primera secuencia de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos heterologa.

En un aspecto se proporciona un metodo de generacion de al menos una protema heterologa extracelular, metodo que comprende las etapas de:

(i) introducir transitoriamente en una celula diana comprendida por el bloque de celulas un primer acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica la protema heterologa,

(ii) causar o permitir la expresion del acido nucleico, durante un periodo de tiempo, de la protema heterologa proporcionando condiciones de cultivo apropiadas, y

(iii) recoger la protema heterologa acumulada de celulas productoras.

El aislamiento puede ser por medios completamente convencionales, y puede o puede no conllevar purificacion parcial o completa.

El periodo de tiempo para el cultivo de bloques de celulas puede ser cualquier periodo hasta o incluso mas alla del que el material celular sigue estando viable, o hasta que se sature con producto; en general puede preferirse que sea entre aproximadamente 1 y 10 dfas, mas preferentemente entre aproximadamente 1 y 6 dfas.

Naturalmente, aquellos expertos en la materia reconoceran que puede usarse mas de un gen en la, o cada, construccion. Pueden introducirse multiples vectores (que incluyen cada uno una o mas secuencias de nucleotidos que codifican la protema heterologa de eleccion) en las celulas diana como se describe en el presente documento o en cualquier parte. Esto puede ser util para producir, por ejemplo, multiples subunidades, por ejemplo, de una enzima o, por ejemplo, multiples enzimas de una via bioqmmica. Esto tambien puede ser util para, por ejemplo, la inactivacion simultanea de genes endogenos, por ejemplo mediante silenciamiento genico mediado por ARNip y/o inactivacion de enzimas heterologas para la modificacion post-traduccional del producto y/o la expresion de marcadores y/o la produccion de multiples productos de los mismos tipos o de diferentes.

Como se muestra en los ejemplos a continuacion, la expresion transitoria de la secuencia heterologa cuando se introduce de esta forma puede dar altos niveles de polipeptido diana durante el transcurso del segundo periodo de incubacion, que generalmente sera varios dfas, dependiendo de los metodos precisos y materiales empleados. Usando los metodos de la invencion como se describen en el presente documento, se logra la acumulacion de polipeptidos heterologos.

Asf, la expresion transitoria en las celulas comprendidas por el bloque de celulas representa una herramienta util en muchos contextos para los que puede previamente haber sido considerada inadecuada, por ejemplo, expresion fiable de protema heterologa inestable, es decir, transitoriamente expresada o secuencias de polipeptidos que se acumulan dentro de las celulas productoras.

El metodo puede ser particularmente preferido en aquellas aplicaciones donde se requieren altos niveles de expresion, pero donde no son deseables construcciones virales (con el requisito para la 'infeccion' de plantas) o plantas transgenicas estables son no deseables, por ejemplo, donde un ensayo rapido es importante, o donde la secuencia en cuestion confiere un fenotipo letal o no deseable.

El indicador puede ser cualquier protema detectable, tal como un gen marcador, comunmente usado en la materia tal como GUS, protemas fluorescentes tales como GFP o DsRed, luciferasa, etc. Preferentemente, el indicador es un marcador no invasivo tal como DsRed o luciferasa. Segun un aspecto adicional de la divulgacion, el material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas multicapa no tejido privado de medio obtenido u obtenible segun el metodo como se describe en el presente documento se usa para fines analfticos. Por ejemplo, las celulas comprendidas por el bloque de celulas pueden incubarse en presencia de una sustancia que va a analizarse. Por ejemplo, un bloque de celulas generado forma una lmea celular en suspension transgenica que contiene un gen marcador cribable (GFP, DsRed, luciferasa, GUS, fosfatasa alcalina secretada, o una enzima que es capaz de producir un compuesto detectable intracelularmente) operativamente unido a un promotor inducible puede usarse para detectar el inductor en muestras de prueba. Alternativamente, la construccion de expresion de gen indicador inducible tambien puede transformarse en un bloque de celulas generado a partir de una lmea celular en suspension no mutada (no transgenica) en una primera etapa y las muestras de prueba se analizan entonces en una segunda etapa. Preferible, se lleva a cabo un tiempo de incubacion de 1-5 dfas entre las dos etapas. Entonces, se aplica un volumen adecuado de una muestra de prueba lfquida o un extracto lfquido de una muestra de prueba no lfquida a la celula bloqueada. Es importante garantizar en esa etapa que la estructura porosa del bloque de celulas se mantenga por o bien usando una relacion apropiada de volumen de la muestra de prueba y el peso del bloque de celulas o bien eliminando el exceso de lfquido de la muestra de prueba despues de un tiempo de contacto adecuado. Tiempos de contacto adecuados son 1 min a 2 h, preferentemente 5 min a 1 h, mas preferible 10 a 30 min. Volumenes

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adecuados de las muestras de prueba Kquidas son hasta 0,75 ml por gramo del bloque de celulas, preferible 0,5 ml por gramo del bloque de celulas, mas preferentemente 0,4 ml por gramo del bloque de celulas.

Ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotor inducible por estrogenos, etanol, azucar. Aquellos expertos en la materia tambien entienden que los circuitos geneticos que usan represores y depresion pueden usarse igualmente. Por ejemplo, la union de tetraciclina al represor tet conduce a la des-represion del promotor de tetraciclina.

Segun un aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos que son muy utiles para estudiar y optimizar eventos de recombinacion debido a la facilidad de manipulacion, alta eficiencia de transformacion y las numerosas posibilidades de administrar acidos nucleicos y/o compuestos en las celulas del bloque de celulas.

Como sera apreciado por el experto, el bloque de celulas segun la presente divulgacion es superior con respecto a los sistemas transitorios basados en hojas, sistemas transitorios en cultivo lfquido, cultivo en suspension no mutante y/o transgenico estable, y el uso de plantas completas no mutantes y/o transgenicas o partes de las mismas.

A diferencia de la invencion, los sistemas de expresion transitorios basados en hojas emplean tejido vegetal diferenciado que consiste en diferentes tipos de celulas (heterogeneas), mientras que las celulas en suspension son conocidas por estar desdiferenciadas o no diferenciadas. En comparacion con los sistemas basados en hojas, la invencion proporciona las siguientes ventajas:

No se necesitan instalaciones de crecimiento que requieren espacio para la produccion de biomasa; Independiente de condiciones climaticas externas;

No hay riesgo de infestacion de patogenos vegetales;

Rapido suministro de grandes cantidades de biomasa altamente homogenea - esto es de particular importancia para productos farmaceuticos (disminuye los problemas reglamentarios);

La recogida de la biomasa es mucho mas facil (no se necesita equipo de recogida especial);

La preservacion por congelacion y/o secado es mas facil debido a una relacion volumen-biomasa mas baja;

Procesamiento mas facil de la biomasa y purificacion mas facil del producto (menos lignina, menos fibras, menos protemas hospedadoras, menos pigmentos);

La biomasa se produce en condiciones asepticas altamente controladas (disminuye las cuestiones reguladoras);

Ventaja de velocidad en comparacion con plantas enteras, facil aumento de escala de la biomasa (a 0,1 l de cultivo iniciador se puede aumentar la escala en 15 dfas para proporcionar 100 kg de biomasa en un cultivo en suspension de 1000 l; 5 d 2,5 l -> 5 d 50 l -> 5 d 1000 l);

Mejor utilizacion del rendimiento espacio-tiempo / espacio (biomasa por m2; la produccion e incubacion normalmente no requiere iluminacion, que permite un apilamiento denso de los bloques de celulas);

Se requieren volumenes mas bajos de suspensiones de vector biologico para infectar la misma cantidad de biomasa (menos "residuo" en comparacion con infiltraciones de tanques);

Implementacion de una contencion completa mas facil que con metodos basados en hojas y plantas;

La aplicacion de bacterias o virus es mas facil con el metodo de "bloques de celulas";

El silenciamiento post-transcripcional involuntario desencadenado en una celula individual esta confinado a las pocas celulas vecinas conectadas por plasmodesmos y no se disemina por via sistemica;

Pueden aplicarse mas facilmente y mas economicamente compuestos qmmicos adicionales (por ejemplo, desencadenantes, inductores, hormonas o precursores para la produccion de metabolito);

Posibilidad de eluir solo protemas secretadas de las celulas en bloques (menos protemas hospedadoras, acceso a solo protemas secretadas completamente procesadas);

Debido a la contencion tambien pueden producirse productos peligrosos (alto nivel de bioseguridad);

Posible cribado de alto rendimiento (placas filtrantes multipocillo);

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• Pueden realizarse tamanos y formas definidas por el usuario mas flexibles;

• Mas susceptible a automatizacion;

• Puede usarse material de celulas vegetales altamente homogeneo para ensayos de crecimiento normalizados de patogenos vegetales u otros organismos, que permite enfoques de cribado de alto rendimiento y de diseno de experimentos;

• La posibilidad de combinar facilmente diferentes metodos, tecnolog^as y etapas de manipulacion en un unico formato, simultaneamente y/o secuencialmente.

Las ventajas en comparacion con los sistemas transitorios en cultivo lfquido pueden resumirse del siguiente modo:

• Elevada expresion de los transgenes transitoriamente suministrados en comparacion con cultivos en suspension en biorreactores (matraces con agitacion o fermentadores) o para callos crecidos sobre medios solidos;

• No necesita controlar o suprimir el crecimiento bacteriano para evitar el crecimiento en exceso de las celulas vegetales (antibioticos, cepas auxotrofas);

• El uso de "bloques de celulas" permite una relacion mas alta de Agrobacteria con respecto a celula vegetal en comparacion con la suspension en biorreactor;

• Como las celulas en el bloque de celulas no son agitadas, se logra un contacto vector con celula mas mtimo y no hay cizallamiento;

• Debido a la alta biomasa concentrada en la segunda fase de cultivo o periodo se necesitan cantidades mas bajas de compuestos caros (por ejemplo, inductores (acetosiringona), hormonas, precursores para la produccion de metabolitos, etc.);

• La segunda fase del cultivo se producen fuera del biorreactor, que se usa para la produccion de las celulas vegetales. Esto permite, por ejemplo, el uso de estrategias de fermentacion continuas en la primera fase de cultivo para asegurar el suministro constante de celulas en suspension. Esto produce una utilizacion mejor y mas economica del caro biorreactor relativo y permite capacidades mas altas;

• Debido a la estructura porosa del bloque de celulas, la limitacion del suministro de oxfgeno es menos cntica.

