KR101008602B1 - 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시스템 - Google Patents

암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 상부 챔버(upper-chamber), 하부 챔버(lower-chamber) 및 상기 상부 챔버와 하부 챔버를 격리(separate)하는 다공성 필터(porous filter)로 이루어지는 다중 챔버(multi-chamber)에서, 상부 챔버에 암세포를 접종하고, 하부 챔버에 암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)를 접종하며, 후보물질(candidate)를 상부 챔버에 첨가한 후, 상기 암세포와 암조직유래-섬유모세포를 공동배양하는 단계; 및 (b) 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정하는 단계. 본 발명의 스크리닝 시스템 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 의하면, 암세포의 침윤 저해물질을 대량 고속(High throughput)의 방식으로 스크리닝할 수 있다.
암세포, 침윤, 침윤 저해제, 사이토카인(cytokine), 키모카인(chemokine), 암세포 독성, 표지된 트리아진계 화합물 라이브러리(tagged triazine library), 스크리닝 시스템

Description

암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 스크리닝 시스템{Screening Method for Inhibitors of Cancer Cell Invasion and Screening System thereof}
본 발명은 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 암세포 침윤 저해제 스크리닝 시스템에 관한 것이다.
성장한 암 조직은 처음 발생한 부위의 주변 조직을 파고 들어가며 증식하는 특성을 갖는데 이를 침윤(invasion)이라고 한다. 이러한 암세포의 침윤과 암의 전이(metastasis)는 불가분의 관계로서 침윤과정은 전이의 초기 단계라고 할 수 있다. 암세포의 침윤 과정은 단백질 분해효소의 과다 생산분비로 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 과정과 방향성을 가진 암세포가 이동하는 과정이 주요한 구성 요소를 이루고 있다. 또한, 암세포의 침윤은 암세포의 단독 작용이 아닌 미세 주위 환경을 이루고 있는 세포들의 유도 작용에 의해 일어난다는 학설이 유력해지고 있다. 조직 내 미세주위 환경과의 상호 작용의 중요성이 부각되면서, 조직 내 미세 주위 환경을 이루는 기질 세포에 의한 상피 암종의 분화, 증 식, 사멸의 유도 및 진행, 및 기질 세포에 의해 상피 암종의 진피 유사체내의 침윤이 유도되는 기전을 밝히는 데에 많은 관심이 집중되고 있다.
한편, 섬유모세포(fibroblast)는 기질을 이루는 대표적인 세포로서, 이 섬유모세포가 상피 또는 상피 암종에 미치는 영향에 대한 연구와, 이들 섬유모세포를 표적으로 한 새로운 암 치료법에 대한 연구가 점차 활발히 진행되고 있다. 그 예로서, 유방암에서 암세포로 변이가 시작된 상피 세포 주위에 섬유모세포가 있을 때, 상피 세포가 과다한 세포 증식, 세포 자살 프로그램의 상실, 조직 침입 능력 등의 암세포의 특성을 빠른 속도로 획득하는 것이 확인되었다(Sadlonova et al. 2005). 또한, 전립선암에서 유래된 섬유모세포는 전립선 암 세포의 증식을 촉진하고 암세포의 분화에 영향을 준다고 보고되어 있다(Orimo et al. 2005). 더불어, 구강편평세포암종(Oral squamous cell carcinoma, OSCC) 세포주의 삼차원적 배양에서 종양 세포들은 섬유모세포가 존재할 경우에만 결체 조직으로 침윤되었다(Che et al, 2006).
