JP2015522287A - 細胞培養上清の濾過 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞と流体の混合物を提供するステップ、第１のフィルターハウジングを該混合物で充填するステップ、ここで、該フィルターハウジングにおいて、細孔径が４μｍ〜５０μｍの範囲であるフィルターが、篩状に穴のあけられたフラット基部表面上に提供され、該フィルターハウジングの壁が、篩状に穴のあけられた該フラット基部表面を用いてシールされるように接続され、少なくとも０．５バールの差圧を上記混合物に適用するステップ、その結果として、該混合物の流体部分がフィルターを通してに押し出され、細胞を含有するフィルターケーキが上記フィルターハウジングに残存し、及び濾過された流体を取り出すステップを含む、細胞から流体上清を分離するための方法に関する。
Description
本発明は、細胞培養上清を濾過するための方法に関する。
生産目的のための生物工学的方法の使用は、他の方法によって、例えば、化学合成によって生産することができない、若しくは経済的に生産することができない物質であって、天然において十分量で利用できない物質を生産するための重要な機会を生じさせる。植物材料の生産は、現在、二次代謝産物が当てられ、ここで、組換え発現産物の割合は着実に上昇している。大規模生産は、主に、植物細胞培養物又は植物に集中する。植物におけるＤＮＡ転写の可能性はまた、植物成分に対する定量的ならびに定性的な改変が可能であることを意味している。さらに、植物及び植物細胞培養物は、異種タンパク質の生産に関心がある（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４，７：１−７）。
一つの戦略は、トランスジェニック植物全体における異種タンパク質の生産を伴う。一例として上記される植物全体を使用することの基本的な欠点は、時間がかかり、コスト集約的な栽培の必要性、ならびに工業規模の栽培にために必要とされる広い場所の必要性にある。さらに、植物全体からの所望の標的物質の精製は、通常、医薬品又は栄養生理学的な目的に使用される物質の場合と同様に、特に、高い要求が生産物の外観及び質に置かれる場合に、複雑な手順ステップを伴う。
第二の戦略では、トランスジェニック植物細胞培養物を抗体産生のために使用した。知られている例は、抗体又は他の哺乳動物タンパク質の発現である（Ｈｕｅｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２００５，７：２９２−２９９）。細胞由来の異種タンパク質の精製は非常に高価であるため、媒体への標的タンパク質の分泌は有意な改善を構成する。さらに、トランスジェニック植物細胞がバイオリアクター中で排他的に培養することができ、放出する必要がないため、安全性の考慮はまた、細胞培養において組換え薬学的に関連するタンパク質を生産することを好む。大スケールでの従属栄養植物細胞培養用のバイオリアクターの開発により、必要とされる大量培養を可能にした。
更なる生産物精製のために、第１のステップにおいて、バイオマスは、上清から分離しなければならない。この目的のために、様々な濾過手順が知られている。組換え分泌タンパク質の場合において、生産物は培養上清中に存在する。したがって、目的は、生産物の損失を避けるように、分離されたバイオマス画分中のできるだけ少ない量の残留水分／上清を保持することである。様々な実験室規模の濾過方法が知られている。Ｂｕｅｔｔｎｅｒ−Ｍａｉｎｉｋ Ａｎｎｅｔｔｅら（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ９（３）（２０１１）：３７３−３８３）は、ヒメツリガネゴケ（Ｐ．ｐａｔｅｎｓ）におけるヒト因子Ｈの生産を報告している。水性細胞培養物は、真空下で吸引フィルターを用いた織布により分離される。得られた生産物は、湿っていて、乾燥しなければならなかった。Ｌｕｃｕｍｉら（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（１０）（２００６）：２１８０−２１８７）は、Ｐ．ｐａｔｅｎｓバイオリアクターにおけるｒｈＶＧＥＦの製造中にクロスフロー濾過を報告している。