TW202307204A - 以超濾法之外泌體富集 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種包含富集外泌體群體之外泌體組合物。該外泌體組合物係藉由分離及超濾法直接獲得，而非藉由調配獲得。本發明亦提供一種用於產生該外泌體組合物之方法。
Description
本發明係關於包含富集外泌體之外泌體組合物及其生產。
外泌體為在大部分真核細胞之內體隔室中產生的膜結合細胞外囊泡(EV)。外泌體一般具有約40 nm至160 nm (平均約100 nm)直徑之大小範圍，具有內體來源。其表面由來自供體細胞之細胞膜的脂質雙層組成，且其含有來自產生外泌體之細胞的細胞溶質，且在表面上展現來自親本細胞之膜蛋白。最初認為外泌體為用於移除不需要的蛋白質之機制。外泌體可以類似於細胞間相互作用之方式結合至細胞表面受體。此外，外泌體可連接至細胞膜且給予細胞新受體及特性。因此，外泌體可與目標細胞融合且在兩種細胞類型之間交換膜蛋白及細胞溶質。已知其介導細胞之間的通訊且促進蛋白質之轉移。亦已知外泌體負荷包括廣泛範圍之信號傳導因子，且此等信號傳導因子對細胞類型具特異性且視分泌細胞之環境而以不同方式調節。作為天然細胞間資訊載劑，外泌體由於其天然材料輸送特性、相對較小分子結構及極佳生物相容性而在藥物載劑領域中具有巨大應用潛能。
本發明之一個態樣係關於一種外泌體組合物，其包含具有特定大小及分子量分佈之富集外泌體。
在一個實施例中，外泌體組合物包含濃度大於約1×10
9個外泌體/毫升之富集外泌體群體，其中外泌體組合物係藉由分離及超濾法或超速離心法直接獲得，而非藉由調配獲得。
在另一實施例中，組合物中外泌體之濃度大於約1×10
10個外泌體/毫升。在一些實施例中，組合物中外泌體之濃度範圍為約1×10
10個外泌體/毫升至約1×10
15個外泌體/毫升、約1×10
10個外泌體/毫升至約1×10
14個外泌體/毫升、約1×10
10個外泌體/毫升至約1×10
13個外泌體/毫升、約1×10
10個外泌體/毫升至約1×10
12個外泌體/毫升、約1×10
10個外泌體/毫升至約1×10
11個外泌體/毫升或約1×10
10個外泌體/毫升至約5×10
10個外泌體/毫升。
在一個實施例中，外泌體組合物包含具有約135 nm至約150 nm或約138 nm至約148 nm之平均粒度的富集外泌體群體。
在一個實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含具有大於約3 kDa、約10 kDa、約50 kDa或約100 kDa之分子量的外泌體。
在一個實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約88%或大於約90%之具有小於約200 nm之粒度的外泌體。在一些實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含約75%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約75%至約93%、約80%至約93%、約85%至約93%或約85%至約92%之具有小於約200 nm之粒度的外泌體。
在一個實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含大於約10%、大於約12%或大於約15%之具有小於100 nm之粒度的外泌體。在一些實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含約10%至約25%、約10%至約20%、約12%至約25%、約12%至約20%、約15%至約25%、約15%至約20%、約16%至約25%或約16%至約20%之具有小於約100 nm之大小的外泌體。
在一些實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含分子量大於約3 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者：
濃度大於1×10
10個外泌體/毫升；
約90%至約93%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；
約16%至約20%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及
平均粒度為約135 nm至約145 nm。
在其他實施例中，濃度大於約2×10
10個外泌體/毫升或約3×10
10個外泌體/毫升(較佳約3.2×10
10個外泌體/毫升)；約92%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約17%至約19% (較佳約18.6×10
10個外泌體/毫升)之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度在約137 nm至約142 nm範圍內(較佳約140 nm)。
