KR20170031152A

KR20170031152A - 신규 미분화 줄기세포 제거 및 심근 순화 정제 배지

Info

Publication number: KR20170031152A
Application number: KR1020177002462A
Authority: KR
Inventors: 게이이치 후쿠다; 준 후지타; 슈고 도야마
Original assignee: 하트 시드 가부시키가이샤
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2017-03-20
Also published as: CN107075475A; IL249813A0; EP3170894A4; AU2015290571B2; BR112016030723B1; IL249813B; JP6333378B2; KR102241348B1; SG11201700023WA; US20170327787A1; CN107075475B; CA2954242C; RU2017104838A; RU2017104838A3; CA2954242A1; BR112016030723A2; EP3170894A1; EP3170894B1; JPWO2016010165A1; BR112016030723B8

Abstract

본 발명에 있어서는, 비심근 세포 또는 미분화 줄기세포에 대하여 보다 완전하게 세포사를 유도할 수 있고, 또한 심근 세포만을 선발할 수 있는, 새로운 조건을 발견하는 것을 과제로 한다. 이와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본건 출원에 있어서, 미분화 줄기세포에 세포사를 일으키기 위해 사용되는 세포 배양액으로서, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 것을 제공하고, 이와 함께 이 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 비심근 세포에 세포사를 유도하는 방법도 또한 제공한다. 본건 출원에 있어서는 또한, 심근 세포를 선택적으로 선발하기 위해 사용되는 세포 배양액으로서, 락트산, 피루브산 또는 지방산을 첨가하고, 당류를 포함하지 않고, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 것을 제공하고, 이와 함께 이 세포 배양액 중에서, 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물을 배양함으로써, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법도 또한 제공한다.

Description

신규 미분화 줄기세포 제거 및 심근 순화 정제 배지{NEW UNDIFFERENTIATED STEM CELL REMOVAL AND MYOCARDIAL PURIFICATION AND REFINEMENT CULTURE MEDIUM}

본 발명은, 미분화 줄기세포 제거 및 심근 세포의 순화(純化) 정제를 위해 사용할 수 있는 배지를 제공하는 것에 관한 것이다.

성체에서의 심근 세포는 증식 활성을 상실하고 있으므로, 중증의 심근경색, 심근증 등의 질환에서는, 종래보다 심장 이식에 의지하지 않을 수 없는 상황이 계속되고 있다. 그러나, 최근, 배아 줄기세포(ES 세포)나 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포) 등의 다능성을 가지는 줄기세포에 대한 연구가 진행되어 오고 있으므로, 이들 다능성을 가지는 줄기세포를 분화·유도하여 심근 세포를 제조하고, 이와 같은 유도된 심근 세포를 이식 의료에 있어서 사용하는 것이 가능해지고 있다.

그러나, 비생리적 조건(즉, in vitro 조건)에서의 심근 세포의 분화의 양식(樣式)은, 생리적 발생과 동일하게, 먼저 미분화인 중배엽 세포가 형성되고, 그 일부가 예정 심근 세포(전심장 중배엽)를 거친 후, 심근 세포로 분화하지만, 다능성을 가지는 줄기세포는, 기본적으로 장기를 구성하는 모든 세포로 분화 가능하므로, 분화·유도의 조작만에 의해 심근 세포라는 1종류의 세포로만 분화시키는 것은 기술적으로 곤란하다. 또한, 비생리적 조건(in vitro 조건)에서는, 모든 다능성을 가지는 줄기세포에 대하여 목적으로 하는 분화를 야기하는 것은 곤란하며, 유도 후에 도 일부에 미분화 줄기세포가 잔존하는 경우가 있다.

이와 같이, 체외에 있어서 줄기세포로부터 심근 세포로의 분화를 유도하는 경우, 모든 다능성을 가지는 줄기세포는, 심근 세포 이외의 세포를 부산물로서 생산하거나 미분화 줄기세포를 잔존시키는 것과 같은, 이식을 포함하는 임상 응용에 대하여 유해한 성질이 남게 된다. 특히, 잔존하는 미분화 줄기세포는, 증식 활성을 가지고 또한 다종류의 세포로 분화할 수 있으므로, 치료에 있어서 생체에 이식된 세포 중에 미분화 줄기세포가 잔존하면, 이 미분화 줄기세포로부터 기형종이 형성될 위험성이 극히 높다(비특허 문헌 1(Miura et al., Nature Biotech., 743-745, 2009). 이와 같은 이유에서, 다능성 줄기세포로 분화 유도를 행하여 제조된 심근 세포를 함유하는 세포 집단을, 그대로 생체에 이식하여 치료에 사용하는 것은 곤란하다. 따라서, 다능성 줄기세포 유래의 심근 세포를 사용한 치료를 안전하게 실행하고, 이상적인 치료 효과 효과를 얻기 위하여, 미분화의 다능성 줄기세포를 완전히 배제하고, 더욱 고도로 심근 세포를 정제하는 방법(즉, 심근 세포 이외의 세포를 제거하는 방법)을 발견할 필요가 있다.

지금까지, 미분화 줄기세포를 배양 조건 중에서 선택적으로 제거하는 방법이 보고되어 있다(비특허 문헌 2(Ben-David, et al., Cell Stem Cell, 2013 12, pp.167-179), 비특허 문헌 3(Wang, et al., Science, 325, 435-439, 2009), 비특허 문헌 4(Shiraki, et al., Cell Metabolism 2014, 19, 1-15). 비특허 문헌 2에 있어서는, 올레산이 인간의 미분화 다능성 줄기세포의 유지에 중요한 것이 발견되었고, 이 조건을 반대로 이용하여, 인간의 미분화 다능성 줄기세포 내에서의 올레산의 생합성을 저해함으로써, 인간의 미분화 다능성 줄기세포를 선택적으로 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 비특허 문헌 3에 있어서는, 마우스의 배아 줄기세포(배아 줄기세포)가, 트레오닌 이외의 다른 아미노산을 제거한 배양액 중에서는 콜로니를 형성할 수 있음에도 불구하고, 트레오닌을 제거한 배양액 중에서는 콜로니를 형성할 수 없는 것으로 밝혀져, 트레오닌을 제거한 배양액 중에서 배양함으로써, 마우스의 미분화 배아 줄기세포를 선택적으로 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 비특허 문헌 4에 있어서는, 인간 다능성 줄기세포에 있어서는, 마우스 배아 줄기세포에서의 트레오닌의 역할을 메티오닌이 담당하고 있고, 메티오닌을 제거한 배양액 중에서는 미분화 줄기세포가 사멸 또는 분화하므로, 인간 미분화 줄기세포를 선택적으로 제거할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

그러나, 이들 문헌에서 밝혀진 방법에서는, 미분화 다능성 줄기세포를 제거할 수 있지만, 심근 세포 이외의 분화가 유도된 비심근 세포에 대해서는, 제거할 수 없었다. 또한 비특허 문헌 3 및 비특허 문헌 4에서는, 단백질 합성할 때 매우 중요한 필수 아미노산을 제거하고 있으므로, 살아남은, 목적으로 하는 세포에서의 영향도 우려된다.