En comparacion con el uso de plantas transgenicas, el sistema segun la divulgacion permite recuperar un producto deseado mas rapidamente y ofrece una contencion completa sin problemas ambientales o riesgos y no garantiza mezcla con la cadena alimentaria.

En comparacion con el uso de celulas en suspension transgenicas estables, la divulgacion proporciona velocidad mas alta de gen a producto, productividad mas alta y permite la produccion de productos toxicos que pueden dificultar la regeneracion de una lmea celular establemente transformada.

La divulgacion se describira ahora adicionalmente con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 representa T-ADN de vectores de expresion basados en las series pTRA, pUTA y TRBO que contienen secuencias de diferentes protemas fluorescentes con diferentes senales de direccionamiento. (A) pTRAc rfp-AH para la expresion de una DsRed secretada, (B) pTRAc rfp-ERH para la expresion de una DsRed retenida en ER, (C) pTRAc rfp-H para la expresion de una DsRed citosolica, (D) pTRAc rTPrfp-H para la expresion de una DsRed

dirigida a plastido, (E) pTRAkc glyDS-zenH para la expresion de una DsRed dirigida a cuerpo de protema, (F) pTRAc

rTPgfp para la expresion de una GFP dirigida a plastido, (G) pUTA TPrfp para la expresion de una DsRed dirigida a plastido, (H) TRBO-G para la expresion de una GFP citosolica usando un replicon del virus del mosaico del tabaco. El esqueleto de vector de pTRA se basa en pPAM (GenBank AY027531). El esqueleto de vector de pUTA contiene la protema de iniciacion de la replicacion trfA para la replicacion de plasmidos independiente de la cepa hospedadora de RK2 ori. El esqueleto de TRBO se origina a partir de pCB301 (GenBank AF139061). LB y RB, borde izquierdo y derecho del T-ADN; SAR, region de union al andamiaje; P y pA, promotor 35S con potenciador y terminador duplicados del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV); CHS, 5'-UTR de gen de chalcona sintetasa (P. hortense); TL, 5'-UTR del virus del grabado del tabaco (TEV); SP, peptido senal optimizado en codon de mAb24

murino; TP, peptido de transito de GBSSI de H. vulgare; rTP, peptido de transito de GBSSI de S. tuberculosum;

DsRed, protema fluorescente roja de Discosoma sp.; glyDs, variante de DsRed con sitio de N-glucosilacion; zen, extremo N de gamma-zema de Zea mays; GFP, protema verde fluorescente de Aequorea victoria (mutante S65C, mutante de ciclo 3); RK2 ori, origen de replicacion de amplio espectro de hospedador; bla, gen beta-lactamasa; ColEI ori, origen de replicacion (E. coli); His6, marca de histidina; KDEL, marca de retencion de ER; RBS, sitio de

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union al ribosoma; Pnos y pAnos, promotor y terminador de la nopalina sintasa; npt II, gen de neomicina fosfotransferasa; replicasa, protema 126K/183K del virus del mosaico del tabaco (TMV); mP, protema de movimiento de TMV; Rib, ribozima.

La Fig. 2 representa las regiones de T-ADN de vectores de expresion de la serie pTRA que contienen secuencias de diferentes anticuerpos. (A) pTRAp 2G12F-Ds para la co-expresion de la cadena pesada del anticuerpo 2G12, cadena ligera del anticuerpo 2G12 y DsRed dirigida a plastido; (B) pTRAp 2G12F-Ds para la co-expresion de la cadena pesada del anticuerpo 2G12 retenida en ER, cadena ligera del anticuerpo 2Gl2 retenida en ER y DsRed dirigida a plastido; (C) pTRAk MTAD para la co-expresion de cadena pesada del anticuerpo M12, cadena ligera del anticuerpo M12 y DsRed retenida en ER. SPg, peptido senal de la cadena gamma de Ig humana; 2G12HC, cadena pesada gamma de anti-Ig de gp120 de VIH-1 2G12 humana; SPk, peptido senal de cadena kappa de Ig humana; 2G12LCF, cadena ligera kappa de anti-Ig de gp120 de VIH-1 2G12 humana; pat, fosfinotricina acetiltransferasa; M12HC, cadena pesada gamma de Ig M12 humana; M12LC, cadena ligera lambda de Ig M12 humana (vease tambien la Fig. 1)

La Fig. 3 representa T-ADN de vectores de expresion basados en las series pSS que contienen secuencias de triptofano descarboxilasa con diferentes senales de direccionamiento (S. Di Fiore et al., "Targeting tryptophan decarboxylase to selected subcellular compartments of tobacco plants affects enzyme stability and in vivo function and leads to a lesion-mimic phenotype", Plant Physiol 129: 1160-1169, 2002). El esqueleto de vector se origina de pPCV002. (A) pT-CYT para la expresion de una triptofano descarboxilasa (TDC) citosolica; (B) pT-CHL para la expresion de una TDC dirigida a plastido. Q, 5'-UTR del virus del mosaico del tabaco; marcas, marcas c-myc/His6; pAocs, terminador de la octopina sintasa (vease tambien la Fig. 1,2)

La Fig. 4 representa T-ADN de la expresion pTRAkc Msp1(383319)ERH-Ds que contiene un fragmento de la protema de la superficie 1 de merozofto 3D7 de Plasmodium falciparum (GenBank XM_001352134).

La Fig. 5 muestra fotos macroscopicas de celulas BY-2 5 dfas despues de la infeccion con un Agrobacterium que contiene los casetes de expresion para la cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano (2G12) y un casete de expresion para una protema fluorescente roja dirigida a plastido (DsRed) bajo luz blanca (A) y bajo luz de excitacion verde para la visualizacion de fluorescencia de DsRed (B). Arriba: "bloque de celulas" infiltrado. Abajo: celulas en suspension recogidas de co-cultivo con Agrobacterium a una DO final de 0,05 (izquierda) y a una DO final de 0,1 (derecha).

La Fig. 6 muestra fotos microscopicas representativas de celulas BY-2 5 dfas despues de la infeccion con un Agrobacterium que contiene los casetes de expresion para la cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano (2G12) y un casete de expresion para una protema fluorescente roja dirigida a plastido (DsRed) bajo luz blanca (A,B) y bajo luz de excitacion verde para la visualizacion de fluorescencia de DsRed (C,D). Celulas de un "bloque de celulas" infectado con agro (A,C). Suspension celulas de co-cultivo con Agrobacterium a una DO final de 0,1 (B,D).

La Fig. 7 muestra fotos de bloques de celulas BY-2 6 dfas despues de infeccion con Agrobacteria que contiene un casete de expresion para un fragmento Msp1 de Plasmodium falciparum (p38-p33-p19) y un casete de expresion para una DsRed dirigida a plastido bajo luz blanca (A) y bajo luz de excitacion verde para la visualizacion de fluorescencia de DsRed (B). Las diferentes densidades opticas (1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625) se indican sobre la placa de Petri (A). (C) muestra la inmunodeteccion de Msp1-p19 de Plasmodium falciparum mediante transferencia puntual.

La Fig. 8 muestra fotograffas de un bloque de celulas BY-2 plano 4 dfas despues de que diferentes cepas de Agrobacterium se expusieran sobre las celulas bajo luz blanca (A), con un filtro de GFP (B) y con un filtro de DsRed (C). (1-3) tres clones de Agrobacteria EHA105 transformados con pTRBO-G, (4-6) tres clones de GV2260 Agrobacteria transformados con pTRBO-G, (7) EHA105 que contiene pUTA-TPrfp, (8) GV3101::pMP90RK que contiene pUTA-TPrfp y (+) control positivo Gv3101::pMP90RK que contiene pTRA-rTPgfp.

La Fig. 9 muestra la acumulacion de protemas fluorescentes elegidas de diferente forma en bloques de celulas 5 dfas despues de la agro-infeccion. Se transformaron transitoriamente bloques de celulas de 0,3 g de peso fresco en microcolumnas (A) y bloques de celulas de 3 g en columnas de 14 ml (B). (1) GFP dirigida a plastido, (2) celulas no transformadas, (3) DsRed secretada, (4) DsRed retenida en ER, (5) DsRed citosolica, (6) DsRed dirigida a plastido, (7) DsRed dirigida a cuerpo de protema, (8) co-transformacion con DsRed retenida en ER y GFP dirigida a plastido. Las fotos se tomaron bajo luz blanca (izquierda), con un filtro de DsRed (centro) y con un filtro de GFP (derecha). La cantidad extrafda de DsRed se muestra en (C).

La Fig. 10 muestra fotos de bloques de celulas BY-2 en columnas de diferentes dimensiones que expresan transitoriamente DsRed. (A) bajo luz blanca, (B) con un filtro de DsRed.

La Fig. 11 muestra la influencia de las condiciones de aireacion sobre la expresion de DsRed y 2G12 transitoriamente expresadas, respectivamente. (A, B) muestra imagenes de bloques de celulas aireados de forma diferente en columnas, (A) bajo luz blanca, (B) con un filtro de DsRed. (C) muestra la acumulacion niveles de DsRed

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y 2G12 en celulas BY-2 rellenas en columna 140 horas despues de la agro-infeccion. La perdida de peso de los bloques de celulas se indica debajo del grafico.

La Fig. 12 muestra geles de SDS-PAGE tenidos con Coomassie de extractos totales y eluatos de celulas rellenas en columna 5 dfas despues de la infiltracion con Agrobacterium transgenico. (A) Infeccion con construcciones de expresion para un anticuerpo M12 secretado o una DsRed que forma cuerpo de protema (control). (B) Infeccion con construcciones de expresion para una DsRed secretada o retenida en ER. Las muestras de extracto sobre los geles se corresponden con aprox. 10 mg de peso de celulas frescas (FCW), las muestras de eluato sobre el gel se corresponden con eluatos de aprox. 20 mg de FCW.

La Fig. 13 muestra la acumulacion de triptamina en celulas rellenas transitoriamente transformadas en diferentes momentos de tiempo despues de la agro-infeccion con triptofano descarboxilasa o GFP dirigida de forma diferente. Se anadio triptofano adicional (trp) 18 h despues de la agro-infeccion.