在一些實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含分子量大於約10 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者：
濃度大於2×10
10個外泌體/毫升；
約90%至約93%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；
約14%至約18%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及
平均粒度為約138 nm至約148 nm。
在其他實施例中，濃度大於約2.5×10
10個外泌體/毫升、約3.0×10
10個外泌體/毫升、約3.5×10
10個外泌體/毫升或約4.0×10
10個外泌體/毫升(較佳約4.2×10
10個外泌體/毫升)；約91%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約15%至約17% (較佳約16.27×10
10個外泌體/毫升)之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度在約140 nm至約145 nm範圍內(較佳約143.7 nm)。
在一些實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含分子量大於約50 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者：
濃度大於1.0×10
10個外泌體/毫升；
約85%至約90%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；
約15%至約25%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及
平均粒度為約140 nm至約150 nm。
在其他實施例中，濃度大於約1.0×10
10個外泌體/毫升(較佳約1.44×10
10個外泌體/毫升)；約88.86%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約18%至約20% (較佳約19.21×10
10個外泌體/毫升)之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度為約142 nm至148 nm (較佳約145 nm)。
在一些實施例中，本文所描述之富集外泌體群體包含分子量大於約100 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者：
濃度大於1.0×10
10個外泌體/毫升；
約88%至約92%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；
約15%至約20%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及
平均粒度為約138 nm至約145 nm。
在其他實施例中，濃度大於約1.2×10
10個外泌體/毫升(較佳約1.48×10
10個外泌體/毫升)；約90.93%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約16%至約19% (較佳約18.7×10
10個外泌體/毫升)之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度在約140 nm至約144 nm範圍內(較佳約142.2 nm)。
在一個實施例中，本文所描述之外泌體衍生自幹細胞。在一些實施例中，幹細胞為胚胎幹細胞(ESC)、間葉幹細胞(MSC)、造血幹細胞移植(HSCT)或誘導性富潛能幹細胞(iPS細胞或iPSC)。
本發明之另一態樣係關於一種用於產生此類外泌體群體之方法。
在一個實施例中，本發明提供一種用於產生本文所描述之外泌體組合物之方法，其包含以下步驟：
在培養基中提供所需量之細胞；
將該培養基離心以移除細胞碎片，且隨後過濾所得上清液以移除細胞凋亡體及小胞；
用具有約3 kDa至約100 kDa之截留分子量的膜對該所得上清液進行超濾法；及
用基於聚合物之沈澱來沈澱外泌體以獲得包含富集外泌體之該外泌體組合物。
在一個實施例中，方法中所用之細胞為幹細胞。在一些實施例中，幹細胞為胚胎幹細胞(ESC)、間葉幹細胞(MSC)、造血幹細胞移植(HSCT)或誘導性富潛能幹細胞(iPS細胞或iPSC)。
在本發明之一些實施例中，利用具有截留分子量之膜的超濾法係經由濃縮器旋轉管柱進行。
在一個實施例中，本發明提供一種用於產生本文所描述之外泌體組合物之方法，其包含以下步驟：
在培養基中提供所需量之細胞；