이에 따라, 본 발명의 발명자의 연구 그룹에서는, 단백질 합성할 때 매우 중요한 필수 아미노산이 아닌, 외부로부터 합성·공급될 가능성이 있는 비필수 아미노산에 주목하고, 다능성을 가지는 줄기세포로부터 심근 세포를 분화·유도할 때 분화·유도되지 않고 잔존하는 미분화 줄기세포뿐만 아니라, 심근 세포를 분화·유도할 때 부산물로서 발생되는 심근 세포 이외의 세포도 효율적으로 제거하는 것을 목적으로 하여, 연구를 진행하여 왔다. 그 중에서, 심근 세포가 가지지만 그 외의 세포가 가지지 않는 각종 생리학적 특징을 발견하고, 이들 특징을 이용하여, 비심근 세포나 미분화 줄기세포로부터, 심근 세포만을 선발하는 방법을 개발해 왔다.

특허 문헌 1: 심근 세포 함유 세포 혼합물로부터, 세포의 상대적 미토콘드리아 함유량 및/또는 세포의 상대적 미토콘드리아 막전위에 기초하여, 심근 세포의 유전자 개변(改變)을 수반하지 않고 심근 세포를 선택하는 방법, 심근 세포 함유 세포 혼합물로부터, 심근 세포의 유전자 개변을 수반하지 않고 심근 세포를 농축하는 방법, 심근 세포의 유전자 개변을 수반하지 않고 심근 세포를 제조하는 방법; 및 심근 세포 함유 세포 혼합물 중에서의 심근 세포 비율을 평가하는 방법(WO2006/022377);

특허 문헌 2: 저혈청 조건, 저당 조건, 저영양 조건, 저칼슘 조건, 약산성 pH 조건, 락트산 첨가 조건, 아스파라긴산·글루타민산 첨가 조건, 및/또는 피루브산 첨가 조건의 배양액 중에서 배아 줄기세포 유래의 심근 세포를 배양함으로써, 효율적으로 또한 고도로 심근 세포를 선택·정제할 수 있는 것(WO2007/088874);

특허 문헌 3: 다능성 줄기세포로부터 분화, 유도된 심근 세포를 포함하는 응집된 세포괴(細胞塊)를 분산시켜 단세포화하는 것에 의해 얻어지는 정제된 다능성 줄기세포 유래의 심근 세포를 무혈청 조건 하의 배지를 사용하여 배양하고, 상기 세포를 응집시키는 것을 특징으로 하는, 다능성 줄기세포 유래 심근 세포의 세포괴를 제조하는 방법(WO2009/017254);

특허 문헌 4: 물질적인 독성이나 세포사 유도 작용이 인정되고 있지 않은 물질을 다능성 줄기세포나 비심근 세포의 배양 조건에 대하여 첨가함으로써, 매우 효율적으로 심근 세포 이외의 세포에 대하여 세포사를 유도하는 방법(WO2010/114136); 그리고

특허 문헌 5: 배양액 중의 배양 심근 세포에 대하여 전위 감수성 형광 색소를 접촉시키고, 배양액 중에 비타민 E 및/또는 콜레스테롤을 첨가하여, 전위 감수성 형광 색소의 전위 의존성 또는 이온 강도 변화 의존성의 형광 강도 변화를 측정하는 것을 특징으로 하는, 배양 심근 세포의 활동 전위를 측정하는 방법(WO2011/052801).

이 중에서 특히, 특허 문헌 2에 있어서, 심근 세포가, 세포 배양의 조건으로서는 일반적으로 엄격한 것으로 여겨지고 있는 조건(저당 조건, 저혈청 조건, 약산성 pH 조건, 저칼슘 조건, 저영양 조건, 락트산 첨가 조건, 아스파라긴산·글루타민산 첨가 조건, 피루브산 첨가 조건 등의 조건) 하에서의 배양에 대하여 내성이 높고, 심근 세포 이외의 세포(즉, 비심근 세포나 미분화 줄기세포)는 세포사하지만, 심근 세포는 생존함으로써, 결과적으로 심근 세포를 선발할 수 있는 것을 나타낸다. 그리고, 마우스의 다능성을 가지는 줄기세포를 사용한 검토에 있어서, 특히 이들 조건 중, 저당 조건 및 락트산 첨가 조건을 사용하는 것이, 가장 효율적으로 심근 세포의 선발에 기여하므로, 저당 조건 및 락트산 첨가 조건을 인간의 다능성을 가지는 줄기세포 유래의 심근 세포의 선발에 있어서도 사용할 수 있는 지의 여부에 대하여, 검토를 행하였다.

그러나, 인간의 다능성을 가지는 줄기세포 유래의 심근 세포에 관한 연구에 있어서, 저당 조건 및 락트산 첨가 조건의 배양 조건 하에서는, 미분화 줄기세포의 제거 및 심근 세포의 선별에 대해서는 가능하지만, 미분화 줄기세포 제거에 시간이 걸리는 점, 및 임상 응용에서는 수억 개의 세포를 취급하기 때문에 미분화 줄기세포의 혼입 확률이 높아지는 점으로부터, 보다 완전하게 보다 단시간에 미분화 줄기세포를 제거할 수 있는 계(系)가 요구되고 있었다.