암세포의 침윤 작용을 연구하기 위해, 종래 트랜스웰(transwell)을 이용한 침투분석법(invasion assay)이 개발되어 널리 사용되고 있으나, 종래의 방법은 트랜스웰에 주로 Matrigel-코팅된 필터(Matrigel-coated filter)를 사용하였고(Repesh LA. 1989), 암세포의 침윤 유도를 위해 섬유모세포를 사용한 방법(Saiki I et al. 1994)이 개시되어 있으나, 사용된 섬유모세포는 정상 피부로부터 분리한 정상 섬유모세포이었다. 따라서, 지금까지 암조직유래-섬유모세포(CAF)와 암세포와의 상호작용을 통해 암세포의 침윤 유도를 조사하는 방법에 대해서는 보고되어 있 지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 새로운 암세포의 침윤 저해물질을 대량/고속 방식으로 스크리닝(HTS, High Throughput Screening)하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 암조직 유래 섬유모 세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)가 암세포의 침윤을 유도한다는 사실에 기초하여, 이 두 가지 세포를 다중 챔버(multi-chamber)인 보이든 챔버(Boyden chamber)에 공동 배양하면서 후보물질을 첨가하고 암세포 침윤 억제 활성을 가지면서 동시에 섬유모 세포에 대한 독성이 없는 물질을 선별하면, 대량 고속의 방식으로 특이성이 높은 (highly specific) 암세포 침윤 저해제를 스크리닝할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 암세포 침윤 저해제 스크리닝 시스템을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 상부 챔버(upper-chamber), 하부 챔버(lower-chamber) 및 상기 상부 챔버와 하부 챔버를 격리(separate)하는 다공성 필터(porous filter)로 이루어지는 다중 챔버(multi-chamber)에서, 상부 챔버에 암세포를 접종하고, 하부 챔버에 암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)를 접종하며, 후보물질(candidate)를 상부 챔버에 첨가한 후, 상기 암세포와 암조직유래-섬유모세포를 공동배양하는 단계; 및 (b) 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정하는 단계.
본 발명자들은 새로운 암세포의 침윤 저해물질을 대량 고속의 방식으로 스크리닝(HTS, High Throughput Screening)하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 암조직유래 섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)가 암세포의 침윤을 유도한다는 사실에 근거하여 이 두 가지 세포를 다중 챔버(multi-chamber)인 보이든 챔버(Boyden chamber)에 공동 배양하면서 후보물질을 첨가하고, 암세포 침윤 억제 활성을 가지면서 동시에 섬유모 세포에 대한 독성이 없는 물질을 선별하면, 대량 고속의 방식으로 특이성이 높은(highly specific) 암세포 침윤 저해제를 스크리닝할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하에서 본 발명의 방법을 단계에 따라 상세히 설명한다.
(a) 상부 챔버 , 하부 챔버 , 및 상기 상부챔버와 하부챔버를 격리하는 다공성 필터로 이루어지는 다중 챔버에서 , 상부 챔버에 암세포를 접종하고, 하부 챔버에 암조직유래 섬유모 세포( CAF )를 접종하며, 후보물질를 상부 챔버에 첨가한 후, 상기 암세포와 CAF 를 공동배양하는 단계.
본 발명의 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법은 암조직유래 섬유모세포(CAF)와 암세포를 공동 배양하면 암조직유래-섬유모세포(CAF)가 암세포의 침윤을 유도한다는 사실에 근거한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법은 다중 챔버(multi-chamber)를 이용하여 종래 화학주성(chemotaxis)에 의한 세포 이동(migration) 또는 침윤(invasion)을 분석하는 보이든 챔버 분석법(Boyden chamber assay) 또는 트랜스웰 분석법(transwell assay)을 적합하게 변형한 것에 기초한 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법의 기본 원리는 다음과 같다. 즉, 트랜스웰(transwell)의 하부 챔버에 암조직유래-섬유모세포(CAF)를 배양하고 트랜스웰의 상부 챔버에 암세포를 배양하여 암세포의 침윤이 유도될 때, 첨가하는 후보 화합물이 이 침윤을 저해하는지를 확인하는 것이다.
본 발명의 상부 챔버에 접종하는 암세포는 예를 들어, 위암(stomach cancer)세포, 간암(liver cancer)세포, 폐암(lung cancer)세포, 유방암(breast cancer)세포, 난소암(ovarian cancer), 기관지암(bronchogenic cancer)세포, 비인두암(nasopharyngeal cancer)세포, 후두암(laryngeal cancer)세포, 췌장암(pancreatic cancer)세포, 방광암(bladder cancer)세포, 결장암(colon cancer)세포, 자궁경부암(cervical cancer)세포, 전립선암(prostate cancer)세포, 신장암(renal cancer)세포, 구강편평상피암종((oral squamous cell carcinoma, OSCC)세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서의 용어 "암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)"는 암(cancer) 또는 악성종양(malignant tumor) 주변을 둘러싸고 있는 조직에 존재하는 섬유모세포를 의미한다. 상기 암조직유래-섬유모세포(CAF)는 예컨대 특정의 악성 종양 조직을 절제하여 얻은 표본(specimens)으로부터 용이하게 분리할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 암조직유래-섬유모세포(CAF)의 분리 원(isolation source)이 되는 악성 종양 조직은 예를 들어, 폐암(lung cancer)조직, 피부암(skin cancer)조직, 위암(stomach cancer)조직, 대장암(intestinal cancer) 조직, 결장암(colon cancer) 조직, 췌장암(pancreatic cancer) 조직, 간암(liver cancer) 조직, 갑상선암(thyroid cancer) 조직, 자궁암(uterine cancer) 조직, 자궁경부암(cervical cancer) 조직, 난소암(ovarian cancer) 조직, 고환암(testicular cancer) 조직, 전립선암(prostate cancer) 조직, 유방암(breast cancer) 조직, 구강암(oral cancer) 조직을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에서 암조직유래-섬유모세포는 다중 챔버의 하부 챔버에 접종 후 배양하여 상부 챔버의 암세포의 침윤을 유도한다.