Ｍａｒｔａ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｎｕｎｅｚ（Ｅ−ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｈａｍｂｕｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（２０１０），ｐ４８，Ｃｈａｐｔｅｒ ２．１１．１）は、Ｐ．ｐａｔｅｎｓにおけるサイトカインプロファイリング中の真空濾過を報告している。Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｒａｉｎｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２６（１−３）（１９９９）：１−１０）は、濾過後に湿っていたタバコのカルス培養物の真空濾過に関する。ＷＯ２００５／１０８５９６Ａ１は、植物細胞内での発現によるシスチンノットを有する環状ペプチドのインビトロ合成に関する。細胞懸濁液を真空下で吸引濾過により分離した。Ｋｉｍ Ｓｕｎ Ｔａｅら（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ９（５）（２００９）：１３０２−１３１３）は、懸濁液中の真菌Ｍ．ｇｒｉｓｅａを用いたイネ細胞の共培養を報告している。分泌されたタンパク質の分離は、真空濾過を用いて行った。Ｎｄｉｍｂａ Ｂｏｎｇａｎｉ Ｋ．（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３（６）（２００３）：１０４７−１０５９）は、懸濁培養のＡｒａｂｄｏｐｓｉｓにおける細胞外マトリックスの変化の検討と関与していた。真空濾過を用いて、培養上清を調べた。
特定の課題は、植物及び植物細胞培養物において、動物細胞及び細菌を用いたプロセスとは対照的に、固形残渣、例えば、濾過の場合のフィルターケーキが膨大な量を占めるという事実にある。このようにして、大量の上清は、それに関連付けられ、保持される。本発明の１つの目的は、したがって、培養上清からの固形バイオマスの分離を改善することである。
本発明は、以下：
ａ）細胞と流体の混合物を提供するステップ、
ｂ）フィルターハウジングを該混合物で充填するステップ、ここで、該フィルターハウジングにおいて、細孔径が４μｍ〜５０μｍの範囲である第１のフィルターが、フラット基部表面上に提供され、該フィルターハウジングの壁が、篩状に穴のあけられた該フラット基部表面を用いてシールされるように接続され、
ｃ）少なくとも０．５バール（５００ｈＰａ）の差圧を上記混合物に適用するステップ、その結果として、該混合物の流体部分がフィルターを通して押し出され、細胞を含有するフィルターケーキが上記フィルターハウジングに残存し、
ｄ）濾過された流体を取り出すステップ
を含む、細胞から流体上清を分離するための方法に関する。
ａ）細胞と流体の混合物を提供するステップ、
ｂ）フィルターハウジングを該混合物で充填するステップ、ここで、該フィルターハウジングにおいて、細孔径が４μｍ〜５０μｍの範囲である第１のフィルターが、フラット基部表面上に提供され、該フィルターハウジングの壁が、篩状に穴のあけられた該フラット基部表面を用いてシールされるように接続され、
ｃ）少なくとも０．５バール（５００ｈＰａ）の差圧を上記混合物に適用するステップ、その結果として、該混合物の流体部分がフィルターを通して押し出され、細胞を含有するフィルターケーキが上記フィルターハウジングに残存し、
ｄ）濾過された流体を取り出すステップ
を含む、細胞から流体上清を分離するための方法に関する。
本発明のフィルターを用いた濾過はまた、フラットベースフィルターを使用せずに（例えば、バッグフィルターをもちいて ）、さらに圧なしに、すなわち、純粋に重力下での濾過で実施され得る。しかしながら、この種の濾過は、フィルターケーキ中の残留水分が高くなるという欠点を受けることになる。所望の精製産物が流体中に存在する限り、これは、生成物の損失がかなりあることを意味する。
基部表面は、好ましくは、篩状に穴があけられる。基部表面は、それ自体でフィルターを構成することができ、又はそれは別個のフィルター用のシート及び支持体として作用することができる。