세포는, 그 생존에 필요한 에너지의 주된 부분을, 글루코오스의 이화 반응(catabolism)에 기초하여 다양한 기구(機構)에 의해 ATP를 생성함으로써 획득하고 있다. 글루코오스의 이화 반응에 기초하여 ATP를 생성할 때까지의 경로는, 세포 내에 섭취된 글루코오스를 피루브산까지 분해하는 프로세스인 해당계(解糖系), 피루브산의 분해에 의해 생긴 아세틸 CoA를 사용하여 회로를 회전시키는 TCA 회로(시트르산 회로), 그리고, 해당계 및 TCA 회로에 있어서 생성되는 NADH, NADPH, 그리고 FADH₂를 이용하여 ATP를 생성하는 전자 전달계가 주요한 것으로서 알려져 있다.

일반적으로 세포는, 환경으로부터 글루코오스를 입수하는 것을 전제로 하여, 에너지 획득을 행하고 있다. 이와 같은 에너지 획득의 경우에는, 해당계가 활성화되어 있고, 글루코오스를 해당계에서 분해하는 것에 기초하여, TCA 회로(시트르산 회로), 전자 전달계를 통하여 에너지 획득을 행하고 있다. 그리고, 에너지를 급겨하게 필요로 하는 경우에는, 해당계를 최대한 이용한 혐기적 호흡에 의해 에너지를 얻어 있으므로, 피루브산의 생성이 소비를 웃돌아, 락트산 발효 경로가 활성화되게 된다. 그리고, 반대로, 락트산을 피루브산으로 되돌리는 역반응은, 상대적으로 활발화되어 있지 않다.

WO2006/022377 WO2007/088874 WO2009/017254 WO2010/114136 WO2011/052801

Miura et al., Nature Biotech., 743-745, 2009 Ben-David, et al., Cell Stem Cell, 2013 12, pp.167-179 Wang, et al., Science, 325, 435-439, 2009 Shiraki, et al., Cell Metabolism 2014, 19, 1-15

전술한 바와 같이, 특허 문헌 2에서 예로 든 저당 조건 및 락트산 첨가 조건 하에서의 배양에 대해서는, 조건에 따라서는, 생존하는 비심근 세포 또는 미분화 줄기세포가 매우 적은 양이 존재하는 경우가 있으므로, 보다 단시간에 미분화 줄기세포를 제거할 수 있어, 결과적으로 비심근 세포 또는 미분화 줄기세포에 대하여 더욱 완전하게 세포사를 유도할 수 있으며, 또한 심근 세포만을 선발할 수 있는, 새로운 조건을 발견할 필요가 있다.

전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본건 출원에 있어서, 미분화 줄기세포에 세포사를 일으키기 위해 사용되는 세포 배양액으로서, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 것을 제공하고, 또한 이 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하는 방법도 또한 제공한다. 본건 출원에 있어서는 또한, 심근 세포를 선택적으로 선발하기 위해 사용되는 세포 배양액으로서, 지방산, 락트산 또는 피루브산을 첨가한, 당류를 포함하지 않으며, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 것을 제공하고, 또한 이 세포 배양액 중에서, 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물을 배양함으로써, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법도 또한 제공한다.

본 발명의 제1 태양에 의해, 미분화 줄기세포에 세포사를 일으키기 위해 사용되는 세포 배양액을 제공할 수 있고, 이 세포 배양액을 사용하여 단지 세포 배양을 행하는 것에만 의해, 미분화 줄기세포에 대하여 간편하게 세포사를 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 제2 태양에 의해, 심근 세포를 선택적으로 선발하기 위해 사용되는 세포 배양액을 제공할 수 있고, 이 세포 배양액을 사용하여 단지 세포 배양을 행하는 것에만 의해, 인간의 배아 줄기세포나 인공 다능성 줄기세포를 포함하는 다능성을 가지는 줄기세포 등의 미분화 줄기세포나, 후술하는 심근 세포 이외의 분화 세포, 주화 세포에 대하여 세포사를 간편하게 유도할 수 있고, 결과적으로 심근 세포를 선택적으로 선발할 수 있다.