본 발명의 스크리닝 방법의 가장 큰 특징 중에 하나는 종래의 트랜스웰-기반 침윤분석법(transwell-based invasion assay)에서와는 다르게 암세포의 침윤 유도를 위해 화학주성물질(chemo-attractant)을 사용하지 않고 암조직유래-섬유모세 포(CAF)를 사용한다는 점에 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 다공성 필터는 콜라겐(collagen)으로 코팅된다. 보다 바람직하게는 콜라겐 타입 I (collagen type I)으로 코팅된다.
본 발명의 또 다른 특징 중 하나는 다공성 필터상에 종래 트랜스웰 분석법에서 사용되는 MatrigelTM(마우스 종양세포로부터 분비되는 젤라틴성 단백질 혼합물)을 코팅하지 않고, 대신 콜라겐을 코팅한다는 점에 있다. MatrigelTM 대신 콜라겐을 코팅함으로써 암조직유래-섬유모세포(CAF)에 의한 암세포의 침윤유도 과정중에서 MatrigelTM 에 포함되어 있을 수 있는 사이토카인(cytokine) 또는 화학주성 유도물질(chemo-attractant)의 영향을 배제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면 특이성 높게 암세포 침윤억제 물질을 스크리닝할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "후보물질"은 암조직유래-섬유모세포(CAF)에는 독성을 나타내지 않으면서 암세포 자체에 대해 독성을 나타내거나, 암조직유래-섬유모세포(CAF)로부터 분비되어 암세포 침윤을 유도하는 사이토카인(cytokine) 또는 키모카인(chemokine)의 분비를 억제하거나 이의 작용을 방해하는 것이 기대되는 물질을 의미한다.
본 발명의 후보물질은 합성화합물, 천연화합물, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
(b) 상기 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정하는 단계.
다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정함으로써 암세포의 침윤을 억제하는 후보물질을 선별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면 다공성 필터를 통과한 세포수의 측정은 필터를 통과한 세포를 고정시키고 염색한 후 고정된 세포의 수를 카운팅(counting)하는 방법으로 행한다. 세포의 염색 방법은 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 DNA 특이적 형광 염료(Hoechst 33258) 또는 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염료를 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단계 (b) 이후에 후보물질을 첨가한 경우에서 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 다공성 필터를 통과한 암세포의 수가 적은 경우, 후보물질을 암세포 침윤 저해제로 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 후보물질이 암세포의 침윤을 저해한다면 다공성 필터를 통과한 암세포의 수가 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 적을 것이다.
(c) 하부 챔버에 접종한 암조직유래 - 섬유모세포(CAF)에 대해 후보물질의 독성을 측정하는 단계.
비특이적 독성을 갖는 후보물질을 배제하기 위해, 하부 챔버에 접종하여 배양한 암조직유래-섬유모세포(CAF)에 대한 후보물질의 독성을 측정하여 CAF에 대해 독성을 나타내는 후보물질은 침윤저해제로 선별하지 않는다. 암조직유래-섬유모세 포(CAF)에 대해 독성을 나타내는 후보물질은 암세포 특이적인 독성물질이 아니며, 이러한 후보물질은 선별에서 제외함으로써 암세포 특이적 저해 활성을 갖는 후보물질만을 스크리닝할 수 있다.
암조직유래-섬유모세포(CAF)에 대한 후보물질의 독성 측정은 예를 들어 암조직유래-섬유모세포의 생존율을 측정하는 MTT 분석법(MTT assay)에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상부 챔버(upper-chamber), 하부 챔버(lower-chamber) 및 상기 상부 챔버 및 하부 챔버를 격리하는 다공성 필터(porous filter)로 이루어지는 다중 챔버에서, 상부 챔버에 암세포가 접종되어 있고, 하부 챔버에 암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)가 접종되어 있는 것을 특징으로 하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 시스템을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 다공성 필터가 콜라겐(collagen)으로 코팅된 것을 특징으로 하는 스크리닝 시스템을 제공한다.