La Fig. 14 muestra fotos de bloques de celulas de Catharanthus roseus generadas a partir de cultivos en suspension pre-cultivados de diferente forma 4 dfas despues de la infiltracion con Agrobacteria que contiene vectores de expresion en plantas para cualquier DsRed secretada (rAH) o una DsRed retenida en ER (rERH). Las fotos fueron tomadas bajo luz blanca (A) y con un filtro de DsRed (B). Las celulas en suspension se cultivaron en medio MS67 o en medio bY-2, respectivamente.

La Fig. 15 muestra una fotograffa de un bloque de celulas BY-2 11 dfas despues de que esporas de diferentes especies de Aspergillus se aplicaran sobre el bloque. (A) A. niger, (B) A. nidulans, (C) A. flavus, (D) A. parasiticus.

La Fig. 16 muestra un gel de SDS-PAGE tenido con Coomassie de un eluato de celulas rellenas en columna de 4 dfas de edad generadas a partir de un cultivo en suspension no mutante de BY-2 de 5 dfas de edad (1) y del medio de cultivo del cultivo en suspension no mutante de bY-2 de 9 dfas de edad correspondiente (2).

Ejemplo 1

Comparacion de la expresion transitoria en bloques de celulas con la expresion transitoria en suspension

Con el fin de evaluar la produccion de protemas recombinantes transitoria en un bloque de celulas segun la presente invencion, se comparo la expresion transitoria de DsRed y el anticuerpo 2G12 en un bloque de celulas infiltrado con Agrobacterium con el metodo del estado de la tecnica de co-cultivo de celulas en suspension con Agrobacterium en cultivo lfquido.

Se usaron Agrobacterium recombinante (cepa GV3101::pMP90RK) que aloja el vector binario pTRAp-2G12FER-Ds que contiene los casetes de expresion para la cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano (2G12) y un casete de expresion para una protema fluorescente roja dirigida a plastido (DsRed) en el mismo T-ADN. Ambos genes 2G12 contienen la secuencia KDEL para retencion en ER del anticuerpo (Fig. 2B). La secuencia KDEL se uso deliberadamente para evitar la secrecion del anticuerpo que permite una comparacion directa de la productividad de celulas de bloques de celulas y en suspension.

Se prepararon cepas de Agrobacterium para la transformacion transitoria del siguiente modo. Se iniciaron cultivos a partir de reservas de glicerol inoculando 50 pl en 5 ml de medio YEB (5 g/l de extracto de ternera, 1 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de peptona, 0,5 g/l de mgSO4, pH 7,4, complementado con 50 mg/l de carbenicilina y 25 mg/l de kanamicina). Los cultivos bacterianos se cultivaron a 26 °C durante tres dfas a una densidad optica (DO) de aproximadamente 5. Las bacterias se sedimentaron por centrifugacion y se resuspendieron a DO 1 con medio de infiltracion (50 g/l de sacarosa, 2 g/l de glucosa, 0,5 g/l de Ferty® 2 Mega (Planta Dungemittel, Alemania), pH 5,3, complementado con acetosiringona 200 pM). La suspension bacteriana se incubo entonces durante 1 hora a 22 °C antes de la aplicacion.

Se cultivaron celulas de Nicotiana tabacum L. cv. bright yellow 2 (BY-2) en medio lfquido (3 % de sacarosa, 4,3 g/l de sales de Murashige y Skoog, 100 mg/l de inositol, 1 mg/l de tiamina, 0,2 mg/l de acido 2,4-diclorofenoxiacetico, 200 mg/l de KH2PO4, pH 5,6) en la oscuridad en un agitador rotatorio (180 rpm) a 26 °C. Las celulas se subcultivaron semanalmente en medio fresco usando un 4 % de inoculo.

Se manipularon celulas vegetales y Agrobacterium bajo condiciones asepticas usando equipo esteril. Se vertio una almuota de 50 ml de un cultivo en suspension de BY-2 de 400 ml de 4 dfas de edad en un embudo Buchner de 75 ml equipado con un filtro de celulosa de 5,5 cm de diametro (MN615) y el medio de cultivo se elimino completamente aplicando un vacm (aproximadamente 500 mbar durante 1 min). El bloque de celulas resultante se transfirio a una placa de Petri y se determino el peso de celulas fresco (FCW) (peso = 4,5 g, diametro = 5,5 cm, altura = 0,3 cm, densidad = 0,63 g/cm3). Entonces se anadieron gota a gota uniformemente 2,5 ml de suspension de Agrobacterium de DO 1 (0,55 ml por gramo de bloque de celulas) sobre el bloque de celulas produciendo una infiltracion completa. La cantidad de lfquido aplicado se ajusto de forma que el bloque de celulas fuera uniformemente humedecido, pero no completamente inundado para permitir una rapida recuperacion de vacms de aire. El bloque de celulas agro- infiltrado se cultivo durante 5 dfas a 26 °C y 95 % de humedad relativa (HR) en la oscuridad.

Para el co-cultivo se anadieron 2,5 ml y 5 ml de suspension de Agrobacterium de DO 1 a 50 ml de cultivo en suspension BY-2, dando la misma relacion y el doble de Agrobacterium con respecto a celulas vegetales que en el bloque de celulas.

Los cultivos de co-cultivo se cultivaron en un agitador rotatorio con 180 rpm a 26 °C en la oscuridad. Las celulas BY- 5 2 de los cultivos de co-cultivo se recogieron por filtracion a vacte despues de 5 dfas y los bloques de celulas

resultantes se transfirieron a placas de Petri. Las celulas de ambos experimented fueron macroscopicamente inspeccionadas bajo luz de excitacion verde mediante un filtro de emision roja para la expresion de DsRed (Fig. 5). La fluorescencia roja fue claramente visible en el bloque de celulas agro-infectadas preparado segun la invencion. Sorprendentemente, no fue visible fluorescencia roja en las celulas que se co-cultivaron con Agrobacterium en 10 suspension. El analisis microscopico de las celulas mostro claramente que se logro una tasa de infeccion mucho mas alta, ademas de una expresion de DsRed mas alta por celula con el metodo de bloques de celulas segun la invencion en comparacion con el metodo del estado de la tecnica de co-cultivo en suspension (Fig. 6).

Se extrajeron protemas solubles de ambos enfoques y se cuantifico DsRed y la acumulacion de anticuerpo. Brevemente, se homogeneizaron las celulas por sonicacion (Bandelin, Sonopuls, intervalo 0,9 s, 40 W, 2 x 30 s) en 15 dos volumenes (peso/volumen) de tampon de extraccion (fosfato de potasio 50 mM, NaCl 500 mM, bisulfato de sodio 10 mM, pH 7,5). El residuo celular se sedimento por centrifugacion (15 min, 13000 g, 4 °C) y el sobrenadante claro se uso para el analisis adicional. Se cuantifico DsRed midiendo la fluorescencia (excitacion 530 ± 12,5 nm; emision 590 ± 17,5 nm) de las protemas solubles extrafdas. Se realizo la cuantificacion de anticuerpos por espectroscopfa de resonancia de plasmones superficiales usando un instrumento BIACORE™ T200 con protema A acoplada a un chip 20 sensor CM5 (como se describe en T. Holland et al., "Optimal nitrogen supply as a key to increased and sustained production of a monoclonal full-size antibody in BY-2 suspension culture", Biotechnol Bioeng 107: 278-289, 2010).

Ni DsRed ni el anticuerpo 2G12 se detectaron en extractos derivados de celulas en suspension co-cultivadas. A diferencia, los extractos derivados del bloque infectado con celulas de agro contuvieron 55 |jg de DsRed y 47 |jg de anticuerpo 2G12 por gramo de FCW.

25 Este ejemplo muestra que usando un bloque de celulas segun la presente invencion, puede lograrse un rendimiento sustancialmente mas alto de protemas recombinantes por expresion transitoria despues del co-cultivo con Agrobacteria recombinante en el bloque de celulas en comparacion con el cultivo en suspension. Ademas, este ejemplo demuestra claramente que la productividad mas alta en el bloque de celulas es debida a una eficiencia de transformacion sustancialmente mas alta (normalmente 50 %-80 %), ademas de a una acumulacion de producto 30 mas alta dentro de la celula.

Ejemplo 2

Expresion transitoria de antfgenos de Plasmodium falciparum en bloques de celulas

Con el fin de probar si los bloques de celulas pueden usarse para la produccion de antfgenos de la malaria, se produjeron transitoriamente diferentes protemas de Plasmodium falciparum.

35 Una cepa de Agrobacterium recombinante que contiene un vector binario con un casete de expresion para un fragmento del extremo carboxi retenido en eR de Msp1 (p38, p33 y p19) de Plasmodium falciparum y un segundo casete de expresion para una DsRed dirigida a plastido (Fig. 4). Las bacterias se cultivaron y prepararon como se describe en el Ejemplo 1. La suspension de infiltracion de Agrobacterium se diluyo en serie de DO 1 a DO 0,0625 antes de la infeccion de las celulas vegetales.

40 Se uso un cultivo en suspension de BY-2 de 3 dfas de edad para generar un bloque de celulas como se describe en el Ejemplo 1. El bloque de celulas se corto en trozos de aproximadamente 5 mm x 5 mm x 10 mm (Fig. 7A). Se transfirieron seis trozos en una placa de Petri y se infiltraron con gotas hasta la saturacion (aprox. 150 jl por bloque de celulas) con suspensiones de Agrobacterium de diferentes densidades opticas. El control negativo se infiltro con medio de infiltracion solo (Fig. 7). Despues de 6 dfas de incubacion a 20 °C y 95 % de HR, los trozos de bloques se 45 analizaron para fluorescencia de DsRed y expresion de antfgenos. DsRed se observo macroscopicamente bajo luz de excitacion verde a traves de un filtro de emision roja (Fig. 7B). Para la deteccion de la protema de Plasmodium, las protemas solubles se extrajeron como se describe en el Ejemplo 1 y se aplico una alteuota de cada extraccion sobre una membrana de nitrocelulosa. La presencia de la protema de Plasmodium se visualizo por inmunodeteccion usando el anticuerpo monoclonal 5.2 contra el dominio p19 y un anticuerpo secundario conjugado con AP seguido 50 de incubacion con NBT/BCIP (nitro-azul de tetrazolio / 5-bromo-4-cloro-3'-indolilfosfato).

