BR112015001120B1 - Filtração de sobrenadantes de cultura de células - Google Patents

Abstract

FILTRAÇÃO DE SOBRENADANTES DE CULTURA DE CÉLULAS. A invenção se refere a um processo para a separação de um sobrenadante líquido de células compreendendo as etapas de: fornecimento de uma mistura das células com um líquido, carregamento de um primeiro compartimento de filtro com a mistura, em que no compartimento de filtro é fornecido um filtro com um tamanho de poro entre 4 (mi)m e 50 (mi)m sobre uma superfície de base plana perfurada em forma de peneira e as paredes do compartimento de filtro são conectadas de forma a vedar com a superfície de base plana, que é perfurada em forma de peneira, aplicação de uma pressão diferencial de pelo menos 0,5 bar (50000 Pa) sobre a mistura, como um resultado do qual a porção líquida da mistura é forçada através do filtro e um bolo de filtração contendo células permanece no compartimento de filtro, e remoção do fluido filtrado.

Description

[0001] A presente invenção se refere a processos para a filtração de sobrenadantes de cultura de células.

[0002] O uso de processos biotecnológicos para fins de produção dá origem a uma oportunidade significativa para produção de substâncias que não podem ser produzidas ou não podem ser economicamente produzidas por outros meios, por exemplo, por síntese química, e que não estão naturalmente disponíveis em quantidades suficientes. A produção de materiais vegetais está focada atualmente em metabólitos secundários, onde a fração de produtos de expressão recombinantes está aumentando constantemente. A produção em larga escala se concentra essencialmente em culturas de células vegetais ou plantas. A possibilidade de transferência de DNA em plantas também significa que são possíveis modificações quantitativas, bem como qualitativas, nos ingredientes das plantas. Além disso, as plantas e culturas de células vegetais são de interesse para a produção de proteínas heterólogas (Fischer et al., Current Opinion in Plant Biology 2004, 7: 1-7).

[0003] Uma estratégia envolve a produção de proteínas heterólogas em plantas transgênicas inteiras. Uma desvantagem fundamental do uso de plantas inteiras, necessidade de seu cultivo demorado e dispendioso, bem como nas grandes áreas requeridas para o cultivo em escala industrial. Além disso, a purificação das substâncias alvo desejadas a partir de plantas inteiras geralmente envolve etapas de procedimento complexas, em particular quando altas demandas são submetidas para aparência e qualidade dos produtos, como é o caso com substâncias usadas para fins farmacêuticos ou fisiológicos nutricionais.

[0004] Na segunda estratégia, culturas de células vegetais transgênicas foram usadas para a produção de anticorpos. Um exemplo conhecido é a expressão de anticorpos ou outras proteínas de mamífero (Huether et al., 2005 Plant Biol., 7: 292-299) e sua secreção no meio. Uma vez que a purificação de proteínas heterólogas a partir de células é muito cara, a secreção da proteína alvo no meio constitui um aprimoramento significativo. Além disso, considerações de segurança também favorecem a produção de proteínas recombinantes farmaceuticamente relevantes em culturas de células, uma vez que as células de plantas transgênicas podem ser cultivadas exclusivamente em biorreatores e não precisam ser liberadas. O desenvolvimento de biorreatores para cultura de células vegetais heterotróficas em escalas maiores tornou possível o cultivo em massa requerido.

