BR112016030723B1

BR112016030723B1 - Meios de cultura de células, método para indução da morte celular de células-tronco indiferenciadas e métodos para seleção de cardiomiócitos

Info

Publication number: BR112016030723B1
Application number: BR112016030723-2A
Authority: BR
Inventors: Keiichi Fukuda; Jun Fujita; Shugo TOHYAMA
Original assignee: Heartseed Inc
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2024-01-09
Also published as: RU2017104838A; JP6333378B2; BR112016030723A2; US20170327787A1; AU2015290571B2; CN107075475B; JPWO2016010165A1; KR102241348B1; CN107075475A; EP3170894A4; BR112016030723B8; EP3170894A1; SG11201700023WA; RU2017104838A3; AU2015290571A1; RU2728188C2; IL249813A0; CA2954242C; WO2016010165A1; KR20170031152A

Abstract

REMOÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO INDIFERENCIADAS NOVAS E MEIO DE CULTURA PARA PURIFICAÇÃO E REFINAMENTO DE CARDIOMIÓCITOS. A presente invenção tem como objetico encontrar novas condições para possibilitar a indução da morte celular de não- cardiomiócitos ou células-tronco indiferenciadas de forma mais completa e a seleção apenas de cardiomióticos. Para atingir este objetivo, são oferecidos no presente pedido: um meio de cultura de células para uso na indução da morte celular de células-tronco indiferenciadas, onde o meio de cultura de células é livre de glutamina no perfil de aminoácidos; e também um método para induzir a morte celular de não-cardiomiócitos sendo feita uma cultura de células no referido meio de cultura de células. São ainda oferecidos neste pedido: um meio de cultura de células para uso na seleção de cardiomiócitos, onde o meio de cultura de células é suplementado com lactato, piruvato ou um ácido graxo, livre de açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos; e também um método para selecionar cardiomiócitos por cultivo de uma mistura de cardiomiócitos e não-cardiomiócitos no referido meio de cultura de células.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se ao fornecimento de meios de cultura que podem ser usados para eliminação de células-tronco indiferenciadas (SCs) e purificação e refinamento de cardiomiócitos (CMs).

Técnica Anterior

[002] Nos indivíduos adultos, os cardiomiócitos não possuem ati vidade proliferativa, de modo que para tratar doenças miocardíacas graves tais como infarto do miocárdio e cardiomiopatia, convencionalmente não há escolha a não ser contar com transplante de coração. No entanto, nos últimos anos, com o avanço dos estudos sobre células-tronco pluripotentes (PSCs) tais como células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), vem se tornando possível induzir a diferenciação de tais PSCs para preparar CMs, e usar tais CMs induzidos em transplante médico.

[003] Neste contexto, no entanto, a diferenciação de cardiomióci-tos em condições não fisiológicas (isto é, condições in vitro) ocorre de maneira similar ao caso do desenvolvimento fisiológico de CMs: primeiro são formadas células mesodérmicas indiferenciadas e em seguida as células mesodérmicas indiferenciadas se diferenciam - algumas delas se diferenciam através de cardiomiócitos presuntivos (precardiac mesoderma pré-cardíaco) - em CMs. Além disso, PSCs são essencialmente capazes de se diferenciar em todos os tipos de células que constituem órgãos. Por estes motivos, é tecnicamente difícil permitir que as PSCs se diferenciem em um único tipo limitado de células, isto é, apenas CMs, simplesmente induzindo a diferenciação das PSCs. Também, em condições não fisiológicas (isto é, condições in vitro), é difícil provocar a diferenciação desejada de todas as PSCs, e algumas PSCs podem permanecer indiferenciadas depois da indução de diferenciação.

[004] Portanto, quando SCs são induzidas in vitro a se diferencia rem em CMs, existem vários fatores prejudiciais para aplicações clínicas, inclusive transplante: por exemplo, todas as PSCs têm potencial para produzir como um subproduto outros tipos de células que não CMs, e algumas PSCs podem permanecer indiferenciadas. Em particular, SCs indiferenciadas residuais têm atividade proliferativa e são capazes de se diferenciarem em uma ampla variedade de células; assim sendo, se algumas SCs indiferenciadas permanecerem nas células transplantadas no corpo para tratamento, há um risco significativamente alto de que teratomas possam ser formados a partir das SCs indiferenciadas (Literatura Não Patentária 1 (Miura, et al., Nature Biotech., 743-745, 2009)). Por esses motivos, massas celulares contendo CMs preparados por indução da diferenciação de PSCs difíceis de serem transplantadas no corpo no estado em que se encontram e de serem usadas para fins terapêuticos. Por conseguinte, para conduzir de forma segura terapias médicas com o uso de CMs derivados de PSCs e obter a eficácia ideal dessas terapias, é necessário descobrir um método para eliminar completamente as SCs indiferenciadas e purificar altamente os CMs (isto é, um método para eliminar outros tipos de células que não os CMs).

[005] Até aqui já foram reportados alguns métodos para eliminar seletivamente SCs indiferenciadas em condições de cultura (Literatura Não Patentária 2 (Ben-David, et al., Cell Stem Cell, 2013 12, págs. 167-179), Literatura Não Patentária 3 (Wang, et al., Science, 325, 435439, 2009)), e Literatura Não Patentária 4 (Shiraki, et al., Cell Metabolism, 2014, 19, 1-15). Na Literatura Não Patentária 2, foi descoberto que o oleato é importante para manter PSCs indiferenciadas humanas, e que com o auxílio desta exigência ao contrário, PSCs indiferenciadas humanas podem ser seletivamente eliminadas por inibição da biossín- tese de oleato em PSCs indiferenciadas humanas. Na Literatura Não Patentária 3, foi descoberto que ESCs murinas conseguem colonizar em meios de cultura individualmente destituídos de cada um dos outros aminoácidos que treonina, mas não conseguem colonizar em um meio de cultura destituído de treonina, e que PSCs indiferenciadas murinas podem ser seletivamente eliminadas por cultivo das mesmas em um meio de cultura destituído de treonina. Na Literatura Não Pa- tentária 4, foi descoberto que a metionina desempenha nas PSCs humanas o mesmo papel que aquele desempenhado pela treonina nas ESCs murinas, e que SCs indiferenciadas humanas podem ser seletivamente eliminadas em um meio de cultura destituído de metionina, no qual as SCs indiferenciadas sofrem morte celular ou diferenciam- se.

[006] No entanto, os métodos descobertos nessas literaturas permitem a eliminação de PSCs indiferenciadas, mas não a eliminação de não cardiomiócitos (não CMs) que são produzidas através de indução da diferenciação de PSCs em outros tipos de células que não CMs. Além disso, os métodos das Literaturas Não Patentárias 3 e 4 eliminam os certos aminoácidos essenciais que são muito importantes para a síntese de proteínas, de modo que há a preocupação de que a ausência desses aminoácidos possa ter alguma influência sobre células sobreviventes desejadas.

[007] Assim sendo, um grupo de estudo com os presentes inven tores focou-se não nos aminoácidos essenciais que são muito importantes para a síntese de proteínas, mas sim nos aminoácidos não essenciais que podem ser sintetizados ou fornecidos a partir de outras fontes, e desenvolveram estudos tendo em vista a eliminação eficiente não só das SCs indiferenciadas que permanecem sem serem induzidas a se diferenciarem quando as PSCs são induzidas a se diferenciarem em CMs, mas também não CMs que são produzidos como um subproduto da indução de diferenciação de CMs. Como resultado, o grupo de inventores descobriu características fisiológicas diferentes que os CMs possuem, mas que outros tipos de células não possuem, e desenvolveram um método para selecionar CMs apenas a partir de não CMs e SCs indiferenciadas através do uso dessas características fisiológicas.

[008] Literatura Patentária 1: Um método para selecionar CMs a partir de uma mistura de células contendo CMs sem alteração genética dos CMs com base em um teor relativo de mitocôndrias celulares e/ou um potencial transmembrana mitocondrial relativo da célula; um método para enriquecer CMs a partir de uma mistura de células contendo CMs sem alteração genética dos CMs; um método para produzir CMs sem alteração genética dos CMs; e um método para avaliar a proporção de CMs em uma mistura de células contendo CMs (WO 2006/022377);

[009] Literatura Patentária 2: CMs derivados de ESCs podem ser eficientemente e altamente selecionados e purificados por cultivo dos CMs em um meio de cultura nas seguintes condições: uma condição suplementada com baixo teor de soro, uma condição suplementada com baixo teor de glicose, uma condição de baixo valor nutricional, uma condição de baixo teor de cálcio, uma condição de pH ligeiramente ácido, uma condição suplementada com baixo teor de lactato, uma condição suplementada com aspartato/glutamato, e/ou uma condição suplementada com piruvato (WO 2007/088874);

[0010] Literatura Patentária 3: Um método para preparar massas celulares de CMs derivados de PSCs, caracterizado pelo fato de que os CMs purificados derivados de PSCs obtidas por dissociação de massas celulares agregadas contendo CMs diferenciados e induzidos a partir de PSCs em células individuais são cultivadas em meio de cultura em condição livre de soro, e com isso os CMs purificados são re- agregados (WO 2009/017254);

[0011] Literatura Patentária 4: Um método para induzir de forma extremamente eficiente a morte celular de outras células que não CMs por adição de uma substância que reconhecidamente não tem toxicidade física ou atividade indutora de morte celular para as condições de cultura para PSCs ou não CMs (WO 2010/114136); e

[0012] Literatura Patentária 5: Um método para medir o potencial de atividade de CMs cultivados, que compreende colocar um fluoro- cromo sensível a potencial em contato com CMs sendo cultivados em um meio de cultura, adicionar vitamina E e/ou colesterol ao meio de cultura, e mediar as alterações na intensidade fluorescente do fluoro- cromo sensível a potencial dependendo das alterações no potencial ou na resistência iônica (WO 2011/052801).

[0013] Extraordinariamente, na Literatura Patentária 2, foi desco berto que CMs são altamente tolerantes de cultura nas condições que geralmente são consideradas condições severas para cultura de células (por exemplo, uma condição suplementada com baixo teor de glicose, uma condição suplementada com baixo teor de soro, uma condição de pH ligeiramente ácido, uma condição de baixo teor de cálcio, uma condição de baixo valor nutricional, uma condição suplementada com baixo teor de lactato, uma condição suplementada com asparta- to/glutamato, e/ou uma condição suplementada com piruvato), e que em tais condições, somente os CMs sobrevivem e os outros tipos de células diferentes dos CMs (isto é, não CMs e SCs indiferenciadas) sofrem morte celular, e consequentemente é possível selecionar os CMs. Além disso, o estudo em PSCs murinas mostrou que o uso de particularmente uma condição suplementada com baixo teor de glicose e uma condição suplementada com baixo teor de lactato entre as condições mencionadas acima contribui de forma mais eficiente para a seleção de CMs, e, portanto, foi feita uma investigação para determinar se uma condição suplementada com baixo teor de glicose e uma condição suplementada com baixo teor de lactato podem ser usadas com o propósito de selecionar CMs derivados de PSCs humanas (hPSCs).

