WO2019083316A2 - C1 가스 전환효율 향상을 위한 유기물질 기반의 신규 나노유체 소재 - Google Patents

C1 가스 전환효율 향상을 위한 유기물질 기반의 신규 나노유체 소재

Info

Publication number
WO2019083316A2
WO2019083316A2 PCT/KR2018/012813 KR2018012813W WO2019083316A2 WO 2019083316 A2 WO2019083316 A2 WO 2019083316A2 KR 2018012813 W KR2018012813 W KR 2018012813W WO 2019083316 A2 WO2019083316 A2 WO 2019083316A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gas
chitosan
nanofluid
group
acid
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/012813
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2019083316A3 (ko
Inventor
최유성
나정걸
강응수
송우호
Original Assignee
충남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충남대학교 산학협력단 filed Critical 충남대학교 산학협력단
Publication of WO2019083316A2 publication Critical patent/WO2019083316A2/ko
Publication of WO2019083316A3 publication Critical patent/WO2019083316A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/0007—Electro-spinning
    • D01D5/0015—Electro-spinning characterised by the initial state of the material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the invention nanoparticles comprising chitosan and lipid compounds or nano activated carbon to increase the generation fermentation of water promotes the gas consumption rate in the biotransformation process of the microorganism using a C1 gases such as carbon monoxide (CO) and methane (CH 4) And a method for producing the nanofluid.
  • a C1 gases such as carbon monoxide (CO) and methane (CH 4)
  • Cl gas such as carbon monoxide (CO) and methane (CH 4 )
  • CO carbon monoxide
  • CH 4 methane
  • Cl gas has a limited development potential, but its technical limitations have so far limited its use in the field of simple energy recovery by combustion.
  • carbon monoxide the by-product gas, which is mainly generated in the combustion process in many processes, has a limited application in spite of the annual average of 6 tons of emission in Korea.
  • Methane gas is a major component of shale gas, which is distributed around the world and has estimated reserves of about 150 billion tons. It is mainly used for producing heat and power such as cogeneration, fuel cell and boiler heat source, Gas is injected directly into an automobile fuel or a city gas pipe network and is used as natural gas. SMR technology is widely known as a technology for using methane gas as a chemical raw material, and processes for converting methane into synthesis gas and using it as raw materials for various chemical products are being studied. However, these studies also have technical difficulties such as the need to adjust the mixing ratio of the synthesis gas to produce specific chemical raw materials.
  • microorganisms consuming Cl gas are thermophilic -bacteria , Halo-bacteria , Gram-positive bacteria , Methanogenic-bacteria , Methanotrophic bacteria have been found, and unlike microorganisms such as S. cerevisiae or E.
  • the solubility of C1 gas is very low (solubility of carbon monoxide is 20 to 25 mg / L, methane solubility is 15 to 20 mg / L), and even if there are excellent bioconversion strains and catalysts,
  • the carbon consumption rate of C. ljungdahlii a microorganism using carbon monoxide, was 0.22 g carbon / g cell / (0.27 g carbon / g cell / hour) of the S. cerevisiae produced by the present invention .
  • a nanofluid is a fluid containing nanometer-sized particles, and usually refers to a stable dispersion of nanoparticles having a diameter of less than or equal to 100 nm in the fluid. Since it was first reported in 1995, research reports on nanofluids are on the increase. The application range is mainly theoretical analysis related to the improvement of heat transfer efficiency. Recently, the use of nanofluids has increased the mass transfer diffusion coefficient It is reported that the effect can also be expected.
  • studies using nanofluids mainly focus on mineral-based oxides, nitrides, and carbide ceramics, metals, metal oxides, and carbon nanotube-based nanoparticles to improve the mass transfer efficiency of oxygen, ammonia, and carbon dioxide And is applied to various fields such as boiling-phenomena, catalysts, surface-area, convection, mass-transfer, and bio-medical Research is underway.
  • various studies on the gas absorption effect on gas-liquid equilibrium (Vapor-Liquid) have been reported.
  • nanofluids can be utilized to effectively improve heat transfer and mass transfer in a wide variety of fields, there have been few studies on nanofluids applied in biological processes, It is because inorganic nanoparticles of 100 nm or less are known to flow into microbial cells and cause cytotoxicity.
  • mass transfer barrier considering the influx of C1 gas into the cell, it is necessary to control the mass transfer barrier at the gas-liquid interface and the liquid phase as well as the material at the liquid- There is a transmission barrier.
  • C1 gas such as carbon monoxide and methane flows into the cell by simple diffusion at the cell surface
  • various types of cell membranes depending on the strain inhibit the inflow of C1 gas from the outside to the inside of the cell. Therefore, introduction of the nanofluid into the biotransformation process should solve the problem of cytotoxicity due to introduction of the nanofluid, and at the same time, improve the mass transfer efficiency by the conventional nanofluid, There is a further need for measures to eliminate the mass transfer barriers.
  • the present inventors prepared nanofluids containing organic nanoparticles prepared by using lipid compounds or nano-activated carbon, which are expected to interact with cell-friendly chitosan and cell membrane.
  • the present invention is a.
  • the lipid compound is at least one selected from the group consisting of oleic acid, lauric acid, oleamide, erucamide, monoglyceride, and sphingosine,
  • the diameter of the nano-activated carbon is 200 nm or less
  • the method comprising the steps of:
  • the present invention also provides a nanofluid prepared according to the method of manufacturing the nanofluid.
  • the present invention also provides a composition for promoting C1 gas conversion comprising the nanofluid.
  • the present invention also includes a nanofluid comprising at least one lipid compound selected from the group consisting of chitosan and oleic acid, lauric acid, oleamide, erucamide, monoglyceride, and sphingosine, or nanofluids having a diameter of 200 nm or less C1 < / RTI >
  • the present invention also relates to the present invention.
  • the method comprising the steps of:
  • the nanofluid of the present invention makes it possible to efficiently use a gas having a low solubility in water in an aqueous solution, thereby increasing the C1 gas consumption rate of the microorganism using the C1 gas, increasing the productivity of the fermented product, and promoting the cell growth rate.
  • the nanofluids containing the novel organic nanoparticles of the present invention also solve the cytotoxicity problem of nanoparticles of microbial strains in the bioconversion process.
  • FIG. 1A shows a nanofiber prepared by using a mixed solution of chitosan and 0% oleamide.
  • 1B shows nanofibers prepared using a mixed solution of chitosan and 10% oleamide.
  • 1C shows nanofibers prepared using a mixed solution of chitosan and oleamide 50%.
  • FIG. 1D shows a nanofiber prepared by using a mixed solution of chitosan and 100% oleamide.
  • FIG. 1E shows a nanofiber prepared by using a mixed solution of chitosan and oleamide at 200%.
  • FIG. 1F shows a nanofiber prepared by using a mixed solution of chitosan and oleamide 400%.
  • Figure 1g shows the correlation between the amount of oleamide in the chitosan fiber and the average diameter of the nanofibers.
  • FIG. 2 is a graph showing the contact angle of nanofibers prepared using a mixed solution of 10%, 30%, 50%, 100%, and 200% by weight of oleamide relative to the weight of chitosan and chitosan.
  • FIG. 3A shows nanofluids prepared using a mixture solution of chitosan and oleamide having the same weight concentration, and nanoparticles forming nanofluids by scanning electron microscopy.
  • FIG. 3b is a visual observation of the nanofluid produced.
  • FIG. 4A is a graph showing the relationship between the nanoparticle size and the dynamic light scattering when the nanofluid is prepared using the chitosan-oleamide mixed solution in which the concentration of the nanofluid solution is 0.025% Wherein the percentage of oleamide is the percentage of the oleamide weight relative to the weight of the chitosan.
  • 4B is a graph showing the relationship between the size of nanoparticles and the size of the nanoparticles when a nanofluid is prepared using a chitosan-oleamide mixed solution in which the concentration of the nanofluid solution is 0.25% based on the total weight ratio, using dynamic light scattering
  • the percentage of oleamide refers to the percentage of oleamide relative to the weight of chitosan.
  • FIG. 6A is an analysis of the sizes of nanoparticles forming nanofluids in various pH solutions.
  • FIG. 6B is a graph showing the sizes of nanoparticles forming nanofluids in a pH range of 7.0 to 9.0.
  • FIG. 6A is an analysis of the sizes of nanoparticles forming nanofluids in various pH solutions.
  • FIG. 6B is a graph showing the sizes of nanoparticles forming nanofluids in a pH range of 7.0 to 9.0.
  • FIG. 6A is an analysis of the sizes of nanoparticles forming nanofluids in various pH solutions.
  • FIG. 6B is a graph showing the sizes of nanoparticles forming nanofluids in a pH range of 7.0 to 9.0.
  • FIG. 7A shows the average size change of nanoparticles when a nanofluid was prepared by applying surfactant Tween 20 to a chitosan / oleamide mixed solution for electrospinning.
  • FIG. 7B shows the average size change of nanoparticles according to pH change when nanofluids were prepared by introducing surfactant Tween 20 into a chitosan / oleamide mixed solution for electrospinning.
  • FIG. 8A to 8E illustrate changes in zeta potential in various pH solutions when the application method of the surfactant tween 20 is changed in the production of nanofluids.
  • the results show that 100% by weight of oleamide nanofluids and 100% by weight of chitosan.
  • the surfactant Tween 20 is added to the oleamide nanofluid
  • the surfactant tween 20 is added to improve the stability of the nanofiber
  • FIG. 9 is a graph showing changes in particle size according to pH change of a nanofluid prepared by electrospinning and crushing in the same manner as in the chitosan / oleamide nanofluid production method using a mixed solution of chitosan and nano-activated carbon.
  • FIG. 10 shows the difference in cell growth rate when the nanofluid using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution in the prepared nanofluid was applied to Thermococus onnurus NA1, which is a hydrogen producing strain using carbon monoxide. will be.
  • FIG. 11 shows the difference in cell growth rate when the nanofluid using the chitosan / nano-activated carbon mixed solution in the prepared nanofluid was applied to Thermococus onnurus NA1, which is a hydrogen producing strain using carbon monoxide.
  • FIG. 12 shows changes in carbon monoxide consumption when the nanofluid using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution in the prepared nanofluid was applied to Thermococus onnurus NA1, which is a hydrogen producing strain using carbon monoxide .
  • FIG. 13 shows that when the nanofluid using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution in the produced nanofluid was applied to Thermococus onnurus NA1, which is a hydrogen producing strain using carbon monoxide, the production amount of hydrogen as a fermentation product .
  • FIG. 14 shows changes in the amount of formic acid produced when the nanofluid using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution in the prepared nanofluid was applied to acetobacterium woody, a strain producing formic acid using carbon monoxide.
  • FIG. 15 shows that, when the nanofluid using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution in the prepared nanofluid was applied to Gram-negative microorganism DH-1, which grows using methane (CH 4 ) And the growth rate.
  • FIG. 16 shows that when the nanofluid using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution in the prepared nanofluid was applied to the methylhydrocinosporium type 5, which is a methanotrophic bacterium that proliferates using methane (CH 4 ) Indicating the difference in cell growth rate.
  • the present invention provides a method for producing nanofluids comprising nanoparticles prepared by mixing nanoparticles comprising chitosan and a lipid compound or activated carbon.
  • the nanoparticles containing the chitosan and the lipid compound or nanocarbons of the present invention can improve the mass transfer efficiency of gas to microbial cells as a nanofluid composition in an aqueous solution and can be mass-produced in nanofluid form, Can be used to make.
  • the present invention relates to a method for preparing chitosan, comprising the steps of 1) mixing chitosan with a lipid compound or nano-
  • the lipid compound is at least one selected from the group consisting of oleic acid, lauric acid, oleamide, erucamide, monoglyceride, and sphingosine,
  • the diameter of the nano-activated carbon is 200 nm or less
  • the method comprising the steps of:
  • the chitosan of the present invention is a naturally occurring highly safe cationic polysaccharide having the structure of (1- > 4) 2-amino-2-deoxy- beta -D-glucan.
  • Chitosan is a polymer in which a free amine group is formed by deacetylation of chitin obtained from natural crustaceans and the like.
  • the chitosan may have a molecular weight of 1 to 500 kDa and a free amine group of 50% or more, preferably a chitosan having a molecular weight of 150 to 400 kDa and a free amine group of 80% or more, but the present invention is not limited thereto.
  • Soluble chitosan and insoluble chitosan and chitosan derivatives in which the molecules of chitosan are changed can be included in the category of chitosan of the present invention in view of solubilization of chitosan, and water-soluble chitosan can be preferably used.