본 발명은 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법 및 암세포 침윤 저해제 스크리닝 시스템을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 시스템 및 스크리닝 방법에 의하면, 암세포의 침윤 저해물질을 대량/고속(High throughput)방식으로 스크리닝할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.　 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
1. 트리아진 라이브러리( Triazine library ) 화합물
본 발명에서 암세포 침윤 저해제 후보물질로서 표지된 트리아진 라이브러리(Tagged triazine library) 화합물 1040개를 준비하고 이를 각각 DMSO (Dimethyl Sulfoxide)에 녹여 5mM 농도로 제조하였다. 표지된 트리아진 라이브러리 화합물 및 이의 제조방법은 종래 문헌에 기술되어 있다 (Facilitated forward chemical genetics using tagged triazine library and zebrafish embryo screening, Khersonsky, S. M; Jung, D. W.; Kang, T. W.; Walsh, D. P.; Moon, H. S.; Jo, H.; Jacobson,E. M.; Shetty, V.; Neubert, T. A.; Chang, Y. T; J. Am . Chem . Soc. 2003, 125, 11804-11805). 본 발명의 트랜스웰 침윤 분석법(transwell invasion assay)에 후보 트리아진 화합물의 최종 농도가 5mM이 되도록 첨가하여 항-침윤(anti-invasive) 효과를 측정하였다.
2. 세포 배양
(i) 구강편평상피암종 ( OSCC , Oral Squamous Cell Carcinoma ) 세포
한국 세포주 은행에 등록된 YD-10B 세포주(Lee EJ et al. Exp Mol Med 2005, 37:379-90)와 일본 세포주 은행에 등록된 HSC-2, HSC-3, Ca9.22 세포주를 구강편평상피암종(OSCC) 세포로서 실험에 사용하였다. HSC-2, HSC-3, Ca9.22 세포주는 DMEM:Hams-F12 (3:1)에 1％ 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지를 이용하여 5％ CO2가 유지되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. YD-10B 세포주는 상기 조성의 배지에 콜레라 독소(cholera toxin) (0.1 mg/㎖, Sigma), 히드로코르티손(hydrocortisone) (0.4 mg/㎖, Sigma), 인슐린(insulin) (5 mg/㎖, Sigma), 아포-트랜스페린(apo-transferrin) (5 mg/㎖, Sigma), 3, 3', 5-트리 요오도-1-티로닌(3, 3', 5-triiodo-1-thyronine) (2 mg/㎖, Sigma)를 추가로 포함한 배지를 사용하여 배양하였다.
(ⅱ) 대장암 세포 ( colon cancer cells )
HT-29, DLD-1, HCT-116 세포주는 연세대학교 암연구소에서 제공 받았다. HT-29, DLD-1 세포주는 RPMI 1640에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지에서 배양하였다. HCT-116 세포주는 DMEM 에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지에서 배양하였 다.
(ⅲ) 폐암 세포 ( lung cancer cells )
NCI-H596, NCI-H460, A549 세포주를 연세대학교 암연구소에서 제공 받았다. NCI-H596 및 NCI-H460 세포주는 RPMI 1640 에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)이 첨가된 배지에서 배양하였다. A549 세포주는 DMEM에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 배지에서 배양하였다.
(ⅳ) 유방암 세포 ( breast cancer cells )
MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하여 DMEM에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS가 첨가된 배지에서 배양하였다.
(ⅴ) 전립선암 세포 ( prostate cancer cells )
PC3 세포주를 연세대학교 암연구소에서 제공받아 Hams-F12에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS가 첨가된 배지에서 배양하였다.
(ⅵ) 정상 상피 세포 ( normal epithelial cells )
교정 목적으로 뽑은 치아의 정상 치은 조직 중 상피에서 유래된 정상 상피 세포를 KGM 배지에서 배양하였다.
(ⅶ) 암 조직 유래 섬유모 세포 ( carcinoma - associated fibroblasts , CAF )
구강암 조직을 베타딘으로 3회 세척한 후, 가위로 조직을 잘라 PBS로 세척하고, 섬유모 세포를 DMEM:Hams-F12 (3:1)에 1％ 페니실린/스트렙토마이신과 10％ FBS가 첨가된 배지에 배양하였다.
