CN104946725A - 一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，涉及珊瑚体内共生细菌的分离。珊瑚样品预处理；制备珊瑚样品匀浆液，过滤后得滤液；在滤液中加入Teepol试剂，混匀，以无菌2216培养液稀释后，涂布于2216固体培养基上培养，在2216固体培养基上生长的菌落即为珊瑚共生细菌。细菌的计数。将固体的珊瑚样品以适当的方法进行匀浆，将匀浆液中的细菌在平板培养基上经若干时间培养形成肉眼可见的菌落，通过计算平板上的菌落数而得知珊瑚样品中共生细菌数。尽可能将珊瑚样品中的细菌匀浆分离出来同时在匀浆过程保持细菌的活力。
Description
技术领域
本发明涉及珊瑚体内共生细菌的分离，尤其是涉及一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法。
背景技术
珊瑚是近岸海域生物多样性的源泉，珊瑚生态系统的健康和完整是近岸生态系统的一个重要屏障。珊瑚体内的共生细菌对珊瑚的健康状态具有举足轻重的作用，分离珊瑚体内共生细菌是了解珊瑚礁体内共生细菌的丰度和群落组成的必须步骤。
现有技术存在以下不足：
文献中对珊瑚体内共生细菌的分析过程多采用分子生物学手段将珊瑚组织整体(含珊瑚虫、共生藻类和细菌)进行基因组的提取后对其中的细菌DNA序列进行比对分析，由于对珊瑚组织整体基因组的提取过程的选择性导致不能将所有细菌尤其是数量较少的细菌的DNA提取出来，同时根据DNA序列的比对分析技术难以在种的水平上鉴别共生细菌，因此基于DNA序列的分析方法只能作为珊瑚共生细菌鉴定的参考手段。对珊瑚礁中的共生细菌的分离和培养是鉴定和深入研究珊瑚共生细菌的有效手段，而目前仍然缺乏有效可行的分离珊瑚共生细菌的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法。
本发明包括以下步骤：
1)珊瑚样品预处理；
2)制备珊瑚样品匀浆液，过滤后得滤液；
3)在滤液中加入Teepol试剂，混匀，以无菌2216培养液稀释后，涂布于2216固体培养基上培养，在2216固体培养基上生长的菌落即为珊瑚共生细菌。
4)细菌的计数。
在步骤1)中，所述珊瑚样品预处理的方法是以无菌蒸馏水冲洗珊瑚样品的表面，将表面的杂物清洗干净，放置在干净的培养皿上晾干。
在步骤2)中，所述制备珊瑚样品匀浆液的具体方法可为：将预处理后的珊瑚样品放入无菌离心管中，加入2216培养液和陶瓷珠，盖好离心管盖，放置在振荡仪中，对离心管中的混合物进行振荡均质处理，得珊瑚样品匀浆液；所述预处理后的珊瑚样品与2216培养液的配比可为(0.2～0.5)g∶1mL，其中，预处理后的珊瑚样品以质量计算，2216培养液以体积计算；所述陶瓷珠的用量可为20～30颗；所述振荡均质处理的条件可为2600rpm下振荡60～80s；
所述过滤的方法可为：将匀浆液倒入装配3.0μm无菌滤膜的预灭菌的过滤器，连接过滤器到真空泵，过滤分离珊瑚骨架；所述无菌滤膜的直径可为25mm；所述过滤器可采用15mL玻璃滤杯；所述真空泵的真空度可＜5MPa。
在步骤3)中，所述Teepol试剂的加入量可为在每毫升滤液中加入10μL Teepol试剂；所述稀释的方法可采用梯度稀释法，将细胞液体分别按原液，10倍和100倍稀释后各取100μL涂布于2216固体培养基上，每个稀释度3个平行培养皿；所述培养可于恒温培养箱25℃温度下培养5～7天；若培养皿上的菌落之间分割不明显或者长成成片的细菌菌落，则说明该培养皿对细菌的分离失败，重复步骤1)～3)，若步骤3)中的稀释倍数需增加一个1000倍稀释梯度，则对珊瑚共生细菌重新进行分离。
在步骤4)中，所述细菌的计数的具体方法可将2216固体培养基上生长出来的单一圆形的细菌菌落的数量进行统计，选择菌落数在30～300个之间的培养皿，以该稀释度3个平行培养皿的平均菌落数乘其稀释倍数，即为该珊瑚样品共生细菌数。
本发明对珊瑚中共生细菌的计数是将固体的珊瑚样品以适当的方法进行匀浆，将匀浆液中的细菌在平板培养基上经若干时间培养形成肉眼可见的菌落(一个菌落代表一个细胞)，通过计算平板上的菌落数而得知珊瑚样品中共生细菌数。本发明的关键是尽可能将珊瑚样品中的细菌匀浆分离出来同时在匀浆过程保持细菌的活力。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
本发明实施例包括以下步骤：
①珊瑚样品预处理
以无菌蒸馏水冲洗珊瑚样品的表面，将表面的杂物清洗干净，放置在干净的培养皿上晾干。
②珊瑚样品的匀浆
准确称取0.2～0.5g珊瑚样品放入2mL无菌离心管中，加入1mL的无菌2216培养液和20～30颗陶瓷珠，盖好离心管盖，放置在振荡仪(IKA，Vortex Genius 3)对离心管中的混合物进行振荡均质处理(振荡设置：2600rpm，振荡时间60～80s)。
③匀浆液的过滤