  • the water-soluble chitosan may be at least one selected from chitosan HCl, chitosan acetate, chitosan glutamate, and chitosan lactate.
  • Water-soluble chitosan is soluble in water because amine groups in the molecular structure form salts with hydrochloric acid or acidic substances such as acetic acid, glutamic acid, and lactic acid. Water-soluble chitosan has advantages such as easy removal of foreign substances.
  • chitosan having the same molecular structure may be included in all of them without limitation.
  • the lipid compounds of the present invention refer to lipids reported to have antimicrobial activity and lipid derivatives functionally similar thereto.
  • Preferred are fatty acids having aliphatic residues between 6 and 18 carbon atoms, such as oleic acid and lauric acid, oleamide, erucamide and fatty alcohols,
  • fatty acids having aliphatic residues between 6 and 18 carbon atoms such as oleic acid and lauric acid, oleamide, erucamide and fatty alcohols
  • lipid compounds and derivatives thereof such as fatty acid derivatives or monoglycerides and sphingosine, more preferably oleamides and erucamides, even more preferably those having structural homology with oleamides.
  • the nano-activated charcoal of the present invention means activated carbon having a diameter of 200 nm or less, which is a material having a strong adsorption property and most constituent materials being carbon.
  • the method for producing a nanofluid of the present invention comprises the steps of 1) mixing a chitosan with a lipid compound or nanotubes.
  • the organic solvent includes trifluoroacetic acid (HFA), hexafluoroisopropanol (HFIP), hexafluoropropanol (HFP), etc.
  • the acidic solvent includes acetic acid, hydrochloric acid and the like.
  • a mixed solvent of TFA and HFIP is preferable.
  • the concentration of the lipid compound dissolved in the solvent may be 10% to 400% (w / v), preferably 100% (w / v) relative to chitosan.
  • the mixing temperature is preferably 40 to 60 DEG C, more preferably about 50 DEG C. [ It is desirable to perform the sonication at the time of mixing, so that the viscosity of the solution can be reduced.
  • the nanofluid production method of the present invention includes the step of 2) preparing nanofibers by electrospinning a solution prepared by mixing in the first step.
  • Electrospinning is a technique of forming fibers by using electrical attraction and repulsion generated when a polymer solution or molten polymer is charged to a predetermined voltage.
  • the electrospinning process is capable of producing fibers with various diameters of several nanometers to several thousands of nanometers, has a simple equipment structure, is applicable to a wide range of materials, and has an advantage in mass production.
  • the chitosan and the lipid compound may be dissolved in an organic solvent alone or in a mixed solvent of an organic solvent and an acidic solvent.
  • the spinning process can be performed using an appropriate spinning device while applying at the appropriate voltage.
  • the voltage applied during the spinning process may be set within the range of 10 to 40 kV, more preferably 20 to 30 kV, so that a stable spinning process can be performed.
  • the spraying rate is preferably 0.2 ml / hour to 0.9 ml / hour, more preferably 0.4 ml / hour to 0.8 ml / hour.
  • the method according to the present invention may further comprise drying the produced nanofibers.
  • the method for producing a nanofluid of the present invention comprises the step of 3) crushing the prepared nanofiber in an aqueous solution having a pH of 9 or less.
  • the nanoparticles produced by the crushing step are nanoparticles capable of forming a nanofluid by retaining a dispersed phase in an aqueous solution.
  • the chopped nanoparticles comprise chitosan and a functional equivalent chitosan composition, a lipid compound and a functionally similar lipid derivative Nanoparticles produced by organic materials.
  • the nanoparticles contained in the produced nanofluids preferably have an average diameter of 200 nm or less.
  • the prepared nanofibers are pulverized by using an ultrasonic pulverizer or a high-pressure pulverizer in order to suspend them in an aqueous solution.
  • the aqueous solution may be distilled water or an aqueous solution having a pH of 9 or less. It may also be a buffer solution containing various electrolyte cell culture components suitable for the process.
  • the pulverized aqueous solution can be used by diluting the nanofluid containing the dispersion of nanoparticles directly or in an appropriate concentration with a cell culture medium.
  • the surfactant may be further included in the third step.
  • the surfactant that may be included is the same as the list of surfactants that may be included in the second step.
  • the present invention provides a nanofluid prepared by the above-described method.
  • the present invention also provides a composition for accelerating the conversion of a C1 gas comprising a nanofluid produced by the above production method.
  • the composition according to the present invention makes it possible to efficiently use a gas having a low solubility in water in an aqueous solution, thereby increasing the C1 gas consumption rate of the microorganism using the C1 gas, increasing the productivity of the fermented product, and promoting the cell growth rate.
  • the nanofluids containing the novel organic nanoparticles of the present invention also solve the cytotoxicity problem of nanoparticles of microbial strains in the bioconversion process.
  • the C1 gas may be any one selected from the group consisting of carbon monoxide, carbon dioxide, and methane.
  • composition of the present invention may be characterized as being active at room temperature and high temperature, preferably at 0 ° C to 100 ° C, more preferably at 20 ° C to 100 ° C, even more preferably at 20 ° C to 80 ° C .
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nanofluid comprising a chitosan and at least one lipid compound selected from the group consisting of oleic acid, lauric acid, oleamide, erucamide, monoglyceride, A composition for promoting gas conversion is provided.
  • the composition of the present invention can be utilized in a dispersed phase at room temperature and high temperature, and is preferably used at 0 ° C to 100 ° C, more preferably at 20 ° C to 100 ° C, even more preferably at 20 ° C to 80 ° C.
  • composition of the present invention can be utilized under various pH conditions, preferably pH 2 to pH 9, more preferably pH 2 to pH 7.
  • the composition of the present invention can be used without limitation to a microorganism using a by-product gas generated upon combustion.
  • the microorganisms using the C1 gas of the present invention as a carbon source or an energy source include microorganisms using Cl gas (carbon monoxide, carbon dioxide, methane), more preferably Gram-negative bacteria using Cl gas, Gram-positive bacteria, Archaea , Thermophilic- bacteria, Halobacteria , Methanogenic- bacteria, Methanotrophic- bacteria, Acetic acid-producing bacteria, Acetogenic- bacteria and Hydrogenic bacteria may be included, and more preferably, Methanotrophic bacteria, Acetogenic- bacteria and Hydrogenic bacteria may be included.
  • the methanotrophic bacteria of the present invention may be selected from the group consisting of Methylomonas sp. DH-1, Methylosinus sporium type 5, Methylosinus tricosporium OB3b Methylosinus tricosporium OB3b, Methylomicrobium alcaliphilum 20z, Methylococcus capsulatus, Methylosphaera hansonii, Methylomicrobium agile, , library bakteo micro emptying album as methyl (Methylomicrobium album), methyl hwiten (Methylobacter whittenburyi), bakteo base Proteus (Methylobacter luteus), bakteo binel randiyi (Methylobacter vinelandii) to bakteo Vorbis (Methylobacter bovis) methyl, methyl, Methylomicrobium pelagicum, Methylomicrobium sporium,
  • Acetogenic bacteria of the present invention include Acetobacterium woodii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans P7, Clostridium carboxydivorans P7, (Clostridium ljungdahlii), no Pasteurella Thermo acetoxy urticae (Moorella thermoacetica), oil cake Te Solarium remote island (Eubacterium limosum), carboxy diborane lance (carboxidivorans), oxo bakteo pen nigiyi (Oxobacter pfennigii), pepto streptococcus a production tooth (Peptostreptococcus but are not limited to, productus , Acetobacterium woodii, Butyribacterium methylotrophicum, Methanosarcina acetivorans, Moorella thermoautotrophica, Desulfotomaculum kuznetsovii, Desulfotomaculum thermobenzikum (Desulfoto maculum
  • the Hydrogenic bacteria may be selected from the group consisting of Rubrivivax gelatinosus, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Citrobacter sp Y19, There may be mentioned, for example, Moorella AMP, Carboxydothermus hydrogenoformans, Carboxydibrachium pacificus, Carboxydocella sporoproducens, Carboxydosella thermoautos, The present invention relates to a medicinal composition containing at least one compound selected from the group consisting of Carboxydocella thermoautotrophica, Thermincola carboxydiphila, Thermolithobacter carboxydivorans, Thermosinus carboxydivorans , Desulfotomaculum carboxydivorans ), Thermococcus strain AM4 (Thermococcus strain AM4), Thermococcus onnulinus (Thermococcus onnurineus) , but the
  • Microorganism using said C1 gas as a carbon source or energy source is most preferably carbon monoxide (CO) and methane (CH 4)
  • CO carbon monoxide
  • CH 4 methane
  • Thermo nose kusu Onnuri Taunus NA1 Thermococcus onnurineus NA1
  • acetonitrile tumefaciens woodiyi Acetobacterium use. Woodii
  • Methylomonas sp. DH-1 and Methylosinus sporium Type-5 can be applied.
  • the present invention relates to: 1) a step of dividing and culturing microorganisms using C1 gas as a carbon source or an energy source; And
  • C1 gas from bio-methanol (CH 3 OH), bio-hydrogen (H 2), propanol (C 3 H 6 OH), acetic acid (Acetic acid), succinic acid (Succinic aicd), maleic Maleic acid, and formate.
  • CH 3 OH bio-methanol
  • H 2 bio-hydrogen
  • C 3 H 6 OH propanol
  • acetic acid Acetic acid
  • succinic acid succinic acid
  • maleic Maleic acid and formate.
  • the present invention is not limited thereto, and any compound which is not included in the compound may be further obtained.
  • the C1 gas conversion method of the present invention includes 1) a step of dividing and culturing microorganisms using C1 gas as a carbon source or an energy source.
  • the culture of the microorganism can be cultured under any medium condition in which the normal stomach microorganism is viable.
  • the C1 gas conversion method of the present invention includes the step of 2) administering the nanofluid of claim 8 to the microorganism cultured in the first step.
  • the nanofluid In the step of administering the nanofluid to the cultured microorganism, it is preferable to administer the nanofluid to a final concentration of 0.0001 to 0.01% (w / v).
  • the C1 gas conversion method of the present invention includes 3) performing a C1 gas conversion reaction by injecting a C1 gas.
  • the injection of the C1 gas may be the injection of the C1 gas itself, or a mixed gas of the C1 gas and the nitrogen gas.
  • microorganism using the C1 gas of the present invention as a carbon source or an energy source is the same as the list of microorganisms defined as a microorganism using the C1 gas as defined above as a carbon source or an energy source.
  • Example 1 Fabrication of nanofibers by electrospinning using chitosan and oleamide
  • the medium chain length (Sigma) was mixed with TFA / HFIP mixed solution at a ratio of 8: 2 by volume of TFA (Trifluoroacetic Acid) and HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2- was added to a glass vial such that the weight ratio of echitosan was 6.5% of the weight of the mixed solution.
  • TFA Trifluoroacetic Acid
  • HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-
  • the oleamide was then added to the glass vial at various ratios to the weight of the chitosan.
  • the glass bottle containing the solution was placed in a water bath set at 50 DEG C and subjected to sonication for 30 to 90 minutes so as to reduce the viscosity of the solution in the glass bottle.
  • the solution with reduced viscosity was stirred with a magnetic bar at 60 to 90 rpm for about 12 to 24 hours.
  • the prepared solution was transferred to a 5 ml syringe having a diameter of 12.46 mm, and then a metal needle having a diameter of 0.5 mm was bonded and applied to the electrospinning. Thereafter, the distance between the metal needle and the collectors was fixed at 15.9 cm, and the electrospinning was conducted at a relative humidity of less than 30% and at a temperature of 20 to 35 ° C.
  • the voltage at the time of electrospinning is set at 20 kV to 30 kV, the feed rate is controlled at 0.4 ml / hr to 0.8 ml / hr, and the uniformity in the collector plate for 5 to 12 hours depending on the amount of the prepared solution Of the nanofibers were recovered.
  • the recovered nanofibers were dried for one day to two days or at a vacuum dryer at 65 ° C for one day in a humidity-free reagent control stand.
  • the results of production of nanofibers analyzed by a scanning electron microscope (SEM) are shown in FIGS. 1A to 1G.
  • FIG. 2 shows the degree of hydrophilicity of the nanofibers as the oleamide content of the chitosan nanofibers is increased.
  • the nanofiber prepared in Example 1 was added in an amount of 0.01 g to 1 g to a 50 ml Falcon Tube containing 10 ml of the third distilled water according to the required nanofluid concentration, To 60%, operation time: 3 seconds, non-operation time: 3 seconds, and then crushed for 20 to 30 minutes.