3. 침윤 저해제 검색 방법 ( in vitro invasion assay )
암세포의 침윤 저해제를 스크리닝하는 방법은 트랜스웰 분석법(transwell assay)을 적합하게 변형하여 시행하였다. 암세포의 침윤성은 24-트랜스웰 플레이트(24-transwell plate) (Corning 사)를 사용하여 측정하였다. 세공(pore) 직경이 8 μm인 필터(filter)에 콜라겐 타입 I(collagen type I)을 코팅한 후, 필터 아래 하부 웰에는 2.1 X 104 세포/웰의 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)를 분주하였다. 밤샘 배양한 후 배지를 무혈청 배지로 교체하고, 무혈청 배지에 희석된 2 X 104 개의 암세포를 콜라겐 코팅된 필터 위에 분주하였다. 스크리닝하고자 하는 트리아진계 화합물은 필터 위쪽에 첨가하였다. 48시간 배양 후, 필터 세공을 통과하여 필터 아래 쪽에 부착된 세포를 10％ 포르말린(formalin)으로 고정시킨 후, 0.25％ 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고 현미경 아래에서 세포의 수를 측정하였다.
4. 세포 생존율 측정 ( cell viability test )
세포의 생존율을 측정하기 위해, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석법(MTT assay)을 시행하였다. 96 웰 플레이트에 세포를 8 X 103 세포/웰로 분주하고 밤샘 배양한 후, 스크리닝 후보 트리아진계 화합물을 첨가하여 24시간, 또는 48시간 더 배양하였다. MTT 시약이 함유된 무혈청 배지로 교체하고 3시간 배양한 후 배양액을 제거하고, DMSO를 첨가하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 용해시킨 후, 540nm 에서 흡광도를 측정하였다.
5. CCL7 측정을 위한 효소 면역 정량법 ( CCL7 ELISA )
세포 배양 배지(cell culture media)로 분비된 CCL7의 양은 Human CCL7 ELISA kit(R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 24-웰 플레이트에 2.1 X 104 세포/웰 개의 CAF(carcinoma-associated fibroblasts)를 분주한 후 밤샘 배양하고, 300 ㎕/웰의 무혈청 배지로 교체한 다음, YD-10B 배양액 200 ㎕/웰을 첨가하였다. 이 때 동시에 후보 트리아진계 화합물을 첨가하거나 대조군으로서 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 같은 용량 첨가하고 24시간 추가 배양하여 배양액을 수집하고, 이를 ELISA 분석에 이용하였다.
6. CXCL1 / GRO -α 측정을 위한 효소 면역 정량법 ( CXCL1 / GRO -α ELISA )
세포 배양 배지로 분비된 CXCL-1의 양은 Human CXCL1 ELISA kit (R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 세포 배양액의 수집 방법은 전술한 CCL7 ELISA법에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 행하였다.
7. CXCL8 / IL -8 측정을 위한 효소 면역 정량법 ( CXCL8 / IL -8 ELISA )
세포 배양 배지로 분비된 IL-8의 양은 Human IL-8 ELISA kit (R&D Systems)를 이용하여 측정하였다. 세포 배양액의 수집 방법은 전술한 CCL7 ELISA법에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 행하였다.
실험 결과
1. 침윤 저해제 스크리닝
후보 화합물로서 표지된 트리아진 라이브러리(tagged triazine library)의 1040개 화합물의 침윤 저해 효과(anti-invasive effect)를 스크리닝한 결과, 그 중 침윤 저해 효과가 강력한 10 개의 화합물을 선발하였다(도 1 참조).
본 발명의 방법에 의한 스크리닝은 구체적으로 다음과 같이 행하였다. 먼저, 트랜스웰(transwell)의 하부 웰에 암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)를 배양하고 트랜스웰의 상부 웰에 암세포로서 구강편평세포암종(OSCC) 세포를 배양하여 구강편평세포암종 세포의 침윤이 유도될 때, 첨가하는 후보 화합물이 이 침윤을 저해하는 지를 확인하였다(도 2 참조). 암세포의 침윤 정도는 트랜스웰의 상부 및 하부 구획(compartment) 사이에 놓여 있는 콜라겐-코팅된 필터(collagen-coated filter)를 통과한 암세포들을 고정하고 염색한 후에 염색된 세포의 수를 측정하여 판단하였다.
또한, 비특이적인 세포 독성에 의한 저해 작용을 나타내는 후보 화합물을 선별로부터 제외하기 위해, 상기한 침윤 억제 활성의 측정과 동시에, 후보 화합물의 암조직유래-섬유모세포(CAF)에 대한 MTT 분석법을 행하였다. MTT 분석법에 의해 암조직유래-섬유모세포에 대해 독성 작용을 나타내는 화합물은 침윤 저해제 선발에서 제외시켰다.
