KR20230017151A - 한외여과에 의한 엑소좀 농축물 - Google Patents
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Abstract
본 개시 내용은 농축된 엑소좀의 집단을 포함하는 엑소좀 조성물(exosome composition)을 제공한다. 엑소좀 조성물은 제형화보다는 단리(isolation) 및 한외여과(ultrafiltration)에 의해 직접 수득된다. 또한, 본 개시 내용은 엑소좀 조성물의 제조방법을 제공한다.
Description
본 발명은 농축된 엑소좀(enriched exosome)을 포함하는 엑소좀 조성물 및 이의 생산에 관한 것이다.
엑소좀은 대부분의 진핵 세포의 엔도좀 구획에서 생성되는 막 결합 세포외 소포체(extracellular vesicle, EV)이다. 엑소좀은 일반적으로 엔도솜 기원의 직경이 ~40 nm 내지 160 nm(평균 ~100 nm)의 크기 범위를 갖는다. 이들의 표면은 기증자 세포의 세포막에서 나온 지질 이중층으로 이루어지며, 엑소좀을 생산한 세포의 세포질을 포함하고, 표면 상에 모세포(parental cell)의 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 처음에 불필요한 단백질을 제거하는 메커니즘으로 생각되었다. 엑소좀은 세포간 상호작용과 유사한 방식으로 세포 표면 수용체에 결합할 수 있다. 또한, 엑소좀은 세포막에 부착되어, 세포에 새로운 수용체와 특성을 부여할 수 있다. 따라서, 엑소좀은 표적 세포와 융합하고, 두 세포 유형 간에 막 단백질 및 세포질을 교환할 수 있다. 이들은 세포들 사이의 통신을 매개하고 단백질의 전달을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 엑소좀 카고(exosome cargo)는 다양한 신호 인자를 포함하고 있으며, 이러한 신호 인자는 세포 유형에 특이적이며, 분비 세포의 환경에 따라 다르게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은, 천연 세포간 정보 운반체로서, 천연 물질 수송 특성, 비교적 작은 분자 구조 및 우수한 생체 적합성으로 인해 약물 운반체 분야에서 큰 응용 가능성을 가지고 있다.
본 개시 내용의 한 측면은 크기 및 분자량에서 특이적 분포를 갖는 농축된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 조성물에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 상기 엑소좀 조성물은 약 1 x 109 엑소좀/mL 초과 농도의 농축된 엑소좀의 집단을 포함하고, 여기서 엑소좀 조성물은 제형보다는 단리 및 한외여과(ultrafiltration) 또는 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 직접 수득된다.
추가 양태에서, 상기 조성물 중 엑소좀의 농도는 약 1 x 1010 엑소좀/mL 초과이다. 일부 양태에서, 상기 조성물 중 엑소좀의 농도는 약 1 x 1010 엑소좀/mL 내지 약 1 x 1015 엑소좀/mL, 약 1 x 1010 엑소좀/mL 내지 약 1 x 1014 엑소좀/mL, 약 1 x 1010 엑소좀/mL 내지 약 1 x 1013 엑소좀/mL, 약 1 x 1010 엑소좀/mL 내지 약 1 x 1012 엑소좀/mL, 약 1 x 1010 엑소좀/mL 내지 약 1 x 1011 엑소좀/mL 또는 약 1 x 1010 엑소좀/mL 내지 약 5 x 1010 엑소좀/mL의 범위이다.