  • FIGS. 3A and 3B show the results of observation of nanoparticles contained in a nanofluid prepared by disrupting nanofibers containing 100% oleamide relative to chitosan by a scanning electron microscope, and the nanoparticles dispersed in nanofluids in an aqueous solution .
  • FIG. 4A and 4B are graphs showing the relationship between the sizes of the nanoparticles containing the nanoparticles and the nanoparticles when the nanofluids were prepared in distilled water using 0.025% and 0.25% concentration of chitosan oleamide mixed solution, respectively, using dynamic light scattering The results of the analysis are shown. When the Zeta Potential of the nanoparticles was analyzed, it was confirmed that the dispersed phase was stable at a value of 40 mV or more (FIG. 5).
  • the particle size of the nanofluid prepared in distilled water was analyzed by dynamic light scattering method. As shown in FIGS. 6A and 6B, when the pH of the chitosan / oleamide nanoparticles was below 7, the size of the nanoparticles remained stable at a level below 100 nm. However, when the pH of the chitosan / oleamide nanoparticles was changed to a basic condition exceeding pH 7, coagulation rapidly occurred Respectively.
  • Example 3 Preparation of nanofluids using a mixture solution of chitosan and nano-activated carbon
  • nanofluids could be prepared by stably dispersing nano-sized activated carbon, which is known to exhibit a variety of gases and strong adsorption ability, in an aqueous solution.
  • nanotubes having a particle size of 200 nm or less which are commercially available, were used to prepare a mixed solution of chitosan and activated carbon, and the nanofibers were prepared by electrospinning the nanotubes, and the nanoparticles were dispersed in a similar manner .
  • the dispersion phase was stably maintained at a pH of 8 or less, and in the pH region larger than pH 8, the particle size of the dispersed phase (Fig. 9).
  • Example 4 Thermococus Onnurinus NA1 ( Thermococcus onnurineus Comparison of CO consumption / hydrogen production / cell growth rate analysis using nanofluids for NA1
  • the nanofluid using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution and the chitosan / nano-activated carbon mixed solution in the prepared nanofluid were applied to Thermococus onnurus NA1, which is a hydrogen producing strain using carbon monoxide , And how the cell growth rate / CO consumption / hydrogen production changes according to the applied nanofluid concentration as compared with that of the thermococcus onninus NA1 strain itself.
  • the cell growth rate of the Thermococus onnulinus NA1 strain was increased in the NM1 medium to which the nanofluids and the chitosan / nano-activated carbon mixed solution were applied using the chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution I could confirm.
  • the amount of carbon monoxide consumption and the amount of hydrogen production of the Thermococcus onninus strain NA1 in the NM1 medium to which nanofluids containing nanoparticles prepared by mixing chitosan / oleamide / tween 20 were applied were also compared with the control group.
  • Example 5 Acetobacterium woody applied with nanofluid ( A.woodii ) Formal Productivity of CO Using CO
  • a microorganism culture medium prepared in a container for example, a glass serum bottle located inside the anaerobic chamber was prepared and dispensed.
  • a container for example, a glass serum bottle located inside the anaerobic chamber
  • the medium prepared in the anaerobic chamber was dispensed into each 100 ml glass serum bottle in a volume of 40 ml, and then Gram-positive bacteria, Acetobacterium woody, were dispensed, And sealed with a rubber stopper and an aluminum seal.
  • the absorbance (OD 600 ) at 600 nm was measured using a UV-spectrometer, and when it reached 1.5 or more, the concentration of acetobacterium woody
  • the cells were transferred from the chamber to a 50 ml Falcon tube, sealed, and then the medium and microorganisms were separated using a centrifuge at 11.300 g and 4 ° C for 10 minutes.
  • the microorganism Acetobacterium woodyman was recovered And then washed twice with imidazole buffer (50 mM imidazole, 20 mM MgSO 4, 20 mM KCl, 4 mM DTE, pH 7.0) in the anaerobic chamber. Subsequently, the microorganisms recovered together with 10 ml of the imidazole buffer containing 20 mM NaCl and 30 ⁇ M ETH2120 in an anaerobic condition were dispensed into a 50 ml glass serum bottle at a concentration of 1 mg / ml, Was added in such a manner that final concentrations thereof were 0.045% and 0.1% (w / v), respectively.
  • imidazole buffer 50 mM imidazole, 20 mM MgSO 4, 20 mM KCl, 4 mM DTE, pH 7.0
  • the container was sealed with a rubber stopper and an aluminum seal, and a 3 mL syringe needle was inserted into one side of each sealed 50 mL glass serum bottle to introduce nitrogen (N 2 ) gas and carbon monoxide (CO) gas was charged at a rate of 100 cc / min in a mixed gas at a ratio of 1: 1 for 10 minutes. Then, the syringe needle was carefully removed, and the reaction was continued for 24 hours in a 37 ° C shaking incubator while maintaining the inner anaerobic state of the glass serum bottle. High performance liquid-chromatography (HPLC) was then used to compare the amount of formic acid produced. The column used for the analysis was Hi-Plex H (7.7 * 300 mm 8 um, UV 210 nm) .
  • the amount of formic acid produced when the nanofluid was used was significantly increased compared to the control.
  • Example 6 Pseudomonas genus as methyl (Methylomonas sp.) When nanofluids are applied to DH-1 cell Growth rate comparison
  • Example 3 10 ml of each of the nanofluids prepared in Example 3 was added to a 50 ml nanofluid Falcon tube using a chitosan / oleamide / tween 20 mixed solution. Then, 10 ml of each of the nanofluids was irradiated with ultraviolet rays (UV) And sterilized for 30 minutes to 2 hours.
  • UV ultraviolet rays
  • a 5 ml syringe needle was inserted into one side of each 500 ml flask containing the nanofluid, and a mixed gas of methane (CH 4 ) gas and air gas (6: 4) was fed at a rate of 300 cc / min After incubation for 8 minutes and 30 seconds, the cells were incubated at 32 ° C for a certain period of time. Cell viability was measured by measuring the absorbance at 600 nm using a spectrophotometer.
  • CH 4 methane
  • Example 7 Methylosynthosporium type -5 ( Methlylosinus sporium . Type-5) when the nanofluid is applied to the cell growth rate analysis
  • the sterilized nanofluid was then fed into the 500 ml flask at 1 ml to a final concentration of 0.001%, 0.0025%, 0.005%, 0.01% (w / v) in the solution.
  • 1 ml of sterilized water was added to adjust the volume to 50 ml. Thereafter, the inlet of the 500 ml flask was closed using a rubber stopper and a flask cap.
  • a 5 ml syringe needle was inserted into one side of each 500 ml flask containing the nanofluid, and a mixed gas of methane (CH 4 ) gas and air gas (6: 4) was fed at a rate of 300 cc / min After incubation for 8 minutes and 30 seconds, the cells were incubated at 32 ° C for a certain period of time, and then the absorbance was measured at 600 nm using a spectrophotometer to confirm the cell growth rate.
  • CH 4 methane
  • the methylosynthosphosphereum type -5 of the control group showed a maximum growth of 34% in the concentration of the nanofluids.
  • the cell growth was improved in comparison with the control group because methane gas was not provided in addition to the methane gas, which is considered to be due to consumption of methane gas.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 일산화탄소(CO)와 메탄(CH4)과 같은 C1 가스의 생물전환 공정에서 물질 전달 효율을 향상시키기 위한 유기물질 기반의 나노입자 및 이에 의해 형성된 나노유체에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 유기 나노입자를 포함하는 나노유체는 물에 용해도가 낮은 가스를 수용액에서 효율적으로 사용할 수 있도록 하여, 생물전환공정에서 미생물 균주가 나노입자의 세포독성 문제를 극복하면서 미생물이 가스를 이용하여 생물전환 생성물을 얻는 데 유용하게 이용할 수 있다. 또한 본 발명의 신규한 유기물질 기반 나노유체는 다양한 미생물전환 세포배양 배지에 적용될 수 있으며, 세포 성장률을 향상시키고 세포의 기체 가스의 사용량을 증가시킬 것으로 기대되어 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

C1 가스 전환효율 향상을 위한 유기물질 기반의 신규 나노유체 소재
본 발명은 일산화탄소(CO)와 메탄(CH4)과 같은 C1 가스를 이용하는 미생물의 생물전환 공정에서 가스 소모 속도를 촉진시켜 발효물의 생성을 증대시키는 키토산과 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 포함하는 나노입자를 포함하는 나노유체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
일산화탄소(CO)와 메탄(CH4)과 같은 C1 가스는 막대한 개발 잠재력에도 불구하고 기술적 한계로 현재까지 단순한 연소에 의한 에너지 회수분야에서는 그 사용이 제한되어 왔다. 일산화탄소의 경우, 많은 공정에서 연소 시 주로 발생하는 부산물 가스로 그 배출량이 한국 연평균 6톤에 달함에도 불구하고, 응용 방안이 제한되고 있다.
특히, 화학공정의 경우, DME 생산기술, 피셔-트로프(Fischer-Tropsh) 공정과 같은 전통적으로 잘 알려진 화학공정에서 합성가스로부터 디메틸에테르나 알킬 탄화수소 등을 생산하는 방법을 위주로 연구가 이루어 졌으나, 이는 고온, 고압의 시스템을 이용한 간접 전환기술에 해당하며, 에너지 절감 측면에서는 큰 이점을 보기 어렵다는 한계가 존재한다. 또한 기술적 한계로 부산물 가스 내에 포함된 불순물들로 인해 촉매가 불활성화 되는 등의 문제가 발생함에 따라 단순 에너지 회수를 위한 연소가스 포집 방안에 대해 연구가 진행되고 있다.
메탄가스는, 세계 각 지역에 골고루 분포되어 있고 추정 매장량이 약 1,500억톤에 이르는 셰일가스의 주성분으로, 현재 열병합발전, 연료전지 및 보일러 열원과 같은 열 및 전력을 생산하는 데에 주로 이용되거나, 메탄가스를 자동차 연료 또는 도시가스 배관망에 직접 주입하여 천연가스로 사용되고 있다. 메탄가스를 화학원료로 사용하기 위한 기술로서 SMR 기술이 널리 알려져 있으며, 메탄을 합성가스로 전환하여 이를 다양한 화학제품의 원료로 사용하는 공정이 연구되고 있다. 하지만, 이러한 연구 또한 특정 화학원료를 제조하기 위해서는 합성가스의 혼합비를 조절해야 하는 등의 기술적 난점이 있다. 반면, C1가스를 이용하는 생물학적 전환 공정의 경우, 이론적으로 생물체를 이용하는 단순한 경로를 이용하여 C1가스를 저온, 저압 조건의 공정에서 직접 전환하고, 투입 가스의 조성 및 투입가스에 포함된 불순물의 영향을 거의 받지 않으며 생성물의 선택성이 높지만, 현 단계에서는 반응속도가 매우 느려 산업적으로 활용되기에는 생산성이 낮다는 문제점이 있다.
최근에는 특이적 대사과정을 통해 C1가스를 소모하는 박테리아, 고세균 및 미세조류를 활용한 바이오에너지 및 화학원료 기술 개발에 관한 연구가 이루어지고 있다. 특히, C1 가스를 소모하는 미생물들은 호열성 세균(Thermophilic-bacteria), 호염성 균주(Halo-bacteria), 그람-양성균(Gram-positive bacteria), 메탄 생산균(Methanogenic-bacteria), 메탄자화균(Methanotrophic-bacteria) 등이 발견되었는데, 이들은 당분을 기질로 하여 증식을 하거나 발효시키는 사카로마이세스 세레비지에(S.cerevisiae) 또는 대장균(E.coli)과 같은 미생물들과 달리, 특이적으로 C1가스 또는 연소 시 배출되는 부산물 가스인 일산화탄소(CO), 이산화탄소(CO2), 메탄(CH4), 프로판(C3H8) 등을 이용하여 산업적으로 가치 있는 바이오 메탄올(CH3OH), 바이오 수소(H2), 프로판올(C3H6OH), 아세트산(Acetic acid), 숙신산(Succinic aicd), 말레산(Maleic acid), 포름산(Formate) 등의 다양한 원료를 생산한다. 따라서, C1가스 또는 연소 시 발생하는 부산물 가스를 이용하는 미생물에 대한 연구는 근래 생물 공정(Bio-Engineering)에서의 이용 방안을 초점으로 활발하게 이루어지고 있으나, 부산물 가스 혹은 C1가스를 이용하는 생물학적 전환 기술의 큰 문제점은 1) 반응기 내 C1가스 혹은 부산물 가스의 액상 내에서 용해도가 낮고 2) 물질 전달효율(KLa)이 낮으며 3) C1가스 혹은 부산물 가스를 이용하는 미생물의 생장 속도 및 발효 속도가 매우 느리다는 것이며, 이러한 단점은 크게 부각된다.