将匀浆液倒入装配了3.0μm无菌滤膜(millipore，25mm直径)的预灭菌的过滤器(millipore，15mL玻璃滤杯)，连接过滤器到真空泵(Millipore，真空度＜5MPa)，过滤分离珊瑚骨架。
④涂布分离
收集过滤下的滤液，每毫升溶液加入10μL Teepol试剂(Sigma-Aldrich)，混匀。根据滤液中的细菌数量多少，以无菌2216培养液适当稀释滤液。一般采用梯度稀释法，将细胞液体分别按原液，10倍和100倍稀释后各取100μL涂布于2216固体培养基上，每个稀释度3个平行培养皿，于恒温培养箱(Binder，KB53)25℃温度下培养5～7天。5～7天培养完成后，2216固体平板上生长的菌落即为珊瑚共生细菌。
注意：若培养皿上的菌落之间分割不明显或者长成成片的细菌菌落，则说明该培养皿对细菌的分离失败，重复步骤①到④并视情况调整步骤④中的稀释倍数如增加一个1000倍稀释梯度，对珊瑚共生细菌重新进行分离。
⑤细菌的计数
将2216固体培养基上生长出来的单一的圆形的细菌菌落的数量进行统计，选择菌落数在30～300个之间的培养皿，以该稀释度3个平行培养皿的平均菌落数乘其稀释倍数，即为该珊瑚样品共生细菌数。
Claims (10)
1.一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)珊瑚样品预处理；
2)制备珊瑚样品匀浆液，过滤后得滤液；
3)在滤液中加入Teepol试剂，混匀，以无菌2216培养液稀释后，涂布于2216固体培养基上培养，在2216固体培养基上生长的菌落即为珊瑚共生细菌。
4)细菌的计数。
2.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤1)中，所述珊瑚样品预处理的方法是以无菌蒸馏水冲洗珊瑚样品的表面，将表面的杂物清洗干净，放置在干净的培养皿上晾干。
3.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述制备珊瑚样品匀浆液的具体方法为：将预处理后的珊瑚样品放入无菌离心管中，加入2216培养液和陶瓷珠，盖好离心管盖，放置在振荡仪中，对离心管中的混合物进行振荡均质处理，得珊瑚样品匀浆液。
4.如权利要求3所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于所述预处理后的珊瑚样品与2216培养液的配比为(0.2～0.5)g∶1mL，其中，预处理后的珊瑚样品以质量计算，2216培养液以体积计算。
5.如权利要求3所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于所述陶瓷珠的用量为20～30颗。
6.如权利要求3所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于所述振荡均质处理的条件为2600rpm下振荡60～80s。
7.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤2)中，所述过滤的方法为：将匀浆液倒入装配3.0μm无菌滤膜的预灭菌的过滤器，连接过滤器到真空泵，过滤分离珊瑚骨架；所述无菌滤膜的直径可为25mm；所述过滤器可采用15mL玻璃滤杯；所述真空泵的真空度可＜5MPa。
8.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤3)中，所述Teepol试剂的加入量为在每毫升滤液中加入10μL Teepol试剂；所述稀释的方法是采用梯度稀释法，将细胞液体分别按原液，10倍和100倍稀释后各取100μL涂布于2216固体培养基上，每个稀释度3个平行培养皿；所述培养可于恒温培养箱25℃温度下培养5～7天。
9.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤3)中，若培养皿上的菌落之间分割不明显或者长成成片的细菌菌落，则说明该培养皿对细菌的分离失败，重复步骤1)～3)，若步骤3)中的稀释倍数需增加一个1000倍稀释梯度，则对珊瑚共生细菌重新进行分离。
10.如权利要求1所述一种分离并计数珊瑚体内共生细菌的方法，其特征在于在步骤4)中，所述细菌的计数的具体方法是将2216固体培养基上生长出来的单一圆形的细菌菌落的数量进行统计，选择菌落数在30～300个之间的培养皿，以该稀释度3个平行培养皿的平均菌落数乘其稀释倍数，即为该珊瑚样品共生细菌数。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘阳等: "东山湾软珊瑚共附生可培养细菌的多样性和产酶活性鉴定", 《应用海洋学学报》 * |
| 李和阳等: "深圳海域细菌总数及可培养细菌总数的分布及其在环境评价中的应用研究", 《海洋环境科学》 * |
| 管华诗编著: "《中华海洋本草生物 海洋药源微生物》", 31 December 2009 * |
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