將該培養基離心以移除細胞碎片，且隨後過濾所得上清液以移除細胞凋亡體及小胞；及
將該所得上清液以約80,000 g至約12,000 g超速離心約50分鐘至約90分鐘，以獲得包含富集外泌體之該外泌體組合物。
在一個實施例中，超速離心法之範圍為約80,000 g至約12,000 g、約85,000 g至約11,500 g、約90,000 g至約11,000 g或約95,000 g至約10,500 g，持續約50分鐘至約90分鐘、約55分鐘至約85分鐘、約60分鐘至約80分鐘或約65分鐘至約75分鐘。
除非上下文另外規定或指示，否則術語「一(a/an)」及「該」意謂「一或多個」。"
如本文所用，「約」將由一般熟習此項技術者理解且將在一定程度上根據使用其之上下文而變化。若術語之使用對於一般熟習此項技術者而言在使用其之上下文中不清楚，則「約」將意謂特定術語加或減10%。
如本文所用，術語「外泌體」係指衍生自人類或動物之任何體液(例如血液)的任何細胞外囊泡，衍生自人類或動物細胞株、細胞培養物及初代培養物之任何細胞外囊泡不限於自體外泌體、通用供體外泌體、同種異體外泌體及經修飾之外泌體。
術語「調配物」係指呈允許活性劑之生物活性有效之形式的製劑。
如本文所用，術語「幹細胞」係指呈未分化或部分分化狀態之細胞，其具有自我更新特性且具有自然分化為更分化細胞類型之發育潛能，關於發育潛能無特定隱含含義(亦即，分化全能、富潛能、多潛能等)。自我更新意謂幹細胞能夠增殖且產生更多此類幹細胞，同時維持其發育潛能。因此，術語「幹細胞」係指在特定情況下具有分化為更特定或分化表型之發育潛能，且在某些情況下保留增殖而不實質上分化之能力的任何細胞亞群。
如本文所用，術語「衍生自」應理解為指示特定樣品或樣品組來源於指定物種，但未必直接獲自指定來源。
外泌體本身或作為遞送藥物有效負載之媒劑正被積極探究作為治療劑。與脂質體相比，注射之外泌體有效進入其他細胞，且可在免疫清除極小之情況下遞送功能性負荷，且在外源投與時展現良好耐受性。
外泌體之異質性可能反映其大小、內含物、對受體細胞之功能影響及細胞來源。大小不等性可歸因於多泡體(MVB)之界限膜的不均勻內褶，導致流體及固體之總含量不同，或包括其他EV之分離方法。涉及EV之精細部分分離方法展現外泌體可含有由不同大小範圍界定之亞群。大小異質性亦可導致不同量之外泌體內含物。細胞之微環境及固有生物學可影響外泌體之內含物及其生物標記(
Raghu Kalluri 及 Valerie S. LeBleu, Science 第 367 卷 , 第 6478 期 , 2020 年 2 月 7 日)。
本文揭示包含濃度大於約1×10
9個外泌體/毫升之富集外泌體群體的外泌體。本文亦考慮用於產生所揭露之外泌體的方法。
外泌體組合物可衍生自任何數目之組織來源，諸如肌肉、脂肪、器官或骨或骨髓。各種細胞可用於製備本發明之外泌體組合物。特定言之，外泌體組合物可衍生自細胞。在本發明之一些實施例中，細胞衍生自真核生物體或細胞株。在本發明之一些實施例中，細胞衍生自植物或動物。細胞可經基因修飾。在本發明之一些實施例中，細胞為幹細胞。在一些實施例中，幹細胞為胚胎幹細胞(ESC)、間葉幹細胞(MSC)、造血幹細胞移植(HSCT)或誘導性富潛能幹細胞(iPS細胞或iPSC)。
特定方法用於產生本發明之外泌體組合物。在用於產生本發明之外泌體組合物之方法中首先提供所需量之細胞。在本發明之一些實施例中，細胞在培養基中培養足以獲得所需量之細胞的一段時間。在本發明之一些實施例中，細胞量為約1×10
5細胞/mL至約1×10
8細胞/mL；約2×10
5細胞/mL至約8×10
7細胞/mL；約4×10
5細胞/mL至約6×10
7細胞/mL；約6×10
5細胞/mL至約4×10
7細胞/mL；約8×10
5細胞/mL至約2×10
7細胞/mL；約1×10
6細胞/mL至約1×10
7細胞/mL；約2×10
6細胞/mL至約8×10
6細胞/mL；或約4×10
6細胞/mL至約6×10
6細胞/mL。培養之方式視細胞而定。在本發明之一些實施例中，培養基為用於獲得所需量之具有特定特性之細胞的條件培養基。舉例而言，提供條件培養基用於將細胞維持在未分化階段或分化階段。
含有所需量之細胞的培養基經受用於移除死細胞及/或細胞碎片之預清除程序。在本發明之一個實施例中，將培養基離心以移除死細胞。在本發明之一些實施例中，死細胞可以約300 g、約350 g或約400 g移除持續約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘、約11分鐘、約12分鐘、約13分鐘、約14分鐘或約15分鐘。在本發明之一個實施例中，將培養基離心以移除細胞碎片。在本發明之一些實施例中，細胞碎片可以約1500 g、約1600 g、約1700 g、約1700 g、約1800 g、約1900 g、約2000 g、約2100 g、約2200 g、約2300 g、約2400 g或約2500 g移除持續約10分鐘、約11分鐘、約12分鐘、約13分鐘、約14分鐘、約15分鐘、約16分鐘、約17分鐘、約18分鐘、約19分鐘或約20分鐘。