하나의 양태에서, 상기 엑소좀 조성물은 평균 입자 크기가 약 135 nm 내지 약 150 nm 또는 약 138 nm 내지 약 148 nm인 농축된 엑소좀의 집단을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은 약 3 kDa, 약 10 kDa, 약 50 kDa 또는 약 100 kDa 초과의 분자량을 갖는 엑소좀을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은 입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀을 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 88% 초과 또는 약 90% 초과로 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은 입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀을 약 75% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 93%, 약 80% 내지 약 93%, 약 85% 내지 약 93% 또는 약 85% 내지 약 92%로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은 입자 크기가 100 nm 미만인 엑소좀을 약 10% 초과, 약 12% 초과 또는 약 15% 초과로 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은 입자 크기가 100 nm 미만인 엑소좀을 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 12% 내지 약 25%, 약 12% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 16% 내지 약 25% 또는 약 16% 내지 약 20%로 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 3 kDa 초과인 엑소좀을 포함한다:
농도가 1 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 90% 내지 약 93%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 16% 내지 약 20%임; 및
평균 입자 크기가 약 135 nm 내지 약 145 nm임.
추가 양태에서, 농도는 약 2 x 1010 엑소좀/mL 초과 또는 약 3 x 1010 엑소좀/mL(바람직하게는 약 3.2 x 1010 엑소좀/mL)이고; 엑소좀의 약 92%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이며; 엑소좀의 약 17% 내지 약 19%(바람직하게는 약 18.6 x 1010 엑소좀/mL)는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기는 약 137 nm 내지 약 142 nm(바람직하게는 약 140 nm)의 범위이다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 10 kDa 초과인 엑소좀을 포함한다:
농도가 2 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 90% 내지 약 93%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 14% 내지 약 18%임; 및
평균 입자 크기가 약 138 nm 내지 약 148 nm임.
추가 양태에서, 농도는 약 2.5 x 1010 엑소좀/mL, 약 3.0 x 1010 엑소좀/mL, 약 3.5 x 1010 엑소좀/mL 또는 약 4.0 x 1010 엑소좀/mL 초과(바람직하게는 약 4.2 x 1010 엑소좀/mL)이고; 엑소좀의 약 91%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이고; 엑소좀의 약 15% 내지 약 17%(바람직하게는 약 16.27 x 101 엑소좀/mL)는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기는 약 140 nm 내지 약 145 nm(바람직하게는 약 143.7 nm)의 범위이다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 50 kDa 초과인 엑소좀을 포함한다:
농도가 1.0 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 85% 내지 약 90%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 15% 내지 약 25%임; 및
평균 입자 크기가 약 140 nm 내지 약 150 nm임.
추가 양태에서, 농도는 약 1.0 x 1010 엑소좀/mL 초과(바람직하게는 약 1.44 x 1010 엑소좀/mL)이고; 엑소좀의 약 88.86%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이며; 엑소좀의 약 18% 내지 약 20%(바람직하게는 약 19.21 x 1010 엑소좀/mL)는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기가 약 142 nm 내지 148 nm(바람직하게는 약 145 nm)이다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 농축된 엑소좀의 집단은, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 100 kDa 초과인 엑소좀을 포함한다:
농도가 1.0 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 88% 내지 약 92%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 15% 내지 약 20%임; 및
평균 입자 크기가 약 138 nm 내지 약 145 nm임.
추가 양태에서, 농도는 약 1.2 x 1010 엑소좀/mL 초과(바람직하게는 약 1.48 x 1010 엑소좀/mL)이고; 엑소좀의 약 90.93%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이며; 엑소좀의 약 16% 내지 약 19%(바람직하게는 약 18.7 x 1010 엑소좀/mL)는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기는 약 140 nm 내지 약 144 nm(바람직하게는 약 142.2 nm)의 범위이다.
하나의 양태에서, 본 명세서에 기재된 엑소좀은 줄기 세포로부터 유래된다. 일부 양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포 또는 iPSC)이다.
본 개시 내용의 또 다른 측면은 이러한 엑소좀 집단을 생성하는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용은, 하기 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 엑소좀 조성물의 제조방법을 제공한다:
배지에 목적하는 양의 세포를 제공하는 단계;
상기 배지를 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 생성된 상청액을 여과하여 세포 사멸체 및 미세소포체를 제거하는 단계;
상기 생성된 상층액을 분자량 컷오프(cutoff)가 약 3 kDa 내지 약 100 kDa인 멤브레인으로 한외여과하는 단계; 및
중합체 기반 침전(polymer-based precipitation)으로 엑소좀을 침전시켜, 농축된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 조성물을 수득하는 단계.