침윤 저해제로서 최종 선발된 10개의 화합물은 암세포에 대한 특이적인 독성을 나타내거나, 섬유모 세포에서 분비되어 암세포 침윤을 유도하는 사이토카인(cytokine) 또는 키모카인(chemokine)의 분비를 억제하거나 작용을 방해하는 것으로 생각되었다.
이를 확인하기 위해, 상기 선별한 10 개의 화합물에 대하여 암세포, 섬유모 세포와 정상세포 각각에 대한 독성, 섬유모 세포에서 분비되는 사이토카인 중 Monocyte Chemotactic Protein-3 (MCP-3/CCL7), CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α의 분비능에 대한 영향을 다시 조사하였다.
그 결과, 10개의 선발된 화합물들 중에서도 화합물 S06이 암세포에 대한 특이적인 독성을 나타내면서 동시에 섬유모 세포에서 분비되는 키모카인(chemokine)으로서 암세포에 대한 화학주성을 나타내는 것으로 알려진 MCP-3/CCL7의 분비를 저하시키는 작용을 하는 것을 확인하였다(도 3 참조).
MTT 분석법을 통해 화합물 S06의 세포 생존 (cell viability) 저해 작용을 조사한 결과, 구강암 세포주(도 4a - 도 4c), 대장암 세포주(도 5), 폐암 세포주(도 6), 유방암 세포주(도 7), 전립선암 세포주(도 8) 모두의 세포 생존력을 저하시키는 것으로 나타났다. 그러나, 암조직유래-섬유모 세포(CAF)에서는 50 mM까지 처리(24시간)해도 생존력이 90％까지 유지되는 것을 확인하였으며(도 9), 정상 상피 세포에 대해서도 20mM까지는(24시간) 90% 이상, 80mM에서도 (24시간) 60% 이상 세포 생존력이 유지되는 것으로 확인하였다(도 10).
2. 침윤 저해제의 섬유모 세포의 사이토카인 분비능에 미치는 영향
트리아진(triazine) 화합물 S06이 암조직유래-섬유모세포(CAF) 사이토카인 분비능에 미치는 영향을 조사하였다. 섬유모세포 배양계에 암세포 배양액(conditioned media)을 첨가함으로써 증가되는 MCP-3/CCL7과 CXCL1/GRO-α의 분비가 화합물 S06 처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었으나(도 11 및 도 12 참조), CXCL8/IL-8의 분비에는 변화가 없었다(도 13).
CCL7(Chemokine C-C motif ligand 7)은 단핵세포 특이적(monocyte-specific) 키모카인(chemokine)-3 (MCP-3)으로도 불려왔으며, CC 키모카인 패밀리에 속하는 사이토카인이다. CCL7는 특히 단핵세포(monocytes)의 화학주성을 유도하며, 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 것으로 알려져 왔다. 몇 가지 암세포주와 대식세포 등이 CCL7을 분비한다고 보고되었으며, 본 발명에 사용된 암세포유래-섬유모세포에서도 암세포의 자극에 의해 CCL7의 분비가 촉진된다. 분비된 CCL7은 암세포의 이동성을 증진시켜 침윤을 촉진하는 것으로 생각된다.
CXCL1(Chemokine (C-X-C motif) ligand 1)은 CXC 키모카인 패밀리에 속하는 사이토카인이며, GRO1 oncogene, Neutrophil-activating protein 3 (NAP-3), Melanoma growth stimulating activity, alpha (MSGA-α)로도 불리어 왔다. CXCL1을 분비하는 암세포로는 인간 멜라노마 세포(human melanoma cells)이 알려져 있으며, 세포분열특성(mitogenic properties)을 가지고 있고, 멜라노마의 발병(melanoma pathogenesis)에 관여할 것이라고 알려져 왔다. CXCL1는 신생혈관생성(angiogenesis), 염증(inflammation), 상처치료(wound healing), 발암(tumorigenesis) 등에도 관여하는 등 다양한 활성을 갖는 사이토카인이다. CXCL1은 본 발명에서 사용된 암조직유래-섬유모세포에서도 분비되며 암세포의 자극에 의해서 분비가 더욱 촉진되며 암세포의 침윤과 성장을 촉진하는 작용을 할 것으로 생각된다.