따라서, C1가스 혹은 부산물 가스를 이용하는 미생물의 생장 속도 및 생산성 개선을 위해 세포 재순환, 막 반응기 등 다양한 고농도 세포배양 방법이 제시되고 있으나, 실질적으로 규모 확장을 통한 공정으로의 응용에 있어, C1가스 혹은 부산물 가스를 이용하는 미생물의 경우 물질 전달 효율이 미생물의 생장 농도와 발효물의 생성 속도에 가장 크게 영향을 미치므로 물질 전달 효율의 개선 없이는 실제 공정으로의 도입이 매우 어려운 상황이다.
공정에 있어서, C1 가스의 용해도가 매우 낮아(일산화탄소의 용해도 20~25 mg/L, 메탄의 용해도 15~20 mg/L), 우수한 생물전환 균주나 촉매가 있더라도, C1 가스의 반응기 내 물질 전달을 향상시킬 수 있는 공정 기술이 없는 상태에서는 생산성 향상에 있어 근본적 한계가 존재한다. 실제로 미국 아칸사스 대학의 개디(Gaddy) 교수의 연구 결과에 따르면, 일산화탄소를 이용하는 미생물인 클로스트리디움 륭달리(C. ljungdahlii)의 탄소소모속도는 0.22 gcarbon/gcell/시간으로, 바이오에탄올을 생산하는 사카로마이세스 세레비지에(S.cerevisiae)의 탄소소모속도(0.27 gcarbon/gcell/시간)와 비교하여 크게 떨어지지 않는다.
근래 세포 재순환, 막 반응기 등 다양한 고농도 세포배양 방법이 제시되고 있으나, 물질 전달 기술의 미비로 세포 활성의 완벽한 발휘는 어려운 것으로 알려져 있다. 이러한 맥락에서 현재 기체-액체 시스템에서의 물질 전달 개선 방안에 대해서는 주로 기체-액체 시스템에서의 물질 전달 효율을 향상시키기 위한 기술개발이 주로 이루어지고 있으며, 기체-액체 시스템 내에서 물질 전달을 향상시키기 위한 방안으로는 1)미세 기포를 안정적으로 생성하고, 2)기체 및 액체의 유속을 증가시키고, 3) 특정한 용매의 사용이나 고압으로 기체의 용해도를 증가시키며, 4)kLa 향상에 의한 기체-액체 간 물질 전달 속도를 증가시키는 전략을 바탕으로 연구가 진행되고 있다. 특히 최근에는 공정 시스템의 개선 및 발효기의 물질 전달 효과 개선에 대한 시도는 많았으나, 높은 설치 비용과 반응기 작동에 들어가는 에너지 절감 효율 감소라는 단점이 있으므로, 적은 양으로도 경제적으로 물질 전달 계수 및 용해도를 향상시킬 수 있는 잠재력을 지닌 나노입자를 도입한 나노유체(Nanofluid)의 활용에 대한 연구가 이루어지고 있다.
나노유체란 나노미터 크기의 입자를 포함하는 유체로, 통상적으로 유체에 직경이 100 nm 보다 작거나 비슷한 수준의 나노입자들이 안정적으로 분산되어 있는 것을 말한다. 1995년 처음 보고된 이래로 나노유체를 주제로 한 연구보고가 증가하는 추세이며, 적용범위는 주로 열전달 효율의 향상과 관련된 이론적 해석이 중심이며, 최근에는 나노유체의 사용이 물질 전달 확산계수를 증가시키는 효과도 기대할 수 있다는 점이 보고되고 있다. 구체적으로 나노유체를 이용한 연구는 대부분 무기물 중심의 산화물, 질화물 및 카바이드 세라믹스, 금속, 금속산화물 및 탄소나노튜브 기반 나노입자를 활용하여, 산소, 암모니아 및 이산화탄소의 물질 전달 효율을 향상시키는 연구가 주로 진행되며, 보일러 현상(Boiling-phenomena), 촉매(Catalyst), 계면 영역(Surface-Area), 대류(Conductivity), 물질 전달(Mass-Transfer), 및 생체 약품(Bio-Medical) 등의 다양한 분야에 걸쳐 연구가 진행되고 있다. 물질 전달의 측면에서, 기체-액체 평형(Vapor-Liquid)에서의 기체의 용해도 향상 효과(Gas absorption)에 대한 여러가지 연구 결과가 보고되어 왔으며, 물질 전달이 향상되는 이유에는 여러 가설이 존재하지만, 그 중 가장 유력한 가설의 종류로서 1) 나노유체에 의한 기포 크기의 감소, 2) 나노유체에 의한 기체-액체 계면의 두께 감소, 3) 나노유체를 이루는 나노입자 표면에서 C1 가스 흡착/탈착에 의한 운반 효과, 4) 나노입자의 추가적인 대류 확산에 의한 액상에서의 물질 전달 등이 있다.
상기한 바와 같이, 나노유체는 매우 다양한 분야에서 열 전달 및 물질 전달을 효과적으로 개선하기 위하여 활용될 수 있음에도 불구하고, 생물 공정 분야에 적용되는 나노유체에 관한 연구는 거의 보고된 바 없는데, 이는 대부분의 100 nm 이하의 무기물 중심 나노입자는 미생물의 세포 내부로 유입되어 세포독성을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 또한, C1 가스 생물전환 공정의 물질 전달 측면에 있어서, 세포 내부로의 C1 가스 유입을 고려할 때, 기체-액체 계면 및 액상에서의 물질 전달 장벽 뿐만 아니라 세포 표면에서 형성되는 액체-고체 계면에서의 물질 전달 장벽이 존재한다. 일산화탄소 및 메탄과 같은 C1 가스는 세포 표면에서 단순 확산에 의해 세포 내부로 유입되므로, 균주에 따른 다양한 형태의 세포막이 세포 외부에서 내부로 C1 가스가 유입되는 것을 억제할 것으로 판단된다. 따라서, 생물전환 공정으로의 나노유체의 도입은 무엇보다 나노유체 도입에 의한 세포독성 문제가 해결되어야 하고 동시에, 통상적인 나노유체에 의한 물질 전달 효율을 향상시킬 수 있고, 세포 표면의 액체-고체 계면에서 물질 전달 장벽을 해소할 수 있는 방안이 추가적으로 요구된다.
이러한 측면에서, C1 가스 전환 공정에 활용되는 미생물 균주에 세포독성을 유발하지 않으면서 통상적인 나노유체에 기대할 수 있는 물질 전달 효율을 향상시킴과 동시에, 액체-고체 계면의 물질 전달 장벽을 극복하여 C1 가스 생물전환 공정에서 물질 전달 효율을 향상시킬 수 있는, 나노유체를 이루는 새로운 나노입자를 제조하고 이를 이용하여 형성된 나노유체를 생산할 수 있는 새로운 방법을 제공할 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 세포에 친화적인 키토산 및 세포막과 상호작용을 할 것으로 기대되는 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 이용하여 제조한 유기나노입자를 포함하는 나노유체를 제조하였다.
본 발명의 목적은 세포에 친화적인 유기나노입자를 포함하는 나노유체를 제조하여, 통상적으로 알려진 나노유체의 세포독성문제를 극복하는 동시에 액상 배지 내에서 가스의 물질 전달 효율과 미생물 균주의 가스 활용(uptake) 효율을 향상시킬 수 있는 나노유체 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은
1) 키토산과 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 혼합하는 단계,
여기서 지질 화합물은 올레산, 라우릭산, 올레아미드, 에루카미드, 모노글리세라이드, 스핑고신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이고,
나노 활성탄의 직경은 200 nm 이하이며;
2) 제1단계에서 혼합하여 제조된 용액을 전기방사법에 의해 나노섬유를 제조하는 단계; 및
3) 제조된 나노 섬유를 pH 9 이하의 수용액에서 파쇄하는 단계;
를 포함하는, 나노유체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 나노유체의 제조방법에 따라 제조된 나노유체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 나노유체를 포함하는 C1가스 전환 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 키토산과 올레산, 라우릭산, 올레아미드, 에루카미드, 모노글리세라이드, 스핑고신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 지질화합물 또는 직경 200 nm 이하 나노 활성탄을 포함하는 나노유체를 포함하는 C1가스 전환 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한
1) C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물을 분주하여 배양하는 단계; 및
2) 제1단계에서 배양된 미생물에 제8항의 나노유체를 투여하는 단계; 및
3) C1가스를 주입하여 C1가스 전환 반응을 수행하는 단계;
를 포함하는 C1가스 전환 방법을 제공한다.
본 발명의 나노유체는 물에 대해 용해도가 낮은 가스를 수용액에서 효율적으로 사용할 수 있게 하여 C1 가스를 이용하는 미생물의 C1 가스 소모율을 증가시키고 발효물의 생산성을 증가시키며 세포 생장속도를 촉진한다. 또한 본 발명의 신규한 유기나노입자를 포함하는 나노유체는 생물전환 공정에서 미생물 균주의 나노입자에 대한 세포독성 문제를 해결한다.
도 1a은 키토산과 올레아미드 0%의 혼합용액을 이용하여 제조한 나노섬유를 나타낸 것이다. 도 1b는 키토산과 올레아미드 10%의 혼합용액을 이용하여 제조한 나노섬유를 나타낸 것이다. 도 1c는 키토산과 올레아미드 50%의 혼합용액을 이용하여 제조한 나노섬유를 나타낸 것이다. 도 1d는 키토산과 올레아미드 100%의 혼합용액을 이용하여 제조한 나노섬유를 나타낸 것이다. 도 1e는 키토산과 올레아미드 200%의 혼합용액을 이용하여 제조한 나노섬유를 나타낸 것이다. 도 1f는 키토산과 올레아미드 400%의 혼합용액을 이용하여 제조한 나노섬유를 나타낸 것이다. 도 1g는 키토산 섬유 내의 올레아미드의 양과 나노 섬유의 평균 직경과의 상관관계를 나타낸 것이다.
도 2는 키토산과 키토산 중량 대비 올레아미드의 중량이 10%, 30%, 50%, 100%, 200%인 혼합용액을 이용하여 제조한 나노섬유의 표면특성을 접촉각을 분석하여 나타낸 것이다.
도 3a는 동일한 무게농도의 키토산과 올레아미드 혼합용액을 이용하여 나노유체를 제조하고, 주사전자현미경으로 나노유체를 이루는 나노입자를 분석한 것이다. 도 3b는 제조한 나노유체를 육안으로 확인한 것이다.
도 4a는 나노유체의 용액의 농도가 전체 중량비 대비 0.025%인 키토산-올레아미드 혼합용액을 이용하여 나노유체를 제조하였을 때, 이를 이루는 나노입자의 크기를 동적광산란법(Dynamic Light Scattering)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이며, 이때 올레아미드의 퍼센트는 키토산의 중량에 대한 올레아미드의 중량의 백분율을 의미하는 것이다. 도 4b는 나노유체의 용액의 농도가 전체 중량비 대비 0.25%인 키토산-올레아미드 혼합용액을 이용하여 나노유체를 제조하였을 때, 이를 이루는 나노입자의 크기를 동적광산란법(Dynamic Light Scattering)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이며, 이때 올레아미드의 퍼센트는 키토산의 중량에 대한 올레아미드의 백분율을 의미하는 것이다.
도 5는 증류수를 이용하여 제조한 나노유체의 제타전위를 분석한 것이다.
도 6a는 다양한 pH 용액에서 나노유체를 이루는 나노입자의 크기를 분석한 것이다. 도 6b는 pH가 7.0 내지 9.0인 범위에서의 나노유체를 이루는 나노입자의 크기를 분석한 것이다.