도 1은, 2.5×10⁵개의 인간 배아 줄기세포를 3일간 배양했을 때 소비되는 배지 중 아미노산 및 글루코오스 농도의 변화를 나타낸다. 세포에 폭로시키기 전의 day 0에서의 아미노산 및 글루코오스 농도를 100%로 하였다.
도 2는, 인간 배아 줄기세포를, 다양한 조건(글루코오스를 포함하는/포함하지 않는, 락트산을 첨가하는/첨가하지 않는, 및 도 1에서 소비가 많았던, 다양한 비필수 아미노산을 포함하지 않는 조건) 하에서 배양한 경우의 인간 배아 줄기세포에서의 알칼리포스파타제(ALP) 염색을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은, 인간 배아 줄기세포를, 다양한 조건(글루코오스를 포함하는/포함하지 않는, 락트산을 첨가한/첨가하지 않는, 및 도 1에서 소비가 많았던, 다양한 비필수 아미노산을 포함하지 않는 조건) 하에서 배양한 경우의 인간 배아 줄기세포에서의 생사를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 4는, 인간 인공 다능성 줄기세포를, 다양한 조건(글루코오스를 포함하는/포함하지 않는, 락트산을 첨가한/첨가하지 않는, 및 도 1에서 소비가 많았던, 다양한 비필수 아미노산을 포함하지 않는 조건) 하에서 배양한 경우의 인간 인공 다능성 줄기세포에서의 알칼리포스파타제(ALP) 염색을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 5는, 인간 배아 줄기세포를, 글루코오스를 포함하지 않고, 또한 다양한 아미노산을 포함하지 않는 조건 하에서 배양한 경우의 인간 인공 다능성 줄기세포에서의 알칼리포스파타제(ALP) 염색을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6은, 랫 신생아 심근 세포를, 다양한 조건(글루코오스를 포함하는/포함하지 않는, 락트산을 첨가한/첨가하지 않는 및 도 1에서 소비가 많았던, 다양한 비필수 아미노산을 포함하지 않는 조건) 하에서 배양한 경우의 신생아 심근 세포에서의 생사를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은, 인간 인공 다능성 줄기세포로부터 2차원 심근 분화 유도한 세포 집단을 락트산을 첨가한, 글루코오스를 포함하지 않은 배지(Gluc^－, All^＋, Lactate^＋) 또는 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋) 조건 하에서 배양한 경우의 사진이다.
도 8은, 도 7에서 얻어진 세포괴를, 0.25% 트립신 EDTA에 의해 분산 처리한 후, 피브로넥틴 코팅 배양 접시에서 배양한 바, 심근 세포만이 생존하고 있는 것을 나타낸 도면이다. B, α-Actinin 양성 심근 세포는 대부분이 Troponin I 양성의 심근 세포였다. C, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에 의해 순화 정제한 후에는 Tra1-60 양성의 미분화 줄기세포가 전혀 잔존하고 있지 않는 것을 확인하였다.
도 9는, 심근 분화 유도 후 또는 순화 정제 후의 잔존 미분화 줄기세포를 QPCR에 의해 평가한 결과이다. 글루타민을 함유하는 락트산을 첨가한 글루코오스를 포함하지 않는 배지(Gluc^－, All^＋, Lactate^＋)에 의해 순화 정제한 경우에는, Lin28이 검출되고 있지만, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에 의해 순화 정제한 후에는 Lin28가 전혀 검출되지 않는 것을 확인하였다.
도 10은, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배양 조건 하에서의 랫 신생아 심근 세포 및 인간 배아 줄기세포에서의 락트산 대사의 차이를 나타낸 것이다. 배지 중에 ¹³C로 라벨화한 락트산을 투여하고, TCA 사이클 및 글루타민산에서의 대사 산물을 정량화함으로써, 락트산이 어떻게 대사되고 있는지를 해석할 수 있다. A는 락트산 관련의 대사 맵을 나타낸다. TCA 사이클 내의 락트산 유래 대사 산물의 총량은 유의하게 심근 세포에서 많은 것이 밝혀졌다. 또한, 2-옥소글루타르산 및 글루타민산에 있어서도 심근 세포에 있어서 ¹³C가 유의하게 많이 검출되었다. 이것은, 심근 세포에 있어서 글루타민산의 생합성에 락트산이 보다 많이 기여하고 있는 것을 나타내는 데이터이다. *p<0.05, **p<0.01
도 11은, 인간 인공 다능성 줄기세포 분화 유도 후의 세포군에 대하여, 트로포닌 T 양성 세포의 비율을 FACS에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는, 인간 배아 줄기세포를, 다양한 조건(글루코오스를 포함하지 않는, 글루타민을 포함하는/포함하지 않는, α-케토 글루타르산을 포함하는/포함하지 않는, 및 피루브산을 첨가한/첨가하지 않는 조건) 하에서 배양한 경우의 인간 배아 줄기세포에서의 알칼리포스파타제(ALP) 염색을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 13은, 랫 신생아 심근 세포를 다양한 조건(글루코오스를 포함하지 않는, 글루타민을 포함하는/포함하지 않는, 피루브산을 첨가한/첨가하지 않는, 락트산을 첨가한/첨가하지 않는 조건)에서 배양한 경우의 신생아 심근 세포의 생사를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 14의 A는, 잔존 미분화 줄기세포의 검출 방법(Tano et al., PLOS ONE 2014)의 검출 정밀도의 결과를 나타낸다. 도 14의 B는, 심근 분화 유도 후 또는 순화 정제 후의 잔존 미분화 줄기세포를 도 14의 A의 방법에 의해 평가한 결과이다. 락트산을 첨가한 글루타민을 포함하지만 글루코오스를 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^＋, Lac^＋)에 의해 순화 정제한 경우에는, 미분화 줄기세포의 검출 마커인 TRA1-60이 검출되었지만, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에 의해 순화 정제한 후에는 TRA1-60이 전혀 검출되지 않았다.
도 15는, 인간 배아 줄기세포 유래의 비심근 세포(증식형)를 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건 및 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않고 락트산을 첨가한 조건 하에서 배양한 경우의 세포의 생사를 나타낸다.
도 16은, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에, 아스코르브산(25 mg/L) 또는 알부민(0.1%)을 첨가한 배지에서 인간 인공 다능성 줄기세포를 배양한 후의 세포군의 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에, 아스코르브산(25 mg/L) 또는 알부민(0.1%)을 첨가한 배지에서 인간 인공 다능성 줄기세포 유래의 비심근 세포를 배양한 후의 세포군의 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에, 아스코르브산(25 mg/L) 또는 알부민(0.1%)을 첨가한 배지에서 인간 인공 다능성 줄기세포 유래의 심근 세포를 배양한 후의 세포군의 관찰 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에, 아스코르브산(25 mg/L) 또는 알부민(0.1%)을 첨가한 배지에서 인간 인공 다능성 줄기세포 유래의 심근 세포를 744시간 배양한 후의 세포군의 관찰 결과를 나타낸 도면이다.

해당계는 대부분의 생물에 존재하는, 글루코오스가 피루브산 또는 락트산까지 혐기적으로 분해되는 대사 경로에서, 근간적(根幹的) 에너지 획득계이다. 동물의 체내에 있어서는, 글루코오스가 ATP의 γ-인산기로 인산화되고, 또는 글리코겐 분해에 의해, 글루코오스 6-인산이 생성되는 반응을 비롯하여, 그것이 순차적으로 대사되고, 프룩토오스 1,6-비스 인산을 거쳐, 트리오스 인산으로 개열(開裂)하고, ATP를 생성하면서, 피루브산에 이른다. 그 동안, 글루코오스 1mol당 전체적으로 ATP 2mol을 생성하고, 2mol의 NAD^＋를 환원하고, 2 mol의 NADH를 생성한다. 이 대사 경로의 최종 산물 피루브산은, 락트산으로 변화되어 세포외에 방출되거나, 미토콘드리아 내로 이행하여, 시트르산 회로의 기질이 된다.