하나의 양태에서, 상기 방법에 사용된 세포는 줄기 세포이다. 일부 양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포 또는 iPSC)이다.
본 개시 내용의 일부 양태에서, 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용한 한외여과는 농축기 스핀 컬럼(concentrator spin column)을 통해 수행된다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용은, 하기 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 엑소좀 조성물의 제조방법을 제공한다:
배지에 목적하는 양의 세포를 제공하는 단계;
상기 배지를 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 생성된 상청액을 여과하여 세포 사멸체 및 미세소포체를 제거하는 단계; 및
상기 생성된 상청액을 약 50분 내지 약 90분 동안 약 80,000g 내지 약 12,000g에서 초원심분리하여, 농축된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 조성물을 수득하는 단계.
하나의 양태에서, 초원심분리는 약 50분 내지 약 90분, 약 55분 내지 약 85분, 약 60분 내지 약 80분, 또는 약 65분 내지 약 75분 동안 약 80,000 g 내지 약 12,000 g, 약 85,000 g 내지 약 11,500 g, 약 90,000 g 내지 약 11,000 g, 또는 약 95,000 g 내지 약 10,500 g의 범위이다.
도 1은 한외여과의 시간 소모 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 나노입자 추적 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 나노입자 추적 분석의 파라미터를 나타낸다. 평균 크기, D90 및 D10은 3 kDa, 10 kDa, 50 kDa 및 100 kDa 한외여과로 표시된다.
도 4는 엑소좀 마커의 발현을 나타낸다. Alix는 엑소좀 내 단백질이다. CD81은 엑소좀의 표면 단백질이며, 3 kDa에 비해 50 kDa 및 100 kDa 감소한다.
도 5는 입자 농도를 나타낸다. 입자 농도가 추정된다. 입자 농도는 나노입자 추적 분석을 통해 3 kDa에 비해 50 kDa 및 100 kDa에서 감소했다.
도 6은 UCMSC 유래 엑소좀에서 투과전자현미경(TEM) 분석을 보여준다.
도 7은 실시예 1 및 3의 나노입자 추적 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 1 및 3에서 나노입자 추적 분석의 파라미터를 나타낸다.
도 9는 실시예 1 및 3에서 엑소좀 마커의 입자 농도 및 발현을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 나노입자 추적 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 나노입자 추적 분석의 파라미터를 나타낸다. 평균 크기, D90 및 D10은 3 kDa, 10 kDa, 50 kDa 및 100 kDa 한외여과로 표시된다.
도 4는 엑소좀 마커의 발현을 나타낸다. Alix는 엑소좀 내 단백질이다. CD81은 엑소좀의 표면 단백질이며, 3 kDa에 비해 50 kDa 및 100 kDa 감소한다.
도 5는 입자 농도를 나타낸다. 입자 농도가 추정된다. 입자 농도는 나노입자 추적 분석을 통해 3 kDa에 비해 50 kDa 및 100 kDa에서 감소했다.
도 6은 UCMSC 유래 엑소좀에서 투과전자현미경(TEM) 분석을 보여준다.
도 7은 실시예 1 및 3의 나노입자 추적 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 실시예 1 및 3에서 나노입자 추적 분석의 파라미터를 나타낸다.
도 9는 실시예 1 및 3에서 엑소좀 마커의 입자 농도 및 발현을 나타낸다.
문맥에 의해 달리 지정되거나 표시되지 않는 한, 용어 "a", "an" 및 "the"는 "하나 이상"을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약(about)"은 당업자에 의해 이해될 것이고, 이들이 사용되는 문맥에 따라 어느 정도 달라질 것이다. 당업자에게 명확하지 않은 용어의 용도가 있는 경우, 용어가 사용되는 맥락을 고려할 때, "약"은 특정 용어의 최대 ±10%를 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "엑소좀(exosome)"은 인간 또는 동물의 체액(예를 들면, 혈액)에서 유래된 임의의 세포외 소포체, 인간 또는 동물의 세포주, 세포 배양액 및 자가 엑소좀(autologous exosome), 보편적 공여자 엑소좀(universal donor exosome), 동종이형 엑소좀(allogenic exosome) 및 변형된 엑소좀으로 제한되지 않는 1차 배양물로부터 유래된 임의의 세포외 소포체를 말한다.