도 7a는 전기방사를 위한 키토산/올레아미드 혼합용액에 계면활성제 트윈 20을 적용하고, 이를 이용하여 나노유체를 제조하였을 때의 나노입자의 평균 크기 변화를 나타낸 것이다. 도 7b는 전기방사를 위한 키토산/올레아미드 혼합용액에 계면활성제 트윈 20을 도입하고, 이를 이용하여 나노유체를 제조하였을 때 pH 변화에 따른 나노입자의 평균 크기 변화를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8e는 나노유체 제조시 계면활성제 트윈 20의 적용 방법을 달리하였을 때, 다양한 pH 용액에서의 제타전위 변화를 나타낸 것으로서, 각각 키토산 대비 100% 중량의 올레아미드 나노유체, 키토산 대비 100% 올레아미드 나노유체에 계면활성제 트윈 20을 첨가한 경우, 나노섬유 제조 단계에서 계면활성제 트윈 20을 추가하여 안정성을 향상시킨 경우 및 트윈 20으로 처리된 올레아미드에 대하여 나노유체를 이루는 나노입자의 다양한 pH에서의 제타변위 변화를 분석하여 도 8a 내지 도 8e에 나타내었다. 도 8a는 pH=2에서의 제타전위 변화를 나타낸 것이다. 도 8b는 pH=5에서의 제타전위 변화를 나타낸 것이다. 도 8c는 pH=7에서의 제타전위 변화를 나타낸 것이다. 도 8d는 pH=9에서의 제타전위 변화를 나타낸 것이다. 도 8e는 pH=11에서의 제타전위 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 키토산과 나노 활성탄 혼합용액을 이용하여, 키토산/올레아미드 나노유체 제조방식과 마찬가지로 전기방사와 파쇄를 통해 제조한 나노유체의 pH 변화에 따른 입자크기 변화를 나타낸 것이다.
도 10은 제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체를, 일산화탄소를 이용하여 수소를 생산하는 균주인 써모코쿠스 온누리누스 NA1에 적용하였을 때, 세포 성장률의 차이를 나타낸 것이다.
도 11은 제조한 나노유체 중 키토산/나노 활성탄 혼합용액을 이용한 나노유체를, 일산화탄소를 이용하여 수소를 생산하는 균주인 써모코쿠스 온누리누스 NA1에 적용하였을 때, 세포 성장률의 차이를 나타낸 것이다.
도 12는 제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체를, 일산화탄소를 이용하여 수소를 생산하는 균주인 써모코쿠스 온누리누스 NA1에 적용하였을 때 일산화탄소 소모량의 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체를, 일산화탄소를 이용하여 수소를 생산하는 균주인 써모코쿠스 온누리누스 NA1에 적용하였을 때, 발효 생성물인 수소의 생산량의 변화를 나타낸 것이다.
도 14는 제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체를, 일산화탄소를 이용하여 포름산을 생산하는 균주인 아세토박테리움 우디이에 적용하였을 때 포름산 생산량의 변화를 나타낸 것이다.
도 15는 제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체를, 메탄(CH4)를 이용하여 증식하는 그람-음성균인 메틸로모나스 속 DH-1에 적용하였을 때, 세포 성장률의 차이를 나타낸 것이다.
도 16은 제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체를, 메탄(CH4)를 이용하여 증식하는 메탄자화균인 메틸로시너스 스포리움 유형-5에 적용하였을 때, 세포 성장률의 차이를 나타낸 것이다.
본 발명은 키토산 및 지질 화합물 또는 활성탄을 포함하는 나노입자를 혼합하여 제조한 나노입자를 포함하는 나노유체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 키토산과 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 포함하는 나노입자는 수용액 상에서 나노유체의 조성물로서 가스의 미생물 세포로의 물질 전달효율을 향상시킬 수 있으며, 나노유체 형태로 대량 생산이 가능하여 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명은 1) 키토산과 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 혼합하는 단계,
여기서 지질 화합물은 올레산, 라우릭산, 올레아미드, 에루카미드, 모노글리세라이드, 스핑고신으로 이루어진 군에서 하나이상 선택되는 것이고,
나노 활성탄의 직경은 200 nm 이하이며;
2) 제1단계에서 혼합하여 제조된 용액을 전기방사법에 의해 나노섬유를 제조하는 단계; 및
3) 제조된 나노섬유를 pH 9 이하의 수용액에서 파쇄하는 단계;
를 포함하는, 나노유체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 키토산은 (1->4) 2-amino-2-deoxy-β-D-glucan의 구조를 가지는 천연에 존재하는 매우 안전한 양이온성 다당류이다. 키토산은 천연의 갑각류 등으로부터 얻어지는 키틴 (chitin)을 탈아세틸화하여 유리 아민기를 생성시킨 폴리머 형태이다. 여기서 키토산은 분자량 1~500kDa이고 유리 아민기가 50% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 키토산의 분자량이 150~400kDa이고 유리 아민기가 80% 이상일 수 있으나 본 발명이 여기에 제한되는 것은 아니다. 키토산의 가용화 측면에서 수용성 키토산 및 불용성 키토산, 키토산의 분자를 변화시킨 키토산 유도체도 본 발 명의 키토산 범주에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 수용성 키토산을 사용할 수 있다. 상기 수용성 키토산은 키토산 HCl, 키토산 아세테이트, 키토산 글루타메이트, 키토산 락테이트 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 수용성 키토산은 분자구조 내의 아민기가 염산 또는 초산, 글루탐산, 젖산 등의 산성 물 질과 당량비로 염을 형성하고 있어 물에 용해가 가능하다. 수용성 키토산은 이물질 제거가 용이하다는 등의 장점이 있다. 이 외에도, 동일 분자 구조를 갖는 키토산 역시 모두 제한되지 않고 이에 포함될 수 있다.
본 발명의 지질 화합물은 항균성을 갖는 것으로 보고된 지질 및 이와 기능적으로 유사한 지질 유도체를 지칭한다. 바람직하게는 올레산(oleic acid) 및 라우릭산(lauric acid)과 같은 탄소수 6-18개 사이의 지방족 잔기를 갖는 지방산(fatty acid), 올레아미드(oleamide)와 에루카미드(erucamide) 및 지방 알콜과 같은 지방산 유도체 또는 모노글리세라이드, 스핑고신(sphingosine) 등의 지질 화합물 및 그 유도체를 말하며, 더욱 바람직하게는 올레아미드 및 에루카미드, 보다 더욱 바람직하게는 올레아미드와 구조적 동일성을 갖는 것을 말한다.
본 발명의 나노 활성탄은 흡착성이 강하고, 대부분의 구성물질이 탄소질로 된 물질로, 직경이 200 nm 이하인 활성탄을 의미한다.
본 발명의 나노유체의 제조방법은 1) 키토산과 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 혼합하는 단계를 포함한다.
상기 혼합하는 단계에서 유기용매는 TFA(trifluoroacetic acid), HFIP(hexafluoroisopropanol), HFP(hexafluoropropanol) 등을 포함하고, 산성용매는 초산(acetic acid), 염산(hydrochloric acid) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명에서는 TFA와 HFIP의 혼합용매가 바람직하다. 상기 용매에 용해된 지질 화합물의 농도는 키토산 대비 10% ~ 400% (w/v), 바람직하게는 100% (w/v) 일 수 있다. 혼합시 온도는 40 내지 60℃가 바람직하며, 보다 바람직하게 약 50 ℃이다. 혼합시 Sonication을 수행하는 것이 바람직하며, 이에 따라 용액의 점도가 감소될 수 있다.
본 발명의 나노유체 제조 방법은 2) 제1단계에서 혼합하여 제조된 용액을 전기방사법에 의해 나노 섬유를 제조하는 단계를 포함한다.
전기방사법은 고분자 용액이나 용융된 고분자를 소정 전압으로 하전시킬 때 발생하는 전기적 인력 및 척력을 이용하여 섬유를 형성하는 기술이다. 전기방사 공정은 수 nm ~ 수천 nm 크기의 다양한 직경을 갖는 섬유를 제조할 수 있고 장비 구조가 간단하고 광범위한 재료에 적용이 가능하며 대량생산이 용이하다는 장점이 있다. 구체적으로, 전기방사 공정을 수행하기 위하여 먼저 키토산과 지질 화합물을 유기용매 단독 또는 유기용매와 산성용매의 혼합용매에 용해시킬 수 있다.
방사 공정은 적절한 전압에서 인가하면서 적절한 방사 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 방사 공정 시 인가되는 전압은 10 내지 40 kV, 보다 바람직하게 20 내지 30 kV의 범위 내로 설정하는 것이 안정적인 방사공정을 수행할 수 있다. 또한 분출 속도 0.2 ㎖/시간 내지 0.9㎖/시간, 보다 바람직하게 0.4 ㎖/시간 내지 0.8㎖/시간이 바람직하다.
상기 전기 방사 후 본원 발명에 따른 방법은 제조된 나노 섬유를 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 나노유체의 제조방법은 3) 제조된 나노섬유를 pH 9 이하의 수용액에서 파쇄하는 단계를 포함한다.
상기 파쇄하는 단계에 의해 제조되는 나노입자들은, 수용액 상에서 분산상을 유지하여 나노유체를 이룰 수 있는 나노입자로, 키토산 및 이와 기능적 동등성이 있는 키토산 조성물과 지질 화합물 및 이와 기능적으로 유사한 지질 유도체를 포함하는 유기물질에 의해 제조되는 나노입자이다. 제조된 나노유체에 포함되는 나노입자는 평균 직경이 200 nm 이하인 것이 바람직하다.
제조된 나노섬유를 수용액에 넣어 용액에 부유시키기 위해 초음파 분쇄기 또는 고압분질기를 이용하여 파쇄한다. 수용액은 증류수일 수 있으며, pH 9 이하의 수용액일수도 있다. 또한 공정에 적합한 다양한 전해질 세포배양 성분을 포함하는 버퍼 용액일 수 있다. 파쇄된 수용액은 나노입자의 분산액을 포함하는 나노유체를 세포배양용 배지로 직접 또는 적정 농도로 희석하여 사용 가능하다.
또한 경우에 따라 상기 제3단계에서 계면활성제가 추가로 포함될 수 있다. 상기 포함될 수 있는 계면활성제는 상기 제2단계에서 포함될 수 있는 계면활성제의 목록과 동일한 것이다.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 나노유체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 나노유체를 포함하는 C1 가스 전환 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 물에 대해 용해도가 낮은 가스를 수용액에서 효율적으로 사용할 수 있게 하여 C1 가스를 이용하는 미생물의 C1 가스 소모율을 증가시키고 발효물의 생산성을 증가시키며 세포 생장속도를 촉진한다. 또한 본 발명의 신규한 유기나노입자를 포함하는 나노유체는 생물전환 공정에서 미생물 균주의 나노입자에 대한 세포독성 문제를 해결한다.
C1가스는 일산화탄소, 이산화탄소, 메탄으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상온 및 고온에서 활성을 특징인 것으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 100℃, 보다 더 바람직하게는 20℃ 내지 80℃에서 활성을 나타내는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 키토산과 올레산, 라우릭산, 올레아미드, 에루카미드, 모노글리세라이드, 스핑고신으로 이루어진 군에서 하나이상 선택되는 지질화합물 또는 직경 200 nm 이하 나노 활성탄을 포함하는 나노유체를 포함하는 C1가스 전환 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 상온 및 고온에서 분산상을 이루어 활용할 수 있으며, 바람직하게는 0℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 100℃, 보다 더 바람직하게는 20℃ 내지 80℃에서 활용할 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 다양한 pH 조건에서 활용할 수 있고, 바람직하게는 pH 2 내지 pH 9, 더욱 바람직하게는 pH 2 내지 pH 7일 수 있다.
본 발명의 조성물은 연소시 발생하는 부산물 가스를 이용하는 미생물에 제한되지 않고 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물은 C1 가스(일산화탄소, 이산화탄소, 메탄)를 이용하는 미생물, 더욱 바람직하게는 C1가스를 이용하는 그람-음성균(Gram-negative bacteria), 그람 양성균(Gram-positive bacteria), 고세균(Archaea), 호열성 균(Thermophilic-bacteria), 호염성 균(Halo-bacteria), 메탄 생산균(Methanogenic-bacteria), 메탄자화균(Methanotrophic-bacteria), 아세트산 생성균(Acetogenic-bacteria) 및 수소생성균(Hydrogenic bacteria)이 포함될 수 있고, 더욱 더 바람직하게는 메탄자화균(Methanotrophic-bacteria), 아세트산 생성균(Acetogenic-bacteria) 및 수소 생성균(Hydrogenic bacteria)일 수 있다.