[0014] Entretanto, o estudo de CMs derivados de hPSCs revelou que na condição de cultura suplementada com baixo teor de glicose e na condição de cultura suplementada com lactato, é possível eliminar SCs indiferenciadas e coletar CMs, mas demora para eliminar as SCs indiferenciadas e que nas aplicações clínicas que usam centenas de milhões de células, é bastante provável que as SCs indiferenciadas fiquem misturadas com os CMs. Por conseguinte, faz-se necessário um sistema que consiga eliminar SCs indiferenciadas de forma mais completa e em um espaço de tempo mais curto.

[0015] As células adquirem a maior parte da energia necessária para sua sobrevivência produzindo ATO através de diferentes mecanismos baseados na reação catabólica da glicose. As vias até a produção de ATP baseada na reação catabólica da glicose são sabidamente compostas principalmente de: o sistema glicolítico que é um processo de degradação da glicose incorporada nas células em pi- ruvato; o ciclo de TCA (ciclo de ácido cítrico) que opera com acetil- CoA geerada pela degradação do piruvato; e o sistema de transporte de elétrons que produz APT a partir de NADH, NADPH, e FADH2 gerado no sistema glicolítico e no ciclo de TCA.

[0016] Em geral, as células adquirem energia com base na pré-condição de que elas capturam glicose do ambiente. Quando as células adquirem energia com base nessa premissa, o sistema glicolítico é ativado, de modo que depois que a glicose é degradada no sistema glicolítico, a energia é adquirida através do ciclo de TCA (ciclo de ácido cítrico) e do sistema de transporte de elétrons. Quando energia é rapidamente necessária, a energia é obtida por respiração anaerógica com o pleno uso do sistema glicolítico; por conseguinte, a produção de piruvato ultrapassa seu consumo, dessa forma levando à ativação da via de fermentação de lactato. Em contraste, a reação inversa para converter o lactato de volta em piruvato relativamente não é ativada. LISTA DE REFERÊNCIAS LITERATURAS PATENTÁRIAS [Literatura Patentária 1] WO 2006/022377 [Literatura Patentária 2] WO 2007/088874 [Literatura Patentária 3] WO 2009/017254 [Literatura Patentária 4] WO 2010/114136 [Literatura Patentária 5] WO 2011/052801 LITERATURAS NÃO PATENTÁRIAS [Literatura Não Patentária 1] Miura et al., Nature Biotech., 743-745, 2009 [Literatura Não Patentária 2] Ben-David, et al., Cell Stem Cell, 2013 12, págs. 167-179 [Literatura Não Patentária 3] Wang, et al., Science, 325, 435-439, 2009 [Literatura Não Patentária 4] Shiraki, et al., Cell Metabolism, 2014, 19, 1-15

Sumário da Invenção Problema Técnico

[0017] Como mencionado acima, quando a cultura de células é feita na condição suplementada com baixo teor de glicose e na condição suplementada com lactato como definido na Literatura Patentária 2, não CMs sobreviventes ou SCs indiferenciadas podem estar presentes em pequenos números dependendo da condição. Por conseguinte, faz-se necessário encontrar novas condições que possibilitem eliminar SCs indiferenciadas em um espaço de tempo mais curto e, consequentemente, induzir a morte celular de não CMs ou SCs indiferenciadas de forma mais completa e selecionar apenas os CMs.

Solução para o Problema

[0018] Para atingir os objetivos mencionados acima, são ofereci dos no presente pedido: um meio de cultura de células para uso na indução de morte celular de SCs indiferenciadas, onde o meio de cultura de células é livre de glutamina no perfil de aminoácidos; e também um método para induzir a morte celular de SCs indiferenciadas sendo feita uma cultura de células no referido meio de cultura de células. São ainda oferecidos neste pedido: um meio de cultura de células for use in selecting CMs, onde o meio de cultura de células é suplementado com um ácido graxo, lactato or piruvato, livre de açúcar, e livre de glutami- na no perfil de aminoácidos; e também um método para selecionar CMs por cultivo de uma mistura de CMs e não CMs no referido meio de cultura de células.

Efeitos Vantajosos da Invenção

[0019] De acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, é possível oferecer um meio de cultura de células para uso na indução de morte celular de SCs indiferenciadas; e simplesmente fazendo uma cultura de células usando o referido meio de cultura de células, SCs indiferenciadas podem ser facilmente induzidas a sofrer morte celular. Também, de acordo com o segundo aspecto desta invenção, é possível oferecer um meio de cultura de células para uso na seleção de CMs; e simplesmente fazendo uma cultura de células using o referido meio de cultura de células, não apenas SCs indiferenciadas, tais como PSCs incluindo ESCs humanas (hESCs) e iPSCs humanas (hiPSCs), como também outras células diferenciadas que não CMs, e células estabelecidas, segundo definição abaixo, podem ser facilmente induzidas a sofrer morte celular, e consequentemente, CMs podem ser sele-cionados.

Breve Descrição dos Desenhos

[0020] A FIG. 1 mostra alterações nas concentrações no meio de aminoácidos e glicose consumidos quando 2.5*105 hESCs são cultivadas por 3 dias. As concentrações de aminoácidos e glicose no dia 0 antes de expostos às células foram expressas como 100%.

[0021] A FIG. 2 mostra os resultados da observação da coloração de fosfatase alcalina (ALP) de hESCs cultivadas em diferentes condições (com/sem glicose, com/sem lactato, e sem qualquer um dos diferentes aminoácidos não essenciais que foram altamente consumidos como visto na FIG. 1).

[0022] A FIG. 3 mostra os resultados da observação da sobrevi vência ou morte das hESCs cultivadas em diferentes condições (com/sem glicose, com/sem lactato, e sem qualquer um dos diferentes aminoácidos não essenciais que foram altamente consumidos como visto na FIG. 1).

[0023] A FIG. 4 mostra os resultados da observação da coloração de fosfatase alcalina (ALP) de hiPSCs cultivadas em diferentes condições (com/sem glicose, com/sem lactato, e sem qualquer um dos diferentes aminoácidos não essenciais que foram altamente consumidos como visto na FIG. 1).

[0024] A FIG. 5 mostra os resultados da observação da coloração de fosfatase alcalina (ALP) de hESCs cultivadas em diferentes condições que são livres de glicose e também livre de quaisquer aminoáci- dos diferentes.

[0025] A FIG. 6 mostra os resultados da observação da sobrevivência ou morte dos CMs neonatais murinos cultivados em diferentes condições (com/sem glicose, com/sem lactato, e sem qualquer um dos diferentes aminoácidos não essenciais que foram altamente consumidos como visto na FIG. 1).

[0026] A FIG. 7 mostra as fotos das massas celulares que foram obtidas por indução de diferenciação bidimensional de CMs a partir de hiPSCs e em seguida cultivados em um meio livre de glicose e suplementado com lactato (Gluc-, All+, Lactato+) ou um meio livre de glicose e de glutamina e suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+).

[0027] A FIG. 8 mostra que quando as massas celulares obtidas na FIG. 7 foram dissociadas com tripsina EDTA a 0.25% e cultivadas em um prato de cultura revestido com fibronectina, somente os CMs sobreviveram. B: A maioria dos CMs positivos para a-actinina eram positivas para troponina I. C: Foi confirmado que depois do refinamento e purificação usando o meio livre de glicose e de glutamina e suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+), nenhuma SC indiferenciada positiva para Tra1-60 sobreviveu.

[0028] A FIG. 9 mostra os resultados da análise por QPCR de SCs indiferenciadas residuais depois de diferenciação de CMs ou depois de refinamento e purificação. Lin28 foi detectada depois de refinamento e purificação usando o meio livre de glicose, suplementado com gluta- mina e suplementado com lactato (Gluc-, All+, Lactato+), ao passo que nenhuma Lin28 foi detectada depois de refinamento e purificação usando o meio livre de glicose e de glutamina e suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+).

[0029] A FIG. 10 mostra a diferença no metabolismo de lactato entre CMs neonatais murinos e hESCs em uma condição de cultura livre de glicose e de glutamina. Tratando as amostras de células com um meio de cultura suplementado com lactato marcado com 13C e quantificando as mesmas quanto aos metabólitos no ciclo de TCA e à bios- síntese de glutamato, é possível analisar quanto lactato é metabolisa- do. A FIG. 10A mostra um mapa esquemático do metabolismo relacionado ao lactato. Foi descoberto que a quantidade total de metabólitos derivados de lactato no ciclo de TCA era significativamente alto nos CMs. Também, marcadores 13C foram detectados em quantidades significativamente mais altas em 2-oxoglutarato e glutamato nos CMs. Os dados acima mostram que nos CMs, o lactato contribuiu de forma mais significativa para a biossíntese de glutamato. *p<0.05, **p<0.01.

[0030] A FIG. 11 mostra os resultados da análise por FACS da percentagem de células positivas para troponina T em grupos de células obtidos depois da indução de diferenciação de hiPSCs.

[0031] A FIG. 12 mostra os resultados da observação da coloração de fosfatase alcalina (ALP) de hESCs cultivadas em diferentes condições (sem glicose, com/sem glutamina, com/sem a-cetoglutarato, e com/sem piruvato).

[0032] A FIG. 13 mostra os resultados da observação da sobrevivência ou morte dos CMs neonatais murinos cultivados em diferentes condições (sem glicose, com/sem glutamina, com/sem piruvato, e com/sem lactato).

[0033] A FIG. 14A mostra os resultados da avaliação da sensibili dade de detecção de um método de detecção para SCs indiferenciadas residuais (Tano, et al., PLOS ONE, 2014). A FIG. 14B mostra os resultados da avaliação da presença de SCs indiferenciadas residuais depois da indução de diferenciação de CMs ou depois de refinamento e purificação seguindo-se o método testado na FIG. 14A. TRA1-60, um marcador de detecção para SCs indiferenciadas, foi detectado depois de refinamento e purificação usando um meio livre de glicose, suplementado com glutamina e suplementado com lactato (Gluc-, Gln+, Lac+), ao passo que o TRA1-60 não foi detectado depois de refinamento e purificação usando um meio livre de glicose e de glutamina e suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+).

[0034] A FIG. 15 mostra a sobrevivência ou morte de não CMs derivados de hESCs (proliferativas) cultivadas em uma condição suplementada com glutamina e livre de glicose e em uma condições suple- mentada com lactato e livre de glicose e de glutamina.

[0035] A FIG. 16 mostra os resultados da observação de diferentes grupos de hiPSCs cultivadas em cada um dos meios livres de glicose e de glutamina e suplementados com lactato (Gluc-, Gln-, Lac+) que foram ainda suplementados com ascorbato (25 mg/L) ou albumina (0.1%).

[0036] A FIG. 17 mostra os resultados da observação de diferentes grupos de não CMs derivados de hiPSCs cultivadas em cada um dos meios livres de glicose e de glutamina e suplementados com lactato (Gluc-, Gln-, Lac+) que foram ainda suplementados com ascorbato (25 mg/L) ou albumina (0.1%).