"제형(formulation)"이라는 용어는 활성제의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태의 제제를 의미한다.
본 명세서에서 "줄기세포(stem cell)"라는 용어는 미분화 또는 부분적으로 분화된 상태의 세포로서, 자가 재생(self-renewal)의 성질을 가지며, 발달 잠재력(즉, 전능성, 다능성, 다능성 등)과 관련하여 암시된 특정 의미 없이, 자연적으로 보다 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 발달 잠재력을 갖는 세포를 의미한다. 자가 재생은, 줄기 세포가 발달 잠재력을 유지하면서 증식할 수 있고 이러한 줄기 세포를 더 많이 생성할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "줄기 세포"는 특정 상황 하에서 보다 전문화되거나 분화된 표현형으로 분화할 수 있는 발달 잠재력을 갖고, 특정 상황 하에서 실질적으로 분화하지 않고 증식할 수 있는 능력을 보유하는 세포의 임의의 하위 집합(subset)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "~에서 파생된(derived from)"이라는 용어는, 특정 샘플 또는 샘플 그룹이 지정된 종에서 유래했지만, 반드시 지정된 출처에서 직접 얻은 것은 아님을 나타내는 것으로 간주된다.
엑소좀 자체 또는 약물 페이로드(drug payload)(들)의 전달을 위한 운반체로서의 엑소좀은 치료제로서 활발히 연구되고 있다. 리포솜과 달리, 주입된 엑소좀은 다른 세포에 효율적으로 진입할 수 있으며, 최소한의 면역 제거로 기능적 카고(functional cargo)를 전달할 수 있으며, 외인성 투여 시 우수한 내성을 나타낼 수 있다.
엑소좀의 이질성은 크기, 함량, 수용자 세포에 대한 기능적 영향 및 세포 기원을 반영하는 것 같다. 크기 불평등은 다포체(MVB)의 제한 막의 고르지 못한 함입으로 인해 유체 및 고체의 총 함량이 뚜렷하게 나타나거나, 다른 EV를 포함하는 격리 방법이 발생할 수 있다. EV를 포함하는 정제된 분류 방법은, 엑소좀이 고유한 크기 범위로 정의된 하위 개체군을 포함할 수 있음을 보여준다. 크기 이질성은 또한 상이한 양의 엑소좀 함량을 초래할 수 있다. 미세 환경과 세포의 고유한 생물학은 엑소좀 및 이들의 생물학적 마커의 함량에 영향을 미칠 수 있다(Raghu Kalluri and Valerie S. LeBleu, Science Vol. 367, Issue 6478, 07 Feb 2020).
약 1 x 109 엑소좀/mL 초과 농도의 농축된 엑소좀의 집단을 포함하는 엑소좀이 본 명세서에 개시된다. 또한, 개시된 엑소좀을 생산하는 방법이 본 명세서에서 고려된다.
엑소좀 조성물은 근육, 지방, 기관 또는 골수 또는 골수와 같은 임의의 수의 조직 공급원으로부터 유래될 수 있다. 다양한 세포를 사용하여 본 개시 내용의 엑소좀 조성물을 제조할 수 있다. 특히, 엑소좀 조성물은 세포로부터 유래될 수 있다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 세포는 진핵 유기체 또는 세포주로부터 유래된다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 세포는 식물 또는 동물로부터 유래된다. 세포는 유전적으로 변형될 수 있다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 조혈 줄기 세포 이식(HSCT) 또는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포 또는 iPSC)이다.