본 발명의 메탄자화균(Methanotrophic-bacteria)은 메틸로모나스 속 DH-1(Methylomonas sp. DH-1), 메틸로시너스 스포리움 유형-5(Methylosinus sporium type 5), 메틸로시너스 트리코스포리움 OB3b(Methylosinus tricosporium OB3b), 메틸로마이크로비움 알칼리피움 20z(Methylomicrobium alcaliphilum 20z), 메틸로코쿠스 캡술라투스(Methylococcus capsulatus), 메틸로스페라 한소니이(Methylosphaera hansonii), 메틸로마이크로비움 아길레(Methylomicrobium agile), 메틸로마이크로비움 알붐(Methylomicrobium album), 메틸로박터 휘텐버리(Methylobacter whittenburyi), 메틸로박터 루테우스(Methylobacter luteus), 메틸로박터 보비스(Methylobacter bovis), 메틸로박터 비넬란디이(Methylobacter vinelandii), 메틸로마이크로비움 펠라기쿰 (Methylomicrobium pelagicum), 메틸로마이크로비움 스포리움(Methylomicrobium sporium), 메틸로모나스 스트레인(Methylomonas Strain), 메틸로모나스 루브라(Methylomonas rubra), 메틸로모나스 아우란티아카(Methylomonas aurantiaca), 메틸로모나스 포디나룸(Methylomonas fodinarum), 메틸로모나스 메타니카(Methylomonas methanica), 메틸로코쿠스 써모필러스 (Methylococcus thermophilus), 메틸로코쿠스 스포리움 (Methylococcus sporium), 메틸로코쿠스 캡술라타스(Methylococcus capsulatas), 메틸로모나스 트리스포리움(Methylomonas trisporium), 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 메틸로시스티스 파르부스(Methylocystis parvus), 메틸로셀라 팔루스트리스 (Methylocella palustris), 메틸로캡사 아시디필라(Methylocapsa acidiphila), 메틸로모나스 부리아텐스(methylomonas buryatense), 메틸로시스티스 스포리움 (Methylocystis sporium), 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 캔디다투스 메타노페레데덴스(Candidatus Methanoperededens), 니트로레두센스 (nitroreducens), 메틸로살시나 피브레이트(Methylosarcina fibrate), 메틸로칼덤 스제게디엔스 (Methylocaldum szegediense), 캔디다투스 메틸로미라빌리스(Candidatus Methylomirabilis limnetica), 메틸로벌럼 사이크로톨레란스(Methylovulum psychrotolerans)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 아세트산 생성균(Acetogenic-bacteria)은 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 클로스트리디움 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카복시디보란스 P7 (Clostridium carboxidivorans P7), 클로스트리디움 륭달리 (Clostridium ljungdahlii), 무렐라 써모아세티카 (Moorella thermoacetica), 유박테리움 리모섬(Eubacterium limosum), 카복시디보란스(carboxidivorans), 옥소박터 펜니기이(Oxobacter pfennigii), 펩토스트렙토코쿠스 프로덕투스(Peptostreptococcus productus), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 메타노살키나 아세티보란스Methanosarcina acetivorans, 무렐라 써모오토트로피카 (Moorella thermoautotrophica), 디설포토마쿨룸 쿠즈넷소비이(Desulfotomaculum kuznetsovii), 디설포토마쿨룸 써모벤조이쿰 (Desulfotomaculum thermobenzoicum), 써모신트로피쿰(Thermosyntrophicum), 아케오글로부스 펄지두스(Archaeoglobus fulgidus)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 수소 생성균(Hydrogenic bacteria)은 루브리비박스 겔라티노서스(Rubrivivax gelatinosus), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 시트로박터 속 Y19 (Citrobacter sp Y19), 무렐라 AMP(Moorella AMP), 카복시도써머스 하이드로게노포르만스 (Carboxydothermus hydrogenoformans), 카복시디브라키움 파시피쿠스(Carboxydibrachium pacificus), 카복시도셀라 스포로프로두센스 (Carboxydocella sporoproducens), 카복시도셀라 써모오토트로피카(Carboxydocella thermoautotrophica), 써모민콜라 카복시디필라 (Thermincola carboxydiphila), 써모리쏘박터 카복시디보란스(Thermolithobacter carboxydivorans), 써모시너스 카복시디보란스(Thermosinus carboxydivorans), 디설포토마쿨룸 카복시디보란스(Desulfotomaculum carboxydivorans), 써모코쿠스 AM4(Thermococcus strain AM4), 써모코쿠스 온누리누스 (Thermococcus onnurineus)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물은 가장 바람직하게는 일산화탄소(CO) 및 메탄(CH4)를 이용하는 써모코쿠스 온누리누스 NA1 (Thermococcus onnurineus NA1) (KCTC10859), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium.Woodii), 메틸로모나스 속 DH-1 (Methylomonas sp. DH-1), 메틸로시너스 스포리움 유형-5 (Methylosinus sporium Type-5)가 적용될 수 있다.
본 발명은 1) C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물을 분주하여 배양하는 단계; 및
2) 제1단계에서 배양된 미생물에 제8항의 나노유체를 투여하는 단계; 및
3) C1가스를 주입하여 C1가스 전환 반응을 수행하는 단계; 를 포함하는 C1가스 전환 방법을 제공한다.
상기 C1가스 전환 방법을 수행하는 경우, C1 가스로부터 바이오 메탄올(CH3OH), 바이오 수소(H2), 프로판올(C3H6OH), 아세트산(Acetic acid), 숙신산(Succinic aicd), 말레산(Maleic acid), 포름산(Formate)으로부터 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 산물을 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 이에 포함되지 않는 임의의 화합물을 추가로 얻을 수 있다.
본 발명의 C1 가스 전환 방법은 1) C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물을 분주하여 배양하는 단계를 포함한다.
상기 미생물의 배양은 통상의 위 미생물이 생존하는 임의의 배지 조건에서 배양될 수 있다.
본 발명의 C1 가스 전환 방법은 2) 제1단계에서 배양된 미생물에 제8항의 나노유체를 투여하는 단계를 포함한다.
위 배양된 미생물에 나노유체를 투여하는 단계는 나노유체를 최종 농도가 0.0001 ~ 0.01% (w/v)되도록 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 C1 가스 전환 방법은 3) C1가스를 주입하여 C1가스 전환 반응을 수행하는 단계를 포함한다. C1가스의 주입은 C1가스 자체, 또는 C1 가스 및 질소 가스의 혼합 가스의 주입일 수 있다.
본 발명의 C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물은 상기 정의한 C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물로서 정의한 미생물의 목록과 동일한 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 키토산과 올레아미드를 이용한 전기방사에 의한 나노섬유 제조
TFA(Trifluoroacetic Acid)와 HFIP(1,1,1,3,3,3-Hexaflouro-2-propanol)를 부피비 8:2로 혼합한 후, 키토산(medium chain length; Sigma)을 TFA/HFIP 혼합 용액에 키토산의 무게 함량 비율이 혼합 용액 무게의 6.5%가 되도록 유리 바이알(Glass-Vial)에 넣었다. 그 후 키토산 무게와 다양한 비율로 올레아미드를 유리 바이알(Glass-vial)에 넣어 준비하였다. 또한, 용액이 든 유리병을 50℃로 설정한 수조(water bath)에 넣고, 30분 내지 90분동안 음파 처리(Sonication)하여 유리병에 든 용액의 점도(Viscosity)가 감소하도록 처리하였다. 점도가 감소한 용액은 자석 막대(Magnetic bar)로 60rpm 내지 90rpm으로 12시간 내지 24시간 가량 교반하였다. 제조한 용액을 지름 12.46mm의 5㎖ 실린지에 옮겨 담은 후, 0.5mm 지름의 금속 니들(Metal needle)을 결합하여 전기방사에 적용하였다. 그 후, 금속 니들과 집전판(Collector) 사이의 거리를 15.9cm로 고정하였고, 상대습도 30% 미만, 온도 20℃ 내지 35℃에서 전기방사를 진행하였다. 전기방사시 전압은 20 kV 내지 30kV로 설정하였으며, 분출 속도(Feed rate) 0.4 ㎖/시간 내지 0.8㎖/시간으로 조절하며, 준비한 용액의 양에 따라 5시간 내지 12시간 동안 집전판에서 균일한 형태의 나노 섬유를 회수하였다. 회수한 나노 섬유는 습도가 없는 시약 관리대에서 하루 내지 이틀 혹은 진공 건조기에 65℃에서 하루 동안 건조하였다. 주사전자현미경(SEM)으로 분석한 나노섬유의 제조 결과를 도 1a 내지 도 1g에 나타내었고, 키토산 나노섬유의 올레아미드 함량이 증가함에 따른 나노섬유의 친수성 변화의 정도를 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 키토산/올레아미드 나노입자를 포함하는 나노유체의 제조
실시예 1에서 제조하여 건조한 나노 섬유를 요구되는 나노유체의 농도에 따라, 3차 증류수 10㎖ 가 담긴 50㎖ 팔콘 튜브(Falcon Tube)에 0.01g 내지 1g을 넣어 초음파 분쇄기로 19.8kHz, Power 50% 내지 60%, 작동 시간: 3초, 비작동 시간: 3초 조건으로 설정한 후 20분 내지 30분 동안 파쇄를 진행하였다. 도 3a 및 도 3b는 키토산 대비 100% 올레아미드가 포함된 나노섬유를 파쇄하여 제조한 나노유체에 포함된 나노입자를 주사전자현미경으로 관찰한 결과와 수용액상에서 나노입자가 나노유체로 분산상을 이루고 있음을 나타낸다. 도 4a 및 도 4b는 각각 0.025% 및 0.25% 농도의 키토산 올레아미드 혼합용액을 이용하여 나노유체를 증류수에서 제조하였을 때, 이를 포함하는 나노입자의 크기를 동적광산란법(Dynamic Light Scattering)을 이용하여 분석한 결과를 나타내었다. 그리고 제조된 나노유체를 이루는 나노입자의 제타전위(Zeta Potential)값을 분석하였을 때 40 mV 이상의 값으로 분산상이 안정적임을 확인하였다(도 5).
다음으로 제조한 나노유체의 pH 변화에 따른 나노유체 분산상의 안정성을 분석하기 위하여, 증류수에서 제조된 나노유체를 다양한 pH의 버퍼 용액에 넣었을 때 입자크기를 동적광산란법으로 분석하였다. 도 6a 및 도 6b에 나타나듯이 키토산/올레아미드 나노입자는 pH가 7 이하의 경우 나노입자의 크기가 100 nm 이하 수준에서 안정적으로 유지되었으나, pH 7 초과의 염기성 조건으로 바뀌면 응집이 급격하게 일어남을 확인하였다. 다만, 일정 농도의 계면활성제가 첨가된 나노유체 용액을 중성 및 염기성 용액에 넣었을 때는 분산상의 입자 크기가 점차 증가하였으나 pH 9 이하에서는 안정적인 분산상을 유지할 수 있었다. 한편 일정농도의 계면활성제를 키토산/올레아미드 혼합용액에 넣은 후 전기방사하여 나노섬유를 얻고 이를 파쇄하여 계면활성제가 포함된 키토산/올레아미드 나노입자를 제조하여 나노유체를 제조하였을 때 나노입자의 크기는 마찬가지로 100 nm 이하 수준에서 안정적으로 유지되었다. 동시에 중성 및 염기성 버퍼 용액에 계면활성제가 포함되어 있지 않더라도 pH가 증가함에 따라 나노입자의 크기가 점차 증가하였지만 분산상을 안정적으로 유지하여 활용할 수 있음을 확인하였다(도 7a 및 도 7b). 또한, 키토산 대비 100% 올레아미드 나노유체와, 키토산 대비 100% 올레아미드 나노유체에 계면활성제 트윈 20을 첨가하였을 때 및 나노섬유 제조시 계면활성제 트윈 20을 추가하여 안정성을 향상시켰을 때 나노유체를 이루는 나노입자들에 대해 다양한 pH 용액에서의 제타변위 변화를 분석하여 도 8a 내지 도 8e에 나타내었다.
실시예 3. 키토산과 나노 활성탄 혼합용액을 이용한 나노유체의 제조
키토산/올레아미드 기반 나노유체 제조 방법과 같은 방법을 활용하여, 여러 다양한 가스와 강한 흡착능력을 보이는 것으로 알려진 나노 활성탄을 수용액 상에 안정적으로 분산하여 나노유체를 제조할 수 있는지 여부를 조사하였다. 그 결과 통상적으로 판매되고 있는 입자크기 200 nm 이하의 나노 활성탄을 이용하여 키토산과 활성탄 혼합용액을 이루고 이를 전기방사하여 나노섬유를 제조하였고, 마찬가지 방식으로 이를 파쇄하여 안정적인 나노입자 분산상을 제조할 수 있었다. 이렇게 제조된 나노유체를 이루는 나노입자의 분산상 입자크기는 평균 약 200 nm 이하였고, 올레아미드의 경우와 마찬가지로 pH 8 이하에서는 분산상이 안정적으로 유지되었고, pH 8 보다 큰 pH 영역에서는 마찬가지로 분산상의 입자크기가 급격하게 증가하였다(도 9).