[0037] A FIG. 18 mostra os resultados da observação de diferentes grupos de CMs derivados de hiPSCs cultivadas em cada um dos meios livres de glicose e de glutamina e suplementados com lactato (Gluc-, Gln-, Lac+) que foram ainda suplementados com ascorbato (25 mg/L) ou albumina (0.1%).

[0038] A FIG. 19 mostra os resultados da observação de diferentes grupos de CMs derivados de hiPSCs cultivadas por 744 horas em cada um dos meios livres de glicose e de glutamina e suplementados com lactato (Gluc-, Gln-, Lac+) que foram ainda suplementados com ascorbato (25 mg/L) ou albumina (0.1%).

Descrição de Modalidades

[0039] O sistema glicolítico é um sistema fundamental para aquisição de energia que é encontrado na maioria dos organismos, e e uma via metabólica na qual a glicose é anaerobicamente degradada em piruvato ou lactato. No corpo dos animais, a glicose é fosforilada pelo grupo y-fosfato de ATP, ou a glicogenólise é ativada, para produzir gli- cose-6-fosfato, como uma primeira reação. Em seguida, o glicose-6- fosfato é sucessivamente metabolisado para frutose-1,6-bisfosfato, que é clivado para triose fosfato, e em seguida o triose fosfato é con- vertido em piruvato enquanto ATP é gerado. Durante este processo, 2 moles de ATP são produzidos, 2 moles de NAD+ são reduzidos, e 2 moles de NADH são produzidos, no total, por mol de glicose. O produto final dessa via metabólica, piruvato, é convertido em lactato e liberado das células, ou é transportado para a mitocôndria, agindo como um substrato do ciclo de ácido cítrico.

[0040] O ciclo de ácido tricarboxílico (ciclo de TCA ou ciclo de ácido cítrico) é uma via metabólica para finalmente oxidar complementa- mente os esqueletos de carbono de açúcares, ácidos graxos, muitos aminoácidos, entre outros. Por exemplo, olhando para o sistema glico- lítico, o produto final do sistema glicolítico, piruvato, é degradado para gerar acetil-CoA, e o acetil-CoA é condensado com oxaloacetato para gerar citrato. Em seguida, o citrato é convertido sucessivamente (via cis-aconitato) em isocitrato, que sofre desodrodescarboxilação para dar 2-oxoglutarato. Além disso, o 2-oxoglutarato sofre sucessivamente desidrodescarboxilação, eliminação de CoA, desidrogenação, hidratação, desidrogenação, e outras reações para se transfomar em succinil- CoA, succinato, fumarato, malato, e finalmente oxaloacetato. Em uma volta do ciclo de TCA, os grupos acetil no acetil-CoA são completamente oxidados; e na degradação de uma molécula de acetil-CoA, duas moléculas de CO2 são liberadas, três moléculas de NADH são produzidas, uma molécula de FAD reduzido é produzida, e uma molécula de GTP é produzida.

[0041] No entanto, o ciclo de TCA não é meramente um processo de degradação mas um ponto regulatório para trocas entre os sistemas metabólicos de açúcares, aminoácidos e ácidos graxos, funcionando como um ponto de partida importante para o metabolismo as- similatório. Por exemplo, quando a glicólise prossegue até certo ponto, as concentrações de citrato, etc. ficam altas e a acetil-CoA carboxilase é ativada, de modo que a operação do ciclo de TCA é suprimida den- tro de um certo limite e de modo que a acetil-CoA é desviada para a síntese de ácidos graxos. Também, por exemplo, oxaloacetato é transformado em aspartato. Assim sendo, como os intermediários da síntese de TCA são desviados para a biossíntese de várias substâncias orgânicas, a quantidade de oxaloacetato produzido em uma volta do ciclo de TCA comumente diminui. Portanto, para manter a operação uniforme do ciclo de TCA, são necessários sistemas separados para reabastecimento de oxaloacetato; e exemplos de tal sistema incluem: (junto com sistemas para degradação de cada um de alanina, glicina, cisteína, serina, e treonina em piruvato) um sistema para degradar pi- ruvato por piruvato carboxilase para fornecer oxaloacetato; um sistema para transaminar aspartato por aspartato transaminase para gerar oxa- loacetato; um sistema para degradar fenilalanina e tirosina para gerar fumarato; e um sistema para degradar arginina, glutamina, histidina e prolina em glutamato e então oxiding ar glutamato por glutamato desi- drogenase para fornecer 2-oxoglutarato.

[0042] Nos sistemas de aquisição de energia nas células animais, os átomos de hidrogênio e os elétrons gerados por diferentes reações de desidrogenação no sistema glicolítico e no ciclo de TCA como descrito acima são transportados para a mitocôndria por um doador de elétrons tal como NADH, NADPH ou FADH2, e passados para uma série de enzimas de redox, isto é, oxidorredutases (complexos), e carre- adores de elétrons (por exemplo, citocromas) encontradas na membrana mitocondrial interna. As enzimas são reduzidas pelo carreador de elétrons que carrega átomos de hidrogênio e elétrons para gerar água. Neste processo, os íons de H+ são transportados unidirecional- mente através da membrana para formar uma diferença de potencial eletroquímico de íons de H+ e, finalmente, ligações fosfato de alta energia como as encontradas em ATP são sintetizadas usando-se esta diferença de potencial eletroquímico.

[0043] Desde quando a cultura de células é feita nas diferentes condições de cultura conhecidas definidas na Literatura Patentária 2, não CMs sobreviventes ou SCs indiferenciadas podem estar presentes em pequenos números, os presentes inventores estudaram intensivamente com a finalidade de encontrar novas condições que possibilitem induzir a morte celular de não CMs ou SCs indiferenciadas de forma mais completa e em um espaço de tempo mais curto e selecionar apenas CMs.

[0044] Primeiro, os inventores investigaram aminoácidos ativamente consumidos em hPSCs medindo as concentrações de aminoá- cidos em um meio de cultura fresco e em um meio de cultura depois usado para cultura de células. Como resultado, foi descoberto que o consumo de serina (Ser), glutamina (Gln), arginina (Arg) e cistina (Cys2) é, em geral, alto em hPSCs. Também foi descoberto que o consumo de leucina (Leu), metionina (Met) e triptofano (Trp) é relativamente alto (FIG. 1). Entretanto, como há a preocupação de que a ausência de aminoácidos essenciais que não muito importantes para a síntese de proteínas, como nos casos das Literaturas Não Patentárias 3 e 4, pode ter uma influência nas células sobreviventes desejadas, os inventores fizeram estudos adicionais focando em aminoácidos não essenciais que podem ser sintetizados ou fornecidos a partir de outras fontes.

[0045] Como resultado do cultivo de hESCs ou hiPSCs na presença de glicose em diferentes condições de aminoácidos, foi descoberto que quando hESCs ou hiPSCs são cultivadas em meios de cultura de células que são suplementados com glicose (Gluc) mas são livres de serina (Ser), glicina (Gly), glutamina (Gln), ou arginina (Arg), o número de colônias de hESC ou hiPSC diminui (FIGs. 2A e 4A). Além disso, a análise do efeito dessas condições de cultura livres de aminoácidos sobre o número de colônias de hESC/hiPSC mostrou que em uma condição de cultura livre de glicose, glutamina (Gln), serina (Ser) & gli- cina (Gly), e arginina (Arg), nesta ordem, apresentaram o efeito mais potente (FIG. 3B).

[0046] Com base nesses resultados, os presentes inventores des cobriram que de acordo com a presente invenção, fazendo uma cultura de células em um meio de cultura que é livre de glutamina no perfil de aminoácidos (Gln-), SCs indiferenciadas, tais como PSCs incluindo hESCs e hiPSCs, e outras células diferenciadas que não CMs como definido abaixo, podem ser induzidas a sofrer morte celular; assim, os inventores concluíram esta invenção.

[0047] Por conseguinte, no primeiro aspecto da presente invenção,é oferecida uma invenção de um meio de cultura de células que é livre de glutamina no perfil de aminoácidos (Gln-). Com base nas descobertas mencionas acima, o meio de cultura de células do primeiro aspecto desta invenção pode ser ainda caracterizado por ser livre de serina e/ou glicina (Ser-, Gly-) e pode ser ainda caracterizado por ser livre de arginina (Arg-). Exemplos específicos do meio de cultura de células inventivo que podem ser usados incluem, porém sem limitação, os seguintes: - um meio de cultura de células que é livre de glutamina no perfil de aminoácidos (Gln-); - um meio de cultura de células que é livre de glutamina e serina no perfil de aminoácidos (Gln-, Ser-); - um meio de cultura de células que é livre de glutamina e glicina no perfil de aminoácidos (Gln-, Gly-); - um meio de cultura de células que é livre de glutamina, serina e glicina no perfil de aminoácidos (Gln-, Ser-, Gly-); - um meio de cultura de células que é livre de glutamina e arginina no perfil de aminoácidos (Gln-, Arg-); - um meio de cultura de células que é livre de glutamina, serina e arginina no perfil de aminoácidos (Gln-, Ser-, Arg-); - um meio de cultura de células que é livre de glutamina, glicina e arginina no perfil de aminoácidos (Gln-, Gly-, Arg-); e - um meio de cultura de células que é livre de glutamina, serina, glicina e arginina no perfil de aminoácidos (Gln-, Ser-, Gly-, Arg-).

[0048] Todos os aminoácidos mencionados acima estão relacionados com o metabolismo de açúcares e com o ciclo de TCA como descrito acima na seção intitulada "Campo Técnico". A glutamina é degradada em glutamato, que é então oxidado pela glutamato desi- drogenase para 2-oxoglutarato e introduzido no ciclo de TCA. A serina e a glicina são, cada uma delas, degradas em piruvato, que é então decomposto pela piruvato carboxilase para dar oxaloacetato e introdu-zido no ciclo de TCA.

[0049] O meio de cultura de células inventivo mencionado acima do primeiro aspecto desta invenção é um meio de cultura livre de soro ou uma alternativa para soro - outras condições para o meio inventivo, além daquelas dos aminoácidos particulares (isto é, glutamina, serina e/ou glicina, ou arginina), podem ser as mesmas que aquelas para meios de cultura de células comuns (por exemplo, meio de eagle modificado da Dulbecco (DMEM), meios de cultura do tipo MEM (por exemplo, α-MEM, MEM [BSS de Hank]), meios de cultura do tipo RPMI (por exemplo, RPMI 1640), meio de cultura F12, StemPro34, e mTeSR1).

[0050] De acordo com os estudos feitos pelos presentes inventores, os meios de cultura de células mencionados acima com perfis de aminoácidos únicos podem ser usados para induzir a morte celular de SCs indiferenciadas, e outras células diferenciadas que não CMs como definido abaixo. No entanto, para induzir a morte celular dessas células de forma mais eficiente, uma condição com baixo teor de glico- se (Gluc-) que é livre de açúcar pode ser adotada além das condições de perfil de aminoácidos mencionadas acima.