本発明によれば、圧力の増加と組み合わせて、特定の基部表面上にフラットフィルターを用いることによって、フィルターケーキ中に保持された残留水分が、驚くべきことに、僅かな最小限に抑えることができる。０％（重量％）の細胞外の残留水分含量を得ることができる。細胞内液は、この場合において残留水分としてカウントされない。本発明によれば、残渣は、細胞内流体なしに改善され、それは、細胞内残留水分が、選択されたタンパク質について生産物の喪失を構成しないためであり、さらに、細胞内の細胞集団が汚染混合物を構成し得た。
本発明によれば、好ましい実施形態において、差圧は、３％（重量％）未満、好ましくは２％未満、特に好ましくは１％未満又は０％の細胞外残留水分がフィルターケーキにおいて得られるまで維持される。残留水分含量は、比較実施例１に記載されるように決定することができる。特に、本発明のフィルターハウジングは、植物細胞によって形成されたフィルターケーキから水分を除くために、特に該残留水分含量に下げるために、該フィルターとともに使用されてもよい。
好ましい実施形態において、フィルターはフラットメンブレンである。これらは、例えば、フラットな形態で使用される、不織布、セラミックキャスティング又はポリマーメンブレンである。それらは、通常、ほとんどの大規模なアプリケーションに使用されない。本発明は、植物細胞の濾過において、フラットフィルターが、それにもかかわらず、特に加圧フィルターを用いて、非常に効果的に使用され、例えば、より通常のバッグ又はサックフィルターよりも低い残留水分含量でさえ生じさせ得ることを示している。
本発明の方法のための本発明の濾過システムは、特に、大規模なアプリケーションのために開発された。このように、好ましい実施形態において、フィルターハウジングの寸法は、大量の流体を濾過するように設計されている。特に好ましくは、フィルターハウジングの内部容積は、少なくとも２Ｌ（ｄｍ3で）、特に少なくとも５Ｌ、少なくとも８Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも２０Ｌ、少なくとも３０Ｌ、少なくとも４０Ｌ又は少なくとも４５Ｌである。
ハウジングの内部は、濾過のためのより多くの上清を用いて、連続的又は不連続的に充填されてもよい。好ましい実施形態において、少なくとも２Ｌ（ｄｍ3）の上清が充填され、特定の実施形態において、少なくとも５Ｌ、少なくとも８Ｌ、少なくとも１０Ｌ、少なくとも２０Ｌ、少なくとも４０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、少なくとも７５Ｌ又は少なくとも１００Ｌが濾過される。
好ましくは、この方法中に細胞は破裂しない。これは、低圧で、穏やかにそれらを処理することによって達成することができる。細胞の破裂を回避することは有利であり、それは、細胞が濾過生産物を汚染しないためであり、さらに、細胞はより効率的に濾別することができるためである。
好ましくは、濾過された生産物を除くための部位での絶対圧力は、少なくとも０．７バール（７００ｈＰａ）である。本発明によれば、好ましくは、全く真空濾過が行われないが、濾過物は、例えば、少なくとも０．７バール、少なくとも０．８バール、少なくとも０．９バール、又は少なくとも１バールの高い大気圧下で残存する。このようにして、流体（特に水溶液）濾過物の流体の蒸発が回避される。これは、フィルターハウジングにおける圧力、又は本発明に係る混合物に適用される圧力、特にフィルターハウジングの入口での圧力の増加は、絶対正圧、すなわち、周囲圧力よりも高い圧力をもたらすことを意味する。
本発明の正圧（荷電した上清及び濾過された流体との間の差圧）が異なる方法で生じさせることができる。一例として、圧力は、（例えば、フィルターハウジングに対する入口又は別個の空気供給口に供給される）圧縮空気を用いて生じさせることができる。
さらなる実施形態において、圧力は、水圧、例えば、流体バンキングアップ圧として、又はポンプの手段によって生じさせてもよい。さらなる可能性は、遠心分離することによって圧力を高めることである。これはまた、例えば、プランジャーを使用して、機械的圧力を使用することも可能である。明らかに、すべてのこれらの代替はまた、互いに組み合わせることができる。好ましくは、流体と細胞の混合物は、最初に、圧力下で供給され、次に、濾過されるべき全混合物を導入した後、より多くの流体が圧縮空気を用いて導入される。圧縮空気は、流体圧と同じであるか又はそれと独立して、同じ圧力で適用することができる。