[0005] Para purificação adicional de produto, em uma primeira etapa, a biomassa deve ser separada do sobrenadante. Para esta finalidade, vários processos de filtração são conhecidos. No caso de proteínas recombinantes secretadas, o produto está presente no sobrenadante de cultura. O objetivo é, portanto, reter tão pouco quanto possível da umidade/sobrenadante residual na fração de biomassa separada, de modo a evitar perda do produto. Vários processos de filtração em escala laboratorial são conhecidos. Buettner-Mainik Annette et al. (Plant Biotechnology Journal 9 (3) (2011): 373-383) descrevem a produção de fator H humano em P. patens. Cultura aquosa de células é separada por meio de um tecido usando um filtro de sucção sob vácuo. O produto obtido era úmido e precisou ser seco. Lucumi et al. (Process Biochemistry 41 (10) (2006): 2180-2187) descrevem uma filtração de fluxo cruzado durante a produção de VGEF rh em um biorreator de P. patens. Marta Fernandez Nunez (EDissertation, Hamburg University (2010), página 48, Capítulo 2.11.1) descreve uma filtração a vácuo durante caracterização de perfil de citocinina em P. patens. Fischer Rainer et al. (Journal of Immunological Methods 226 (1-3) (1999): 1-10) se refere a uma filtração a vácuo de culturas de caules de tabaco que estavam úmidos após filtração. O documento WO 2005/108596 A1 refere-se à síntese in vitro de peptídeos cíclicos com um nó de cistina por meio de expressão em células vegetais. Suspensões de células foram separadas com um filtro de sucção sob vácuo. Kim Tae Sun et al. (Proteomics 9 (5) (2009): 1302-1313) descrevem uma co-cultura de células de arroz com o fungo M. grisea em suspensão. A separação das proteínas secretadas foi realizada por meio de filtração sob vácuo. Ndimba Bongani K. (Proteomics 3 (6) (2003): 1047-1059) descreve um exame de alterações na matriz extracelular em Arabidopsis em culturas de suspensão. Filtração sob vácuo foi usada para investigar o sobrenadante de cultura.

[0006] Um problema particular reside no fato de que, em culturas de plantas e células vegetais, em contraste com processos com células de animais e bactérias, o resíduo sólido, por exemplo, o bolo de filtração no caso de filtração, toma um volume imenso. Assim, grandes quantidades de sobrenadante são associadas a ele e são retidas. Um objetivo da presente invenção é, assim, melhorar a separação de biomassa sólida do sobrenadante de cultura.

[0007] A presente invenção se refere a um processo para separação de um sobrenadante fluido de células compreendendo as etapas a seguir: a) fornecer uma mistura das células com um fluido, b) carregar um compartimento de filtro com a mistura, em que, no compartimento de filtro, um primeiro filtro tendo um tamanho de poro na faixa de 4 m a 50 m é fornecido sobre uma superfície de base plana e as paredes do compartimento de filtro estão conectadas de modo a vedar com a superfície de base plana, que é perfurada, na forma de uma peneira, c) aplicar um diferencial de pressão de pelo menos 0,5 bar (50000 Pa) à mistura, como um resultado do qual a porção fluida da mistura é forçada através do filtro e um bolo de filtração contendo células permanece no compartimento de filtro, d) remover o fluido filtrado.

[0008] A filtração com o filtro da invenção também pode ser realizada sem o uso de um filtro de base plana (por exemplo, com um filtro de saco) e também sem pressão, isto é, filtração puramente sob gravidade. Uma filtração deste tipo, no entanto, sofreria da desvantagem de que a umidade residual no bolo de filtração seria alta. Na medida em que o produto de purificação desejado está presente no fluido, isto significa que a perda de produto é substancial.

[0009] A superfície de base é, de preferência, perfurada na forma de uma peneira. A superfície de base pode constituir um filtro em si ou pode atuar como um local e um suporte para um filtro separado.

[0010] De acordo com a invenção, pela utilização do filtro plano sobre uma superfície de base específica em combinação com o aumento da pressão, a umidade residual retida no bolo de filtração pode, surpreendentemente, ser reduzida para um mínimo imperceptível. Teores de umidade residual extracelular de 0% (% em peso) podem ser obtidos. O fluido intracelular não é contado como umidade residual no presente caso. De acordo com a invenção, o isolamento do resíduo é aprimorado sem fluido intracelular, uma vez que a umidade residual intracelular não constitui uma perda de produto para proteínas selecionadas e, além disso, a população intracelular de células poderia constituir uma mistura contaminante.