[0051] Conforme usado neste relatório, "células-tronco indiferenciadas (SCs)" refere-se a células-tronco tendo pluripotência ou multipo- tência que são comumente usadas no campo técnica ao qual a presente invenção pertence, e inclui ESCs, todos os outros tipos de PSCs (por exemplo, iPSCs) tendo características similares àquelas das ESCs, e SCs multipotentes na forma encontrada em células orgâni- cas/teciduais adultas, células da medula óssea e células sanguíneas de mamíferos. Conforme mencionado acima, "características similares àquelas das ESCs" podem ser definidas pelas características celulares biológicas específicas para ESCs, tais como a presença de marcadores (antigênicos) superficiais específicos para ESCs, a expressão de genes ESC-específicos, a capacidade de formação de teratoma ou a capacidade de formação de camundongo quimérico. Nesta invenção, é preferível que as SCs indiferenciadas sejam PSCs.

[0052] As SCs indiferenciadas também podem ser definidas por terem seus marcadores celulares únicos, tais como OCT3/4, NANOG, TRA1-60, TRA1-81, SSEA-3 e SSEA-4.

[0053] No que diz respeito à preparação de CMs a partir de PSCs,considera-se que à medida em que a diferenciação prossegue, as PSCs são convertidas em mesodermas indiferenciados e então em mesodermas cardíacos (ou cardiomiócitos presuntivos) e depois disso diferenciam-se em CMs. Por conseguinte, "cardiomiócitos (CMs)", conforme usado nesta invenção, é um conceito que inclui todos os tipos de células geradas durante a indução da diferenciação de SCs indiferenciadas em CMs, e cobre todos dentre mesodermas indiferenciados, mesodermas cardíacos (ou cardiomiócitos presuntivos), e os cardio- miócitos subsequentes como mencionado acima. Conforme indicado acima, "mesodermas indiferenciados" refere-se a células que observa- damente expressam proteínas de Brachyury específicas para meso- dermas indiferenciados. "Mesodermas cardíacos (ou cardiomiócitos presuntivos)" refere-se a células que observadamente expressam proteínas semelhantes à Mesp-1 específica para o mesoderma que começam a diferenciar-se no coração mas que observadamente ainda expressam proteínas CM-específicas como Nkx2.5 e actinina, e que possuem a capacidade de se diferenciarem exclusivamente em CMs sem a necessidade de qualquer indução adicional subsequente. Também, "cardiomiócitos" significa células viáveis que batem espontaneamente, ou células imobilizadas expressando marcadores tais como Nkx2.5, GATA4 e actinina.

[0054] No período fetal, a concentração de ácido graxo no sangue é de 0,1 mM ou menos e a concentração de lactato no sangue varia na faixa de 5-7 mM; por conseguinte, os CMs usam lactato como uma fonte de energia essencial (Tohyama S., et al., Cell Stem Cell., 2013;12:127-137). No período pós-natal, a concentração de ácido gra- xo no sangue aumenta para 0,2-0,4 mM e a concentração de lactato no sangue diminui para 0,5 mM; por conseguinte, os CMs usam ácidos graxos como uma fonte de energia essencial (Lopaschuk G.D., et al., Am J Physiol., 1991; 261:H1698-1705; Werner J.C., et al., 1987;22:552-556; Medina J.M., Biol Neonate., 1985;48:237-244; Lo- paschuk G.D., et al., J Cardiovasc Pharmacol., 2010;56:130-140).Quando os CMs pós-natais são estressados por isquemia, sobrecarga de pressão, etc., seu padrão de expressão gênica muda para o padrão fetal, de modo que elas ficam capazes de usar lactato como uma fonte de energia essencial como fazem os CMs fetais. Em geral, "cardiomió- citos (CMs)", ao contrário de outros tipos de células, possuem uma característica comum no sentido que eles podem usar lactato, piruvato e ácidos graxos em vez de glicose como uma fonte de energia. E de acordo com a presente invenção usando esta característica comparti- lhada em comum somente por CMs, e não por outros tipos de células, é possível conduzir a purificação de CMs. Portanto, as "CMs" usadas nesta invenção não são limitadas por sua origem ou pelo método de obtenção das mesmas. Exemplos dos CMs incluem, porém sem limitação: "CMs" obtidos por indução da diferenciação de PSCs; "CMs" coletadas de fetos, recém-nascidos e adultos humanos; "CMs" coletadas de fetos humanos, recém-nascidos e adultos de animais pertencentes aos mamíferos; e "CMs" obtidos por reprogramação direta de não CMs diferenciados.

[0055] Conforme usado na presente invenção, "células estabeleci das" refere-se a células imortalizadas que são capazes de autorrepli- cação em condições de cultura de células.

[0056] Na presente invenção, quando um meio de cultura de células é definido como sendo "livre" de qualquer um dos aminoácidos particulares (isto é, serina, glicina, glutamina, ou arginina) e/ou açúcar, é essencialmente desejável que o meio de cultura esteja completamente livres desses componentes, porém na medida em que o objetivo da invenção possa ser atingido, não é necessariamente exigido que o meio de cultura seja 100% destituído desses componentes, e é até mesmo aceitável que qualquer um desses aminoácidos esteja presente no meio de cultura de quantidades traço. Os teores aceitáveis dos aminoácidos particulares ou açúcar podem ser definidos com base na característica de que a cultura de células é feita em condições tais que SCs indiferenciadas, não CMs e células estabelecidas são induzidas a sofrer morte celular sem proliferar. Por exemplo, o meio de cultura de células usado nesta invenção é um meio caracterizado pelo fato de que o teor dos aminoácidos particulares ou açúcar seja menos de 10%, preferivelmente menos de 5%, mais preferivelmente menos de 1%, do teor em um meio de cultura comercialmente disponível comu- mente usado em cultura de células. Para citar alguns exemplos,

[0057] - meio de eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich) é um meio de cultura contendo 0,042 g/L de L-serina, 0,03 g/L de glicina, 0,584 g/L de L-glutamina, 0,84 g/L ou 0,084 g/L de L- arginina HCl, e 4,5-10 g/L de açúcar (D-glicose);

[0058] - meio de cultura F-12 (Sigma-Aldrich) é um meio de cultura contendo 0,02102 ou 0,0105 g/L de L-serina, 0,015014 g/L ou 0,00751 g/L de glicina, 0,1460-2922 g/L de L-glutamina, 0,4214 ou 0,211 g/L de L-arginina HCl, e 1,26-1,802 g/L de açúcar (D-glicose); e

[0059] - meio de cultura RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) é um meio de cultura contendo 0,03-0,3 g/L de L-Serina, 0,01-0,1 g/L de glicina, 0,3 g/L de L-glutamina, 0,2-2 g/L de L-arginina, e 2,0-20,0 g/L de açúcar (D-glicose). Portanto, quando um meio de cultura de células é definido como sendo "livre" de qualquer um dos aminoácidos particulares e/ou açúcar, é uma exigência que, tendo como referência a constituição de um meio de cultura comercial comumente usado em cultura de células como mencionado acima, o teor desses componentes seja reduzido para menos de 10%, preferivelmente menos de 5%, mais preferivelmente menos de 1%, do teor no meio comercial. Adicionalmente, "açúcar", conforme usado neste relatório, é um conceito que inclui todos os açúcares (isto é, polissacarídeos e monossacarídeos (por exemplo, glicose, galactose, frutose, manose)) encontrados em um meio de cultura.

[0060] De acordo com o primeiro aspecto da presente invenção descrito acima, SCs indiferenciadas podem ser induzidas a sofrer morte celular sendo feita uma cultura de células em um meio de cultura de células que é livre de glutamina no perfil de aminoácidos, ou em um meio de cultura de células que é livre de glutamina, assim como serina e glicina, no perfil de aminoácidos, ou em um meio de cultura de células que é livre de glutamina, serina e glicina, assim como arginina, no perfil de aminoácidos; e como consequência, os presentes inventores can disclose um método para induzir a morte celular de SCs indiferenciadas.

[0061] No primeiro aspecto da presente invenção, a fim de induzir a morte celular de SCs indiferenciadas, a cultura de células continua em qualquer uma das condições mencionadas acima livre dos amino- ácidos particulares por 12-360 horas, preferivelmente 24-240 horas, mais preferivelmente 48-120 horas.

[0062] Como mencionado acima, quando as diferentes condições de cultura para CMs como aquelas definidas na Literatura Patentária 2 são aplicadas a células humanas, não CMs sobreviventes ou SCs indiferenciadas podem estar presentes em pequenos números dependendo da condição. Por conseguinte, os presentes inventores investigaram então se os CMs podem ser selecionados de forma mais eficiente combinando as descobertas das condições de cultura para obter seletivamente CMs da maneira divulgada na Literatura Patentária 2 com as descobertas das condições de cultura para induzir a morte celular de SCs indiferenciadas mostradas no primeiro aspecto da presente in-venção.

[0063] Como resultado, foi descoberto que também no caso de células humanas, CMs podem ser selecionados de forma mais eficiente escolhendo-se, dentre as diferentes condições de cultura definidas na Literatura Patentária 2, uma condição com baixo teor de glicose e uma condição suplementada com lactato, piruvato ou um ácido graxo que pode ser usado como uma fonte de energia para CMs, e combinando-se essas condições selecionadas com as condições de cultura para induzir a morte celular de SCs indiferenciadas divulgadas acima na presente descrição.

[0064] Com base nesses resultados, os presentes inventores descobriram que, de acordo com a presente invenção, sendo feita uma cultura de células em meios de cultura que são suplementados com um ácido graxo, lactato ou piruvato, livres de açúcar, e livres de gluta- mina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-; ou Pyr+, Gluc-, Gln-), SCs indiferenciadas, tais como PSCs incluindo hESCs e hiPSCs, e outras células diferenciadas que não CMs, podem ser induzidas a sofrer morte celular (FIGs. 2B, 3B e 4B), e consequentemente, CMs podem ser seletivamente selecionados; por conseguinte, os inventores concluíram esta invenção.

[0065] Além disso, considerando o fato de que o consumo de Cys2 e Met é relativamente alto, os presentes inventores investigaram se SCs indiferenciadas (hESCs) são destruídas usando meios de cultura que são suplementados com lactato e livres de açúcar (Lactato+, Gluc-) e que são ainda livres de qualquer um dos aminoácidos mencionados acima. Como resultado, foi descoberto que em comparação com um meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Lacta- to+, Gluc-, Gln-), um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de Cys2 (Lactato+, Gluc-, Cys2-), e um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de Met (Lactato+, Gluc-, Met-) têm atividade indutora de morte celular apenas comparável com um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de treonina (Lactato+, Gluc-, Thr-) usado como controle -- a atividade indutora de morte celular do meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Lactato+, Gluc-, Gln-) é mais extraordinária (FIG. 5). Estes resultados sugerem que o meio livre de glicose e de glutamina é superior em termos da capacidade de eliminar SCs indiferenciadas residuais em relação aos meios livres de treonina ou de metionina nas Literaturas Não Patentárias 3 e 4.