さらなる実施形態において、圧力は、水圧、例えば、流体バンキングアップ圧として、又はポンプの手段によって生じさせてもよい。さらなる可能性は、遠心分離することによって圧力を高めることである。これはまた、例えば、プランジャーを使用して、機械的圧力を使用することも可能である。明らかに、すべてのこれらの代替はまた、互いに組み合わせることができる。好ましくは、流体と細胞の混合物は、最初に、圧力下で供給され、次に、濾過されるべき全混合物を導入した後、より多くの流体が圧縮空気を用いて導入される。圧縮空気は、流体圧と同じであるか又はそれと独立して、同じ圧力で適用することができる。
好ましい実施形態において、差圧は、少なくとも０．８バール（８００ｈＰａ）、好ましくは少なくとも１バール（１０００ｈＰａ）、又はさらには少なくとも１．２バール（１２００ｈＰａ）である。特定の実施形態において、圧力は、最大８バール、最大５バール、最大３バール、最大２バール又は最大１．５バールである。圧差は、本質的に、使用されるフィルター（細孔径、寸法）によって決定され、それに応じて、特定の逆圧は、フィルタハウジングに対する入口で選択された正圧で生じる。選択された正圧は、例えば、出口が閉じているときに測定することができ、好ましくは少なくとも１．８バール（１８００ｈＰａ）、好ましくは少なくとも２バール（２０００ｈＰａ）、又はさらには少なくとも３バール（３０００ｈＰａ）の絶対圧である。
したがって、フィルターハウジングは、好ましくは、圧力容器、特に、少なくとも２バール（２０００ｈＰａ）、特に好ましくは少なくとも５バール（５０００ｈＰａ）、又はさらには少なくとも８バール（８０００ｈＰａ）の圧力用に設計された圧力容器である。
第１のフィルターの細孔径は、４μｍ〜５０μｍの範囲内である。好ましい実施形態において、第１のフィルターの細孔径は、６μｍ〜４０μｍの範囲内又は８μｍ〜３０μｍの範囲内、特に、９μｍ〜２５０μｍの範囲内である。
本発明によれば、篩状に穴のあけられた基部表面は、フラットであり、何ら曲率がなく、又はほとんど曲率がない。好ましくは、篩様の穴は円形である。それらは、好ましくは、容器の壁にしっかりと接続された基部表面の縁から少なくとも２ｃｍの距離である。篩様の穴は、サイズにして０．００１ｍｍ〜５ｍｍ、好ましくは０．００５ｍｍ〜３ｍｍ又は０．０１ｍｍ〜１．５ｍｍ、最も好ましくは０．０３ｍｍ〜０．０６ｍｍであってもよい。
方法中の温度は、細胞の穏やかな濾過のために、好ましくは０℃〜４０℃の範囲内、特に１０℃〜３０℃の範囲内である。
本発明によれば、フィルターケーキの残留水分含量を効率的に低減させる目的で、それをさらに洗浄する必要はない。このステップは明らかに行うことができるが、好ましい実施形態において、フィルターケーキを追加の流体で洗浄しない。他の実施形態において、ごく少量の洗浄流体が用いられる。例えば、最大１％若しくは最大０．１％の体積の上清及び／又は最大５％若しくは最大２％の体積の体積のフィルターケーキが挙げられる。
特に好ましい実施形態において、上記の濾過は、更なる濾過、特に激しい濾過及び／又は滅菌濾過に続く。
好ましくは、本発明の方法は、ｅ１）第１のフィルターよりも小さい細孔径を有する第２のフィルターを用いて、ステップｄ）で得られた濾液をさらに濾過するステップをさらに含み、ここで、第２のフィルターの細孔径は１μｍ〜２０μｍの範囲内である。好ましくは、第２のフィルターの細孔径は、２μｍ〜１５μｍの範囲内、特に３μｍ〜１０μｍの範囲内、とりわけ４μｍ〜８μｍの範囲内である。
好ましくは、本発明の方法は、さらに、ｅ２）第２のフィルターよりも小さい細孔径を有する第３のフィルターを用いて、ステップｄ）又はｅ１）で得られた濾液をさらに濾過するステップをさらに含み、ここで、第３のフィルターの細孔径は０．２５μｍ〜１０μｍの範囲内である。好ましくは、第３のフィルターの細孔径は、０．３μｍ〜５μｍの範囲内、特に０．３５μｍ〜２μｍの範囲内、とりわけ０．４μｍ〜１．５μｍの範囲内である。