[0011] De acordo com a invenção, em concretizações preferidas, a pressão diferencial é mantida até que uma umidade residual extracelular inferior a 3% (% em peso), de preferência inferior a 2%, particularmente de preferência inferior a 1% ou 0% seja obtida no bolo de filtração. O teor de umidade residual pode ser determinado conforme descrito no Exemplo Comparativo 1. Em particular, o compartimento de filtro da invenção pode ser usado com o dito filtro de forma a remover a umidade de um bolo de filtração formado por células de plantas - em particular, abaixo dos ditos teores de umidade residual.

[0012] Em concretizações preferidas, o filtro é uma membrana plana. Estas são, por exemplo, membranas não teciduais, moldagens de cerâmica ou membranas poliméricas, que são usadas na forma plana. Normalmente, elas dificilmente são usadas para aplicações em larga escala. A invenção mostrou que, em filtração de células de plantas, filtros planos podem, todavia, ser usados de forma muito eficaz, em particular com filtração sob pressão, e podem mesmo produzir menores teores de umidade residual, por exemplo, do que os filtros de saco mais usuais.

[0013] O sistema de filtração da invenção para o processo da invenção foi especialmente desenvolvido para aplicações em larga escala. Deste modo, em concretizações preferidas, as dimensões do compartimento de filtro são concebidas para filtrar grandes volumes de fluido. Particularmente de preferência, o volume interno do compartimento de filtro é de pelo menos 2 l (dm3), especialmente pelo menos 5 l, pelo menos 8 l, pelo menos 10 l, pelo menos 20 l, pelo menos 30 l, pelo menos 40 l ou pelo menos 45 l.

[0014] O interior do compartimento pode ser preenchido de forma contínua ou descontínua com mais sobrenadante para filtração. Em concretizações preferidas, pelo menos 2 l (dm3) do sobrenadante são filtrados, em concretizações especiais, pelo menos 5 l, pelo menos 8 l, pelo menos 10 l, pelo menos 20 l, pelo menos 40 l, pelo menos 50 l, pelo menos 75 l ou pelo menos 100 l são filtrados.

[0015] De preferência, durante o processo, as células são não rompidas. Isto pode ser alcançado manipulando-as suavemente em baixas pressões. Evitar a ruptura das células é vantajoso porque o conteúdo da célula não contamina o produto de filtração e, além disso, as células podem ser filtradas de forma mais eficiente.

[0016] De preferência, a pressão absoluta no local para remoção do produto filtrado é de pelo menos 0,7 bar (70000 Pa). De acordo com a invenção, de preferência, nenhuma filtração a vácuo é realizada, mas o filtrado permanece sob altas pressões atmosféricas, por exemplo, de pelo menos 0,7 bar (70000 Pa), pelo menos 0,8 bar (80000 Pa), pelo menos 0,9 bar (90000 Pa) ou pelo menos 1 bar (100000 Pa). Deste modo, a evaporação do filtrado fluido (em particular aquoso) é evitada. Isto significa que o aumento na pressão no compartimento de filtro ou aplicada à mistura de acordo com a invenção, em particular na entrada do compartimento de filtro, resulta em uma pressão absoluta positiva, isto é, uma pressão que é maior do que a pressão ambiente.

[0017] A pressão positiva da invenção (pressão diferencial entre o sobrenadante carregado e o fluido filtrado) pode ser produzida de diferentes maneiras. Como um exemplo, a pressão pode ser produzida usando comprimido (por exemplo, alimentado na entrada para o compartimento de filtro ou para uma abertura de alimentação de ar separada). Em outras concretizações, a pressão pode ser produzida por pressão hidráulica, por exemplo, como uma pressão de suporte de fluido ou por meio de uma bomba. Outra possibilidade é aumentar a pressão por centrifugação. Também é possível usar pressão mecânica, por exemplo, usando um êmbolo. Evidentemente, todas estas alternativas também podem ser combinadas umas com as outras. De preferência, a mistura de células com o fluido é fornecida inicialmente sob pressão e, então, após introdução de toda a mistura a ser filtrada, mais fluido é introduzido usando ar comprimido. O ar comprimido pode ser aplicado nas mesmas pressões - idênticas ou independentemente da pressão do fluido.