Se detecto una fuerte fluorescencia de DsRed en todos los bloques infectados con celulas (Fig. 7B). Solo se detecto una diferencia menor en la intensidad de fluorescencia entre bloques de celulas infiltradas con una concentracion de Agrobacterium de DO 1 y bloques de celulas infiltradas con una suspension de Agrobacterium superior a 10 veces de DO 0,0625. La deteccion inmunologica clara de la protema de Plasmodium co-transformada en todos los bloques 55 de celulas infiltrados tampoco reflejo la dilucion de 10 veces de Agrobacterium (Fig. 7C). El nivel de acumulacion mas alto se obtuvo por infiltracion con una suspension de Agrobacterium de DO 1.

En experimented adicionales, se expresaron satisfactoriamente otras protemas de Plasmodium falciparum (Pfsp25 solo y en fusion con DsRed; y otra protema de fusion que consiste en dominios de varias protemas de la malaria diferentes) en diferentes formatos de bloques de celulas BY-2 (datos no mostrados). Este ejemplo muestra que la acumulacion de protema recombinante es alta incluso cuando el bloque de celulas se infiltra con cantidades mas 5 bajas de Agrobacteria. La invencion, por tanto, proporciona un metodo para una produccion mas economica que es particularmente importante para aplicaciones industriales a grandes escalas. Esto tambien muestra que protemas de la malaria diferentes pueden ser eficientemente expresadas y producidas y que el metodo desvelado es generalmente adecuado para el desarrollo y la produccion de vacunas contra la malaria y vacunas contra otras enfermedades infecciosas.

10 Ejemplo 3

Uso de bloques de celulas para aplicaciones de cribado

Como los bloques de celulas son altamente homogeneos, tambien son ideales para fines de cribado. Por tanto, esto se demostro en este ejemplo evaluando la influencia de la cepa de Agrobacterium infiltrada y diferentes vectores de expresion en la acumulacion transitoria de producto. Se usaron dos vectores de expresion diferentes. El vector 15 binario pUTA-TPrfp que contiene una DsRed dirigida a plastido conducida por el promotor 35S (Fig. 1G), y el vector binario pTRBO-G que contiene un ADNc conducido por el promotor 35S del virus del mosaico del tabaco (TMV) donde la secuencia de protemas de la capside esta sustituida por GFP (Fig. 1H) (J.A. Lindbo, "TRBO: a high- efficiency tobaco mosaic virus RNA-based overexpression vector", Plant Phys 145: 1232-1240, 2007). Cada vector se introdujo en dos cepas de Agrobacterium diferentes. El vector estandar pUTA-TPrfp se introdujo en 20 GV3101::pMP90RK y EHA105; el vector viral pTRBO-G en GV2260 y EHA105 (R. Helens et al., "A guide to

Agrobacterium binary Ti vectors", TIBS 5: 446-451,2000).

Se uso pTRA-rTPgfp en GV3101::pMP90RK como control positivo (Fig. 1F). Se iniciaron cultivos lfquidos de GV- pUTA-TPrfp, EHA-pUTA-TPrfp y GV-pTRA-rTPgfp a partir de reservas de glicerol. Para cultivos de GV-pTRBO-G y EHA-pTRBO-G, se inocularon tres colonias sin verificar obtenidas de una electro-transformacion recien hecha con 25 ADN de plasmido para cada cepa. Se cultivaron cepas de Agrobacterium en condicion normal (Ejemplo 1) con 50 mg/l de carbenicilina y 25 mg/l de kanamicina para GV-pUTA-TPrfp, GV-pTRBO-G y GV-pTRA-rTPgfp, 50 mg/l de carbenicilina para EHA-pUTA-TPrfp y 25 mg/l de kanamicina para EHA-pTRBO-G. Despues de 3 dfas las bacterias se sedimentaron por centrifugacion y se resuspendieron a DO 1 con medio de infiltracion. Las suspensiones bacterianas se incubaron durante 3 horas a 22 °C antes de la aplicacion. Se genero un bloque de celulas (peso = 4 30 g, diametro = 5,5 cm, altura = 0,3 cm, densidad = 0,56 g/cm3) usando 25 ml de un cultivo de BY-2 de 5 dfas de edad cultivado en condiciones normales (Ejemplo 1). El bloque de celulas se dispuso invertido en una placa de Petri y entonces se aplicaron 40 pl de cada suspension de Agrobacterium sobre la superficie lisa. El bloque de celulas infiltrado se incubo a 26 °C con 95% de HR. Despues de 4 dfas el bloque de celulas se inspecciono bajo luz de excitacion azul a traves de un filtro verde para la expresion de GFP (Fig. 8B) y bajo luz de excitacion verde a traves 35 de un filtro rojo para la expresion de DsRed (Fig. 8C). La expresion fluorescente de protemas con el vector viral, ademas del vector binario estandar, fue claramente menos eficiente cuando EHA105 se uso para transferir las construcciones de expresion en las celulas vegetales. Este resultado se confirmo infectando bloques de celulas de 3 g en columnas y por transformacion transitoria de hojas de Nicotiana benthamiana con las mismas suspensiones de Agrobacterium (datos no mostrados). Este metodo de "aplicacion de agro" facil de manipular a pequena escala 40 tambien puede usarse para evaluar otro parametro que puede influir en la expresion de protemas diana (por ejemplo, condiciones de crecimiento y pretratamiento de Agrobacteria, composicion de medios de infiltracion o condiciones de cultivo del bloque de celulas infiltradas). Cientos de muestras pueden ser analizadas en paralelo sin exigir equipo tecnico, un matraz oscilante de 1 l con 400 ml de cultivo de BY-2 proporcionara material durante 16 veces de bloques de celulas de 4 g en 5 dfas, a partir de un cultivo de 400 ml de 11 dfas de edad pueden generarse 30 45 bloques de celulas.

Ejemplo 4

Expresion transitoria en bloques de celulas en columnas

Con el fin de probar si es posible generar, infiltrar y mantener bloques de celulas en columnas, se realizaron varios experimentos. En este ejemplo, versiones dirigidas de forma diferente de la protema fluorescente roja DsRed y la 50 protema verde fluorescente GFP se expresaron transitoriamente en un formato de columna de celulas rellenas.

Se usaron diferentes cepas de Agrobacterium que alojan vectores de expresion binarios para una DsRed secretada (Fig. 1A), una DsRed retenida en ER (Fig. 1B), una DsRed citosolica (Fig. 1C), una DsRed dirigida a plastido (Fig. 1D), una DsRed dirigida a cuerpo de protema (Fig. 1E) y una GFP dirigida a plastido (Fig. 1F). Las suspensiones de Agrobacterium para la agro-infeccion se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Antes de la aplicacion, las 55 suspensiones bacterianas se incubaron durante 5 horas a 22 °C. Para los experimentos de co-infeccion, se mezclaron dos cepas de Agrobacterium (que conteman una DsRed retenida en eR y una GFP dirigida a plastido, respectivamente) de DO 1, dando una DO de 0,5 para cada una de las cepas.

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Se usaron celulas en suspension de BY-2 de 11 dfas cultivadas en condiciones normales (Ejemplo 1) para generar bloques de celulas en dos tipos diferentes de columnas de polipropileno esteril. Se usaron micro-columnas de centrifugacion (columna Receiver 20 pm, MACHEREY-NAGEL, Alemania, Fig. 8A) con un volumen de 0,7 ml y columnas midi (columna QIAGEN-tip 100, QIAGEN, Alemania, Fig. 9B) con 14 ml de volumen, ambas equipadas con una frita de filtro de polietileno de 20 pm. Se generaron bloques de celulas vertiendo el cultivo en suspension en una columna conectada a un vado. Despues de eliminarse completamente el medio por filtracion a vado, se determinaron las dimensiones del bloque de celulas resultante. Se uso 1 ml del cultivo en suspension para las micro- columnas, dando un bloque de celulas de 0,3 g de peso con un diametro de 0,68 cm, una altura de 1,5 cm y una densidad de 0,54 g/cm3. Los bloques de celulas generados a partir de la suspension de 10 ml en las columnas midi tuvieron un peso de 3 g, un diametro de 1,4 cm, una altura de 3,6 cm y una densidad de 0,54 g/cm3.

Los bloques de celulas se infiltraron en la columna pipeteando la suspension de Agrobacterium sobre los bloques de celulas (1 ml por gramo de bloque de celulas). Con el fin de lograr una infiltracion completa, se aplico un corto vado hasta que las primeras gotas de lfquido dejaron la columna, pero todavfa dejaron la parte superior del bloque de celulas cubierta con suspension. Despues de incubar los bloques de celulas infiltrados durante 30 min a 22 °C, el lfquido restante se elimino completamente aplicando vado a la columna con el fin de restaurar los huecos de aire. La eliminacion del lfquido aplicado se controlo determinando el peso de las celulas rellenas en columna tratadas. Para garantizar la alta viabilidad de las celulas durante la siguiente fase de incubacion, el aumento de peso debido a la captacion de lfquido por el bloque de celulas o celulas debe preferentemente no superar, por ejemplo, el 15% del peso de celulas fresco original (FCW) del bloque. Los bloques de celulas se cultivaron en las columnas a 26 °C y 92 % de humedad relativa. 5 dfas despues de la agro-infeccion, las protemas solubles totales se extrajeron de los bloques de celulas como se describe en el Ejemplo 1.