[0066] Por conseguinte, no segundo aspecto da presente inven ção, é oferecida uma invenção de um meio de cultura de células caracterizado por ser suplementado com lactato, piruvato ou um ácido graxo (Lactato+ ou Pyr+), livre de glicose (Gluc-), e livres de glutamina no perfil de aminoácidos (Gln-). O meio de cultura de células do segundo aspecto desta invenção pode ser ainda caracterizado por ser livre de serina e/ou glicina (Ser-, Gly-) e ainda caracterizado por ser livre de arginina (Arg-). Exemplos específicos do meio de cultura de células inventivo que podem ser usados incluem, porém sem limitação, os seguintes: - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-); - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina e serina no perfil de ami- noácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-, Ser-); - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina e glicina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-, Gly-); - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina e glicina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-, Ser-, Gly-); - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina e arginina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina e arginina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-, Ser-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, glicina e arginina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-, Gly-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina, glicina e arginina no perfil de aminoácidos (Lactato+, Gluc-, Gln-, Ser-, Gly-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoáci- dos (Pyr+, Gluc-, Gln-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina e serina no perfil de aminoácidos (Pyr+, Gluc-, Gln-, Ser-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina e glicina no perfil de aminoácidos (Pyr+, Gluc-, Gln-, Gly-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina e glicina no perfil de aminoácidos (Pyr+, Gluc-, Gln-, Ser-, Gly-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina e arginina no perfil de aminoácidos (Pyr+, Gluc-, Gln-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina e arginina no perfil de aminoácidos (Pyr+, Gluc-, Gln-, Ser-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, glicina e arginina no perfil de aminoácidos (Pyr+, Gluc-, Gln-, Gly-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina, glicina e argini- na no perfil de aminoácidos (Pyr+, Gluc-, Gln-, Ser-, Gly-, Arg-); - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos; - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina e serina no perfil de aminoácidos; - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina e glicina no per fil de aminoácidos; - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina e glicina no perfil de aminoácidos; - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina e arginina no perfil de aminoácidos; - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina e argini- na no perfil de aminoácidos; - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina, glicina e argini- na no perfil de aminoácidos; - um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, baixo em açúcar, e livre de glutamina, serina, glicina e arginina no perfil de aminoácidos.

[0067] O meio de cultura de células inventivo pode ser suplementado com ascorbato ou albumina, ou ambos. Suplementação com as- corbato e/ou albumina não afeta a atividade indutora de morte celular do meio de cultura de células.

[0068] O meio de cultura de células inventivo mencionado acima do segundo aspecto desta invenção é um meio de cultura livre de soro ou uma alternativa para soro - outras condições para o meio inventivo, além daquelas de lactato, piruvato e um ácido graxo, glicose, e dos aminoácidos particulares (isto é, glutamina, serina e/ou glicina, ou ar- ginina), podem ser as mesmas que aquelas para meios de cultura de células comuns (por exemplo, Meio de eagle modificado da Dulbecco (DMEM), meio de cultura do tipo MEM (por exemplo, α-MEM, MEM [BSS de Hank]), meio de cultura do tipo RPMI (por exemplo, RPMI 1940), meio de cultura F12, StemPro34, e mTeSR1).

[0069] De acordo com os estudos feitos pelos presentes inventores, os meios de cultura de células mencionados acima tendo perfis de aminoácidos únicos são capazes de induzir a morte celular de SCs indiferenciadas, outras células diferenciadas que não CMs, e células estabelecidas, mas não são capazes de induzir a morte celular de CMs. Como resultado, o meio de cultura de células do segundo aspecto da presente invenção pode ser usado para selecionar CMs a partir de uma mistura de CMs e não CMs.

[0070] Na presente invenção, dizer que um meio de cultura de células é suplementado com lactato significa que o meio de cultura de células a ser usado é suplementado com lactato para dar uma concentração de 0,1-10 mM. Dizer que um meio de cultura de células é suplementado com piruvato significa que o meio de cultura de células a ser usado é suplementado com piruvato (ácido pirúvico) para dar uma concentração de 0,1-10 mM. Dizer que um meio de cultura de células é suplementado com um ácido graxo significa que o meio de cultura de células a ser usado é suplementado com um ácido graxo de cadeia média (um ácido graxo tendo 5-12 átomos de carbono) ou um ácido graxo de cadeia comprida (um ácido graxo tendo mais de 12 átomos de carbono). Por exemplo, oleato, linoleato, palmitato ou similar pode ser acrescentado para dar uma concentração de 0,05-0,5 mM.

[0071] Em contraste, no que diz respeito aos outros componentes,quando um meio de cultura de células é definido como sendo "livre" de qualquer um dos aminoácidos particulares (isto é, serina, glicina, glu- tamina, e arginina) e/ou açúcar, é essencialmente desejável que o meio de cultura esteja completamente livres desses componentes, porém na medida em que o objetivo da invenção possa ser atingido, não é necessariamente exigido que o meio de cultura seja 100% destituído desses componentes.

[0072] De acordo com o segundo aspecto da presente invenção, não CMs podem ser induzidos a sofrer morte celular sendo feita uma cultura de células em um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, piruvato ou um ácido graxo, livre de glicose, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos, ou em um meio de cultura de células suplementado com lactato/piruvato/ácido graxo e livre de glicose que é livre de glutamina, assim como serina e glicina, no perfil de aminoácidos, ou em um meio de cultura de células suplementado com lactato/piruvato/ácido graxo e livre de glicose que é livre de glutamina, serina e glicina, assim como arginina, no perfil de aminoácidos; e como consequência, os presentes inventores podem divulgar um método para induzir a morte celular de não CMs e dessa forma selecionar CMs cultivando-se uma mistura de CMs e não CMs. Conforme usado nesta invenção, "não cardiomiócitos (não CMs)" inclui todos os tipos de células que não CMs e células que no futuro serão induzidas a se diferenciarem em CMs - por exemplo, SCs indiferenciadas, não CMs diferenciados, ou células estabelecidas estão incluídas em "não cardiomióci- tos (não CMs)".

[0073] No segundo aspecto da presente invenção, para induzir a morte celular de não CMs, a cultura de células continua em qualquer uma das condições mencionadas acima livres dos aminoácidos particulares por 12-360 horas, preferivelmente 24-240 horas, mais preferivelmente 48-120 horas.

[0074] O meio de cultura de células inventivo pode ser suplementado com ascorbato ou albumina, ou ambos. Mesmo quando ascorbato e/ou albumina são adicionados, esta adição não tem influência na atividade indutora de morte celular ou na precisão da purificação de CMs do meio de cultura de células, e CMs podem ser cultivados por pelo menos 600 horas.

[0075] A seguir estão apresentados exemplos de trabalho da presente invenção. Estes exemplos destinam-se a descrever a invenção e não a limitar a invenção de forma alguma.

EXEMPLOS Exemplo 1: Cultura de Células

[0076] Neste exemplo, SCs indiferenciadas (ESCs e iPSCs) foram cultivadas, células diferenciadas foram cultivadas, e SCs indiferenciadas foram induzidas a se diferenciarem em CMs.

[0077] As ESCs humanas (hESCs) foram adquiridas do Professor Norio Nakatsuji, Stem Cell Research Center, Institute for Frontier Medical Sciences, National Universtiy Corporation Kyoto University. As iPSCs humanas foram adquiridas do Professor Shinya Yamanaka, Center for iPS Cell Research e Application, National University Corporation Kyoto University. As hESCs e hiPSCs foram submetidas à cultura indiferenciada de manutenção do estado usando Matrigel (BD Bioscience, Cat No. 354277). O meio de cultura usado foi mTeSR1 (STEMCELL Technologies Inc., Cat No. 11875-119). Além do mTeSR1, qualquer outro meio de cultura, como Essential 8 (Life Technologies) ou TeSR2 (STEMCELL Technologies Inc.), que é co- mumente usado como um meio sem alimentação, também pode ser usado como um meio de cultura para manter o estado indiferenciado. Também, além de Matrigel, qualquer outra matriz, como Vitronectina (Life Technologies) ou iMatrix-511 (Takara No. 892001), que é comu- mente usado como uma matriz sem alimentação, pode ser usasda.

[0078] Para passagem, colônias de hESC e hiPSC foram dissociadas com uma solução de CTK (Repro CELL) a 37°C por 5 minutos. Além da solução de CTK, StemPro Accutase (Life Technologies N° 1110501) ou TrypLE Express/Select (Life Technologies) também pode ser usado para tratamento de dissociação celular.

[0079] No presente teste, a diferenciação de CMs das SCs indife-renciadas foi induzida usando-se o seguinte procedimento. - Para diferenciação de CMs, depois que as hESCs ou hiPSCs atingiram 50-90% de confluência, o meio foi substituído pelo meio RPMI (Invitrogen) suplementado com B27 (sem insulina; Invitro- gen) e 6 μM de CHIR99021 (Selleckchem ou Wako) (dia 0). - Nos dias 1-2, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(-). - Nos dias 3-5, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(-)suplementado ainda com 5 μM de IWP2 ou 5 μM de IWR-1 (Sigma I0161). - Nos dias 6-7, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(-). - No dia 8 e depois disso, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(+) (Lian, X., et al., Nat Protocol, 2013, 8, 162175). Durante os dias 8-11, foi observada a presença de CMs pulsan- tes.

[0080] Para estabelecer a condição de que o meio de cultura este ja tão livre de açúcar quanto possível, devem ser feitas duas lavagens com PBS (Gluc-). Depois disso, uma cultura de células foi feita por 3-4 dias no meio de cultura D-MEM suplementado com 4 mM de lactato (Wako Pure Chemical, Cat No. 129-02666) (Lactato+), seja na presença de glutamina (Gln+) ou na ausência de glutamina (Gln-). A concentração lactato precisa ser ajustada para estar na faixa de 1-10 mM - neste exemplo, 4 mM de lactato foram acrescentados.

Exemplo 2: Necessidades aminoacídicas de SCs indiferenciadas cultivadas nas condições de cultura

[0081] Neste exemplo, hESCs ou hiPSCs foram usadas como SCs indiferenciadas e investigadas para ver quais aminoácidos são necessários pelas SCs indiferenciadas nas condições de cultura.

[0082] Para investigar os aminoácidos não essenciais e os amino- ácidos semi-essenciais particularmente consumidos ativamente nas hESCs, as concentrações de aminoácidos no meio de cultura foram medidas. Para sermos específicos, para cada tipo de células, 1,5x106 células foram cultivadas em um prato de 3,5 cm, e então a constituição do meio de cultura foi analisada antes e depois da cultura de células.