[0018] Em concretizações preferidas, a diferença de pressão é de pelo menos 0,8 bar (80000 Pa), de preferência pelo menos, 1 bar (100000 Pa) ou ainda pelo menos 1,2 bar (120000 Pa). Em concretizações particulares, a pressão é de no máximo 8 bar (800000 Pa), no máximo 5 bar (500000 Pa), no máximo 3 bar (300000 Pa), no máximo 2 bar (200000 Pa) ou no máximo 1,5 bar (150000 Pa). A diferença de pressão é essencialmente determinada pelo filtro usado (tamanho de poro, dimensões), após o que uma determinada contrapressão surge em uma pressão positiva selecionada na entrada do compartimento de filtro. A pressão positiva selecionada pode, por exemplo, ser medida quando a saída está fechada e é, de preferência, uma pressão absoluta de pelo menos 1,8 bar (180000 Pa), de preferência pelo menos 2 bar (200000 Pa) ou mesmo pelo menos 3 bar (300000 Pa).

[0019] Assim, o compartimento de filtro é, de preferência, um frasco pressurizado, em particular um frasco pressurizado concebido para pressões de pelo menos 2 bar (200000 Pa), particularmente de preferência pelo menos 5 bar (500000 Pa) ou mesmo pelo menos 8 bar (800000 Pa).

[0020] O tamanho de poro do primeiro filtro está na faixa de 4 m a 50 m. Em concretizações preferidas, o tamanho de poro do primeiro filtro está na faixa de 6 μm a 40 m ou na faixa de 8 m a 30 m, em particular na faixa de 9 m a 250 m.

[0021] De acordo com a invenção, a superfície de base perfurada na forma de uma peneira é plana e sem qualquer curvatura ou praticamente sem curvatura. De preferência, os furos do tipo peneira são de formato circular. Eles estão, de preferência, em uma distância de pelo menos 2 cm da borda da superfície de base, que é firmemente conectada à parede do frasco. Os furos de tipo peneira podem ser de 0,001 mm a 5 mm, de preferência 0,005 mm a 3 mm ou 0,01 mm a 1,5 mm, mais preferivelmente 0,03 mm a 0,06 mm de tamanho.

[0022] A temperatura durante o processo está, de preferência, na faixa de 0°C a 40°C, em particular na faixa de 10°C a 30°C, para filtração suave das células.

[0023] De acordo com a invenção, para fins de redução eficiente do teor de umidade residual do bolo de filtração, não é necessário lavá-lo adicionalmente. Embora esta etapa possa, obviamente, ser realizada, em concretizações preferidas, o bolo de filtração não é lavado com fluido adicional. Em outras concretizações, apenas pequenos volumes de fluido de lavagem são usados, por exemplo, um máximo de 1% ou um máximo de 0,1% do volume de sobrenadante e/ou um máximo de 5% ou um máximo de 2% do volume do bolo de filtração.

[0024] Em concretizações particularmente preferidas, a filtração citada acima é seguida por outra filtração, em particular filtração intensa e/ou filtração estéril.

[0025] De preferência, o processo da invenção compreende a etapa adicional de: e1) filtração adicional do fluido filtrado obtido na etapa d) com um segundo filtro com um tamanho de poro menor do que aquele do primeiro filtro, em que o tamanho de poro do segundo filtro está na faixa de 1 m a 20 m. De preferência, o tamanho de poro do segundo filtro está na faixa de 2 m a 15 m, em particular na faixa de 3 m a 10 m, especialmente na faixa de 4 m a 8 m.

[0026] De preferência, o processo da invenção compreende a etapa adicional de: e2) filtração adicional do fluido filtrado obtido na etapa d) ou e1) com um terceiro filtro com um tamanho de poro menor do que aquele do segundo filtro, em que o tamanho de poro do terceiro filtro está na faixa de 0,25 m a 10 m. De preferência, o tamanho de poro do terceiro filtro está na faixa de 0,3 m a 5 m, em particular na faixa de 0,35 m a 2 m, especialmente na faixa de 0,4 m a 1,5 m.