본 개시 내용의 엑소좀 조성물을 생성하기 위해 특정 공정이 사용된다. 본 개시 내용의 엑소좀 조성물의 제조방법은 우선 목적하는 양의 세포를 제공한다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 세포는 목적하는 양의 세포를 수득하기에 충분한 기간 동안 배지에서 배양된다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 세포 수는 약 1 x 105 세포/mL 내지 약 1 x 108 세포/mL이고; 약 2 x 105 세포/mL 내지 약 8 x 107 세포/mL; 약 4 x 105 세포/mL 내지 약 6 x 107 세포/mL; 약 6 x 105 세포/mL 내지 약 4 x 107 세포/mL; 약 8 x 105 세포/mL 내지 약 2 x 10 세포/mL; 약 1 x 106 세포/mL 내지 약 1 x 107 세포/mL; 약 2 x 106 세포/mL 내지 약 8 x 106 세포/mL; 또는 약 4 x 106 세포/mL 내지 약 6 x 106 세포/mL이다. 배양 방법은 세포에 따라 달라진다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 배지는 특정 특성을 갖는 목적하는 양의 세포를 수득하기 위한 조절 배지이다. 예를 들면, 미분화 단계 또는 분화 단계에서 세포를 유지하기 위해 조절 배지가 제공된다.
목적하는 양의 세포를 포함하는 배지는 죽은 세포 및/또는 세포 파편을 제거하기 위한 사전 청소 절차를 거친다. 본 개시 내용의 하나의 양태에서, 배지는 원심분리되어 죽은 세포를 제거한다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 죽은 세포는 약 5분, 약 6분, 약 7분, 약 8분, 약 9분, 약 10분, 약 11분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 또는 약 15분 동안 약 300 g, 약 350 g, 또는 약 400 g에서 제거될 수 있다. 본 개시 내용의 하나의 양태에서, 배지는 원심분리되어 세포 파편을 제거한다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 세포 파편은 약 10분, 약 11분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분, 약 19분 또는 약 20분 동안 약 1500 g, 약 1600 g, 약 1700 g, 약 1700 g, 약 1800 g, 약 1900 g, 약 2000 g, 약 2100 g, 약 2200 g, 약 2200 g, 약 2300 g, 약 2400 g, 또는 약 2500 g 제거될 수 있다.
죽은 세포 및/또는 세포 파편을 제거한 후 생성된 상청액을 여과하여, 세포 사멸체 및 미세소포를 제거한다. 본 개시 내용의 하나의 양태에서, 생성된 상청액은 약 0.15 ㎛, 약 0.16 ㎛, 약 0.18 ㎛, 약 0.20 ㎛, 약 0.22 ㎛, 약 0.24 ㎛, 약 0.26 ㎛, 또는 약 0.28 ㎛ 필터를 통과함으로써 여과된다.
본 개시 내용의 하나의 양태에서, 사전 청소 후 생성된 상청액은 그 후 약 3 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막을 사용하여 한외여과된다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 한외여과는 농축기 스핀 컬럼을 통해 수행된다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 분자량 컷오프가 약 3 kDa인 막 및 한외여과가 480분 동안 수행된다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 분자량 컷오프가 약 10 kDa이고 한외여과가 60분 동안 수행된다.
힘(예를 들면, 압력 또는 농도 구배)이 반투막을 통한 분리로 이어지는 일종의 막 여과이다. 한외여과 멤브레인은 일반적으로 멤브레인의 분자량 차단을 특징으로 한다. 부유 고형물과 고분자량 용질은 잔류물에 남아 있는 반면에, 물과 저분자량 용질은 투과물에서 막을 통과한다. 한외여과 공정에 다양한 유형의 모듈이 사용될 수 있다. 이러한 모듈의 예로는 플라스틱 또는 종이 튜브 내부에 주조된 중합체 막을 사용하는 관형 요소; 다중 중공사(multiple hollow fiber)를 포함하는 중공사 디자인; 평평한 멤브레인 시트가 중앙의 천공된 튜브 주위에 롤링되고 관형 강철 압력 용기 케이싱에 끼워지는 얇은 메쉬 스페이서 재료에 의해 분리되는 나선형 감긴 모듈; 및 여과액이 통과하는 메쉬 유사 물질에 의해 분리된 평판 위에 놓인 막을 사용하는 플레이트 및 프레임 어셈블리가 있다.