실시예 4. 써모코쿠스 온누리누스 NA1 ( Thermococcus onnurineus NA1)에 나노유체를 적용시 CO 소모/수소 생성/세포 성장률 비교 분석
제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체와 키토산/나노 활성탄 혼합용액을 이용한 나노유체를, 일산화탄소를 이용하여 수소를 생산하는 균주인 써모코쿠스 온누리누스 NA1에 적용하여, 적용된 나노유체 농도에 따라 세포성장률/CO 소모/수소 생성이 써모코쿠스 온누리누스 NA1 균주 자체 대조군과 비교하여 어떻게 변화하는지 확인하였다.
먼저 50㎖ 팔콘 튜브(Falcon tube)에 나노유체를 각각 10㎖씩 넣은 후 생물안전실험대에서 자외선(UV)를 이용하여 30분에서 2시간 동안 멸균시켰다. 이어서, 멸균수 1L 당 NaCl 35g, KCl 0.7g, CaCl2·2H2O 0.4g, NH4Cl 0.3g, 시스테인-HCl 0.5g, 효소 추출물 10g, CuSO4·5H2O 0.04g, ZnSO4·7H2O 0.4g, CoCl2·6H2O 0.020g, MnCl2·4H2O 0.8g, Na2MoO4·2H2O 0.4g, KBr 0.2g, KI 0.2g, H3BO3 0.4g, NaF 0.2g, LiCl 0.2g, Al2(SO4)3 0.2g, NiCl2·6H2O 0.04g, VOSO4·2H2O 0.02g, H2WO4 0.02g, Na2SeO4 0.02g, SrCl·6H2O 0.02g, BaCl2 0.02g, 파라 아미노벤조산 0.005g, 바이오틴(Biotin) 0.002g, 판토텐산 칼슘 0.005g, 사아노코발라민 (B12) 0.0001g, 엽산 0.002g, 니코틴산 0.005g, 피리독신 0.01g, 리보플라빈 0.005g, 티아민-HCl 0.005g 및 리포산 0.005g이 포함된 미생물 배지(이하 NM1배지)를 제조하였다. 이후 100㎖ 유리 세럼병에 제조된 NM1배지를 36㎖ 분주 후, 써모코쿠스속 균에 속하는 써모코쿠스 온누리누스(Thermococcus onnurineus) NA1 156T 시드(seed)를 2㎖ 분주하였다. 이어서, 멸균된 나노유체를 최종 농도의 0 ~ 0.01% (w/v) 가 되도록 100㎖ 유리 세럼병에 공급하였다. 이후, 모든 샘플의 최종 부피 40㎖가 되도록 멸균수를 공급하였다. 다음으로, 고무 스토퍼와 알루미늄 씰을 이용하여 100㎖ 유리 세럼병의 입구를 막은 후, 나노유체를 포함하는 100㎖ 유리 세럼병 각각의 일 측에 3㎖의 실린지 바늘을 꽂아, 질소(N2) 가스를 100㏄/분의 속도로 20분 동안 공급하여 유리 세럼병 내부를 혐기성 배양 조건으로 유지하였다. 이후, 일산화탄소(CO) 가스를 100㏄/분의 속도로 30분 동안 공급한 후 80℃에서 6시간 동안 배치 배양을 진행하였다. 배양한 미생물의 생장 농도를 분광 광도계를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물 성장 농도를 비교하였으며, 가스-크로마토그래피(Agilent 6890 GC)를 이용하여 일산화탄소(CO) 가스의 소모량 및 수소(H2)의 생성량을 측정하였다. 이때 가스-크로마토그래피에 사용된 컬럼(Column)은 Agilent 사의 Carboxen- 1000(메쉬 60/80)을 사용하였다.
도 10에서와 같이 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액으로 제조한 나노입자를 포함하는 나노유체를 적용하였을 때 대조군과 비교하여 초기에는 세포 성장률이 다소 감소하는 경향을 보이다가 나노입자 농도가 점차 증가함에 비례하여 균주의 성장률이 함께 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 11에서와 같이 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체와 키토산/나노 활성탄 혼합용액을 이용한 나노유체를 적용한 NM1 배지에서 써모코쿠스 온누리누스 NA1 균주의 세포 생장율이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
한편, 키토산/올레아미드/트윈 20을 혼합하여 제조한 나노입자를 포함하는 나노유체를 적용한 NM1 배지에서 써모코쿠스 온누리누스 NA1 균주의 일산화탄소 소모량, 수소 생성량을 마찬가지로 대조군과 함께 비교하였다.
도 12 및 도 13에 따르면 CO 소비량이 증가하는 나노유체 적용농도에서 수소 생성량 또한 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
이는 나노유체에 영향을 받은 세포막으로 인해 CO 이외에 다른 탄소원인 효소 추출물을 더 이용함에 따른 것으로 추정된다.
실시예 5. 나노유체를 적용한 아세토박테리움 우디이( A.woodii )의 CO 이용 포름산(Formate) 생산성 비교
제조한 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체와 일산화탄소를 이용하여 포름산을 생산하는 균주인 아세토박테리움 우디이에 적용하여 포름산 생산성이 균주 자체 대조군과 비교하여 어떻게 변화하는지 확인하였다.
먼저 혐기성 챔버 내부에 위치하는 용기(예를 들어, 유리 세럼병 등)에 제조된 미생물 배지를 준비하여 분주하였다. 이 때 미생물 배지에는, 멸균수 1L 당 20mM 프럭토오즈와 KH2PO4 0.2g, NH4Cl 0.25g, NaCl 1.16g, MgSO4·7H2O 1.45g, CaCl2 0.11g, KCI 0.50g, 효소 추출물 2.0g, 바이오틴 0.04㎎, 엽산 0.04㎎, 염산피리독신 0.2㎎, 염산티아민, 0.1㎎, 염산리보플라빈 0.1㎎, 니코틴산 0.1㎎, DL-판토텐산칼슘 0.1㎎, 비타민 B12 0.002㎎, 파라-아미노벤조산 0.1㎎, 리포산 0.1㎎, Na2S·9H2O 0.15g, 염산시스테인 0.3g, 미량원소용액 1㎖, 셀레나이트-텅스텐 용액 1㎖를 첨가하여 제조한 후, 질소(N2)가스를 약 100㏄/분의 속도로 약 20분 동안 공급하여 혐기성 상태를 조성되게 하였다. 다음으로 혐기성 챔버 내에서 제조한 배지를 각각의 100㎖ 유리 세럼병에 40㎖의 배지를 분주한 후, 그람-양성균(Gram-positive bacteria)인 아세토박테리움 우디이 (Acetobacterium.woodii)를 분주하고, 고무 스토퍼 와 알루미늄 씰을 사용하여 밀봉하였다. 이후, 37℃ 진탕 배양기에서 약 16~19 시간 배양한 후, 분광 광도계(UV-spectrometer)를 이용하여 600nm 에서 흡광도(O.D600)를 측정하여 1.5 이상이 되었을 때, 배양액 내의 아세토박테리움 우디이를 혐기성 챔버에서 50㎖ 팔콘 튜브(Falcon tube)에 옮긴 후, 밀봉하였고, 이후 원심분리기를 이용하여 11.300 g, 4℃ 10분의 조건에서 배지와 미생물을 분리한 후 미생물인 아세토박테리움 우디이만을 회수하여 다시 혐기성 챔버에서 이미다졸 버퍼(50 mM 이미다졸, 20 mM MgSO4, 20 mM KCl, 4 mM DTE, pH 7.0)를 이용하여 씻어주는 과정을 총 2번 반복 진행하였다. 이어서, 혐기성 조건 내에서 20 mM NaCl, 30μM ETH2120 가 포함된 이미다졸 버퍼 10㎖와 함께 회수한 미생물을 50㎖ 유리 세럼병에 1㎎/㎖ 농도로 분주한 후, 제조한 나노유체를 용기 내 용액의 최종 농도가 각각 0.045%, 0.1% (w/v)가 되도록 분주하여 넣었다. 이후 고무 스토퍼와 알루미늄 씰을 이용하여 용기를 밀봉한 후, 밀봉된 50㎖ 유리 세럼병 각각의 일 측에 3㎖의 실린지 바늘을 꽂아 용기 내부로 질소(N2)가스와 일산화탄소(CO) 가스가 1:1 비율로 혼합된 혼합 가스 100cc/분의 속도로 10분 충전하였다. 이후 실린지 바늘을 조심스럽게 제거하여 유리 세럼병의 내부 혐기 상태를 유지한 상태로 37℃ 진탕 배양기에서 24 시간 반응을 진행했다. 이후, 생성된 포름산의 생성량을 비교하기 위해 고성능 액체-크로마토그래피(HPLC)를 사용하였으며, 분석에 사용된 컬럼(Column)은 Agilent사의 Hi-Plex H (7.7*300mm 8um, UV 210nm)를 사용하였다.
도 14에서 확인하듯이 나노유체를 이용하였을 때 포름산 생성량이 대조군 대비 크게 증가하였음을 확인할 수 있다.
실시예 6. 메틸로모나스 속( Methylomonas sp. ) DH-1에 나노유체를 적용한 경우 세포 생장률 비교
상기 실시예 3과 같이 제조된 나노유체 중 키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체 50㎖ 팔콘 튜브(Falcon tube)에 각각 10㎖씩 넣은 후 생물안전실험대에서 자외선(UV)를 이용하여 30분내지 2시간동안 멸균시켰다. 이어서, 멸균수 1L 당 MgSO4·7H2O 1g, KNO3 1g, CaCl2·2H2O 0.2g, iron-chelate 0.0038g, Na2MoO4·2H2O 0.0006g, KH2PO4 0.26g, Na2HPO4·7H2O 0.62g, CuSO4·5H2O 2.5㎎, 바이오틴 0.02㎎, 엽산 0.02㎎, 염산티아민 0.05㎎ 판토텐산칼륨 0.05㎎, 비타민-B12 0.001㎎, 리보플라빈 0.05㎎, 니코틴아미드 0.05㎎, FeSO4·7H2O 0.5㎎, ZnSO4·7H2O 0.4㎎, MnCl2·7H2O 0.02㎎, CoCl2·6H2O 0.05㎎, NiCl2·6H2O 0.01㎎, boric acid 0.015㎎, EDTA 0.25㎎ 포함하는 NMS 배지를 제조하였다. 제조한 NMS 배지를 500㎖ 플라스크에 45㎖ 분주한 후, 메탄을 소모하는 그람-음성균 (Gram-negative bacteria)에 속하는 메틸로모나스 속 DH-1 시드를 4㎖ 분주하였다. 이어서, 최종 농도가 용액내에 0.0001%, 0.001%, 0.01%(w/v)이 되도록 500㎖ 플라스크에 멸균된 나노유체를 1㎖ 공급하였다. 대조군에는 볼륨을 50㎖ 로 맞추기 위하여 멸균수를 1㎖ 넣었다. 이후, 고무 스토퍼 와 플라스크 캡을 이용하여 500㎖ 플라스크의 입구를 막았다. 나노유체를 포함하는 500㎖ 플라스크 각각의 일측에 5㎖의 실린지 바늘을 꽂은 후, 메탄(CH4)가스와 공기(Air)가스가 6:4 혼합된 혼합가스를 300㏄/분의 속도로 8분 30초 동안 공급한 후, 32℃에서 일정시간 배치 배양한 후 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생장률을 비교하였다.
도 15와 같이 나노유체를 NMS배지에 001% (w/v)으로 적용하여 배양한 경우, 16시간 배양이후부터 대조군인 DH-1 나노유체를 적용한 경우 세포 생장 농도가 향상된 것을 확인하였다. 그리고, DH-1의 경우 배양시 메탄 가스 이외에 별도의 탄소원을 제공하지 않으므로 향상된 세포 생장은 대조군과 대비하여 더 많은 메탄가스를 소비하는 것으로 판단된다.