[0027] De preferência, o processo da invenção compreende a etapa adicional de: f) filtração adicional do fluido filtrado obtido na etapa e1) ou e2) com um quarto filtro com um tamanho de poro menor do que aquele do terceiro filtro, em que o tamanho de poro do quarto filtro está na faixa de 0,05 m a 2 m. De preferência, o tamanho de poro do quarto filtro está na faixa de 0,08 m a 1,5 m, em particular na faixa de 0,1 m a 1 m, especialmente na faixa de 0,15 m a 0,6 m ou 0,4 m.

[0028] Os termos "primeiro", "segundo", "terceiro" e "quarto" filtros não significam que o processo da presente invenção esteja limitado a este número de filtros ou que exatamente este número de filtros deve ser usado como os filtros. Ele serve apenas para diferenciar os vários filtros com diferentes tamanhos de poro. De preferência, no processo da invenção, 1, 2, 3, 4 das etapas de filtração adicionais são realizadas em que, em concretizações preferidas, o filtro em uma etapa subsequente tem um tamanho de poro menor do que aquele do filtro na etapa precedente.

[0029] Quaisquer filtros que são adequados para filtração de células são materiais de filtro adequados para o primeiro, segundo, terceiro e/ou quarto filtros. Exemplos de materiais são aqueles formados de membranas celulósicas ou poliméricas. Exemplos são membranas de poli éter sulfona (tais como filtros Sartopore, por exemplo) ou filtros de celulose/terra diatomácea/perlita (tais como filtros Seitz da série K, por exemplo).

[0030] A célula a ser empregada no processo da invenção é, de preferência, uma célula de planta, de preferência um musgo, em particular selecionado do grupo que consiste em musgos de terra e hepáticas, em que espécies dos gêneros Physcomitrella, Funaria, Sphagnum e Ceratodon ou Marchantia e Sphaerocarpos são particularmente preferidas. Physcomitrella patens é particularmente preferido. Mais particularmente, de preferência, o processo da invenção é realizado usando células, plantas ou tecidos de plantas, tal como protonema do musgo de terra Physcomitrella patens. Outras plantas preferidas são tabaco, feijão ou lentilhas. De preferência, a planta é uma planta aquática, por exemplo, dos gêneros Lemna, Spirodela, Landoltia, Wolffia ou Wolffiella.

[0031] O processo da invenção é particularmente adequado para filtração de células que têm uma parede celular. Além de células de plantas genuínas, as células também podem ser selecionadas de uma célula fúngica ou uma célula de alga, que podem ser consideradas como concretizações equivalentes. Conforme usado aqui, o termo "células" pode significar células isoladas, células aglomeradas ou uma célula em um organismo multicelular. Uma "célula de planta" pode ser uma célula de planta individual ou uma célula em uma planta ou em um tecido de planta. De maneira análoga, uma "célula fúngica" pode ser uma célula individual ou uma célula em um fungo ou um tecido fúngico. A "célula de alga" é, de preferência, uma célula de alga verde. Os tecidos podem, por exemplo, ser selecionados de floema, xilema, mesófilo, filo, folhas, talos, protonema, cloronema, caulonema, rizoide ou tecidos de gametóforos. As células podem compreender ou consistir em protoplastos ou células parenquimatosas, em particular, células de caule.

[0032] Outras células adequadas são células bacterianas. Embora a invenção seja primeiro e principalmente otimizada para células de plantas, as mesmas vantagens, tal como o tratamento suave das células em uma alta proporção de separação de fluido, também podem ser observadas em células bacterianas.

[0033] De preferência, uma proteína recombinante produzida pelas células de planta está presente no sobrenadante fluido. Neste contexto, igualmente ou em combinação, também é possível purificar uma proteína recombinante no sobrenadante por meio de filtração do fluido. A produção recombinante de proteínas em plantas é bem conhecida, conforme discutido acima na introdução, e os processos usuais para transformação e expressão em plantas podem ser aplicados.