트리카르복시산 회로(TCA 회로, 또는 시트르산 회로)는, 당, 지방산, 대부분의 아미노산 등의 탄소 골격을 최종적으로 완전 산화하기 위한 대사 회로이며, 예를 들면, 해당계를 볼 경우, 해당계의 최종 산물인 피루브산의 분해로부터 생긴 아세틸 CoA는, 옥사로아세트산과 축합하여 시트르산을 생성하고, 순차적으로 (cis-아코니트산), 이소시트르산으로 된 후, 탈수적 탈탄산을 받고, 2-옥소글루타르산이 된다. 또한, 탈수소적 탈탄산, CoA의 탈리(脫離), 탈수소, 가수, 탈수소 등의 반응을 순차적으로 받고, 숙시닐 CoA, 숙신산, 푸마르산, 말을 거쳐 옥사로아세트산에 이른다. 회로의 1회전에 의해, 아세틸 CoA의 아세틸기는 완전 산화되고, 1분자의 아세틸 CoA의 분해에 의해, 2분자의 CO2의 방출, 3분자의 NADH의 생성, 1분자의 환원형 FAD의 생성, 그리고, 1분자의 GTP를 생성하게 된다.

그러나, TCA 회로는 단순한 분해 과정이 아니며, 당·아미노산·지방산의 각 대사계의 전환의 조절점이기도 하며, 동화 대사에서의 중요한 출발점이 된다. 예를 들면, 해당이 어느 정도 진행되면, 시트르산 등의 농도가 높아지고, 아세틸 CoA 카르복실라제를 활성화하고, TCA 회로 자체의 회전은 어느 한도 내로 억제되고, 아세틸 CoA는 지방산 합성의 방향으로 나아갈 수 있다. 또한, 예를 들면, 옥사로아세트산으로부터는 아스파라긴산이 만들어진다. 이와 같이, TCA 회로의 중간체는, 다양한 유기물의 생합성을 위해 빼앗기기 때문에, TCA 회로가 1회전할 때 재생되는 옥사로아세트산의 양은 통상은 감소하게 된다. 이에 따라, TCA 회로의 순조로운 회전을 유지하기 위해서는, 별개로 옥사로아세트산을 보급하는 계가 필요하며, 예를 들면, 알라닌과 글리신, 시스테인, 세린, 그리고, 트레오닌이 피루브산으로 분해되는 계와 함께, 피루브산을 피루브산 카르복실라제에 의해 분해함으로써 옥사로아세트산을 공급하는 계, 아스파라긴산을 트랜스 아미나제로 아미노 전이하여 옥사로아세트산을 생성하는 계, 페닐알라닌 및 티로신을 분해하여 푸마르산을 생성하는 계, 아르기닌, 글루타민, 히스티딘, 프롤린을 글루타민산으로 분해한 후, 글루타민산을 글루타민산디하이드로게나제에 의해 산화하여 2-옥소글루타르산을 공급하는 계 등의 계가 여기에 해당한다.

동물의 세포 내에서의 에너지 획득계는, 전술한 해당계 및 TCA 회로의 각종 탈수소 반응에 의해 생긴 수소 및 전자는, NADH, NADPH, FADH₂ 등의 전자 공여체에 의해 미토콘드리아로 운반되고, 미토콘드리아 내막에 있는 산화 환원계의 일련의 산화 환원 효소(복합체)나 전자 전달체(각종 시토크롬 등)에 전달되고, 이들 물질로 구성되는 전자 전달계를 거쳐, 산소를 환원하여 물을 생성한다. 이 때, H^＋가 막을 통하여 일방향적으로 운반되고, H^＋의 전기 화학 포텐셜 차가 형성되고, 이것을 사용하여 최종적으로 ATP 등의 고에너지 인산 결합이 합성된다.

본 발명의 발명자들은, 특허 문헌 2에서 예로 든 기지(旣知)의 각종 배양 조건 하에서는 생존하는 비심근 세포 또는 미분화 줄기세포가 매우 적은 양으로 존재하므로, 보다 완전하게 또한 단시간에 비심근 세포 또는 미분화 줄기세포에 대하여 세포사를 유도할 수 있고, 또한 심근 세포만을 선발할 수 있는, 새로운 조건을 발견 것을 목적으로 하여 예의(銳意) 연구를 행하였다.

먼저, 신선한 배양액과 세포 배양 후의 배양액의 사이에서의 아미노산 농도를 측정함으로써, 인간 다능성 줄기세포에서의 소비가 활발한 아미노산을 조사하였다. 그 결과, 인간 다능성 줄기세포에 있어서는 대체로, 세린(Ser)의 소비량, 글루타민(Gln)의 소비량, 아르기닌(Arg)의 소비량, 시스틴(Cys2)의 소비량이 매우 많은 것을 알았다. 또한, 류신(Leu), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp)의 소비량도 비교적 많은 것도 밝혀졌다(도 1). 다만, 비특허 문헌 3 및 비특허 문헌 4와 같이, 단백 합성할 때 매우 중요한 필수 아미노산을 포함하지 않는 경우에는, 살아남은 목적으로 하는 세포에서의 영향도 우려되므로, 다른 곳으로부터 합성·공급될 가능성이 있는 비필수 아미노산에 주목하여 연구를 행하였다.

그리고, 글루코오스의 존재 하에서, 인간의 배아 줄기세포 또는 인간 인공 다능성 줄기세포를 각종 아미노산 조건 하에서 배양한 바, 글루코오스(Gluc)가 존재함에도 불구하고, 세린(Ser), 글리신(Gly), 글루타민(Gln), 또는 아르기닌(Arg)을 포함하지 않는 세포 배양액에서 배양하는 것에 의해, 인간 배아 줄기세포 또는 인공 다능성 줄기세포의 콜로니 수가 저하되는 것을 알았다(도 2의 A 및 도 4의 A). 그리고, 인간 배아 줄기세포 또는 인공 다능성 줄기세포의 콜로니수에 대한, 이들 아미노산을 포함하지 않는 배양 조건의 효과를 확인한 바, 글루코오스를 포함하지 않는 배양 조건에 있어서는 글루타민(Gln), 세린(Ser) 및 글리신(Gly), 아르기닌(Arg)의 순서로 강력한 효과를 가지고 있는 것도 밝혀졌다(도 3의 B).