결론적으로, 본 발명에서 검색된 화합물들은 암세포에 대한 선택적 독성 작용을 할 뿐 아니라, 암세포의 침윤을 촉진시키는 작용을 하는 섬유모세포의 사이토카인들의 분비를 저해함으로써 보다 강력한 암 치료 효과를 보일 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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도 1은 표지된 트리아진 화합물 라이브러리로부터 선별한 암세포 침윤 저해 활성을 나타내는 화합물들이다.
도 2는 종양-기질 상호작용(tumor-stroma interactions)을 조절하는 저분자의 스크리닝 시스템을 설명하는 도면이다. 침윤 저해제 스크리닝을 위해, 8 μm의 세공 사이즈를 갖는 필터를 콜라겐 타입 I(collagen type I)(45g/30L)으로 코팅하였다. 2 X 104 OSCC 세포들을 다공성 필터를 갖는 트랜스웰(transwell)의 상부 웰(upper well)에 접종하고, 2 X 104 CAF 세포 및 CAF-조건화된 배지(CM) 또는 CCL7을 하부 웰(lower well)에 첨가하였다. 필터를 침투한 세포들을 고정화시키고, 0.25％ 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후에, 광학 현미경하에서 세포를 계수하였다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 스크리닝된 화합물 S06이 CAF-유도된 구강암 세포주 YD-10B의 침윤 및 증식을 억제하고, CAF에 의한 CCL7의 분비를 감소시키는 것을 보여주는 도면이다. 암 세포주(YD-10B)을 다공성 필터(세공 사이즈 8 μm)를 갖는 24-트랜스웰 챔버(transwell chamber)의 상부웰(upper well)에 접종하고, CAF는 하부웰(lower well)에 첨가하였다. 세포의 침윤을 측정하기 위해, 콜라겐 코팅된 트랜스웰 막을 통과한 세포를 고정하고, 염색한 후에, 광학현미경 아래에서 그 수를 측정하였다. 세포 침윤은 광학 현미경에 의해 시각화하였고(도 3의 패널 A(i)), 침윤된 세포를 계수하여 정량화하였다(도 3의 패널 A(ⅱ)). MTT 분석법에 의해, 화합물 SO6를 첨가한 후 48 시간 동안의 구강암 세포주 YD-10B 생존능을 측정하였다(도 3의 패널 B). 웰당 2.1 X 104의 CAF를 24-웰 플레이트에 접종하고, SO6 (1mM 또는 5mM) 또는 대조군으로서 DMSO로 처리하였다. 24 시간 인큐베이션한 후에, CAF 배양액으로부터 상등액을 회수하고, CCL7 농도를 상업적으로 구입가능한 ELISA Kit를 사용하여 측정하였다(Error=S.D.)(도 3의 패널 C).
도 4a - 도4c는 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 구강암 세포주 YD10B, HSC-2, HSC-3, 및 Ca9.22에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후 24시간 (도 4a), 48시간 (도 4b) 및 72시간 (도 4c)에서 측정하였다(Error=S.D.).
도 5는 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 대장암 세포주 HCT-116, DLD-1 및 HT-29에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후, 24시간 후에 측정하였다(Error=S.D.).
도 6은 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 폐암 세포주 A549, NCI-H596 및 NCI-H460에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세 포 생존능은 화합물 첨가 후 24 시간 후에 측정하였다(Error=S.D.).
도 7은 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 유방암 세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-435 및 MCF-7에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후 24시간 후에 측정하였다(Error=S.D.).
도 8은 MTT 분석법을 사용하여 트리아진 화합물 S06의 전립선암 세포주 PC-3에 대한 세포 독성 민감도를 테스트한 결과를 보여준다. 세포 생존능은 화합물 첨가 후 24시간 (도 8의 패널 A) 및 48 시간(도 8의 패널 B) 후에 측정하였다(Error=S.D.).
도 9는 트리아진 화합물 SO6이 CAF의 생존능에 특별한 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 세포의 생존능은 트리아진 화합물 SO6을 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 mM의 각 농도로 처리한 후 24 시간 또는 48 시간 후에 MTT 분석법에 의해 측정하였다(Error=S.D.).
도 10은 트리아진 화합물 SO6의 구강으로부터 분리한 정상 상피세포들에 대한 세포독성 민감도를 MTT 분석법에 의해 측정한 결과를 보여준다(Error=S.D.).
도 11은 YD-10B 세포주로부터 조절 배지(conditioned media)를 회수하여 트 리아진 화합물 S06의 존재(1mM, 2.5mM 또는 5mM) 또는 부존재하에 CCL7 분비 유도를 위해 24-웰 플레이트내의 CAF 배양에 첨가한 결과를 보여준다. 24시간 후에, 각 배지로부터 상등액을 회수하여 CAF 배지에서의 CCL7 농도를 ELISA에 의해 측정하였다(Error=S.D.).