好ましくは、本発明の方法は、さらに、ｆ）第３のフィルターよりも小さい細孔径を有する第４のフィルターを用いて、ステップｅ１）又はｅ２）で得られた濾液をさらに濾過するステップをさらに含み、ここで、第３のフィルターの細孔径は０．０５μｍ〜２μｍの範囲内である。好ましくは、第４のフィルターの細孔径は、０．０８μｍ〜１．５μｍの範囲内、特に０．１μｍ〜１μｍの範囲内、とりわけ０．１５μｍ〜０．６μｍ又は０．４μｍの範囲内である。
用語「第１の」、「第２の」、「第３の」及び「第４の」フィルターは、本発明の方法が、この数のフィルターに限定されること、及び正確にこの数のフィルターがフィルターとして使用されなければならないことを意味しない。単に、異なる細孔径を有する様々なフィルターを区別するのに役立つ。好ましくは、本発明の方法において、１、２、３、４のより多くの濾過ステップが実施され、ここで、好ましい実施形態において、続くステップにおける濾過が、先行するステップにおける濾過よりも小さな細孔径を有する。
細胞濾過に適している任意のフィルターは、第１、第２、第３及び／又は第４の濾過に適したフィルター材料である。材料の例としては、セルロース又はポリマーメンブレンから形成されるものである。例えば、ポリエーテルスルホンメンブレン（例えば、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅフィルター）又はセルロース／珪藻土／パーライトフィルター（例えば、Ｓｅｉｔｚ Ｋシリーズフィルター）が挙げられる。
本発明の方法に使用されるべき細胞は、好ましくは、植物細胞、好ましくは苔（ｍｏｓｓ）であり、特に、土壌苔細胞及び苔類からなる群から選択され、ここで、フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）属、フナリア（Ｆｕｎａｒｉａ）属、スファグナム（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）属及びセラトドン（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）属の種が特に好ましい。ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）が特に好ましい。最も特に好ましくは、本発明の方法は、細胞、植物又は植物組織、例えば、土壌苔ヒメツリガネゴケからの原糸体を用いて行われる。さらに好ましい植物は、タバコ、豆又はレンズ豆である。好ましくは、植物は、例えば、レムナ（Ｌｅｍｎａ）属、スピロデラ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ）属、ランドルティア（Ｌａｎｄｏｌｔｉａ）属、ウォルフィア（Ｗｏｌｆｆｉａ）属又はウォルフィエラ（Ｗｏｌｆｆｉｅｌｌａ）属由来の水生植物である。
本発明の方法は、細胞壁を有する細胞の濾過に特に適している。植物細胞属に加え、細胞はまた、同等の実施形態と見なすことができる真菌細胞又は藻類細胞から選択することができる。本明細書で使用されるとき、「細胞」とは、単離された細胞、凝集した細胞、又は多細胞生物における１つの細胞を意味することができる。「植物細胞」は、個々の植物細胞、又は植物若しくは植物組織中の細胞であってもよい。類似した方法で、「真菌細胞」は、個々の細胞、又は真菌若しくは真菌組織における細胞であってもよい。「藻細胞」は、好ましくは、緑藻細胞である。組織は、例えば、師部、木部、葉肉、門、葉、葉状体、原糸体、クロロネーマ、カウロネーマ、仮根又は茎葉体組織から選択することができる。細胞は、プロトプラスト又は実質細胞、特にカルス細胞を含み、又はそれからなってもよい。
さらに適切な細胞は、細菌細胞である。本発明は、何よりも第一に植物細胞に最適化されているが、高い流体分離比での細胞の穏やかな処置などの同様の利点もまた、細菌細胞において観察することができる。
好ましくは、植物細胞によって生成された組換えタンパク質は、流体上清中に存在する。この点で、均等に又は組み合わせて、流体の濾過によって上清中の組換えタンパク質を精製することも可能である。導入部で前述したように、植物におけるタンパク質の組換え生成は周知であり、植物における形質転換及び発現のための通常の方法を適用することができる。
さらに、本発明は、上述したフィルターハウジングと、例えば、４μｍ〜５０μｍの範囲にある細孔径を有する、上述した第１のフィルターを含むキット又はシステムに関する。キット又はシステムはまた、好都合には、本明細書に記載されている第２、第３及び／又は第４のフィルターとともに提供されてもよい。このキット又はシステムは、本発明の方法を実施し、又はこの目的に使用されるのに適している。