이들 결과에 기초하여, 본 발명에 있어서는, 배양액 중의 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 것(Gln^－)에 의해, 인간의 배아 줄기세포나 인공 다능성 줄기세포를 포함하는 다능성을 가지는 줄기세포 등의 미분화 줄기세포나, 후술하는 심근 세포 이외의 분화 세포에 대하여 세포사를 유도할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 제1 태양에 있어서, 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는, 세포 배양액(Gln^－)의 발명을 제공한다. 본 발명의 제1 태양에서의 세포 배양액은, 전술한 지견에 기초하여, 세린 및/또는 글리신(Ser^－, Gly^－)을 포함하지 않는 것을 새로운 특징으로 할 수도 있고, 그리고, 아르기닌을 포함하지 않는 것(Arg^－)을 새로운 특징으로 할 수도 있다. 구체적으로 열거하면:

·아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－);

·아미노산 조성 중, 글루타민, 및 세린을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－, Ser^－);

아미노산 조성 중, 글루타민 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－, Gly^－);

·아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－, Ser^－, Gly^－);

·아미노산 조성 중, 글루타민, 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－, Arg^－);

·아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－, Ser^－, Arg^－);

·아미노산 조성 중, 글루타민, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－, Gly^－, Arg^－);

·아미노산 조성 중, 글루타민, 세린, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Gln^－, Ser^－, Gly^－, Arg^－);

등을 사용할 수 있다.

이들 아미노산은, 모두 종래 기술의 항에 있어서 기재한 당대사 및 TCA 회로와 관련성이 있는 아미노산이며, 글루타민은, 글루타민산으로 분해된 후, 또한 글루타민산디하이드로게나제에 의해 산화되어 2-옥소글루타르산이 되고, TCA 회로에 도입된다. 또한, 세린 및 글리신은 피루브산으로 분해된 후, 피루브산 카르복실라제에 의해 분해됨으로써 옥사로아세트산이 되고, TCA 회로에 도입된다.

본 발명의 제1 태양에서의 전술한 본 발명의 세포 배양액은, 혈청이나 혈청 대체품을 포함하지 않는 배양액이며, 글루타민, 세린 및/또는 글리신, 또는 아르기닌 등의 특정한 아미노산의 조건 이외의 조건에 대해서는, 일반적인 세포 배양액(예를 들면, 둘베코 수정 이글 배양액(DMEM), MEM 배양액(예를 들면, α-MEM, MEM[Hank's BSS]), RPMI 배양액(예를 들면, RPMI 1640 등), F12 배양액, StemPro34, mTeSR1 등)과 동일한 조성으로 할 수 있다.

본 발명의 발명자 등의 검토에 따라, 전술한 바와 같은 특수한 아미노산 조성을 가지는 세포 배양액은, 미분화 줄기세포나, 후술하는 심근 세포 이외의 분화 세포에 대하여, 세포사를 일으키기 위해 사용할 수 있다. 그러나, 더욱 효율적으로, 이들 세포에 대하여 세포사를 일으키고자 할 경우에는, 상기 아미노산 조성의 조건에 더하여, 당류를 포함하지 않는 저당 조건(Gluc^－)을 사용할 수 있다.

여기서, 「미분화 줄기세포」의 경우, 본 발명이 속하는 기술 분야에 있어서 일반적으로 사용되는 다능성을 가지는 줄기세포 또는 다분화능을 가지는 줄기세포를 의미하고, 배아 줄기세포, 인공 다능성 줄기세포 등의 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 그 외의 모든 다능성을 가지는 줄기세포, 및 포유동물의 성체 장기나 조직의 세포, 골수 세포, 혈액 세포 등에 포함되는 다분화능을 가지는 줄기세포가 포함된다. 이 경우에, 배아 줄기세포와 유사한 형질이란, 배아 줄기세포에 특이적인 표면(항원) 마커의 존재나 배아 줄기세포 특이적인 유전자의 발현, 또는 테라토마(teratoma) 형성능이나 키메라 마우스(chimera mouse) 형성능과 같은, 배아 줄기세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로서 정의할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 미분화 줄기세포는, 다능성을 가지는 줄기세포인 것이 바람직하다.

이들 세포는, OCT3/4, NANOG, TRA1-60, TRA1-81, SSEA-3, SSEA-4 등의 미분화 줄기세포가 가지는 특유의 세포 마커를 가지는 것에 의해 정의할 수도 있다.

다능성을 가지는 줄기세포로부터 심근 세포를 조제하는 경우, 심근 세포로의분화가 진행됨에 따라, 미분화 중배엽, 심장 중배엽(또는 예정 심근 세포)을 거쳐 심근 세포로 분화하는 것으로 여겨지고 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 「심근 세포」라고 할 경우, 미분화 줄기세포로부터 심근 세포로의 분화·유도가 개시된 세포를 모두 포함하는 개념이며, 전술한 미분화 중배엽, 심장 중배엽(또는 예정 심근 세포)을 거쳐 심근 세포를 모두 포함한다. 여기서, 미분화 중배엽이란, 미분화 중배엽에 특이적인 브라큐리(Brachyury) 단백질의 발현이 인정되는 세포를 의미한다. 심장 중배엽(또는 예정 심근 세포)이란, Mesp-1 등의 심장으로의 분화가 개시된 중배엽에 특이적인 단백질의 발현이 인정되고, 또한 동일 세포에 있어서 Nkx2.5나 액티닌 등의 심근 세포 특이적 단백질의 발현을 아직 인정하지 않는 세포로서, 그 후에 새로운 유도를 행할 필요가 없고, 오로지 심근 세포로 분화하는 능력을 가지는 세포를 의미한다. 그리고, 심근 세포란, 살아있는 세포의 경우에는 자율 박동을 행하고 있는 세포를 의미하고, 고정 후에는, Nkx2.5, GATA4, 액티닌 등의 마커를 발현하는 세포를 의미한다.