도 12는 YD-10B 세포주로부터 조절된 배지(conditioned media)를 회수하여 트리아진 화합물 S06의 존재(1mM, 2.5mM 또는 5mM) 또는 부존재하에 CXCL1 분비 유도를 위해 24-웰 플레이트내의 CAF 배양에 첨가한 결과를 보여준다. 24시간 후에, 각 배지로부터 상등액을 회수하고, CAF 배지에서의 CXCL1 농도를 ELISA에 의해 측정하였다(Error=S.D.).
도 13은 YD-10B 세포주로부터 조절된 배지(conditioned media)를 회수하여 트리아진 화합물 S06의 존재(1mM, 2.5mM 또는 5mM) 또는 부존재하에 IL-8 분비 유도를 위해 24-웰 플레이트내의 CAF 배양에 첨가한 결과를 보여준다. 24시간 후에, 각 배지로부터 상등액을 회수하고, CAF 배지에서의 IL-8 농도를 ELISA에 의해 측정하였다(Error=S.D.).

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 방법:
    (a) 상부 챔버(upper-chamber), 하부 챔버(lower-chamber) 및 상기 상부 챔버와 하부 챔버를 격리(separate)하는, 콜라겐(collagen) 코팅된 다공성 필터(porous filter)로 이루어지는 다중 챔버(multi-chamber)에서, 상부 챔버에 암세포를 접종하고, 하부 챔버에 암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)를 접종하며, 후보물질(candidate)를 상부 챔버에 첨가한 후, 상기 암세포와 암조직유래-섬유모세포를 공동배양하는 단계; 및
    (b) 다공성 필터를 통과한 암세포의 수를 측정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에, 하부 챔버에 접종한 암조직유래-섬유모세포(CAF)에 대해 후보물질의 독성을 측정하는 단계 (c) 를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 이후에, 후보물질을 첨가한 경우가 후보물질을 첨가하지 않은 경우에 비해 다공성 필터를 통과한 암세포의 수가 적은 경우, 후보물질을 암세포 침윤 저해제로 결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 상부 챔버에 접종하는 암세포는 위암(stomach cancer)세포, 간암(liver cancer)세포, 폐암(lung cancer)세포, 유방암(breast cancer)세포, 난소암(ovarian cancer), 기관지암(bronchogenic cancer)세포, 비인두암(nasopharyngeal cancer)세포, 후두암(laryngeal cancer)세포, 췌장암(pancreatic cancer)세포, 방광암(bladder cancer)세포, 결장암(colon cancer)세포, 자궁경부암( cervical cancer)세포, 전립선암(prostate cancer)세포, 신장암(renal cancer)세포, 구강편평상피암종((oral squamous cell carcinoma, OSCC)세포로 이루어지는 군에서 선택된 암세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 하부 챔버에 접종하는 암조직유래-섬유모세포(CAF)는 폐암(lung cancer)조직, 피부암(skin cancer)조직, 위암(stomach cancer)조직, 대장암(intestinal cancer) 조직, 결장암(colon cancer) 조직, 췌장암(pancreatic cancer) 조직, 간암(liver cancer) 조직, 갑상선암(thyroid cancer) 조직, 자궁암(uterine cancer) 조직, 자궁경부암(cervical cancer) 조직, 난소암(ovarian cancer) 조직, 고환암(testicular cancer) 조직, 전립선암(prostate cancer) 조직, 유방암(breast cancer) 조직, 및 구강암(oral cancer) 조직으로 이루어지는 군에서 선택된 조직에서 유래된 섬유모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 다공성 필터를 통과하여 필터 아래 쪽에 부착된 암세포를 고정시킨 후 염색하여 염색된 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 상부 챔버(upper-chamber), 하부 챔버(lower-chamber) 및 상기 상부 챔버 및 하부 챔버를 격리하는 다공성 필터(porous filter)로 이루어지는 다중 챔버에서, 상부 챔버에 암세포가 접종되어 있고, 하부 챔버에 암조직유래-섬유모세포(carcinoma-associated fibroblasts, CAF)가 접종되어 있고, 상기 다공성 필터는 콜라겐(collagen)으로 코팅된 것을 특징으로 하는 암세포 침윤 저해제의 스크리닝 시스템.
  9. 삭제
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