本発明はまた、（植物）細胞から形成されるフィルターケーキから水分を除去するために、本発明のキット又はそのコンポーネントの使用に関する。
本発明は、ここで、以下の図面及び実施例によって例証される；本発明のこれらの特定の実施形態はいかなる意味においても限定的でない。
比較実施例１：
小規模で、組換え的に精製された抗体（癌胎児性抗原（ＣＥＡ）特異的ＩｇＧ１Ｈ１０）を含む上清は、最大７ｇ／Ｌの細胞密度で生成された原糸体苔組織から分離された。細孔径が１００μｍである篩をこの目的に使用した；残りの残留水分含有量は約５０％であった。
小規模で、組換え的に精製された抗体（癌胎児性抗原（ＣＥＡ）特異的ＩｇＧ１Ｈ１０）を含む上清は、最大７ｇ／Ｌの細胞密度で生成された原糸体苔組織から分離された。細孔径が１００μｍである篩をこの目的に使用した；残りの残留水分含有量は約５０％であった。
生成をスケールアップしたとき、適切なフィルター方法を検討した。この点において、第１の濾過ステップは、比較的粗いフィルター上で行われるべきであった。これは、目詰まりからフィルターを防止し、主に、苔と上清の分離のために意図された。清澄濾過中の激しい濾過効果はあまり重要でなかった。
第１の濾過ステップにおいて、バックフィルターはを用いた（Ｅａｔｏｎ；ハウジングタイプ：ＴＢＦ−０１０１−ＡＤ１０−０５０Ｄ、バッグフィルター商品番号：Ｆ５８６９５４９；容積１３Ｌ）。フィルターは、湾曲した基部表面を有するハウジングインサートに位置した。ここで、インサートは、基部表面及びインサート壁で篩状に穴があけられていた。濾過は成功したが、しかしながら、分離された苔中の残留水分含有量は非常に高く、圧縮空気（１〜３バール）を使用して苔から強制排出することができなかった。
濾過がフィルターケーキを除去し、手動で強制排出することによって完了した後、細胞外の残留水分含有量を決定した。強制排出された流体と保持された苔材料の体積比較は、約５０％の比率を生じさせた。これは、別々に測定されなかった高い生成物の損失と関連していた。
比較実施例２：
スケールアップ実験において、比較例１と同様に、組換え的に生成された抗体を含む上清を濾過によってそれを生成する苔組織から分離した。湾曲した基部表面を有する代替のハウジングインサートを使用した；この時、インサートの基部表面で篩状に穴があけられた。これは、圧縮空気が、フィルターケーキ全体で均一に逃れ、残留水分が苔残留物から除去されたことを確実にすることを意味した。しかしながら、これは、実際にはそうではなかった。比較例１に記載したように、残留水分含量を測定し、さらに、約５０％（重量％）であった。
スケールアップ実験において、比較例１と同様に、組換え的に生成された抗体を含む上清を濾過によってそれを生成する苔組織から分離した。湾曲した基部表面を有する代替のハウジングインサートを使用した；この時、インサートの基部表面で篩状に穴があけられた。これは、圧縮空気が、フィルターケーキ全体で均一に逃れ、残留水分が苔残留物から除去されたことを確実にすることを意味した。しかしながら、これは、実際にはそうではなかった。比較例１に記載したように、残留水分含量を測定し、さらに、約５０％（重量％）であった。
実施例１：大容積濾過
分離された植物細胞中のより低い低い残留水分含有量を生じさせることが意図された新規なフィルターハウジングを開発した。新規なハウジングを図１に示す。フィルターハウジングは、フィルター材料のためのフラットシートとして作用する篩状インサート（４）によって特徴付けられる。ハウジング壁は、フィルター表面として作用しない。濾過された流体のすべては、出口に向かう途中でフラット基部プレートを通過しなければならない。動物細胞の場合には、このフィルターは、小さな濾過表面に起因して、非常に早く目詰まりする傾向がある。しかしながら、植物細胞の場合には、高容量（＞５Ｌ）で可能にする濾過であるだけでなく、驚くべきことに、低い残留水分含有量を生じさせる利点を有することが観察されている。