그 후, 한외여과 후 생성된 상청액은 농축을 위해 엑소좀 침전에 적용된다. 본 개시 내용의 일부 양태에서, 한외여과 후 생성된 상청액은 중합체 기반 침전을 사용한 침전이다. 생성된 상청액은 약 1 x 109 엑소좀/mL 초과 농도의 농축 엑소좀 집단을 포함한다.
세포 조건 배지는 엑소좀 추출을 위한 중요한 단계이다. 다량의 세포 조건 배지는 엑소좀 추출 및 농축 비용을 증가시킨다. 한외여과에 의해, 세포 조절 배지는 엑소좀 추출의 농축을 위해 농축된다. 본 개시 내용은 추출을 위한 엑소좀 농축의 효율적인 제조 공정을 제공한다.
본 개시 내용의 하나의 양태에서, 사전-제거(pre-clearance) 후 생성된 상청액은 그 후 약 50분 내지 약 90분 동안 약 80,000g 내지 약 12,000g에서 초원심분리된다.
엑소좀 조성물은 분자량, 평균 입자 크기, 엑소좀 농도 및 입자 크기 범위를 결정하여 확인할 수 있다. 결과는 본 명세서에 기재되어 있다. 본 개시 내용의 일부 실시양태에서, 나노입자 추적 분석에서, 3 kDa 한외여과 후 엑소좀 추출은 종래의 초원심분리와 비교하여 입자 수를 증가시키는 것으로 나타났다. 엑소좀 마커 발현은 3 kDa 한외여과에서도 증가한다. 또한, 10 kDa 한외여과 후 엑소좀 추출의 효율은 초원심분리와 유사하다. 평균 크기는 약 150 nm 내지 약 160 nm이고, 크기 분포는 약 100 nm 내지 약 200 nm이다.
본 엑소좀 조성물은, 암 및 종양학적 장애; 전염병; 심혈관 질환; 제1형 진성 당뇨병 및 제2형 진성 당뇨병을 포함하는 진성 당뇨병; 간 질환; 비만; 희귀질환; 위장 질환; 골격 질환; 및 겸상 적혈구 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 엑소좀 조성물은 또한 세포 치료제; 벡터 및 세포 공학, 약리학 및 독성학 분석 개발에 사용될 수 있다.
본 개시 내용은 단지 예시의 목적으로 특정 양태를 사용하여 본 명세서에서 기술되었다. 그러나, 본 발명의 원리가 다른 방식으로 구현될 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 특정 양태 및 청구범위로 범위가 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예
실시예 1
엑소좀 조성물의 생산
탯줄 중간엽 줄기 세포(MSC)는 1.5 x 106 세포/mL의 세포 양에 도달하기 위해 세포 조절 배지에서 배양했다. 배양액을 350 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 죽은 세포를 제거하였다. 생성된 상청액을 4 ℃에서 15분 동안 2,000 g에서 추가로 원심분리하여, 세포 파편을 제거하였다. 생성된 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하여, 세포 사멸체 및 미세소포를 제거하였다.
30 ml 사전-제거된(pre-cleared) 세포 조절 배지를 3 kDa, 10 kDa, 50 kDa 및 100 kDa 농축기 스핀 컬럼, VIVASPIN® 6(로딩 샘플 부피: 2 mL 내지 6 mL) 및 20(샘플 용량 로드: 5 mL 내지 20 mL)을 통해 한외여과했다. 농축기 스핀 컬럼 멤브레인의 기공 크기는 킬로 달턴에 비례한다. 1 mL로 농축되는 30 mL 사전-제거된 세포 조절 배지의 시간 소모를 추정하고, 표 1 및 도 1에 나타냈다. 결과적으로, 3 kDa 한외여과(480분)는 10 kDa(60분), 50 kDa(55분), 100 kDa(50분)보다 많은 시간이 걸렸다.