[0083] A análise dos aminoácidos foi feita segundo o sistema de Shimbo, et al. (Shimbo, K., Rapid Commun. Mass Spectrom., 2009, 23, 1483-1492). Depois da cultura de células, cada um dos sobrena- dantes foi colocado em um tubo de 1,5 mL e armazenado a -80°C até serem medidos. As amostras foram dedproteinadadas derivatizadas com um reagente APDS, e colocadas no analisador. As concentrações de aminoácidos nas amostras foram determinadas usando-se uma curva de calibração. Os 37 aminoácidos analisados foram os seguintes: glicina (Gly), sarcosina (Sar), alanina (Ala), ácido y-aminobutírico (GABA), ácido β-isoaminobutirico (b-AiBA), ácido a-aminobutírico (a- ABA), serina (Ser), prolina (Pro), valina (Val), treonina (Thr), taurina (Tau), hidroxiprolina (HyPro), isoleucina (Ile), leucina (Leu), asparagina (Asn), ornitina (Orn), aspartato (Asp), glutamina (Gln), lisina (Lys), glu- tamato (Glu), metionina (Met), histidina (His), ácido a-aminoadípico (a- AAA), hidroxilisina (HyLys), fenilalanina (Phe), 1-metil-histidina (1MeHis), 3-metil-histidina (3MeHis), arginina (Arg), citrulina (Cit), tiro- sina (Tyr), triptofano (Trp), cistationina (Cysthi), carnosina (Car), anse- rina (Ans), cistina (Cys2), alanina-glutamina (Ala-Gln), e glicina- glutamina (Gly-Gln).

[0084] Foi descoberto que as concentrações de serina, arginina, cistina e glutamina no meio particularmente diminui de forma significativa com o tempo de cultura.

[0085] Em seguida, para determinar a viabilidade das células culti vadas em diferentes condições, as hESCs (FIG. 2) e hiPSCs (FIG. 4) foram, cada uma delas, investigadas quanto a sua reatividade para diferentes condições aminoacídicas determinando-se a atividade de fosfatase alcalina (ALP) dessas células, com as células coloridas com o kit de coloração de fosfatase alcalina StemTAGTM (Sigma 86-R) sendo consideradas células viáveis.

[0086] Com base na constituição do DMEM alto em glicose (Invi- trogen) ("Gluc+" nas FIGs. 2A e 4A), foram preparados um meio de cultura livre de todos os quatro aminoácidos (isto é, glutamina, serina, glicina e arginina), assim como meios de cultura todos livres de qualquer um desses aminoácidos (isto é, serina apenas, serina/glicina apenas, arginina apenas, e glutamina apenas) na constituição básica do referido DMEM ("Ser-", "Ser-Gly-", "Arg-", e "Gln-", respectivamente). Como resultado da cultura de hESCs e hiPSCs em cada uma das condições de cultura mencionadas acima por cerca de 48 horas, com as células cultivadas sendo então submetidas à coloração com ALP, foi descoberto que o número de colônieas de hESC ou hiPSC diminuía ao se fazer uma cultura de células, embora na presença de glicose, na condição livre de serina (Ser-), na condição livre de serina/glicina (Ser-Gly-), na condição livre de glutamina (Gln-), ou na condição livre de arginina (Arg-). No entanto, mesmo depois de cultura de células por 48 horas, colônias de células indiferenciadas ALP-positivas foram ob-servadas em grandes números (FIGs. 2A, 4A).

[0087] Em seguida, com base na constituição do DMEM livre de glicose (Invitrogen), com lactato (4 mM) sendo acrescentado ao mesmo ("Gluc-, Lactato+" nas FIGs. 2B e 4B), foram preparados um meio de cultura livre de todos os quatro aminoácidos (isto é, serina, glicina, arginina e glutamina) na constituição básica do DMEM, assim como meios de cultura todos livres de qualquer um desses aminoácidos (isto é, serina alone, serina/glicina apenas, arginina apenas, e glutamina apenas) na constituição básica do DMEM ("Ser-", "Ser-Gly-", "Arg-" e "Gln-", respectivamente). Como resultado da cultura de hESCs e hiPSCs em cada uma das condições de cultura mencionadas acima por cerca de 48, com as células cultivadas sendo então submetidas à coloração com ALP, foi descoberto que nos grupos de amostras cultivados no meio livre dos quatro aminoácidos na constituição do DMEM livre de glicose, ou no meio livre de glutamina apenas (Gln-) na constituição do DMEM livre de glicose, as colônias de hESCs ou hiPSC ALP-positivas desapareceram significativamente em 24 horas e desapareceram completamente em 48 horas (FIGs. 2B, 4B).

[0088] Levando em consideração a FIG. 1 que mostra que o con sumo de Cys2 e Met nas hESCs é relativamente alto, foi investigado se SCs indiferenciadas (hESCs) conseguem sobreviver mesmo quando cultivada usando-se meios de cultura que são suplementados com lactato e livres de açúcar (Lactato+, Gluc-) e que são ainda livres de quaisquer dos aminoácidos mencionados acima. Quanto aos meios de cultura, com base na constituição do DMEM livre de glicose (Invitro- gen), com lactato (4 mM) sendo acrescentado ao mesmo ("Gluc-, Lac- tato+"), foram preparados e usados meios de cultura todos livres de qualquer um dos quatro aminoácidos (isto é, glutamina apenas, cistina apenas, metionina apenas, e treonina apenas) na constituição básica do referido DMEM ("Gln-", "Cys2-", "Met-" e "Thr-", respectivamente). Depois de cultivadas por 24 horas usando cada um dos meios de cultura, as células foram determinadas quanto a sua atividade de fosfa- tase alcalina (ALP) por coloração das mesmas com o kit de coloração de fosfatase alcalina StemTAGTM (Sigma 86-R) e observação das células coloridas de vermelho como células viáveis. Como resultado, foi descoberto que em comparação com um meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Lactato+, Gluc-, Gln-), um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de Cys2 (Lactato+, Gluc-, Cys2-), e um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de Met (Lactato+, Gluc-, Met-) possuem atividade indutora de morte celular equiparável apenas àquela de um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de treonina (Gluc-, Lactato+, Thr-) usado como controle - a atividade indutora de morte celular do meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Gluc-, Lactato+, Gln-) é mais extraordinária (FIG. 5). Esses resultados sugerem que o meio livre de glicose e de glutamina é superior em termos da capacidade de eliminar SCs indiferenciadas residuais em relação aos meios livres de treo- nina ou de metionina divulgados nas Literaturas Não Patentárias 3 e 4. Exemplo 3: Reatividade das células para diferentes condições do meio de cultura

[0089] Neste exemplo, foi esclarecido como mudam os índices de sobrevivência de SCs indiferenciadas e CMs quando as mesmas são cultivadas em diferentes condições do meio de cultura.

[0090] Quanto aos meios de cultura usados neste exemplo, com base na constituição de DMEM livre de glicose (Invitrogen), seja com lactato (4 mM) sendo acrescentado ao mesmo (Gluc-, Lactato+) ou sem lactato sendo acrescentado ao mesmo (Gluc-, Lactato-), foram preparados meios de cultura todos livres ainda de qualquer um dos quatro aminoácidos (isto é, arginina apenas, glutamina apenas, serina apenas, e glicina apenas) ("Arg-", "Gln-", "Ser-" e "Gly-", respectivamente). Depois que as SCs indiferenciadas (hESCs) ou CMs neonatais muri- nos foram cultivados por cerca de 24 horas em cada uma das condições de cultura mencionadas acima, as células foram coloridas usando-se um kit de coloração dupla de células vivas/mortas (TaKaRa Bio, Inc.), imageadas (FIGs. 3A e 6A), e contadas para determinar seus índices de sobrevivência celular (FIGs. 3B e 6B).

[0091] A FIG. 3 mostra os resultados da observação da sobrevivência ou morte das SCs indiferenciadas (hESCs) cultivadas nas diferentes condições livres de qualquer um dos diferentes aminoácidos não essenciais que foram altamente consumidos como mostrado na FIG. 1, e com base nisso, determinando-se seus índices de sobrevivência celular. Os resultados revelaram que o índice de sobrevivência das SCs indiferenciadas foi significativamente reduzido quando as mesmas foram cultivadas em meios de cultura livres de glutamina independente de serem suplmentados ou não suplementados com lactato ("Lactato+, Gluc-, Gln-" ou "Lactato-, Gluc-, Gln-") (FIG. 3).

[0092] A FIG. 6 mostra os resultados obtidos da mesma maneira observando-se a sobrevivência ou morte dos CMs neonatais murinos cultivados nas diferentes condições livres de qualquer um dos diferentes aminoácidos não essenciais que foram altamente consumidos como mostrado na FIG. 1, e com base nisso, determinando-se seus índices de sobrevivência celular. Os resultados revelaram que o índice de sobrevivência dos CMs neonatais foi significativamente melhorado quando as mesmas foram cultivadas no meio de cultura livre de gluta- mina porém suplementado com lactato (Lactato+, Gluc-, Gln-), ou em outras palavras que a atividade indutora de morte celular de um meio livre de glutamina (Gln-) é reduzida pela adição de lactato (FIG. 6).

Exemplo 4: Indução de diferenciação de cardiomiócitos (CMs) das iPSCs em condições de cultura

[0093] Este exemplo destina-se a esclarecer o procedimento para induzir a diferenciação de CMs de hiPSCs.

[0094] - Para diferenciação de CMs, depois que as hiESCs atingi ram 50-90% de confluência, o meio foi substituído pelo meio RPMI (In- vitrogen) suplementado com B27 (sem insulina; Invitrogen) e 6 μM de CHIR99021 (Selleckchem ou Wako) (dia 0).

[0095] - Nos dias 1-2, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(-).

[0096] - Nos dias 3-5, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(-)suplementado ainda com 5 μM de IWP2 ou 5 μM de IWR-1.

[0097] - Nos dias 6-7, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(-).

[0098] - No dia 8 e depois disso, uma cultura de células foi feita no meio RPMI/B27-insulina(+) (Lian, X., et al., Nat Protocol, 2013, 8, 162175). Durante os dias 8-11, foi observada a presença de CMs pulsan- tes (FIG. 4A).

[0099] Para estabelecer a condição em que o meio de cultura está substancialmente livre de açúcar, foram feitas duas lavagens com PBS (Gluc-). Depois disso, uma cultura de células foi feita por 3-4 dias no meio de cultura D-MEM suplementado com 4 mM de lactato (Wako Pure Chemical, Cat No. 129-02666) (Lactato+), seja na presença de glutamina (Gln+) ou na ausência de glutamina (Gln-). A concentração de lactato precisa ser ajustada para estar na faixa de 1-10 mM - neste exemplo, 4 mM de lactato foram usados.

Exemplo 5: Necessidades aminoacídicas de CMs diferenciados nas condições de cultura.

[00100] Neste exemplo, os CMs nos quais hiPSCs foram induzidos a se diferenciarem foram investigados para ver quais aminoácidos são necessários pelos CMs diferenciados nas condições de cultura.

[00101] A FIG. 7 mostra as fotos das células que foram cultivadas por 3 dias em um meio suplementado com glicose (FIG. 7A), um meio de livre glicose e suplementado com lactato (Cell Stem Cell, 2013 12:127-37) (Gluc-, All+, Lactato+) (FIG. 7B) ou um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln-, Lactato+) (FIG. 7C), e e então submetidas à imunocoloração.