隨後過濾移除死細胞及/或細胞碎片之後的所得上清液以移除細胞凋亡體及小胞。在本發明之一個實施例中，所得上清液藉由通過約0.15 μm、約0.16 μm、約0.18 μm、約0.20 μm、約0.22 μm、約0.24 μm、約0.26 μm或約0.28 μm過濾器過濾。
在本發明之一個實施例中，預清除之後所得上清液隨後經受利用具有約3 kDa至約100 kDa之截留分子量之膜進行的超濾法。在本發明之一些實施例中，超濾法經由濃縮器旋轉管柱進行。在本發明之一些實施例中，膜具有約3 kDa之截留分子量，且超濾法進行480分鐘。在本發明之一些實施例中，膜具有約10 kDa之截留分子量，且超濾法進行60分鐘。
一種類型之膜過濾，其中力(諸如壓力或濃度梯度)使得經由半透膜而分離。超濾膜通常特徵在於膜之截留分子量。懸浮固體及較高分子量之溶質保留在保留物中，而水及低分子量溶質在滲透物中穿過膜。不同類型之模組可用於超濾過程。此等模組之實例為使用在塑膠或紙管內側上鑄造之聚合膜的管狀元件；含有多個中空纖維之中空纖維設計；螺旋捲繞模組，其中平坦膜片藉由在中心穿孔管周圍捲起且安裝至管狀鋼壓力容器殼體中之薄網狀間隔材料隔開；及板及框架總成，其使用置放於平板上藉由濾液穿過之網狀材料隔開的膜。
在超濾法之後所得上清液隨後經受外泌體沈澱以富集。在本發明之一些實施例中，在超濾法之後所得上清液係用基於聚合物之沈澱進行沈澱。所得上清液包含濃度大於約1×10
9個外泌體/毫升之富集外泌體群體。
細胞條件培養基為外泌體萃取之關鍵步驟。大量細胞條件培養基導致外泌體萃取及富集成本增加。藉由超濾法，濃縮細胞條件培養基以富集外泌體萃取。本發明提供用於萃取之外泌體富集之效率製造方法。
在本發明之一個實施例中，在預清除之後所得上清液隨後以約80,000 g至約12,000 g經受超速離心法約50分鐘至約90分鐘。
外泌體組合物可藉由測定其分子量、平均粒度、外泌體濃度及粒度範圍來鑑別。結果在本文中描述。在本發明之一些實施例中，在奈米粒子追蹤分析中，與傳統超速離心法相比，3 kDa超濾法之後外泌體萃取展示增加粒子數目。外泌體標記表現亦在3 kDa超濾法中增加。另外，10 kDa超濾法之後的外泌體萃取效率類似於超速離心法。平均大小為約150 nm至約160 nm，且大小分佈為約100 nm至約200 nm。
本發明外泌體組合物可用於治療以下疾病中之任一者，包括但不限於：癌症及腫瘤病症；感染性疾病；心血管疾病；糖尿病，包括第1型糖尿病及第2型糖尿病；肝病；肥胖症；罕見疾病；胃腸疾病；骨骼疾病；及鐮狀細胞疾病。本發明外泌體組合物亦可用於細胞治療劑；載體及細胞工程改造，以及藥理學及毒理學分析開發。
僅出於說明的目的，已在本文中使用特定實施例來描述本發明。然而，一般熟習此項技術者將顯而易見，本發明之原理可以其他方式體現。因此，本發明不應被視為在範疇上限於特定實施例及申請專利範圍。
實例
實例
1
外泌體組合物之產生
將臍帶間葉幹細胞(MSC)在細胞條件培養基中培養，以達到細胞量1.5×10
6細胞/mL。將培養基在4℃下以350 g離心10分鐘以移除死細胞。將所得上清液進一步在4℃下以2,000 g離心15分鐘以移除細胞碎片。使用0.22 μm過濾器過濾所得上清液以移除細胞凋亡體及小胞。
30 ml預清除細胞條件培養基經由3 kDa、10 kDa、50 kDa及100 kDa濃縮器旋轉管柱VIVASPIN® 6 (裝載樣品量：2 mL至6 mL)和20 (裝載樣品量：5 mL至20 mL)。進行超濾。濃縮器旋轉管柱之膜的孔徑與千道爾頓(Dalton)成比例。估計30 mL預清除細胞條件培養基濃縮至1 mL之耗時，且其展示於表1及圖1中。結果，3 kDa超濾法(480分鐘)比10 kDa (60分鐘)、50 kDa (55 分鐘)、100 kDa (50分鐘)花費更多時間。
表1
| 超濾法 (30 mL至 mL) | 3 kDa | 10 kDa | 50 kDa | 100 kDa |
| 孔徑 | 1.2 nm | 2.5 nm | 7 nm | 10 nm |
| 時間 (分鐘) | 480分鐘 | 60分鐘 | 55分鐘 | 50分鐘 |
外泌體藉由TOOLSharp® Cell Culture Media Exosome Extraction Kit基於聚合物之沈澱來沈澱。隨後獲得包含富集外泌體群體之外泌體組合物。外泌體組合物經確定具有表2以及圖2及圖3中之特徵。藉由奈米粒子追蹤分析來分析外泌體之大小分佈。如圖2中所展示，3 kDa、10 kDa、50 kDa及100 kDa中之大小分佈類似且在100 nm至200 nm之間。如圖3中所展示，平均大小為約150 nm至160 nm。D90及D10展示在100 nm至200 nm之間的大小分佈。
表2
| 3 kDa | 10 kDa | 50 kDa | 100 kDa | |
| CCM 體積 | 30 ml | 30 ml | 30 ml | 30 ml |