[0034] A presente invenção também se refere a um kit ou um sistema com um compartimento de filtro, conforme descrito aqui acima, e um primeiro filtro conforme descrito aqui acima, por exemplo, com um tamanho de poro na faixa de 4 m a 50 m. O kit ou o sistema também pode, vantajosamente, ser fornecido com um segundo, terceiro e/ou quarto filtros, conforme descrito aqui. Este kit ou o sistema é adequado para realização do processo da invenção ou é usado para esta finalidade.

[0035] A invenção também se refere ao uso do kit da presente invenção ou seus componentes para remover a umidade de um bolo de filtração formado de células (plantas).

[0036] A presente invenção será agora ilustrada por meio das figuras e exemplos a seguir; estas concretizações especiais da presente invenção não são limitativas de qualquer maneira.

Figuras:

[0037] A Figura 1 mostra uma seção transversal através de um compartimento de filtro de acordo com a invenção com uma placa de base (2), uma tampa (3) e uma superfície de base de tipo peneira (4) da câmara de carregamento como um local para um material de filtro. A tampa é hermeticamente selada com a parede cilíndrica do compartimento (1) por meio de uma conexão de parafuso liberável (5). O compartimento também tem uma entrada (6) e uma saída (7).

[0038] A Figura 2 mostra os resultados de análise após purificação do material suspenso por meio de medições de turbidez (NTU [-]; A), bem como as perdas de produto (titulação [mg/l]; B) com o sistema Supradisc durante filtração intensa. (1 = sobrenadante de cultura, 2 = filtrado K900 sem musgo, 3 = filtrado K700, 4 = filtrado KS50, 5 = filtrado estéril).

[0039] A Figura 3 mostra os resultados de análise após purificação do material suspenso por meio de medições de turbidez (NTU [-]; A), bem como as perdas de produto (titulação [mg/l]; B) com o sistema Supracap durante filtração intensa. (1 = sobrenadante de cultura, 2 = filtrado K900 sem musgo, 3 = filtrado K700, 4 = filtrado KS50, 5 = filtrado estéril).

EXEMPLOS Exemplo Comparativo 1:

[0040] Em uma pequena escala, um sobrenadante com anticorpos recombinantemente produzidos (IgG1 H10 específica para antígeno carcinoembrionário (CEA)) foi separado do tecido de protonema de musgo produzido com uma densidade celular de 7 g/L. Uma peneira com um tamanho de poro de 100 m foi usada para esta finalidade; o teor de umidade residual remanescente foi de aproximadamente 50%.

[0041] Ao intensificar a produção, foram investigados processos de filtração adequados. Neste contexto, a primeira etapa de filtração foi realizada sobre um filtro relativamente grosseiro. Isso impediu a obstrução do filtro e se destinava principalmente à separação de musgo e sobrenadante. Efeitos de filtração intensa durante filtração para clarificação não foram muito significativos.

[0042] Em uma primeira etapa de filtração, um filtro de saco foi usado (Eaton, tipo de compartimento: TBF-0101- AD10-050D, filtro de saco artigo n°: F5869549, volume 13 l). O filtro foi posicionado em uma inserção de compartimento com uma superfície de base curvada, em que a inserção foi perfurada na forma de uma peneira na superfície da base e na parede da inserção. A filtração foi bem sucedida, no entanto, o teor de umidade residual no musgo separado era muito alto e não pôde ser forçado para fora do musgo usando ar comprimido (1-3 bar) (100000-300000 Pa).

[0043] O teor de umidade residual extracelular foi determinado após filtração estar concluída pela remoção do bolo de filtração e forçando-o manualmente para fora. Uma comparação volumétrica do fluido forçado para fora e do material de musgo retido produziu uma proporção de aproximadamente 50%. Esta foi associada às altas perdas de produto que não foram medidas separadamente.