La expresion de protemas fluorescentes fue macroscopicamente detectable en todos los bloques de celulas infiltrados (Fig. 9) mostrando que diferentes compartimentos de las celulas en un bloque de celulas pueden usarse para la produccion de protemas recombinantes. Los bloques de celulas mostraron una fluorescencia homogenea que indica una administracion eficiente de las Agrobacteria a cada area del bloque de celulas. Dependiendo del compartimento diana se observo una clara diferencia en los niveles de acumulacion, que oscilo de aprox. 40 pg/g de FCW para una DsRed dirigida a plastido a aprox. 160 pg/g de FCW para una DsRed citosolica (Fig. 9C). DsRed dirigida a cuerpos de protema mostro una alta fluorescencia in vivo, pero no fue extrafble debido a la insolubilidad de cuerpos de protema. La expresion simultanea de DsRed y GFP (Fig. 9A8 y 9B8) mostro que la co-infeccion con dos cepas de Agrobacterium separadas era posible. El tamano del bloque de celulas, 0,3 g en micro-columnas o 3 g en columnas de 14 ml, no tuvo efecto sobre los niveles de expresion. Por tanto, se preve que micro-bloques de celulas seran muy utiles para fines de cribado y analtticos, por ejemplo para determinar los parametros optimos para una produccion a gran escala (por ejemplo, condiciones de pre-cultivo, infeccion y co-cultivo), para evaluar diferentes construcciones de expresion o para desarrollar y estudiar vfas metabolicas. Debido a la alta homogeneidad de los bloques de celulas, son particularmente utiles para disenos estadfsticos y experimentos multifactoriales. Para el analisis de alto rendimiento, estan disponibles placas filtrantes de 96 pocillos que son compatibles con sistemas automatizados (por ejemplo, placa Receiver de 20 pm, placa filtrante Chromabond® MULTI 96, ambas de MACHEREY-NAGEL, Alemania). Los pocillos de estas placas filtrantes son similares a las micro-columnas usadas para la generacion e infiltracion de bloques de celulas en este ejemplo. En comparacion con el analisis de alto rendimiento en cultivos en suspension en placas de 96 pocillos, los micro-bloques de celulas tienen la ventaja de que la expresion transitoria es mas eficiente (vease el Ejemplo 1) y que mas biomasa esta disponible para el analisis. Ademas de las columnas usadas anteriormente, tambien se probaron columnas mas grandes (Fig. 10). Se observo expresion de DsRed 4 dfas despues de la agro-infeccion en un bloque de celulas de 12 g (2,8 cm de diametro, 3,5 cm de altura) en una columna de 70 ml (jeringa de filtro del kit GenElute™ HP Plasmid Midiprep, SIGMA, EE.UU.) y en un bloque de celulas de 87 g (3,7 cm de diametro, 11 cm de altura) en una columna de 150 ml (columna de polipropileno Chromabond® de 150 ml, MACHEREY-NAGEL, Alemania). El bloque de celulas de 12 g se genero a partir de un cultivo en suspension de BY-2 de 4 dfas de edad y se infiltro con un Agrobacterium que aloja una construccion de expresion para una DsRed dirigida a plastido (Fig. 2B). El bloque de celulas de 87 g se genero a partir de un cultivo de 11 dfas de edad y se infiltro con un Agrobacterium que aloja una construccion de expresion para una DsRed retenida en ER (Fig. 1B). La unica diferencia con los procedimientos convencionales descritos anteriormente era que el bloque de celulas de 87 g se infiltro con una suspension de Agrobacterium de DO 0,25. La determinacion de la densidad del bloque de celulas y la confirmacion de que se elimino lfquido suficiente para restaurar los huecos de aire se lograron pesando. Los diferentes experimentos tambien mostraron que celulas de diferente edad, es decir, dfas despues del subcultivo, son adecuadas para generar un bloque de celulas segun la presente invencion. Ademas, son posibles diferentes formas y tamanos de bloques de celulas. Este ejemplo muestra que es factible transformar e incubar tambien bloques de celulas mas grandes bajo condiciones esteriles y contenidas. Esto es a diferencia de los sistemas basados en hojas que generalmente no son esteriles.

Ejemplo 5

Efecto de la elevada aireacion sobre la produccion de protemas transitoria

Para investigar la influencia de la aireacion sobre el rendimiento de las celulas rellenas transformadas, se probaron diferentes configuraciones: (1) un bloque de celulas activamente aireado, (2) un bloque de celulas pasivamente

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aireado, (3) un bloque de celulas con un canal de aire central, (4) un bloque de celulas en una columna perforada (Fig. 11A).

La cepa de Agrobacterium que aloja el vector binario pTRAp-2G12FER-Ds (Fig. 2B) se cultivo en condiciones normales y se preparo como se describe en el Ejemplo 1.

Se usaron celulas en suspension de BY-2 de 4,5 dfas de edad cultivadas bajo condiciones normales para generar bloques de celulas en columnas midi de 14 ml (Ejemplo 4). En los experimented 1, 2, 4 se generaron bloques de celulas solidos, la columna perforada se sello con Parafilm®. En el experimento 3 se coloco una varilla de plastico con un diametro de 2,5 mm en el centro de la columna. Los bloques de celulas tuvieron diametros de 1,4 cm y pesos de 2,1-2,5 g, alturas de 2,5-2,7 cm y densidades de aproximadamente 0,57 g/cm3. Despues de la infiltracion con suspension de Agrobacterium y eliminacion del lfquido (Ejemplo 4), la varilla de la columna 3 y la junta de Parafilm® de la columna 4 se eliminaron dando un bloque de celulas con un canal de aire central y un bloque de celulas con suministro de aire adicional desde los lados, respectivamente. Las columnas se cultivaron a 26 °C en una estufa de incubacion con 92 % de HR. La columna 1 esta conectada a una bomba de aire, que se coloco dentro de la estufa de incubacion para el suministro con aire de 26 °C y 92 % de HR. La bomba tuvo una capacidad de 50 l/h y se establecio a un bombeo periodico (15 min encendida, 45 min apagada). 6 dfas despues de la agro-infeccion se determino el peso de los bloques de celulas y las protemas solubles se extrajeron de los bloques de celulas y se analizaron para DsRed y la expresion de anticuerpos 2G12 (como se describe en el Ejemplo 1). Debido a la diferente perdida de peso de los bloques de celulas, la cantidad de DsRed y anticuerpo 2G12 se calculo basandose en el FCW al inicio del cultivo en la estufa de incubacion (Fig. 11C). Los resultados muestran que una perdida de humedad debido a la evaporacion bien mediante aireacion forzada (Fig. 11C1) o bien como una elevada superficie (Fig. 11C4) tiene un efecto negativo sobre la productividad de las celulas rellenas. Tanto la acumulacion de DsRed dirigida a plastido como tambien la acumulacion del anticuerpo retenido en ER se reducen en celulas, que muestra una perdida de peso superior al 20 %. Por tanto, deben usarse condiciones de cultivo, que minimizan la desecacion de los bloques de celulas (por ejemplo, aumentando la humedad relativa o re-humedeciendo los bloques de celulas). Por otra parte, los resultados muestran que a esta dimension la aireacion es suficiente y no se necesitan medidas para el mejor suministro de oxfgeno e intercambio de gases.

Ejemplo 6

Recoleccion no destructiva de productos secretados de celulas rellenas

Para determinar si las protemas secretoras recombinantes pueden eluirse sin destruir las celulas, se rellenaron celulas en suspension de BY-2 en columnas y se transformaron transitoriamente mediante agroinfeccion. Se usaron diferentes cepas de Agrobacterium que conteman construcciones de expresion para un anticuerpo monoclonal secretor M12 junto con una DsRed retenida en ER (Fig. 2C), una DsRed secretora (Fig. 1A), DsRed retenida en ER (Fig. 1B) y una DsRed que forma cuerpos de protema (Fig 1E), respectivamente, para el experimento. El anticuerpo M12 (150 kDa) y DsRed (108 kDa) son ejemplos de protemas secretadas grandes. Como la DsRed retenida en ER es intracelular, es un control adecuado para examinar si las celulas vegetales son alteradas durante la incubacion o elucion. Se empleo DsRed formadora de cuerpos de protema insoluble como control para los extractos de celulas completas.

Se usaron celulas en suspension de BY-2 de 11 dfas de edad cultivadas en condiciones normales (Ejemplo 1) para generar bloques de celulas en columnas. Se vertieron 10 ml del cultivo en suspension en una columna de polipropileno de 14 ml (diametro 1,4 cm, altura 9 cm) equipada con una frita de filtro de polietileno de 20 pm. El medio se elimino completamente por filtracion a vacte y el bloque de celulas resultante (peso = 3 g, diametro = 1,4 cm, altura = 3,6 cm, densidad = 0,54 g/cm3) se infiltro dentro de la columna pipeteando la suspension de Agrobacterium sobre el bloque de celulas (1 ml por gramo de bloque de celulas). Con el fin de lograr una infiltracion completa, se aplico un corto vacte hasta que las primeras gotas de lfquido dejaron la columna pero todavfa dejaron la parte superior del bloque de celulas cubierto con la suspension. El bloque de celulas infiltrado se incubo durante 30 min a 22 °C y entonces el lfquido restante se elimino completamente para restaurar la estructura porosa aplicando vacte a la columna. Los bloques de celulas se cultivaron en las columnas a 26 °C y 92 % de humedad relativa. 5 dfas despues de la agro-infeccion las protemas solubles totales de muestras de 200 mg de FCW de las celulas rellenas se extrajeron con 2 volumenes de tampon de extraccion (fosfato de potasio 50 mM, NaCl 500 mM, bisulfito de sodio 10 mM, pH 7,5). Con el fin de solo recuperar protemas secretadas, las restantes celulas de la columna rellena se lavaron con tampon de extraccion del siguiente modo. Se aplicaron 3 ml de tampon a una columna y se aspiraron en el bloque de celulas por un corto vacte. Despues de 30 min de incubacion, el tampon se recogio por vacte y se aplico otra vez sobre las celulas. Despues de tres etapas de lavado consecutivas se recuperaron 2,7 ml de eluato y posteriormente se clarificaron por centrifugacion. Se analizaron preparaciones de protema extratele total y protemas eluibles para el contenido de protema recombinante sobre geles de SDS-PAGE tenidos con Coomassie (Fig. 12). Las cantidades de protema cargadas sobre los geles se correspondieron con las protemas extrateles totales del bloque de celulas de 10 mg y con las protemas eluibles del bloque de celulas de 20 mg. Las intensidades de las bandas de protema recombinante son casi las mismas en el extracto y eluato para el anticuerpo (Fig. 12A) y para DsRed (Fig. 12B), respectivamente. Esto significa que en ambos casos puede eluirse aproximadamente el 50 % de la protema recombinante totalmente producida. Sin embargo, la cantidad de protemas hospedadoras contaminantes era mas baja en las muestras de elucion.