| 平均值( 大小) | 139.7 nm | 143.7 nm | 145.0 nm | 142.2 nm |
| 外泌體濃度 | 3.20×10 10 | 4.26×10 10 | 1.44×10 10 | 1.48×10 10 |
| D10 | 91.9 nm | 94.9 nm | 92.6 nm | 91.3 nm |
| D90 | 191.8 nm | 197.8 nm | 205.9 nm | 197.5 nm |
| ＜200 nm | 91.90 % | 90.71 % | 88.86 % | 90.93 % |
| ＜100 nm | 18.66 % | 16.27 % | 19.21 % | 18.70 % |
實例
2
包含外泌體群體之外泌體組合物
藉由電泳量測實例1中獲得之UCMSC衍生之外泌體上Alix及CD81之量，且其展示於圖4中。與3 kDa相比，在50 kDa及100 kDa中Alix及CD81降低。
經由奈米粒子追蹤分析，與3 kDa相比，在50 kDa及100 kDa中粒子濃度降低。
UCMSC衍生之外泌體中的穿透電子顯微術(TEM)分析展示於圖6中。
實例
3
外泌體組合物之產生
-
超速離心法
將臍帶間葉幹細胞(MSC)在細胞條件培養基中培養，以達到細胞量1.5×10
6細胞/mL。將培養基在4℃下以350 g離心10分鐘以移除死細胞。將所得上清液進一步在4℃下以2,000 g離心15分鐘以移除細胞碎片。使用0.22 μm過濾器過濾所得上清液以移除細胞凋亡體及小胞。
將12 mL預清除細胞條件培養基以100,000 g超速離心70分鐘。藉由奈米粒子追蹤分析來分析此實例(超速離心法)及實例1 (3 kDa及10 kDa)中外泌體之大小分佈，且其展示於圖7中。結果展示在100 nm至200 nm之間的類似大小分佈。
藉由奈米粒子追蹤分析來分析此實例(超速離心法)及實例1 (3 kDa及10 kDa)中之奈米粒子追蹤分析的參數，且其展示於圖8中。所有粒子之平均大小為約150 nm至160 nm。D90及D10展示在100 nm至200 nm之間的大小分佈。
量測此實例(超速離心法)及實例1 (3 kDa及10 kDa)中獲得之UCMSC衍生之外泌體上的粒子濃度以及Alix及CD81之量，且其展示於圖9中。與10 kDa及超速離心法相比，在3 kDa超濾法中粒子濃度提高。Alix及CD81表現亦在3 kDa中增加。
圖1展示超濾法之耗時結果。
圖2展示實例1中之奈米粒子追蹤分析的結果。
圖3展示奈米粒子追蹤分析之參數。平均大小、D90及D10展示於3 kDa、10 kDa、50 kDa及100 kDa超濾法中。
圖4展示外泌體標記之表現。Alix為外泌體內蛋白質。CD81為外泌體之表面蛋白，與3 kDa相比，在50 kDa及100 kDa中降低。
圖5展示粒子濃度之表現。估計粒子濃度之表現。經由奈米粒子追蹤分析，與3 kDa相比，在50 kDa及100 kDa中粒子濃度降低。
圖6展示UCMSC衍生之外泌體中之穿透電子顯微術(TEM)分析。
圖7展示實例1及實例3中之奈米粒子追蹤分析的結果。
圖8展示實例1及實例3中之奈米粒子追蹤分析的參數。
圖9展示實例1及實例3中之粒子濃度及外泌體標記之表現。
Claims (20)
- 一種外泌體組合物，其包含濃度大於約1×10 9個外泌體/毫升之富集外泌體群體，其中該外泌體組合物係藉由分離及超濾法或超速離心法直接獲得，而非藉由調配獲得。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該組合物中該等外泌體之該濃度大於約1×10 10個外泌體/毫升。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該外泌體組合物包含具有約135 nm至約150 nm之平均粒度的富集外泌體群體。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含具有大於約3 kDa之分子量的外泌體。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含具有大於約10 kDa之分子量的外泌體。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含具有大於約50 kDa之分子量的外泌體。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含具有大於約100 kDa之分子量的外泌體。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含大於約80%之具有小於約200 nm之粒度的外泌體。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含大於約10%之具有小於約100 nm之粒度的外泌體。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含分子量大於約3 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者： 濃度大於約1×10 10個外泌體/毫升； 約90%至約93%之外泌體具有小於約200 nm之粒度； 約16%至約20%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及 平均粒度為約135 nm至約145 nm。