Exemplo Comparativo 2:

[0044] De uma maneira análoga àquela do Exemplo Comparativo 1 em um experimento com aumento de escala, o sobrenadante com os anticorpos recombinantemente produzidos foi separado do tecido de musgo ao produzi-lo por meio de filtração. Uma inserção de compartimento alternativa com uma superfície de base curvada foi usada; desta vez, ele foi perfurado na forma de uma peneira na superfície de base da inserção. Isto foi feito para assegurar que o ar comprimido escapasse homogeneamente pelo bolo de filtração e que a umidade residual fosse removida do resíduo de musgo. No entanto, este não foi, de fato, o caso. O teor de umidade residual foi determinado conforme descrito no Exemplo Comparativo 1 e também era de aproximadamente 50% (% em peso).

Exemplo 1: Filtração de grande volume

[0045] Um novo compartimento de filtro foi desenvolvido, o qual se destinava a produzir um menor teor de umidade residual nas células vegetais separadas. O novo compartimento é mostrado na Figura 1. O compartimento de filtro é caracterizado por uma inserção de tipo peneira (4) que atua como um local plano para um material de filtro. A parede do compartimento não atua como uma superfície de filtração. Todo o fluido filtrado deve passar através da placa de base plana no trajeto até a saída. No caso de células de animais, este filtro tenderia a obstruir muito rapidamente em virtude da pequena superfície de filtração. No caso de células vegetais, no entanto, foi observado que não apenas é possível filtrar com um volume elevado (> 5 l), mas, surpreendentemente, ele tem a vantagem de produzir um baixo teor de umidade residual.

[0046] O compartimento é equipado com um disco de filtro Seitz K900 (tamanho de poro 8-20 m; Pall). O compartimento é concebido para uma escala de até 500 l e pode ser escalonado para qualquer volume de sobrenadante de cultura. Os testes com este compartimento de filtro forneceram bons dados. Uma operação de teste com 500 l de licor de cultura e uma baixa biomassa (0,5 g/l), bem como vários testes com 100 l de licor de cultura com alta biomassa (4 a 7 g/l) foram capazes de obter um teor de umidade residual extracelular de 0% no bolo de filtração (determinado conforme o Exemplo Comparativo 1). Isto significa que o sobrenadante do licor de cultura neste módulo foi forçado sucessivamente através do bolo de filtração completo, então, no filtro e para fora do compartimento de filtro. As perdas de produto para um anticorpo, em mg/l, também acabaram sendo muito baixas (4% a 13% - etapa 1 na Tabela 1). As perdas aqui foram apenas em virtude de retenção não específica de produto no bolo de filtração ou filtro, mas não em virtude do sobrenadante de cultura ser retido no bolo de filtração.

Exemplo 2: Filtração intensa e estéril

[0047] O filtrado do Exemplo 1 foi adicionalmente filtrado de forma a realizar filtração intensa e estéril: para a filtração intensa, filtração foi realizada com um disco de filtro Seitz K700 (tamanho de poro 6-12 m; Pall) e um disco de filtro Seitz KS50 (tamanho de poro 0,4-1 m; Pall). Estas filtrações podem ser realizadas sequencialmente em um compartimento e em uma passagem, ou separadamente em compartimentos separados. A diferença entre os filtros foi selecionada de modo que espaço suficiente estivesse disponível para as células de musgo ou fragmentos de células. Os filtros foram montados em dois trilhos paralelos, de acordo com os sistemas SUPRAdiscTM (Pall) e o SupracapTM 100 (Pall) (filtro Supradisc: 300P700S205SP e 200P050S205SP; filtro Supracap: NP6P7001 e NP6P0501).

[0048] Para filtração estéril, o filtrado foi adicionalmente filtrado com um disco de filtro Sartopore 2 (tamanho de poro de 0,2 m; Sartorius).

Exemplo 3: Resultados

[0049] O compartimento de filtro que foi desenvolvido garante separação otimizada de sólido-fluido. Um bolo de filtração sólido é formado, o qual é grandemente livre de umidade residual e, portanto, as perdas de produto são mantidas baixas. Todo o processo garante que as outras etapas de purificação possam ser realizadas rapidamente sem obstruir o filtro.