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La cantidad de anticuerpo M12 se cuantifico por espectroscopfa de resonancia de plasmones superficiales con protema A acoplada a un chip sensor, la cantidad de DsRed se determino por fluorescencia. Se eluyeron aproximadamente el 55 % (96 pg/g de FCW) de M12 secretor totalmente producido (175 pg/g de FCW) y 40 % (28 |jg/g de FCW) de la DsRed secretora (70 pg/g de FCW). La presencia de solo una fraccion (inferior al 1 %) de la DsRed retenida en ER totalmente producida (120 pg/g de FCW) en las muestras de elucion indica que las celulas no fueron danadas durante el cultivo o durante la elucion de las protemas secretadas (vease tambien la Fig. 12B).

Si se usa el metodo del estado de la tecnica de transformacion transitoria de hojas de planta o plantas completas es factible una preparacion selectiva de productos secretados a una escala analttica recogiendo lfquido de lavado intercelular, pero poco practico a una mayor escala. Por lo tanto, a gran escala los productos secretados tienen que recuperarse de extractos de biomasa completa. Asf, el producto deseado tiene que purificarse a partir de una mezcla compleja de compuestos hospedadores (por ejemplo, protemas, metabolitos, ligninas, celulosas). En particular, los compuestos fenolicos son problematicos con respecto al procesamiento y purificacion aguas abajo. A este respecto, la presente invencion elude estos problemas, ya que los productos secretados pueden ser directamente eluidos del bloque de celulas sin destruir las celulas vegetales y con un mmimo de compuestos hospedadores contaminantes. Ademas, debido a la escalabilidad, el metodo de bloques de celulas puede implementarse a una gran escala industrial. Es concebible que bajo condiciones de elucion y cultivo optimizadas la elucion repetida de productos secretados de celulas rellenas producira rendimientos mucho mas altos del producto deseado.

Ejemplo 7

Produccion de un metabolito secundario novedoso por ingeniena metabolica

Con el fin de establecer una nueva via biosintetica en celulas rellenas, se expreso transitoriamente la enzima triptofano descarboxilasa (TDC; EC 4.1.1.28), que no existe en N. tabacum en bloques de celulas de BY-2.

La TDC es una enzima citosolica que cataliza una etapa temprana de la via biosintetica del alcaloide terpenoide indol por descarboxilacion de 1-triptofano para producir el protoalcaloide triptamina. La triptamina es un precursor comun de un grupo de metabolitos secundarios terapeuticamente relevantes (por ejemplo, los farmacos antineoplasicos vinblastina y vincristina de Catharanthus roseus). Con el fin de aumentar adicionalmente el rendimiento del metabolito deseado, el triptofano precursor se alimento en una segunda etapa a los bloques de celulas despues de la transformacion.

Se rellenaron celulas en suspension de BY-2 de 4 dfas de edad en columnas de 14 ml como se describe en el Ejemplo 4 dando bloques de celulas de 2 g de FCW con una densidad de 0,58 g/cm3. Los bloques de celulas se transformaron transitoriamente por duplicado mediante agro-infeccion. La cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101::pMP90RK transformada con construcciones de expresion de planta para tanto una protema verde fluorescente dirigida a plastido (GFP) (Fig. 1F), una TDC dirigida a plastido (Fig. 3A) como una TDC citosolica (Fig. 3B) se cultivaron en condiciones normales (Ejemplo 1).

Las cepas de Agrobacterium se sedimentaron por centrifugacion, se resuspendieron y se ajustaron a una DO de 1 con medio de infiltracion. La suspension bacteriana se incubo durante 4 horas a 22 °C antes de la aplicacion sobre bloques de celulas vegetales.

Cada bloque de celulas se infiltro con 2 ml de suspension de Agrobacterium, se incubo durante 30 min a 22 °C, se seco por aspiracion por vacfo y se cultivo adicionalmente a 26 °C y 92 % de humedad relativa. 18 horas despues de la agro-infeccion, los bloques de celulas se infiltraron otra vez o bien con 2 ml de disolucion de triptofano (50 mM en medio de infiltracion semi-concentrado) o bien con 2 ml de medio de infiltracion semi-concentrado. Despues de la incubacion de los bloques de celulas infiltrados durante 30 min a 26 °C, las disoluciones se eliminaron otra vez completamente por vacm y las celulas rellenas en columna se colocaron de nuevo en el armario de cultivo. Se tomaron muestras de aproximadamente 250 mg de FCW a 69 h, 91 h y 112 h despues de la agro-infeccion y se guardaron a -80 °C. Se extrajo triptamina y se ensayo segun el metodo de R.S. Sangwan et al., "Direct fluorometry of phase-extracted tryptamine-based fast quantitative assay of 1-tryptophan decarboxylase from Catharanthus roseus ieaf', Anal Biochem 255: 39-46, (1998), con modificaciones menores.

En resumen, se extrajeron compuestos solubles en agua de las muestras de celulas por sonicacion en 2 volumenes (v/p) de tampon de extraccion (fosfato de potasio 50 mM, NaCl 500 mM, bisulfato de sodio 10 mM, pH 7,5) (vease el Ejemplo 1). Despues de anadir 0,9 ml de agua destilada a 0,1 ml del extracto claro, se anadieron 2 ml de NaOH 5 M y 3,5 ml de acetato de etilo. La emulsion se mezclo agitando con vortex durante 10 s y se dispuso a 4 °C durante 16 h para la separacion de fases. La fase organica superior se sometio a analisis fluorometrico usando un espectrometro de luminiscencia Aminco Bowman AB2 (Spectronic Instruments, Rochester, NY). Se midio la fluorescencia de triptamina a longitudes de onda de 280 nm de excitacion y 350 nm de emision con anchura de ranura de 4 nm para la luz de excitacion y de emision y el voltaje de fotomultiplicador establecido a 575 V.

Los niveles de triptamina detectados muestran que una TDC activa se expreso en los plastidos y en el citosol, respectivamente (Fig 13). Las enzimas introducidas convirtieron el triptofano endogeno en la novedosa sustancia triptamina. El alimentar triptofano adicional a las celulas que expresan transitoriamente TDC condujo a un claro

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aumento en la produccion de triptamina (5 veces para la TDC dirigida a plastido, casi 10 veces para la TDC citosolica).

Este ejemplo tambien muestra que el metodo segun la invencion puede usarse para la produccion de un metabolito. Ademas, demuestra que un bloque de celulas puede no solo transformarse para, por ejemplo, producir una enzima (TDC), sino tambien que sustratos y/o precursores pueden ser facilmente suministrados a las celulas en una etapa posterior con el fin de aumentar el rendimiento de producto. Por tanto, la presente invencion tambien incluye posibilidades para administrar cualquier sustancia de interes a las celulas con el fin de optimizar la formacion de producto (por ejemplo, nutrientes de planta adicionales, inductores, inhibidores), por ejemplo, por etapas de transformacion repetida, infiltracion y de incubacion. La manipulacion del metabolismo celular puede tener lugar durante, antes y/o despues de suministrar la informacion genetica por cualquier combinacion de aplicar compuestos y genes adecuados.

Aquellos expertos en la materia reconoceran facilmente que los bloques de celulas preparados a partir de cultivos en suspension no mutantes, mutados y/o transgenicos tambien pueden manipularse sin transformacion, es decir, aplicando compuestos diferentes. Esto en particular significa que los rendimientos de compuestos que existen de forma natural pueden aumentarse usando bloques de celulas segun la presente invencion y anadiendo sustratos, hormonas, inhibidores y/o precursores adecuados a ellas.

Ejemplo 8

Bloques de celulas de cultivos en suspension de diferentes especies de planta

Ademas de celulas en suspension de BY-2 de N. tabacum, se usaron varias otras suspensiones de celulas vegetales para generar bloques de celulas.

Catharanthus roseus

Se cultivaron celulas de C. roseus en medio MS67 (3 % de sacarosa, 4,4 g/l de sales de Murashige y Skoog, 0,6 mg/l de tiamina, 0,2 mg/l de kinetina, 1 mg/l de acido 2,4-diclorofenoxiacetico, pH 5,8) o en medio de BY-2 (Ejemplo 1) en la oscuridad en un agitador rotatorio (180 rpm) a 26 °C. Las celulas se subcultivaron semanalmente (20:100) en medio fresco.

Arabidopsis thaliana

Se cultivaron celulas de A. thaliana en medio ARA (3 % de sacarosa, 4,4 g/l de sales de Murashige y Skoog, 0,5 mg/l de acido naftalenoacetico, 0,1 mg/l de kinetina, pH 5,7) con 16 h de luz / 8 h de oscuridad en un agitador rotatorio (180 rpm) a 26 °C. Las celulas se subcultivaron semanalmente (15:100) en medio fresco.

Nicotiana benthamiana

Se cultivaron celulas de N. benthamiana en medio de BY-2 (ejemplo 1) en la oscuridad en un agitador rotatorio (180 rpm) a 26 °C. Las celulas se subcultivaron semanalmente (20:100) en medio fresco.

Se prepararon bloques de celulas de diferentes formas a partir de cada cultivo en suspension. Para los experimentos se usaron cultivos de 4 a 5 dfas de edad. Se generaron bloques de celulas similares a galleta de diferente espesor (0,2-0,5 cm) como se describe en el Ejemplo 1. Los bloques de celulas de aproximadamente 2 a 4 cm de altura se produjeron en columnas midi de 14 ml como se describe en el Ejemplo 4. Dependiendo de la especie de planta, se obtuvieron diferentes densidades de los bloques de celulas. La densidad de los bloques de celulas de C. roseus fue normalmente 0,65-0,75 g/cm3, bloques de celulas de A. thaliana tuvieron una densidad de aproximadamente 0,550,67 g/cm3 y bloques de N. benthamiana tuvieron una densidad de aproximadamente 0,6-0,7 g/cm3.

Bloques de celulas de C. roseus, A. thaliana y N. benthamiana infiltrados con Agrobacteria que alojan el vector binario pTRAp-2G12FER-Ds (Fig. 2B) mostraron expresion de DsRed macroscopicamente detectable. La produccion del anticuerpo 2G12 tambien se confirmo para cada especie de planta probada por espectroscopfa de resonancia de plasmones superficiales como se describe en el Ejemplo 1.