分離された植物細胞中のより低い低い残留水分含有量を生じさせることが意図された新規なフィルターハウジングを開発した。新規なハウジングを図１に示す。フィルターハウジングは、フィルター材料のためのフラットシートとして作用する篩状インサート（４）によって特徴付けられる。ハウジング壁は、フィルター表面として作用しない。濾過された流体のすべては、出口に向かう途中でフラット基部プレートを通過しなければならない。動物細胞の場合には、このフィルターは、小さな濾過表面に起因して、非常に早く目詰まりする傾向がある。しかしながら、植物細胞の場合には、高容量（＞５Ｌ）で可能にする濾過であるだけでなく、驚くべきことに、低い残留水分含有量を生じさせる利点を有することが観察されている。
ハウジングは、Ｓｅｉｔｚ Ｋ９００フィルターディスク（細孔径８〜２０μｍ）を備えている。ハウジングは、最大５００Ｌのスケールに設計され、培養上清の任意の体積にスケールアップすることができる。このフィルターハウジングを用いたテストでは、良好なデータを示した。５００Ｌの培養液と低いバイオマス（０．５ｇ／Ｌ）を用いて行われた試験、並びに高いバイオマス（４〜７ｇ／Ｌ）を有する１００Ｌの培養液を用いたいくつかのテストは、フィルターケーキ中に０％の細胞外の残留水分含有量を得ることができた（比較実施例１において決定された）。これは、このモジュール内の培養液の上清が、完全なフィルターケーキ、次にフィルターを通して、及びフィルターハウジングの外に連続的に強制排出された。また、抗体についての生成物の喪失（ｍｇ／Ｌ）は、結果として非常に低くなった（４％〜１３％−表１におけるステップ１）。ここで、損失は、苔ケーキ又はフィルターにおける生成物の非特異的な保持にのみ起因し、フィルターケーキに保持された培養上清に起因しなかった。
実施例２：激しい滅菌濾過
実施例１の濾液物は、さらに激しい滅菌濾過を実施するために濾過された：激しい濾過のために、濾過は、Ｓｅｉｔｚ Ｋ７００フィルターディスク（細孔径６〜１２μｍ；Ｐａｌｌ）とＳｅｔｉｚ ＫＳ５０フィルターディスク（細孔径０．４〜１μｍ；Ｐａｌｌ）を用いて行われた。これらの濾過は、１つのハウジング内でかつ１つの経路で連続して行われ、又は別個のハウジング内で別々に行われ得る。フィルター間のギャップが選択され、それにより、十分な空間が苔細胞又は細胞断片に利用可能とされた。フィルターは、ＳＵＰＲＡｄｉｓｃ（商標）（Ｐａｌｌ）とＳｕｐｒａｃａｐ（商標）１００（Ｐａｌｌ）システム（Ｓｕｐｒａｄｉｓｃ ｆｉｌｔｅｒ：３００Ｐ７００Ｓ２０５ＳＰと２００Ｐ０５０Ｓ２０５ＳＰ；Ｓｕｐｒａｃａｐフィルター：ＮＰ６Ｐ７００１とＮＰ６Ｐ０５０１）に従って、２つの並列運転で積層された。
実施例１の濾液物は、さらに激しい滅菌濾過を実施するために濾過された：激しい濾過のために、濾過は、Ｓｅｉｔｚ Ｋ７００フィルターディスク（細孔径６〜１２μｍ；Ｐａｌｌ）とＳｅｔｉｚ ＫＳ５０フィルターディスク（細孔径０．４〜１μｍ；Ｐａｌｌ）を用いて行われた。これらの濾過は、１つのハウジング内でかつ１つの経路で連続して行われ、又は別個のハウジング内で別々に行われ得る。フィルター間のギャップが選択され、それにより、十分な空間が苔細胞又は細胞断片に利用可能とされた。フィルターは、ＳＵＰＲＡｄｉｓｃ（商標）（Ｐａｌｌ）とＳｕｐｒａｃａｐ（商標）１００（Ｐａｌｌ）システム（Ｓｕｐｒａｄｉｓｃ ｆｉｌｔｅｒ：３００Ｐ７００Ｓ２０５ＳＰと２００Ｐ０５０Ｓ２０５ＳＰ；Ｓｕｐｒａｃａｐフィルター：ＮＰ６Ｐ７００１とＮＰ６Ｐ０５０１）に従って、２つの並列運転で積層された。
滅菌濾過のために、濾液をさらにのＳａｒｔｏｐｏｒｅ２フィルターディスク（ザルトリウスポアサイズ０．２μｍ）で濾過した。
実施例３：結果
保証開発されたフィルターハウジングは、固液分離を最適化した。残留水分の大部分を含まない固体フィルターケーキが形成され、したがって、生成物の喪失を低く維持する。プロセス全体は、さらなる精製ステップが、フィルタを詰まらせることなく迅速に行うことができることを確実にする。
保証開発されたフィルターハウジングは、固液分離を最適化した。残留水分の大部分を含まない固体フィルターケーキが形成され、したがって、生成物の喪失を低く維持する。プロセス全体は、さらなる精製ステップが、フィルタを詰まらせることなく迅速に行うことができることを確実にする。