태아기에는, 혈중 지방산 농도가 0.1 mM 이하이며, 락트산 농도가 5∼7 mM이며, 심근 세포는 락트산을 주된 에너지원으로 하고 있다(Tohyama S et al.,. Cell Stem Cell.2013; 12: 127-137). 출생 후에는, 혈중 지방산 농도가 0.2∼0.4 mM로 상승하고, 또한, 락트산 농도는 0.5 mM로 저하되고, 심근 세포는 지방산을 주된 에너지원으로 하게 된다(Lopaschuk GD et al., Am J Physiol.1991; 261: H1698-1705, Werner JC et al., 1987; 22: 552-556, Medina JM., Biol Neonate.1985; 48: 237-244, Lopaschuk GD et al., J Cardiovasc Pharmacol.2010; 56: 130-140). 또한, 출생 후의 심근 세포는, 허혈이나 압부하 등의 스트레스를 받으면, 유전자 발현 패턴이 태아형의 패턴으로 변화되고, 태아기의 심근 세포와 같이 락트산을 주된 에너지원으로 사용할 수 있게 된다. 「심근 세포」는, 일반적으로, 다른 세포와는 달리, 글루코오스 대신 락트산, 피루브산 및 지방산을 에너지원으로서 이용할 수 있는 특징을 공통적으로 가지고 있다. 그리고, 다른 세포는 가지고 있지 않는, 심근 세포 만이 공통적으로 가지는 이와 같은 특징을 이용함으로써, 본 발명을 사용하여 심근 세포를 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 사용하는 「심근 세포」는, 그 세포의 유래나 취득 수단에 의해 한정되지 않는다. 예를 들면, 다능성을 가지는 줄기세포를 분화·유도하여 얻어진 「심근 세포」, 인간의 태아, 신생아 및 성체로부터 채취한 「심근 세포」, 포유류에 속하는 동물의 신생아, 태아 및 성체로부터 채취한 「심근 세포」, 및 비심근의 분화 세포로부터 직접 분화시켜(direct reprogra㎜ing) 얻은 「심근 세포」 등도 포함된다.

본 발명에 있어서, 「주화 세포」라고 할 경우, 세포 배양 조건 하에 있어서 자가 복제할 수 있는 불사화된 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 세포 배양액중으로부터 특정한 아미노산(세린, 글리신, 글루타민, 또는 아르기닌) 및/또는 당류를 「포함하지 않는다」라고 할 경우, 궁극적으로는 이들 특정한 아미노산이나 당류를 배양액 중에 전혀 포함하지 않는 것이지만, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 배양액중으로부터 100% 제거되어 있는 것까지는 요구되지 않으며, 이들 아미노산 중 어느 하나가 미량 배양액 중에 포함된다면, 허용된다. 허용되는 이들 특정한 아미노산 또는 당류의 양은, 미분화 줄기세포나, 비심근 세포, 주화 세포 등은 증식할 수 없고 세포사를 유도하는 배양 조건인 것을 특징으로서 규정할 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 세포 배양에 있어서 사용되는 시판 중인 배양액에 포함되는 각각의 아미노산량 또는 당류의 양을, 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만으로 한 세포 배양액을 사용한다. 예를 들면,

·둘베코 수정 이글 배지(DMEM, Sigma-Aldrich)는, L-Serine을 0.042 g/L, Glycine을 0.03 g/L, L-Glutamine을 0.584 g/L, L-Arginine·HCl을 0.84 g/L 또는 0.084 g/L, 그리고, 당류(D-글루코오스)를 4.5∼10 g/L 포함하는 배양액;

·F-12 배지(Sigma-Aldrich)는, L-Serine을 0.02102 또는 0.0105 g/L, Glycine를 0.015014 g/L 또는 0.00751 g/L, L-Glutamine을 0.1460∼2922 g/L, L-Arginine·HCl을 0.4214 또는 0.211 g/L, 그리고, 당류(D-글루코오스)를 1.26∼1.802 g/L 포함하는 배양액;

·RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich)는, L-Serine을 0.03∼0.3 g/L, Glycine을 0.01∼0.1 g/L, L-Glutamine을 0.3 g/L, L-Arginine을 0.2∼2 g/L, 그리고, 당류(D-글루코오스)를 2.0∼20.0 g/L 포함하는 배양액이다.

따라서, 특정한 아미노산 및/또는 당류를 「포함하지 않는다」라고 할 경우, 전술한 세포 배양에 있어서 일반적으로 사용하는 배양액의 조성에 기초하여, 이들 아미노산량 또는 당류의 양을 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만으로 한다. 그리고, 여기서, 당류라고 할 경우, 배양액 중의 당류(즉, 다당, 단당(글루코오스, 갈락토스, 프룩토오스, 만노스 등))를 모두 포함하는 개념이다.

전술한 본 발명의 제1 태양에 기초하여, 본 발명의 발명자 등은, 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 또는 아미노산 조성 중, 글루타민뿐만 아니라 세린 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 또는 아미노산 조성 중, 아르기닌을 또한 포함하지 않는 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도할 수 있으므로, 그 결과, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하기 위한 방법을 개시할 수 있다.

본 발명의 제1 태양에 있어서, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하기 위하여, 전술한 특정한 아미노산을 포함하지 않는 조건 하에서, 세포 배양을 12시간∼360시간, 바람직하게는 24∼240시간, 더욱 바람직하게는 48∼120시간, 계속한다.

전술한 바와 같이, 특허 문헌 2에서 예로 든 다양한 심근 세포 배양 조건을 인간의 세포에 대하여 적용하는 경우에, 조건에 따라서는, 생존하는 비심근 세포 또는 미분화 줄기세포가 매우 적은 양으로 존재하는 경우가 있으므로, 본 발명의 발명자들은 계속하여, 특허 문헌 2에 있어서 밝혀진 심근 세포의 선택적 취득을 위한 배양 조건의 지견에 대하여, 본 발명의 제1 태양에 있어서 얻어진 미분화 줄기세포에 대하여 세포사를 유도하는 배양 조건에 대한 지견을 조합함으로써, 심근 세포를 더욱 효율적으로 취득할 수 있는지의 여부에 대하여 검토했다.

그 결과, 특허 문헌 2에서 예로 든 각종 배양시 조건 중에서, 저당 조건, 또한 심근 세포가 에너지원으로 할 수 있는 락트산, 피루브산 또는 지방산을 첨가한 조건의 배양 조건과, 본원 명세서에 있어서 밝혀진 전술한 바와 같은 미분화 줄기세포에 대하여 세포사를 일으키는 배양 조건을 조합함으로써, 인간에 있어서도 심근 세포를 더욱 효율적으로 취득할 수 있는 것을 밝혀냈다.