De forma interesante, dependiendo del medio usado para el cultivo en suspension de C. roseus, se observo una clara diferencia en los niveles de expresion. Esto se analizo adicionalmente transformando bloques de celulas de C. roseus generados a partir de celulas cultivadas en medio MS67 o medio BY-2 con dos construcciones de expresion de DsRed diferentes, pTRAc rfp-AH y pTRAc rfp-ERH (Fig. 1A, B). Tanto la DsRed secretada como la retenida en ER se acumularon mucho mas en celulas que se cultivaron en medio BY-2 (Fig. 14). Esto e muestra la importancia de una optimizacion de tambien las condiciones de pre-cultivo para lograr la alta transformacion y/o alta smtesis de producto. Los experimentos mostraron que la presente invencion puede aplicarse a celulas vegetales de diferentes especies.

Es muy conocido para aquellos expertos en la materia que condiciones de cultivo (por ejemplo, temperatura, aireacion, agitacion velocidad, composicion de la luz, etc.) y/o composicion del medio de cultivo (por ejemplo, nutrientes, hormonas, pH, conductividad, osmolaridad etc.) son factores determinantes para las caractensticas

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morfologicas y fisiologicas de un cultivo en suspension de plantas. La variacion de cada factor puede tener influencia sobre el rendimiento de las celulas vegetales en las etapas posteriores. Esto significa que las condiciones de cultivo y/o composiciones de medio tienen que optimizarse para cualquier produccion. Ademas de la optimizacion de la produccion del material de partida, los parametros de infiltracion (por ejemplo, densidad de Agrobacterium, tiempo de contacto, composicion del medio de infiltracion) y las condiciones de cultivo del bloque de celulas (por ejemplo, duracion, temperatura, aireacion, alimentacion, aplicacion de aditivos) tienen que optimizarse para cualquier lmea de celulas vegetales y para cualquier producto.

Ejemplo 9

Uso de celulas rellenas como sustrato para el cultivo de patogenos

Se genero un bloque de celulas de 3,64 ml (peso = 2 g, diametro = 5,5 cm, altura - 0,15 cm, densidad = 0,55 g/cm3) usando 50 ml de un cultivo de BY-2 de 4 dfas de edad cultivado en condiciones normales (Ejemplo 1). El bloque de celulas se dispuso en una placa de Petri vada y se infiltro con 1 ml de medio de infiltracion (50 g/l de sacarosa, 2 g/l de glucosa, 0,5 g/l de Ferty 2 Mega (Planta Dungemittel, Alemania), pH 5,3) que fue absorbido completamente por el bloque de celulas (peso del bloque de celulas = 3 g; densidad = 0,825 g/cm3). Se ha encontrado que esta cantidad de volumen (es decir, menor o igual a 1 ml por 2 gramos de bloque de celulas) es favorable para el inicio de la incubacion de los bloques de celulas en placas Petri debido a que los huecos de aire son generados en el plazo de algunas horas. Esto se ha confirmado por mediciones de control de la densidad del bloque de celulas que disminuyo a menos de 0,6 g/cm3 debido a la evaporacion. Y, lo que es mas importante, cantidades mas altas de lfquido (es decir, superiores a 1 ml por 2 gramos de bloque de celulas) fueron altamente perjudiciales debido a que, debido al exceso de lfquido, los huecos de aire no pudieron reconstituirse produciendo un bloque de celulas que tuviera una densidad que era demasiado alta para soportar apropiadamente la viabilidad celular o incluso para prevenir la muerte celular.

La siguiente etapa de tratamiento consistio en aplicar un pequeno volumen de 20 pl de suspensiones de esporas de cuatro especies de Aspergillus diferentes (Fig. 15; A - D) sobre la superficie del bloque de celulas. El bloque de celulas se incubo durante 11 dfas y luego se fotografio (Fig. 15).

Este ejemplo muestra que el bloque de celulas vegetales puede usarse como sustrato de crecimiento para diferentes especies de Aspergillus. Se selecciono Aspergillus como representante como patogeno vegetal, pero tambien como representante como patogeno humano y animal.

En este ejemplo, el bloque de celulas se preparo a partir de celulas en suspension de BY2 no mutadas para el posterior cultivo de hongos. Aquellos expertos en la materia apreciaran que tambien pueden usarse celulas en suspension transgenicas. En particular, pueden usarse bloques de celulas transgenicas que producen peptidos antifungicos, protemas o compuestos y su efecto sobre el crecimiento y desarrollo de los hongos puede ser estudiado. Igualmente, bloques de celulas generados a partir de celulas no mutadas pueden primero someterse a un tratamiento de transformacion y entonces usarse para estudiar el impacto de los productos sobre el crecimiento del patogeno fungico. Aquellos expertos en la materia tambien aceptaran que el metodo tambien puede usarse para estudiar el impacto de compuestos antibacterianos. El uso de bloques de celulas en placas de multi-titulacion para aplicaciones de cribado de alto rendimiento se describe en el Ejemplo 11 a continuacion y es obvio que estos ejemplos tambien pueden combinarse.

Ejemplo 10

Recoleccion no destructiva de un producto secretado del bloque de celulas generado a partir de una lmea celular en suspension transgenica

Se generaron cultivos en suspension de BY2 transgenicas despues de la transformacion con una construccion de expresion para un anticuerpo monoclonal M12 secretor junto con una DsRed retenida en ER (Fig. 2C). Despues de la seleccion en placas que contienen kanamicina, se transfirieron callos transgenicos a medio lfquido para establecer cultivos en suspension altamente homogeneos. Los cultivos en suspension se sub-cultivaron semanalmente transfiriendo 4 % del cultivo en suspension en medio lfquido fresco (Ejemplo 1).

Celulas en suspension de un cultivo en suspension de 5 dfas de edad fueron o bien recogidos para generar los bloques de celulas segun la presente divulgacion o bien las celulas se cultivaron adicionalmente en cultivo en suspension. Tanto los bloques de celulas como los cultivos en suspension se incubaron durante otros 4 dfas. Se prepararon bloques de celulas de 2 g de FCW (peso de celulas fresco) como se describe en el Ejemplo 6 usando columnas de polipropileno de 14 ml. Otra vez, se monitorizo cuidadosamente la constitucion de los huecos de aire y se controlo durante toda la incubacion / cultivo midiendo la densidad del bloque de celulas colado del que se habfa eliminado el medio lfquido. Por consiguiente, una humedad relativa del 90 % fue siempre garantizada durante la incubacion del bloque de celulas a 26 °C para prevenir el secado de las celulas dentro del bloque de celulas.

Las protemas solubles totales de muestras de 400 mg de FCW de los bloques de celulas o de las celulas del cultivo en suspension (separadas del medio por filtracion a vado) se extrajeron con 2 volumenes de tampon de extraccion (fosfato de potasio 50 mM, NaCl 500 mM, bisulfito de sodio 10 mM, pH 7,5).

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Se recuperaron anticuerpos secretados de las celulas rellenas en columna lavando las celulas rellenas en columna con tampon de extraccion (Ejemplo 6). Brevemente, se aplicaron 2 ml de tampon a una columna de 2 g y se aspiraron en el bloque de celulas por un corto vado. Despues de 30 min de incubacion el tampon se recogio por vado y se aplico otra vez sobre las celulas. Despues de tres lavados consecutivos se recuperaron 1,6 ml de eluato. Las muestras recogidas del medio de suspension original se usaron para comparacion.

Se midieron concentraciones de anticuerpo por SPR en una superficie de protema A (inmovilizada por acoplamiento a amina) usando el anticuerpo humano purificado H10 producido en celulas CHO como patron. Todas las muestras se analizaron en el intervalo lineal de la curva de dosis-respuesta. Se determino DsRed por fluorescencia usando un patron de DsRed.

A pesar del hecho de que el cultivo en suspension hada alcanzado una alta biomasa de celulas, no se detecto anticuerpo en el sobrenadante de cultivo en suspension. Asf, la fraccion de producto recombinante secretado fue del 0 %. La acumulacion intracelular del anticuerpo M12 fue 4,02 |jg por gramo de FCW de celulas en suspension de BY2 transgenicas. El rendimiento total (anticuerpo en el sobrenadante de celulas mas anticuerpo dentro de las celulas) fue asf tambien de 4,02 jg por gramo.

A diferencia, el rendimiento total de M12 alcanzo 11,4 jg por gramo de bloque de celulas, que se corresponde con un aumento de rendimiento total sustancial del 284 %. Y, lo que es mas importante, fue posible eluir anticuerpo secretado del bloque de celulas. El rendimiento de producto secretado fue 1,4 jg de anticuerpo M12 por gramo de bloque de celulas, que se corresponde con el 12 % del rendimiento total.

Este ejemplo demuestra que es posible derivar un producto de protema recombinante de un bloque de celulas generado a partir de un cultivo en suspension transgenico y que los rendimientos han aumentado significativamente el 284 % en comparacion con el control de celulas suspensas.

El rendimiento de DsRed retenida en ER aumento el 70 % en celulas del bloque de celulas en comparacion con las celulas en suspension (5,2 jg/g de FCW y 3,0 jg/g de FCW, respectivamente).

Este ejemplo tambien ilustra claramente que la incubacion de las celulas en suspension transgenicas en forma de un bloque de celulas no solo permite que el producto se recoja de una manera concentrada (en comparacion con el sobrenadante de cultivo celular en suspension) que es altamente beneficioso para el procesamiento corriente abajo (incluyendo una reduccion en tanto el tiempo de proceso como los costes).

Y, lo que es mas importante, el bloque de celulas tambien proporciona un punto de entrada excelente para usar tampones diferentes del medio de cultivo celular para maximizar la elucion del producto (aqrn una protema diana recombinante que ha sido secretada de las celulas) y asf el bloque de celulas proporciona beneficios adicionales con respecto a las celulas en suspension. Los sobrenadantes del cultivo en suspension contuvieron cantidades mucho mas altas de polisacaridos que eluyen de las celulas rellenas en columna. Se prefiere una baja cantidad de polisacaridos, debido a que los polisacaridos gelatinosos previenen procesos corriente abajo como filtracion y ultrafiltracion.

Ademas, el porcentaje de protema recombinante recogida que ha sido secretada aumento considerablemente del 0 % para las celulas en suspension al 12 % para el bloque de celulas generadas segun la invencion.