図２及び３に結果を示す。それらは、激しい濾過中のＳｕｐｒａｄｉｓｃシステムを用いた精製（図２）とＳｕｐｒａｃａｐシステムを用いた精製（図３）について各回、濁度測定（ＮＴＵ）を用いた濾過による懸濁した材料の精製の分析と、該濾過による抗体喪失の発生の分析を示す。表１に生成物の喪失を概要する。
Claims (15)
- 以下：
ａ）細胞と流体の混合物を提供するステップ、
ｂ）フィルターハウジングを該混合物で充填するステップ、ここで、該フィルターハウジングにおいて、細孔径が４μｍ〜５０μｍの範囲である第１のフィルターが、フラット基部表面上に提供され、該フィルターハウジングの壁が、篩状に穴のあけられた該フラット基部表面を用いてシールされるように接続され、
ｃ）少なくとも０．５バールの差圧を上記混合物に適用するステップ、その結果として、該混合物の流体部分がフィルターを通して押し出され、細胞を含有するフィルターケーキが上記フィルターハウジングに残存し、
ｄ）濾過された流体を取り出すステップ
を含む、細胞から流体上清を分離するための方法。 - フィルターハウジングの内部容積が少なくとも２Ｌである、請求項１に記載の方法。
- 上清の少なくとも１０Ｌを濾過する、請求項１又は２に記載の方法。
- 細胞が方法中に破裂されない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 離脱点での絶対圧が少なくとも０．７バールである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 差圧が、少なくとも０．８バール、好ましくは少なくとも１バールである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- フィルターハウジングが、圧容器であり、特に、少なくとも２バールの圧力、特に好ましくは少なくとも５バールの圧力用に設計された圧容器である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 方法中の温度が０℃〜４０℃の範囲内である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- フィルターケーキが追加の流体によって洗浄されず、及び／又は流体が圧縮空気を用いてフィルターケーキから放出される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- ｅ１）第１のフィルターよりも小さい細孔径を有する第２のフィルターを用いて、ステップｄ）で得られた濾液をさらに濾過するステップをさらに含み、ここで、第２のフィルターの細孔径が１μｍ〜２０μｍの範囲内である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- ｅ２）第２のフィルターよりも小さい細孔径を有する第３のフィルターを用いて、ステップｄ）又はｅ１）で得られた濾液をさらに濾過するステップをさらに含み、ここで、第３のフィルターの細孔径が０．３μｍ〜１０μｍの範囲内である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- ｆ）第３のフィルターよりも小さい細孔径を有する第４のフィルターを用いて、ステップｅ１）又はｅ２）で得られた濾液をさらに濾過するステップをさらに含み、ここで、第３のフィルターの細孔径が０．０５μｍ〜２μｍの範囲内である、請求項１０又は１１に記載の方法。
- 細胞が、植物細胞であり、特に苔（ｍｏｓｓ）細胞であり、好ましくは土壌苔細胞、特に好ましくはヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 細胞によって生成される組換えタンパク質が流体上清に存在し、及び／又は組換えタンパク質が濾過によって上清から精製される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 特に細胞によって形成されるフィルターケーキから水分を除くための、請求項１、２又は７のいずれか１項に定義されるフィルターハウジング、及び細孔径が４μｍ〜５０μｍの範囲内である第１のフィルター、好ましくは追加的に、請求項１０〜１２のいずれか１項に定義される第２、第３及び／又は第４のフィルターを含むキット。
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