[0050] As Figuras 2 e 3 mostram os resultados. Elas mostram a análise da purificação do material suspenso através de filtração por meio de medições de turbidez (NTU) e o desenvolvimento de perdas de anticorpos pela filtração para purificação usando o sistema Supradisc (Figura 2) e a purificação usando o sistema Supracap (Figura 3) durante filtração intensa. A Tabela 1 resume as perdas de produto. Tabela 1: Perdas do produto durante purificação usando os sistemas Supradisc e Supracap

Claims (15)

1. Processo para separação de um sobrenadante fluido de células com parede celular caracterizado pelo fato de compreender as etapas a seguir: a) fornecer uma mistura das células com um fluido; b) carregar um compartimento de filtro com a mistura, em que, um primeiro filtro possuindo tamanho de poro na faixa de 4 μm a 50 μm é fornecido sobre uma superfície de base plana e as paredes do compartimento de filtro são conectadas de modo a vedar com a superfície de base plana, a qual é perfurada na forma de uma peneira; c) aplicar uma pressão diferencial de pelo menos 50.000 Pa (0,5 bar) à mistura por meio de ar comprimido, como um resultado disso, a porção fluida da mistura é forçada através do filtro e um bolo de filtração contendo células permanece no compartimento de filtro, em que a pressão absoluta no ponto de retirada é de pelo menos 70.000 Pa (0,7 bar); d) remover o fluido filtrado.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o volume interno do compartimento de filtro é de pelo menos 2 litros.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10 litros de sobrenadante são filtrados.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as células são isentas de ruptura durante o processo.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a pressão absoluta no ponto de retirada é de pelo menos 80.000 Pa (0,8 bar).

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a pressão diferencial é de pelo menos 80.000 Pa (0,8 bar), de preferência pelo menos 100.000 Pa (1 bar).

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o compartimento de filtro é um frasco pressurizado, em particular um frasco pressurizado concebido para pressões de pelo menos 200.000 Pa (2 bar), particularmente de preferência pelo menos 500.000 Pa (5 bar).

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a temperatura durante o processo está na faixa de 0°C a 40°C.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o bolo de filtração é isento de lavagem por fluido adicional e/ou o fluido é descarregado do bolo de filtração usando ar comprimido.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de compreender ainda a etapa de: e1) filtrar adicionalmente o fluido filtrado obtido na etapa d) com um segundo filtro com um tamanho de poro menor do que aquele do primeiro filtro, em que o tamanho de poro do segundo filtro está na faixa de 1 μm a 20 μm.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de compreender ainda a etapa de: e2) filtrar adicionalmente o fluido filtrado obtido na etapa d) ou e1) com um terceiro filtro com um tamanho de poro menor do que aquele do segundo filtro, em que o tamanho de poro do terceiro filtro está na faixa de 0,3 μm a 10 μm.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender ainda a etapa de: f) filtrar adicionalmente o fluido filtrado obtido na etapa e1) ou e2) com um quarto filtro com um tamanho de poro menor do que aquele do terceiro filtro, em que o tamanho de poro do quarto filtro está na faixa de 0,05 μm a 2 μm.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que as células são células de planta, em particular células de musgo, de preferência células de musgo da terra, particularmente, de preferência, células de Physcomitrella patens.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que uma proteína recombinante produzida pelas células está presente no sobrenadante fluido e/ou em que uma proteína recombinante é purificada do sobrenadante por meio de filtração.

15. Kit caracterizado pelo fato de compreender um compartimento de filtro conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 7 e possuindo um volume interno de pelo menos 2 litros, em que o compartimento de filtro é um frasco pressurizado possuindo uma entrada e uma abertura de suprimento de ar, e compreendendo um primeiro filtro com um tamanho de poro na faixa de 4 μm a 50 μm, de preferência adicionalmente com um segundo, terceiro e/ou quarto filtros, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 10 a 12.

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