Finalmente, este ejemplo ilustra que el rendimiento global en el bloque de celulas tambien es significativamente elevado en comparacion con las mismas celulas cultivadas como celulas en suspension.

Aquellos expertos en la materia tambien apreciaran facilmente que este metodo no se limita a la produccion y/o aislamiento de protemas recombinantes de celulas transgenicas, pero es igualmente aplicable a metabolitos secundarios producidos en celulas no transgenicas o transgenicas o a otros productos de interes, que incluyen (pero no se limitan a) metabolitos primarios, fibras, oligo- y polisacaridos (celulosa, almidon, hemicelulosas, xilanos, fructanos, etc.), peptidos y protemas nativos, pigmentos, vitaminas, aromas, acidos de frutas, o cualquier otro producto de celulas vegetales.

Ejemplo 11

Uso de bloques de celulas generadas en placas de multi-titulacion

Se generaron bloques de celulas como se explico antes usando placas de multi-titulacion (placa Receiver de 20 jm (N.° 740686.4), mAcHEREY-NAGEL, Alemania) que contema filtros permeables a lfquido en el fondo de la placa.

Se colo 1 ml de un cultivo en suspension de BY2 de tabaco no mutante (no transgenico) por pocillo de la placa Receiver para generar 96 microbloques de celulas. El medio lfquido se elimino completamente por vado usando el colector de vado NucleoVac 96 de MACHEREY-NAGEL, Alemania. Los bloques de celulas resultantes de 0,2 g se analizaron microscopicamente para la presencia de huecos de aire y se confirmo que la densidad del bloque de celulas resultante era inferior a 0,7 g/cm3 usando un experimento de control independiente.

Se aplicaron 0,8 ml de suspension recombinante de Agrobacterium tumefaciens (DO 600 nm = 0,1) que lleva plasmidos pTRA que codifican o bien el anticuerpo M12 (Fig. 2C) o bien el anticuerpo 2G12 (Fig. 2A) a cada bloque de celulas. Para cada construccion de expresion de anticuerpo se infiltraron 32 microbloques de celulas. Despues de 30 minutos se elimino cualquier Kquido para reconstituir los huecos de aire y para restablecer una densidad del 5 bloque de celulas de menos de 0,7 g/cm3. Los bloques de celulas en la placa de multi-titulacion se incubaron entonces durante 4 dfas a 25 °C y 90 % de humedad relativa. Entonces, los bloques de celulas se recogieron y los anticuerpos recombinantes se extrajeron (Ejemplo 1). Las concentraciones de anticuerpo se midieron por mediciones de resonancia de plasmones superficiales en una superficie de protema A usando un instrumento BiacoreT200 (T=25 °C, tampon de electroforesis = HBS-EP) para 32 muestras para cada anticuerpo para determinar 10 la concentracion media de anticuerpo y el coeficiente de variacion (CV).

El rendimiento medio del anticuerpo M12 fue 117,8 ± 14,4 |jg por g de bloque de celulas y el coeficiente de variacion fue del 12,2%. El rendimiento medio del anticuerpo 2G12 fue 32,3 ± 3,6 jg por g de bloque de celulas y el coeficiente de variacion fue del 11,1 %.

Estos son valores excelentes para ensayos biologicos e ilustran claramente la excelente reproducibilidad y robustez 15 de los ensayos basados en los bloques de celulas preparadas segun la invencion.

Esto tambien muestra que diferentes tamanos y geometnas del bloque de celulas pueden usarse para diferentes aplicaciones y este experimento demuestra que pueden generarse bloques de celulas en formato de multi-titulacion, que facilita las aplicaciones de alto rendimiento a alta resolucion.

Ademas, tambien es evidente que los bloques de celulas en formato de multi-titulacion pueden ser manipulados y 20 tratados de la misma forma o similar que aquellos colados en columnas, que incluyen elucion de productos secretados o extracelulares, para la posterior cuantificacion o analisis.

Aquellos expertos en la materia reconoceran que los bloques de celulas tambien pueden usarse para fines analfticos. Por ejemplo, un bloque de celulas generado a partir de un cultivo en suspension transgenico o un bloque de celulas transformado con genes para anticuerpos recombinantes, que incluye (pero no se limita a), por ejemplo, 25 protemas de fusion de anticuerpo con la protema de union de celulosa o anticuerpos recombinantes unidos a o

integrados en la membrana celular (plasmalema) pueden ponerse en contacto con una disolucion (muestra) que contiene una sustancia que se une al anticuerpo. La naturaleza porosa del bloque de celulas es otra vez una clara ventaja aqrn debido a que grandes volumenes pueden ser facilmente pasados a traves del bloque de celulas para aumentar la sensibilidad. Ademas, es obvio que etapas de lavado, intercambios de tampon y la aplicacion de 30 anticuerpos conjugados con enzima u otros reactivos de deteccion tambien pueden facilmente aplicarse y eliminarse del bloque de celulas. En una etapa final, puede aplicarse un sustrato que entonces se transforma enzimaticamente en un producto medible para revelar la presencia y concentracion de la sustancia.

Ejemplo 12

Protema endogena recuperada de un bloque de celulas generado a partir de celulas no mutadas

35 Celulas en suspension de un cultivo en suspension no mutante de BY-2 de 5 dfas de edad fueron o bien recogidas para generar los bloques de celulas o bien las celulas se cultivaron adicionalmente en cultivo en suspension. Tanto los bloques de celulas como los cultivos en suspension se incubaron durante otros 4 dfas. Se preparo un bloque de celulas de 2,5 g de FCW (peso de celulas fresco) como se describe en el Ejemplo 6 usando columnas de 14 ml de polipropileno. Despues de eliminar el lfquido, el bloque de celulas se incubo a 26 °C con una humedad relativa del 40 90 %. El cultivo en suspension de BY-2 de 5 dfas se cultivo adicionalmente a 26 °C en un agitador rotatorio a

180 rpm. Despues de 4 dfas, se recogieron las protemas secretadas. Las protemas secretadas se recogieron del bloque de celulas lavando el bloque con 2,5 ml de tampon como se describe en el Ejemplo 6. Las protemas secretadas del cultivo en suspension de 9 dfas de edad se recogieron eliminando las celulas del medio de cultivo usando filtracion a vacm. Se analizaron una muestra de 25 jl de o bien las protemas eluidas o bien secretadas en un 45 gel de SDS-PAGE tenido con Coomassie (Fig. 16). Este ejemplo muestra que las protemas nativas secretadas pueden recuperarse de bloques de celulas generadas e incubarse segun la invencion. Cada banda sobre el gel representa una protema natural diferente. El analisis de gel tambien mostro que la cantidad y el tipo de las protemas nativas secretadas difirieron entre celulas en un bloque de celulas y celulas en suspension. La secrecion de ciertas protemas nativas aumenta sustancialmente en las celulas de un bloque de celulas (Fig. 16, indicado porflechas).

50 Aquellos expertos en la materia tambien apreciaran facilmente que este metodo no se limita a la recuperacion de protemas nativas de celulas vegetales, sino que es igualmente aplicable a otros productos endogenos de interes, que incluyen metabolitos secundarios, metabolitos primarios, fibras, oligo- y polisacaridos (celulosa, almidon, hemicelulosas, xilanos, fructanos, etc.), peptidos y protemas nativos, pigmentos, vitaminas, aromas, acidos de frutas, o cualquier otro producto de celulas vegetales. Aquellos expertos en la materia reconoceran que pueden generarse 55 bloques de celulas a partir de celulas en suspension seleccionadas de una amplia variedad de especies de plantas, que incluyen, pero no se limitan a, Catharanthus roseus, Taxus spec., Stevia rebaudiana y Artemisia annua.

Claims (9)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo para la generacion de material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas privado de medio, estructurado poroso y multicapa no tejido y para el posterior mantenimiento de dicho bloque de celulas, que comprende las etapas de (i) proporcionar un bloque de celulas que tiene una estructura porosa separando las celulas de un cultivo de celulas vegetales en suspension, en el que las celulas separadas de dicho cultivo de celulas vegetales en suspension son nativas o transgenicas y capaces de acumular un producto deseado, y en el que el contenido del ftquido comprendido por el bloque de celulas se reduce y ajusta para corresponderse con una densidad del bloque de celulas entre 0,1 y 0,9 g en peso de celulas humedas por cm3, estableciendo asf la naturaleza privada de medio y estructurada porosa de dicho bloque de celulas, y (ii) incubar dicho bloque de celulas privado de medio y estructurado poroso en un entorno no ftquido bajo una humedad relativa del 50 al 100 % para acumular dicho producto deseado sin poner dicho bloque de celulas sobre o en cualquier contacto con un medio de mantenimiento o de crecimiento.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el contenido de ftquido comprendido por el bloque de celulas se reduce y ajusta para corresponderse con una densidad del bloque de celulas entre 0,2 y 0,85, preferentemente entre 0,4 y 0,8 g en peso de celulas humedas por cm3.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que las celulas transgenicas son o bien transitoriamente o bien establemente transformadas con el fin de acumular dicho producto deseado.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que las celulas comprendidas por el bloque de celulas como se proporciona en la etapa (i) son transitoriamente transformadas con al menos un vector de expresion que comprende al menos una secuencia de acidos nucleicos heterologa antes de ser sometida a la etapa (ii), en el que dicha al menos una secuencia de acidos nucleicos heterologa codifica un producto deseado.
5. 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (ii) comprende la recogida de un producto deseado.
6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el producto deseado esta seleccionado del grupo que consiste en protemas o polipeptidos nativos y heterologos, metabolitos secundarios, marcadores y resultados anaftticos / de diagnostico.
7. 7. Uso del material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas privado de medio, estructurado poroso y multicapa no tejido obtenido u obtenible por un metodo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para fines analfticos o de diagnostico.
8. 8. Uso segun la reivindicacion 7, en el que las celulas comprendidas por el bloque de celulas se incuban en presencia de un organismo o de una sustancia que va a analizarse o diagnosticarse.
9. 9. Herramienta de diagnostico que comprende material de celulas vegetales en forma de un bloque de celulas privado de medio, estructurado poroso y multicapa no tejido obtenido u obtenible por un metodo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.