[표 1]
엑소좀은 TOOLSharp® 세포 배양 배지 엑소좀 추출 키트를 사용한 중합체 기반 침전에 의해 침전되었다. 그 후, 풍부한 엑소좀 집단을 포함하는 엑소좀 조성물을 수득했다. 엑소좀 조성물은 표 2 및 도 2 및 도 3에서의 특성을 갖는 것으로 확인되었다. 엑소좀의 크기 분포는 나노입자 추적 분석으로 분석하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 3 kDa, 10 kDa, 50 kDa 및 100 kDa의 크기 분포는 100 nm 내지 200 nm 사이에서 유사하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 평균 크기는 약 150 nm 내지 160 nm이다. D90 및 D10은 100 nm 내지 200 nm 사이의 크기 분포를 나타낸다.
[표 2]
실시예 2
엑소좀 집단을 포함하는 엑소좀 조성물
실시예 1에서 수득된 UCMSC 유래 엑소좀에 대한 Alix 및 CD81의 양을 전기영동으로 측정하여, 도 4에 나타냈다. Alix 및 CD81은 3 kDa에 비해 50 kDa 및 100 kDa에서 감소한다.
입자 농도는 나노입자 추적 분석을 통해 3 kDa에 비해 50 kDa 및 100 kDa에서 감소했다.
UCMSC 유래 엑소좀에서 투과전자현미경(TEM) 분석 결과를 도 6에 나타냈다.
실시예 3
엑소좀 조성물의 생산 - 초원심분리
탯줄 중간엽 줄기 세포(MSC)는 1.5 x 106 세포/mL의 세포 양에 도달하기 위해 세포 조절 배지에서 배양했다. 배양액을 350 g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하여 죽은 세포를 제거하였다. 생성된 상청액을 4 ℃에서 15분 동안 2,000 g에서 추가로 원심분리하여, 세포 파편을 제거하였다. 생성된 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과하여, 세포 사멸체 및 미세소포를 제거하였다.
12mL의 사전-제거된 세포 조절 배지를 100,000 g에서 70분 동안 초원심분리했다. 본 실시예(초원심분리) 및 실시예 1(3 kDa 및 10 kDa)에서 엑소좀의 크기 분포를 나노입자 추적 분석으로 분석하여, 도 7에 나타냈다. 결과는 100 nm 내지 200 nm 사이에서 유사한 크기 분포를 보여준다.
본 실시예(초원심분리) 및 실시예 1(3 kDa 및 10 kDa)에서 나노입자 추적 분석의 파라미터를 나노입자 추적 분석으로 분석하여 도 8에 나타냈다. 모든 입자의 평균 크기는 약 150 nm 내지 160 nm이다. D90 및 D10은 100 nm 내지 200 nm 사이의 크기 분포를 나타낸다.
본 실시예(초원심분리) 및 실시예 1(3 kDa 및 10 kDa)에서 수득된 UCMSC 유래 엑소좀 상의 입자 농도 및 Alix 및 CD81의 양을 측정하여 도 9에 나타냈다. 입자 농도는 10 kDa 및 초원심분리에 비해 3 kDa 한외여과에서 증가했다. Alix 및 CD81 발현 또한 3 kDa에서 증가했다.
Claims (20)
- 약 1 x 109 엑소좀/mL 초과 농도의 농축된 엑소좀 집단을 포함하는 엑소좀 조성물(exosome composition)로서,
상기 엑소좀 조성물은 제형 대신에 단리 및 한외여과(ultrafiltration) 또는 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 직접 수득되는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물 중 엑소좀의 농도는 약 1 x 1010 엑소좀/mL 초과인 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 엑소좀 조성물은 평균 입자 크기가 약 135 nm 내지 약 150 nm인 농축된 엑소좀의 집단을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은 분자량이 약 3 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은 분자량이 약 10 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은 분자량이 약 50 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은 분자량이 약 100 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은 입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀을 약 80% 초과로 포함하는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은 입자 크기가 약 100 nm 미만의 엑소좀을 약 10% 초과로 포함하는 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은, 하기 특징들 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 3 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물:
농도가 약 1 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 90% 내지 약 93%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 16% 내지 약 20%임; 및
평균 입자 크기가 약 135 nm 내지 약 145 nm임.