[00102] Para a imunocoloração, as células foram imobilizadas com 4% de paraformaldeído por 15-30 minutos, e então coloridas com DAPI (Invitrogen) para os núcleos das células, e com anticorpo anti-a- actinina (Sigma) e IgG anti-camundongo de burro Alexa 546 (Invitro- gen) para estruturas estriadas, para dessa forma detectar emissões de fluorescência.

[00103] De acordo com as imagens de imunocoloração capturdas depois da cultura de células por 3 dias, apenas algumas das células cultivadas no meio livre de glicose e suplementado com lactato (com glutamina) (Gluc-, Gln+, Lactato+) e tendo núcleos coloridos com DAPI foram observadas como sendo negativas para a-actinina como um marcador de CMs (FIG. 7B), ao passo que quase 100% das células cultivadas no meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+) e tendo núcleos coloridos com DAPI foram positivas para a-actinina (FIG. 7C).

[00104] Estes resultados indicam que na condição de cultura suplementada com glutamina (FIG. 7B), outros tipos de células que não CMs sobreviveram em números pequenos, ao passo que na condição de cultura livre de glutamina (FIG. 7C), os CMs sobreviveram mas outros tipos de células que não CMs (isto é, SCs indiferenciadas, não CMs) foram induzidos a sofrer morte celular e desapareceram completamente.

[00105] De acordo com a predição do mecanismo por meio do qual essa diferença pode ocorrer com relação às vias metabólicas de açúcares, foi previsto que no caso de células comuns (SCs indiferenciadas e não CMs), a via de fornecimento de piruvato a partir do sistema glicolítico, a via de fornecimento de a-cetoglutarato a partir de glutami- na via glutamato, no fluxo sequencial do metabolismo de açúcares, contribuem bastante para a sobrevivência das células, mas a via de fornecimento de piruvato a partir de lactato geralmente é mantida contribuindo significativamente menos para a sobrevivência das células. Em contraste, foi previsto que no caso de CMs, não apenas a via de fornecimento de piruvato a partir do sistema glicolítico e a via de fornecimento de a-cetoglutarato a partir de glutamina via glutamato, mas também a via de fornecimento de piruvato a partir de lactato, contribu-em substancialmente para a sobrevência de CMs.

[00106] Como resultado, foi descoberto que CMs podem ser seletivamente selecionados de forma mais eficiente e em um espaço de tempo mais curto por cultivo de CMs induzidos a partir de hESCs ou hiPSCs (isto é, CMs em mistura com SCs indiferenciadas e não CMs) na condição suplementada com lactato, livre de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln-, Lactato+), em comparação com o caso de cultivo das células na condição de cultura suplementada com lactato, livre de glicose (com glutamina) (Gluc-, Gln+, Lactato+) (FIG. 7B).

[00107] A FIG. 8 mostra as massas de CMs que foram cultivadas por 4 dias no meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+), dissociado com 0,25% de tripsina EDTA, semeadas em um prato de cultura revestido com fibronectina (Sigma), e submetidas à imunocoloração. Para a imunocoloração, as células foram imobilizadas com 4% de paraformaldeído e então coloridas com anticorpo anti-α-actinina (Sigma), anticorpo anti-troponina I (Santacruz), e Anti-Tra1-60 (Millipore). Aqui, α-actinina e troponina I são marcadores CM-específicos, e Tra1-60 é um marcador PSC- específico.

[00108] Os resultados mostraram que quase todas as células que foram coloridas no núcleo com DAPI eram positivas para a-actinina e troponina I (FIGs. 8A e 8B). Para confirmar se as células cultivadas eram CMs, as células foram submetidas à coloração sobreposta para a-actinina e troponina I, e como resultado, as células coloridas com a- actinina estavam completamente de acordo com as células coloridas com troponina I (FIG. 8C). Também, para confirmar a presença de SCs indiferenciadas residuais, as células cultivadas foram analisadas quanto à presença de células Tra1-60-positivas, e como resultado, todas as células eram negativas para Tra1-60 (painel superior à direita na FIG. 8D). Por conseguinte, foi confirmado que as SCs indiferencia-das foram completamente eliminadas.

Exemplo 6: Detecção de SCs indiferenciadas residuais

[00109] Como um método de detecção para SCs indiferenciadas residuais, foi apresentado um método altamente sensível para qualificar a expressão do gene Lin28 por Q-PCR (PLOS ONE, 2012; 7(5): e37342). Em cada um dentre um meio suplementado com lactato, livre de glicose (Gluc-, All+, Lactato+) e um meio livre de glicose e de gluta- mina, suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+), hiPSCs foram induzidas a se diferenciarem em CMs, e cada frasco de células foi refinado e purificado por 4 dias e submetido à extração de mRNA para preparar cDNA. Como resultado da normalização dos níveis de expressão com 18S, Lin28 foi expresso nas células cultivadas no meio suplementado com lactato, livre de glicose (Gluc-, All+, Lactato+), ao passo que este marcador não foi absolutamente expresso nas células cultivadas no meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+) (FIG. 9). Estes resultados mostraram que o meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lactato+) é superior em termos da capacidade de eliminar SCs indiferenciadas em relação ao meio suplementado com lactato, livre de glicose (Gluc-, All+, Lactato+).

Exemplo 7: Análise do fluxoma de lactato (fluxo metabólico) em CMs em cultura em meio livre de glicose e de glutamina

[00110] Neste exemplo, o mecanismo de como os CMs metaboli- zam lactato e spbrevivem em uma condição de cultura livre de glicose e de glutamina foi investigado usando-se eletroforese capilar e espec- trometria de massas.

[00111] Para cada uma das hESCs e CMs neonatais murinos, o meio de cultura foi trocado por DMEM livre de glicose modificado (Invi- trogen) suplementado com 4 mM de lactato marcado com [13C] (Isotec). Depois de uma hora, as células foram lavadas em manitol a 10% (Wako) e mergulhadas em metanol contendo padrões internos (200 μM de L-metionina sulfona para cátions, e 200 μM de MES para ânions). Depois que as células e os meios de cultura foram recolhidos, eletroforese capilar e espectrometria de massas foram conduzidas usando-se um sistema de eletroforese capilar Agilent quipado com uma bomba de pressão de ar, um espectrômero de massas com detector seletivo de massas Agilent série 1100, uma bomba de cromato- grafia líquida de alta eficiência isocrática Agilent série 1100, um kit de adaptadores de eletroforese capilar e espectrometria de massas Agilent G1603A, e um kit de borrifadores de eletroforese capilar e espec- trometria de massas Agilent G1607A (Agilent Technologies). Os valores foram corrigidos contra os números de células. Nos CMs, metabóli- tos do ciclo de TCA foram detectados em quantidades significativamente altas (FIGs. 10A, 10B). No entanto, nas hESCs, os metabólitos foram observados apenas em pequenas quantidades (FIG. 10B). Isto sugeriu que nos CMs, em comparação com não CMs incluindo ESCs, lactato exógeno é metabolizado de forma mais eficiente através do ciclo de TCA. Surpreendentemente, marcadores [13C] foram detectados em quantidades significativamente mais altas em 2-oxoglutarato e glu- tamato nos CMs (FIGs. 10C, 10D). Estes resultados não só indicam que o lactato contribui bastante para a produção de ATP através do ciclo de TCA, como também sugere que mesmo em cultura em um meio livre de glutamina e de glutamato, o lactato contribui para a bios- síntese de 2-oxoglutarato e glutamato e compensa os mesmos, e isto explica porque os CMs sobrevivem.

Exemplo 8: Efeito da cultura do grupo de células obtido por indução de diferenciação de hiPSCs, na condição de cultura suplementada com lactato, livre de glicose e de glutamina

[00112] Seguindo o mesmo procedimento que aquele usado no Exemplo 4, hiPSCs foram induzidas a se diferenciarem em CMs. Para refinamento e purificação do grupos de células obtido (hiPSC-CMs), foi preparado um meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lac+) com base na constituição de DMEM (Invitro- gen), e o grupo de células foi cultivado no meio preparado por 5 dias.

[00113] Nos dias 2 e 5 a contar do início da cultura no meio suplementado com lactato, livre de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln-, Lac+), o grupo de células foi analisado por FACS. Os resultados estão mostrados na FIG. 11. De acordo com os dados da FACS, a percentagem de células troponina T-positivas foi de 93,5% no grupo de células no dia 2 e 98,7% no grupo de células no dia 5.

[00114] Isto revelou que CMs podem ser purificados sendo feita uma cultura de células na condição livre de glicose e de glutamina suplementada com lactato como uma fonte de energia para CMs (Gluc-, Gln-, Lac+).

Exemplo 9: Viabilidade de SCs indiferenciadas e CMs na condição suplementada com piruvato, livre de glutamina

[00115] Neste exemplo, foi investigado se as hESCs usadas como SCs indiferenciadas, e os CMs neonatais murinos usados como CMs, conseguem sobreviver quando cultivados em uma condição de cultura suplementada com piruvato, livre de glutamina.

[00116] Com base na constituição de DMEM livre de glicose (Invi- trogen), foram preparados um meio contendo todos os aminoácidos na constituição básica do DMEM ("condição Gluc-, ALL+"), um meio livre de glutamina na constituição básica do DMEM ("condição Gluc-, Gln-"), um meio livre de glutamina na constituição básica do DMEM porém suplementado com 4 mM de a-cetoglutarato ("Gluc-, Gln-, DM-aKG+"), e um meio livre de glutamina na constituição básica do DMEM porém suplementado com 2 mM de piruvato ("Gluc-, Gln-, Pyr+"). Em cada um dos meios de cultura mencionados acima, hESCs foram cultivadas por 48 horas. Então, as hESCs foram analisados quanto a sua atividade de fosfatase alcalina (ALP) colorindo-se as mesmas com o kit de coloração de fosfatase alcalina StemTAGTM (Sigma 86-R) e observando-se as células coloridas de vermelho como células viáveis (FIG. 12). Como resultado, colônias de células indiferenciadas ALP-positivas foram observadas em grandes números no meio suplementado com a- cetoglutarato, enquanto que nenhuma colônia de células indiferenciadas ALP-positivas estava presente no meio suplementado com piruva- to. Isto revelou que em uma condição livre de glutamato, células indiferenciadas sofrem morte celular em um curto espaço de tempo mesmo na presença de piruvato.

[00117] Em seguida, com o propósito de serem usados em CMs neonatais murinos, foram preparados, com base na constituição de DMEM livre de glicose (Invitrogen), um meio contendo todos os ami- noácidos na constituição básica do DMEM (Gluc-, ALL+), um meio livre de glutamina na constituição básica do DMEM (Gluc-, Gln-), um meio livre de glutamina na constituição básica do DMEM porém suplementado com 2 mM de piruvato (Gluc-, Gln-, Pyr+), e um meio livre de glu- tamina na constituição básica do DMEM porém suplementado com 4 mM de lactato (Gluc-, Gln-, Lac+). CMs neonatais murinos foram cultivados por 48 horas em cada um dos meios de cultura mencionados acima, coloridos com um kit de coloração dupla de células vi- vas/mortas (TaKaRa Bio, Inc.), e imageados (FIG. 13). As células coloridas de verdade representam células viáveis, enquanto que as células coloridas de vermelho representam células apoptóticas. Em uma condição de cultura livre de glicose e de glutamina, o índice de sobrevivência dos CMs cultivados na presença de lactato ou piruvato como uma fonte de energia para CMs foi significativamente maior que aquela dos CMs cultivados na ausência de lactato e piruvato. Isto revelou que a atividade indutora de morte celular de um meio livre de glutami- na (Gln-) em CMs é reduzida pela adição de piruvato.