- 如請求項10之外泌體組合物，其中該濃度大於約2×10 10個外泌體/毫升；約92%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約17%至約19%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度在約137 nm至約142 nm範圍內。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含分子量大於約10 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者： 濃度大於約2×10 10個外泌體/毫升； 約90%至約93%之外泌體具有小於約200 nm之粒度； 約14%至約18%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及 平均粒度為約138 nm至約148 nm。
- 如請求項12之外泌體組合物，其中該濃度大於約2.5×10 10個外泌體/毫升；約91%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約15%至約17%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度在約140 nm至約145 nm範圍內。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含分子量大於約50 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者： 濃度大於1.0×10 10個外泌體/毫升； 約85%至約90%之外泌體具有小於約200 nm之粒度； 約15%至約25%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及 平均粒度為約140 nm至約150 nm。
- 如請求項14之外泌體組合物，其中該濃度大於約1.0×10 10個外泌體/毫升；約88.86%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約18%至約20%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度在約142 nm至約148 nm範圍內。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該富集外泌體群體包含分子量大於約100 kDa之外泌體，其具有以下特徵中之一或多者： 濃度大於1.0×10 10個外泌體/毫升； 約88%至約92%之外泌體具有小於約200 nm之粒度； 約15%至約20%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及 平均粒度為約138 nm至約145 nm。
- 如請求項16之外泌體組合物，其中該濃度大於約1.2×10 10個外泌體/毫升；約90.93%之外泌體具有小於約200 nm之粒度；約16%至約19%之外泌體具有小於約100 nm之粒度；及/或平均粒度在約140 nm至約144 nm範圍內。
- 如請求項1之外泌體組合物，其中該等外泌體衍生自幹細胞。
- 一種用於產生如請求項1之外泌體組合物之方法，其包含以下步驟： 在培養基中提供所需量之細胞； 將該培養基離心以移除細胞碎片，且隨後過濾所得上清液以移除細胞凋亡體及小胞； 用具有約3 kDa至約100 kDa之截留分子量的膜對該所得上清液進行超濾法；及 經由將該所得上清液以約6,000 g至約15,000 g離心至少約10分鐘用基於聚合物之沈澱來沈澱外泌體，以獲得包含富集外泌體之該外泌體組合物。
- 一種用於產生如請求項1之外泌體組合物之方法，其包含以下步驟： 在培養基中提供所需量之細胞； 將該培養基離心以移除細胞碎片，且隨後過濾所得上清液以移除細胞凋亡體及小胞； 將該所得上清液以約80,000 g至約12,000 g超速離心約50分鐘至約90分鐘，以獲得包含富集外泌體之該外泌體組合物。
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2024
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