실시예 7. 메틸로시너스 스포리움 유형-5( Methlylosinus sporium . Type-5)에 나노유체를 적용한 경우 세포 성장률 분석
키토산/올레아미드/트윈 20 혼합용액을 이용한 나노유체를 50㎖ 팔콘 튜브에 각각 10㎖씩 넣은 후 생물안전실험대에서 자외선(UV)를 이용하여 30분내지 2시간동안 멸균시켰다. 이어서, 멸균수 1L 당 MgSO4·7H2O 1g, KNO3 1g, CaCl2·6H2O 0.2g, 시트르산철암모늄 0.0002g, EDTA 나트륨 염 0.0004g, KH2PO4 0.26g, Na2HPO4·7H2O 0.62g, FeSO4·7H2O 0.1㎎, ZnSO4·7H2O 0.005㎎, MnCl2·4H2O 0.0015㎎, CoCl2·6H2O 0.01㎎, NiCl2·6H2O 0.001㎎, 붕산 0.015㎎, EDTA 0.25㎎을 넣어 ATCC 배지(NMS 1306)를 제조하였다. 제조한 ATCC 배지를 500㎖ 플라스크에 45㎖ 분주한 후, 메탄 자화균 (Methanotroph)에 속하는 메틸로시너스 스포리움 유형-5 (Methlylosinus sporium. Type-5) 시드를 4㎖ 분주하였다. 이어서, 멸균된 나노유체를 최종 농도가 용액내에 0.001%, 0.0025%, 0.005%, 0.01%(w/v)가 되도록 500㎖ 플라스크에 1㎖ 공급하였다. 대조군에는 부피를 50㎖로 맞추기 위하여 멸균수를 1㎖ 넣었다. 이후, 고무 스토퍼와 플라스크 캡을 이용하여 500㎖ 플라스크의 입구를 막았다. 나노유체를 포함하는 500㎖ 플라스크 각각의 일측에 5㎖의 실린지 바늘을 꽂은 후, 메탄(CH4)가스와 공기(Air)가스가 6:4 혼합된 혼합가스를 300㏄/분의 속도로 8분 30초 동안 공급한 후, 32℃에서 일정시간 배치 배양한 후 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하여 세포생장률을 확인하였다.
도 16과 같이 적용한 나노유체의 모든 농도 구간에서 대조군 대비 메틸로시너스 스포리움 유형-5는 최대 34%의 세포 성장농도 향상 효과를 보였다. 마찬가지로 메틸로시너스 스포리움 유형-5의 경우 또한 배양시 메탄 가스 이외에 별도의 탄소원을 제공하지 않으므로 대조군 대비하여 세포 생장이 향상된 것은 더 많은 메탄가스를 소비하였기 때문인 것으로 판단된다.

Claims (17)

1) 키토산과 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 혼합하는 단계,
여기서 지질 화합물은 올레산, 라우릭산, 올레아미드, 에루카미드, 모노글리세라이드, 스핑고신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느하나 이상인 것이고,
나노 활성탄의 직경은 200 nm 이하이며;
2) 제1단계에서 혼합하여 제조된 용액을 전기방사법에 의해 나노섬유를 제조하는 단계; 및
3) 제조된 나노섬유를 pH 9이하의 수용액에서 파쇄하는 단계;
를 포함하는, 나노유체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 키토산은 수용성 키토산, 불용성 키토산 및 키토산 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 나노유체의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 수용성 키토산은 키토산 HCL, 키토산 아세테이트, 키토산 글루타메이트 및 키토산 락테이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 나노유체의 제조방법.
제1항에 있어서, 나노유체에 포함된 나노입자의 평균 직경은 200nm 이하인 것인 나노유체의 제조방법.
제1항에 있어서, 제1단계에서 트리플루오로아세트산, 헥사플루오로이소프로판올, 헥사플루오로프로판올, 아세트산, 및 염산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 산성 혼합 용매에 키토산과 지질 화합물 또는 나노 활성탄을 혼합하는 것인 나노유체의 제조방법.
제1항에 있어서, 제2단계에서 전기방사법으로 나노섬유 제조시 트윈계 또는 트리톤계 계면활성제를 용액에 더 포함하는 것인 나노유체의 제조방법.
제1항에 있어서, 제2단계에서 전기방사법은 유속 0.4 ㎖/시간 내지 0.8㎖/시간 및 전압 10 kV 내지 40kV 하에서 수행하는 것인 나노유체의 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 나노유체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 나노유체를 포함하는 C1가스 전환 촉진용 조성물.
제9항에 있어서, C1가스는 일산화탄소, 이산화탄소, 메탄으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 C1가스 전환 촉진용 조성물.
키토산과 올레산, 라우릭산, 올레아미드, 에루카미드, 모노글리세라이드, 스핑고신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 지질화합물 또는 직경 200 nm 이하 나노 활성탄을 포함하는 나노유체를 포함하는 C1가스 전환 촉진용 조성물.
1) C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물을 분주하여 배양하는 단계; 및
2) 제1단계에서 배양된 미생물에 제8항의 나노유체를 투여하는 단계; 및
3) C1가스를 주입하여 C1가스 전환 반응을 수행하는 단계; 를 포함하는 C1가스 전환 방법.
제12항에 있어서, C1가스는 일산화탄소, 이산화탄소, 메탄으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 C1가스 전환 방법.
제12항에 있어서, C1가스를 탄소원이나 에너지원으로 이용하는 미생물은 메탄자화균, 아세트산 생성균 및 수소 생성균로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 C1가스 전환 방법.
제14항에 있어서, 메탄자화균은 메틸로모나스 속 DH-1, 메틸로시너스 스포리움 유형-5, 메틸로시너스 트리코스포리움, 메틸로마이크로비움 알칼리피움 20z, 메틸로코쿠스 캡술라투스, 메틸로스페라 한소니이, 메틸로마이크로비움 아길레, 메틸로마이크로비움 알붐, 메틸로박터 휘텐버리, 메틸로박터 루테우스, 메틸로박터 보비스, 메틸로박터 비넬란디이, 메틸로마이크로비움 펠라기쿰, 메틸로마이크로비움 스포리움, 메틸로모나스 스트레인, 메틸로모나스 루브라, 메틸로모나스 아우란티아카, 메틸로모나스 포디나룸, 메틸로모나스 메타니카, 메틸로코쿠스 써모필러, 메틸로코쿠스 스포리움, 메틸로코쿠스 캡술라타스, 메틸로모나스 트리스포리움, 메틸로시너스 트리코스포리움, 메틸로시스티스 파르부스, 메틸로셀라 팔루스트리스, 메틸로캡사 아시디필라, 메틸로모나스 부리아텐스, 메틸로시스티스 스포리움, 메틸로시너스 트리코스포리움, 캔디다투스 메타노페레데덴스, 니트로레두센스, 메틸로살시나 피브레이트, 메틸로칼덤 스제게디엔스, 캔디다투스 메틸로미라빌리스 림네티카, 메틸로벌럼 사이크로톨레란스로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 C1가스 전환 방법.
제14항에 있어서, 아세트산 생성균은 아세토박테리움 우디이, 클로스트리디움 오토에타노게늄, 클로스트리디움 카복시디보란스, 클로스트리디움 륭달리, 무렐라 써모아세티카, 유박테리움 리모섬, 카복시디보란스, 옥소박터 펜니기이, 펩토스트렙토코쿠스 프로덕투스, 아세토박테리움 우디이, 부티리박테리움 메틸로트로피쿰, 메타노살시나 아세티보란스, 무렐라 써모오토트로피카, 디설포토마쿨룸 쿠즈넷소비이, 디설포토마쿨룸 써모벤조이쿰, 써모신트로피쿰, 아케오글로부스 펄지두스로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 C1가스 전환 방법.
제14항에 있어서, 수소 생성균은 루브리비박스 겔라티노서스, 로도슈도모나스 팔루스트리스, 로도스피릴룸 루브룸, 시트로박터 속 Y19, 무렐라 AMP, 카복시도써머스 하이드로게노포르만스, 카복시디브라키움 파시피쿠스, 카복시도셀라 스포로프로두센스, 카복시도셀라 써모오토트로피카, 써모민콜라 카복시디필라, 써모리쏘박터 카복시디보란스, 써모시너스 카복시디보란스, 디설포토마쿨룸 카복시디보란스, 써모코쿠스 AM4, 써모코쿠스 온누리누스로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 C1가스 전환 방법.
PCT/KR2018/012813 2017-10-26 2018-10-26 C1 가스 전환효율 향상을 위한 유기물질 기반의 신규 나노유체 소재 WO2019083316A2 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20170139941 2017-10-26
KR10-2017-0139941 2017-10-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2019083316A2 true WO2019083316A2 (ko) 2019-05-02
WO2019083316A3 WO2019083316A3 (ko) 2019-07-11

Family

ID=66246462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/012813 WO2019083316A2 (ko) 2017-10-26 2018-10-26 C1 가스 전환효율 향상을 위한 유기물질 기반의 신규 나노유체 소재

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102105851B1 (ko)
WO (1) WO2019083316A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363056A (zh) * 2020-03-17 2020-07-03 湖南省植物保护研究所 沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022065866A1 (ko) * 2020-09-23 2022-03-31 포항공과대학교 산학협력단 나노유체를 이용한 일산화탄소의 독성 저감 및 미생물의 일산화탄소 대사 안정성 향상방법
WO2022092338A1 (ko) * 2020-10-27 2022-05-05 충남대학교산학협력단 유기물질 기반 나노유체에 의한 미생물의 씨원가스를 활용한 대사산물 생산성 향상방법
KR102462992B1 (ko) * 2020-10-27 2022-11-03 충남대학교산학협력단 유기물질 기반 나노유체에 의한 미생물의 c1가스를 활용한 대사산물 생산성 향상방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7704740B2 (en) * 2003-11-05 2010-04-27 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
BR112015000671A2 (pt) * 2012-07-13 2017-06-27 Calysta Inc sistema de biorrefinaria, métodos e composições dos mesmos.
KR101490113B1 (ko) * 2013-04-22 2015-02-11 한경대학교 산학협력단 나노입자를 이용한 바이오알코올의 제조방법
KR101664665B1 (ko) * 2015-03-06 2016-10-12 서강대학교산학협력단 메조포러스 물질을 이용한 수중 메탄의 물질 전달 계수 향상방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111363056A (zh) * 2020-03-17 2020-07-03 湖南省植物保护研究所 沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用
CN111363056B (zh) * 2020-03-17 2021-07-09 湖南省植物保护研究所 沼泽红假单胞菌胞外多糖及其制备方法和应用
US11473115B2 (en) 2020-03-17 2022-10-18 Hunan Plant Protection Institute Exopolysaccharide from Rhodopseudomonas palustris and method for preparing and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019083316A3 (ko) 2019-07-11
KR102105851B1 (ko) 2020-04-29
KR20190046702A (ko) 2019-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019083316A2 (ko) C1 가스 전환효율 향상을 위한 유기물질 기반의 신규 나노유체 소재
ES2536786T3 (es) Proceso de producción de alcohol microbiano
KR101375029B1 (ko) 신규 세균 및 이의 이용 방법
ES2547428T3 (es) Mejora de la captura del carbono en la fermentación
ES2578229T3 (es) Fermentación de CO mediante el uso de un potencial eléctrico
Sinha et al. Biohydrogen production from various feedstocks by Bacillus firmus NMBL-03
US20090137013A1 (en) Microorganisms and methods for increased hydrogen production using diverse carbonaceous feedstock and highly absorptive materials
CN106434483B (zh) 一种布氏乳杆菌及其应用
Steger et al. Optimisation of continuous gas fermentation by immobilisation of acetate-producing Acetobacterium woodii
CN100494350C (zh) 一种梭状芽胞杆菌属大庆梭菌及其应用
Yu et al. Photosynthetic Polymer Dots–Bacteria Biohybrid System Based on Transmembrane Electron Transport for Fixing CO2 into Poly-3-hydroxybutyrate
Qi et al. The anaerobic biodegradation of poly (lactic) acid textiles in photosynthetic microbial fuel cells: self-sustained bioelectricity generation
Rai et al. Evaluation of low cost immobilized support matrices in augmentation of biohydrogen potential in dark fermentation process using B. licheniformis AP1
CN111699170B (zh) 羧酸的提取
CN110106125A (zh) 一种高效定向富集分离产氢菌的方法
KR102462992B1 (ko) 유기물질 기반 나노유체에 의한 미생물의 c1가스를 활용한 대사산물 생산성 향상방법
TWI797569B (zh) 用於生產脂質的醱酵方法
An et al. Fullerenols and fullerene alter cell growth and metabolisms of Escherichia coli
US11584943B2 (en) Method for converting CO2 by means of biological reduction
KR20130018382A (ko) 고정화 탄산무수화 효소를 이용한 고효율 이산화탄소 전환 및 이를 활용한 광합성 미생물의 생리활성물질 생산성 향상 방법
WO2022092338A1 (ko) 유기물질 기반 나노유체에 의한 미생물의 씨원가스를 활용한 대사산물 생산성 향상방법
CN101748089B (zh) 一株纤维素分解复合菌系及其产物用于培养硫酸盐还原菌的方法
WO2022065866A1 (ko) 나노유체를 이용한 일산화탄소의 독성 저감 및 미생물의 일산화탄소 대사 안정성 향상방법
Ramió Pujol Insights into key parameters for bio-alcohol production in syngas fermentation using model carboxydotrophic bacteria
US8889386B2 (en) Method for producing bio-alcohol using nanoparticles

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18871417

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2