- 제10항에 있어서,
농도는 약 2 x 1010 엑소좀/mL 초과이고; 엑소좀의 약 92%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이며; 엑소좀의 약 17% 내지 약 19%는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기는 약 137 nm 내지 약 142 nm의 범위인 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은, 하기 특징들 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 10 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물:
농도가 약 2 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 90% 내지 약 93%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 14% 내지 약 18%임; 및
평균 입자 크기가 약 138 nm 내지 약 148 nm임.
- 제12항에 있어서,
농도는 약 2.5 x 1010 엑소좀/mL 초과이고; 엑소좀의 약 91%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이며; 엑소좀의 약 15% 내지 약 17%는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기는 약 140 nm 내지 약 145 nm의 범위인 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은, 하기 특징들 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 50 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물:
농도가 1.0 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 85% 내지 약 90%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 15% 내지 약 25%임; 및
평균 입자 크기가 약 140 nm 내지 약 150 nm임.
- 제14항에 있어서,
농도는 약 1.0 x 1010 엑소좀/mL 초과이고; 엑소좀의 약 88.86%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이며; 엑소좀의 약 18% 내지 약 20%는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기는 약 142 nm 내지 약 148 nm의 범위인 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 농축된 엑소좀 집단은, 하기 특징들 중 하나 이상을 갖는, 분자량이 약 100 kDa 초과인 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀 조성물:
농도가 1.0 x 1010 엑소좀/mL 초과임;
입자 크기가 약 200 nm 미만인 엑소좀이 약 88% 내지 약 92%임;
입자 크기가 약 100 nm 미만인 엑소좀이 약 15% 내지 약 20%임; 및
평균 입자 크기가 약 138 nm 내지 약 145 nm임.
- 제16항에 있어서,
농도는 약 1.2 x 1010 엑소좀/mL 초과이고; 엑소좀의 약 90.93%는 입자 크기가 약 200 nm 미만이며; 엑소좀의 약 16% 내지 약 19%는 입자 크기가 약 100 nm 미만이며; 및/또는 평균 입자 크기는 약 140 nm 내지 약 144 nm의 범위인 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 줄기세포로부터 유래된 것인, 엑소좀 조성물.
- 제1항의 엑소좀 조성물의 제조방법으로서, 상기 방법은,
배지에 목적하는 양의 세포를 제공하는 단계;
상기 배지를 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 생성된 상청액을 여과하여 세포 사멸체 및 미세소포체(microvesicle)를 제거하는 단계; 및
상기 생성된 상층액을 분자량 컷오프(cutoff)가 약 3 kDa 내지 약 100 kDa인 멤브레인으로 한외여과하는 단계; 및
상기 생성된 상청액을 적어도 약 10분 동안 약 6,000 g 내지 약 15,000 g에서 원심분리하여 중합체 기반 침전(polymer-based precipitation)으로 엑소좀을 침전시켜, 농축된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 것인, 엑소좀 조성물의 제조방법.
- 제1항의 엑소좀 조성물의 제조방법으로서, 상기 방법은,
배지에 목적하는 양의 세포를 제공하는 단계;
상기 배지를 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 생성된 상청액을 여과하여 세포 사멸체 및 미세소포체를 제거하는 단계; 및
상기 생성된 상청액을 약 50분 내지 약 90분 동안 약 80,000 g 내지 약 12,000 g에서 초원심분리하여, 농축된 엑소좀을 포함하는 엑소좀 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 것인, 엑소좀 조성물의 제조방법.
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