Exemplo 10: Detecção de SCs indiferenciadas residuais

[00118] Este exemplo investigou a sensibilidade de detecção de um outro método de detecção para SCs indiferenciadas residuais usando uma combinação de laminina-521 e meio Essencial 8 (Tano, et al., PLOS ONE, 2014). O método usando mTeSR1 como meio de cultura e iMatrix (produzido pela Nippi, Inc.) como material de cadafalso foi avaliado quanto a sua sensibilidade na detecção de SCs indiferenciadas. Em primeiro lugar, grupos de células HEK293 não misturados com hiPSCs (0%) ou misturados com 0,1%, 0,01% ou 0,001% de hiPSCs foram imageados (FIG. 14A). Como hiPSCs foram detectadas mesmo no grupo de células misturado com 0,001% de hiPSCs, foi confirmado que este método de detecção é capaz de detectar SCs indiferenciadas presentes em uma proporção tão baixa quanto 0,001%.

[00119] Em seguida, células diferenciadas de hiPSCs foram avaliadas quanto à presença de SCs indiferenciadas residuais. Primeiro, seguindo-se o mesmo procedimento que aquele usado no Exemplo 4, hiPSCs foram induzidas a se diferenciarem em CMs, e as células foram imageadas (FIG. 14B). Em seguida, para refinamento e purificação dos grupos de células induzidos a se diferenciarem nas mesmas condições, foram preparados um meio suplementado com lactato, livre de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln+, Lac+) com base na constituição do DMEM (Invitrogen), e um meio livre de glicose e de glutamina, suplementado com lactato (Gluc-, Gln-, Lac+) com base na constituição do DMEM (Invitrogen), e os grupos de células foram cultivados em cada um destes meios de cultura por 4 dias e em seguida imageados (FIG. 14B). Células TRA1-60-positivas foram observadas no grupo de células antes do refinamento e purificação, e no grupo de células refi-nado e purificado na condição suplementada com 4 mM de lactato, livre de glicose, e suplementada com 4 mM de glutamina (Gluc-, Gln+, Lac+). Em contraste, nenhuma célula TRA1-60-positiva foi detectada no grupo de células refinato e purificado na condição suplementada com lactato, livre de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln-, Lac+).

[00120] Isto revelou que o índice de sobrevivência de SCs indiferenciadas residuais é menor que 0,001% na condição suplementada com lactato, livre de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln-, Lac+).

Exemplo 11: Atividade indutora de morte celular em não CMs prolifera- tivos

[00121] Este exemplo investigou a atividade indutora de morte celular de um meio de cultura livre de glutamina em não CMs proliferativos.

[00122] Primeiro, hESCs foram cultivadas na condição de DMEM (com 10% de FBS, sem bFGF) por 2 semanas para obter um grupo de não CMs proliferativos não incluindo CMs. Este grupo de células inclui fibroblastos e outras células diferenciadas que não CMs. Depois que o grupo de células foi cultivado por 48 horas em uma condição de cultura livre de glicose, suplementada com 4 mM de glutamina (Gluc-, Gln+) com base na constituição do DMEM (Invitrogen), foi observada a presença de células viáveis (FIG. 15). Em contraste, depois que não CMs proliferativos foram cultivados por 48 horas em uma condição suplementada com 4 mM de lactato, livre de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln-, Lac+), a presença de células viáveis não foi absolutamente observada e as células cultivadas sofreram morte celular completa (FIG. 15).

[00123] Isto revelou que não CMs proliferativos podem ser induzidos a sofrer morte celular na condição suplementada com lactato, livre de glicose e de glutamina. Nos últimos anos, foi reportado que a formação de tumor depois de transplante de células é causada não só pelas SCs indiferenciadas como também por células proliferativas imaturas (Nori, et al., Stem Célula Report, 2015). No entanto, este método inventivo pode induzir a morte celular não só de SCs indiferenciadas mas também de células proliferativas em um curto espaço de tempo.

Exemplo 12: Compostos que podem ser adicionados aos meios de purificação

[00124] Este exemplo buscou uma condição na qual SCs indiferenciadas e não CMs diferenciados não sobreviveram mas apenas CMs conseguiram sobreviver por um período de tempo mais longo quando uma cultura de células foi feita em um meio de cultura de purificação suplementado com um composto que é nutricional para CMs.

[00125] Com base na constituição de DMEM (Invitrogen), foram preparados meios de cultura suplementados com lactato, livres de glicose e de glutamina (Gluc-, Gln-, Lac+) que foram ainda suplementados com ascorbato (25 mg/L) ou albumina (0,1%).

[00126] Em seguida, hiPSCs foram cultivadas em cada um dos meios preparados. Depois de 24 horas a contar do início da cultura, foi observado que as hiPSCs cultivadas em ambos os meios sofreram morte celular (FIG. 16).

[00127] Em seguida, hiPSCs foram cultivadas na condição de DMEM (com 10% de FBS, sem bFGF) por 2 semanas para obter um grupo de não CMs proliferativos não incluindo CMs. O grupo de células obtido foi cultivado em cada um dos meios preparados. Depois de 48 horas a contar do início da cultura, foi observado que as células sofreram morte celular (FIG. 17).

[00128] Em seguida, seguindo-se o mesmo procedimento que aquele usado no Exemplo 4, hiPSCs foram induzidas a se diferenciarem em CMs. Depois que as massas celulares obtidas foram cultivadas por 600 horas em cada um dos meios suplementados com ascor- bato ou albumina, foi observado que os CMs sobreviveram (FIG. 18).

[00129] Além disso, a cultura de células continuou até completar 744 horas, e como resultado, foi observado que CMs pulsantes ainda estavam presentes em grandes números em ambas as condições de cultura. Em seguida, a coloração das células foi feita com o corante fluorescente para coloração de células mortas PI (iodeto de propídio) e as células coloridas foram observadas (FIG. 19). Células vivas foram observadas na condição suplementada com ascorbato ou albumina em quantidades maiores do que na condição livre de ascorbato e de albumina ("Free(-)"). Os resultados acima revelaram que CMs podem ser purificados usando-se cada um dos meios de cultura livres de glicose e de glutamina que são suplementados com lactato como uma fonte de energia para CMs e suplementados ainda com ascorbato ou albumina. Os resultados também mostraram que CMs podem ser deixados sobreviver por mais tempo utilizando-se esses meios de cultura inventivos.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00130] De acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, é possível fornecer um meio de cultura de células para uso na indução de morte celular de SCs indiferenciadas preparando-se um meio de cultura de células que é livre de glutamina no perfil de aminoácidos. Pela simples feitura de uma cultura de células usando o meio de cultura de células do primeiro aspecto desta invenção, SCs indiferenciadas podem ser facilmente induzidas a sofrer morte celular. Também, de acordo com o segundo aspecto desta invenção, é possível oferecer um meio de cultura de células para uso na seleção de CMs preparando-se um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, piruvato ou um ácido graxo, livre de açúcar (glicose), e livre de gluta- mina no perfil de aminoácidos. Pela simples feitura de uma cultura de células usando o meio de cultura de células do segundo aspecto desta invenção, SCs indiferenciadas, tais como PSCs incluindo hESCs e hiPSCs, assim como outras células diferenciadas que não CMs, e células estabelecidas, definidas abaixo, podem ser facilmente induzidas a sofrer morte celular, e consequentemente, CMs podem ser selecionados.

Claims

1. Meio de cultura de células para uso na indução da morte celular de células-tronco indiferenciadas, caracterizado por ser livre de glutamina no perfil de aminoácidos.

2. Meio de cultura de células de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é ainda livre de serina e glicina no perfil de aminoácidos.

3. Meio de cultura de células de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é ainda livre de arginina no perfil de aminoácidos.

4. Meio de cultura de células de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as células-tronco indiferenciadas são células-tronco pluripotentes ou células-tronco multipotentes.

5. Método para induzir a morte celular de células-tronco in-diferenciadas, caracterizado pelo fato de que é feita uma cultura de células em um meio de cultura de células que é livre de glutamina no perfil de aminoácidos.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as células-tronco indiferenciadas são células-tronco pluripotentes ou células-tronco multipotentes.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é ainda livre de serina e glicina no perfil de aminoácidos.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é ainda livre de arginina no perfil de aminoácidos.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que a cultura de células é continuada por 12-360 horas em qualquer uma das condições livres de aminoáci- dos particulares acima.

10. Meio de cultura de células para uso na seleção de car- diomiócitos a partir de uma mistura de cardiomiócitos e não cardiomió- citos, caracterizado pelo fato de que é suplementado com lactato, livre de açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos.

11. Meio de cultura de células para uso na seleção de car- diomiócitos a partir de uma mistura de cardiomiócitos e não cardiomió- citos, caracterizado pelo fato de que é suplementado com piruvato, livre de açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos.

12. Meio de cultura de células para uso na seleção de car- diomiócitos a partir de uma mistura de cardiomiócitos e não cardiomió- citos, caracterizado pelo fato de que é suplementado com um ácido graxo, livre de açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos.

13. Meio de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que é ainda livre de serina e glicina no perfil de aminoácidos.

14. Meio de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que é ainda livre de arginina no perfil de aminoácidos.

15. Meio de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que os não car- diomiócitos são células que incluem células-tronco indiferenciadas, outras células diferenciadas que não cardiomiócitos, e células estabelecidas.

16. Meio de cultura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que é suplementado com ascorbato ou albumina.

17. Método para selecionar cardiomiócitos, caracterizado por compreender cultivar uma mistura de cardiomiócitos e não cardio- miócitos em um meio de cultura de células que é suplementado com lactato, livre de açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos.

18. Método para selecionar cardiomiócitos, caracterizado por compreender cultivar uma mistura de cardiomiócitos e não cardio- miócitos em um meio de cultura de células que é suplementado com piruvato, livre de açúcar, e livre de glutamina no perfil de aminoácidos.

19. Método para selecionar cardiomiócitos, caracterizado por compreender cultivar uma mistura de cardiomiócitos e não cardio- miócitos em um meio de cultura de células que é suplementado com um ácido graxo, livre de açúcar, e livre de glutamina no perfil de ami- noácidos.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado pelo fato de que os não cardiomiócitos são células-tronco indiferenciadas, não cardiomiócitos diferenciados, ou células estabelecidas.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é ainda livre de serina e glicina no perfil de aminoácidos.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é ainda livre de arginina no perfil de aminoácidos.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado pelo fato de que a cultura de células é continuada por 12-360 horas em qualquer uma das condições livres de aminoácidos particulares acima.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é suplementado com ascorbato ou albumina.