이들 결과에 기초하여, 본 발명에 있어서는, 배양액의 조건으로서, 락트산, 피루브산 또는 지방산을 첨가한, 당류를 포함하지 않는 조건 하, 배양액 중의 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 것(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, 또는, Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－)에 의해, 인간의 배아 줄기세포나 인공 다능성 줄기세포를 포함하는 다능성을 가지는 줄기세포 등의 미분화 줄기세포나, 심근 세포 이외의 분화 세포에 대하여 세포사를 유도할 수 있고(도 2의 B, 도 3의 B, 및 도 4의 B), 그 결과 심근 세포만을 선택적으로 취득할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

그리고, Cys2, 및 Met의 소비량이 비교적 많은 것을 고려하여, 락트산을 첨가한, 당류를 포함하지 않는 조건 하(Lactate^＋, Gluc^－), 이들 아미노산 중 어느 하나를 포함하지 않는 배지를 사용하여, 미분화 줄기세포(인간 배아 줄기세포)가 사멸하는지의 여부에 대하여 검토했다. 그 결과, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－)의 경우와 비교하여, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 Cys2를 포함하지 않는 배지(Lactate^＋, Gluc^－, Cys2^－), 및 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 Met를 포함하지 않는 배지(Lactate^＋, Gluc^－, Met^－)의 세포사 유도 활성은, 대조군으로서 사용한, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 트레오닌을 포함하지 않는 배지(Lactate^＋, Gluc^－, Thr^－)와 동일한 정도의 세포사 유도 활성밖에 가지지 않는 것으로 밝혀져, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－)의 세포사 유도 활성이 뛰어난 것으로 밝혀졌다(도 5). 이 결과는, 비특허 문헌 3 및 비특허 문헌 4에서 나타내는 미분화 줄기세포에서의 트레오닌이나 메티오닌에 비해, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지가, 잔존하는 미분화 줄기세포의 제거 능력이, 보다 우수한 것을 시사하는 것이다.

따라서, 본 발명의 제2 태양에 있어서, 락트산, 피루브산 또는 지방산을 첨가한(Lactate^＋ 또는 Pyr^＋), 글루코오스를 포함하지 않고(Gluc^－), 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 것(Gln^－)을 특징으로 하는, 세포 배양액의 발명을 제공한다. 본 발명의 제2 태양에서의 세포 배양액은, 세린 및/또는 글리신(Ser^－; Gly^－)을 포함하지 않는 것을 새로운 특징으로 할 수도 있고, 그리고, 아르기닌을 포함하지 않는 것(Arg^－)을 새로운 특징으로서 할 수도 있다. 구체적으로 열거하면:

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－);

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 세린을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－);

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, Gly^－);

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－, Gly^－);

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, Arg^－);

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－, Arg^－);

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, Gly^－, Arg^－);

·락트산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－, Gly^－, Arg^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 세린을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－, Gly^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－, Gly^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－, Arg^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－, Arg^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－, Gly^－, Arg^－);

·피루브산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액(Pyr^＋, Gluc^－, Gln^－, Ser^－, Gly^－, Arg^－);

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액;

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 세린을 포함하지 않는 세포 배양액;

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액;

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액;

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액;

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액;

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액;

·지방산 첨가, 저당 조건, 또한 아미노산 조성 중, 글루타민, 세린, 글리신 및 아르기닌을 포함하지 않는 세포 배양액

등을 사용할 수 있다.

본 발명의 세포 배양액에, 아스코르브산 또는 알부민, 또는 이들 양쪽을 첨가할 수도 있다. 아스코르브산이나 알부민을 첨가해도, 세포 배양액의 세포사 유도 활성에 영향을 미치지 않는다.

본 발명의 제2 태양에서의 전술한 세포 배양액은, 혈청이나 혈청 대체품을 포함하지 않는 배양액이며, 락트산, 피루브산 및 지방산, 글루코오스, 글루타민, 세린 및/또는 글리신 아미노산, 또는 아르기닌 등의 특정한 아미노산의 조건 이외의 조건에 대해서는, 일반적인 세포 배양액(예를 들면, 둘베코 수정 이글 배양액(DMEM), MEM 배양액(예를 들면, α-MEM, MEM[Hank's BSS]), RPMI 배양액(예를 들면, RPMI 1940 등), F12 배양액, StemPro34, mTeSR1 등)과 동일한 조성으로 할 수 있다.

본 발명의 발명자 등의 검토에 기초하여, 전술한 바와 같은 특수한 아미노산 조성을 가지는 세포 배양액은, 미분화 줄기세포나, 심근 세포 이외의 분화 세포, 주화 세포에 대해서는 세포사를 일으키지만, 심근 세포에는 세포사를 유도하지 않는다. 그 결과, 본 발명의 제2 태양에서의 세포 배양액은, 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물로부터, 심근 세포를 선택적으로 선발하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 세포 배양액에 대하여 락트산을 첨가한다고 할 경우, 사용하는 세포 배양액에 대하여, 락트산(Lactate)을 0.1∼10 mM로 되도록 첨가한 것을 말한다. 또한, 세포 배양액에 대하여 피루브산을 첨가한다고 할 경우, 사용하는 세포 배양액에 대하여, 피루브산(Pyruvic acid)을 0.1∼10 mM로 되도록 첨가한 것을 말한다. 세포 배양액에 대하여 지방산을 첨가한다고 할 경우, 사용하는 세포 배양액에 대하여, 중쇄 지방산(탄소수가 5∼12 개의 지방산)이나 장쇄 지방산(탄소수가 12개보다 많은 지방산)을 첨가한 것을 말한다. 예를 들면, 올레산, 리놀레산 및 팔미트산 등이 0.05∼0.5 mM로 되도록 첨가할 수 있다.

한편, 그 외의 성분에 대하여, 세포 배양액중으로부터 특정한 아미노산(세린, 글리신, 글루타민, 또는 아르기닌) 및/또는 당류를 「포함하지 않는다」라고 할 경우, 궁극적으로는 전혀 포함하지 않는 것이지만, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 배양액중으로부터 100% 제거되어 있는 것까지는 요구되지 않는다.

전술한 본 발명의 제2 태양에 기초하여, 본 발명의 발명자 등은, 락트산, 피루브산 또는 지방산을 첨가하고, 글루코오스를 포함하지 않을 뿐만 아니라, 아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 또는 아미노산 조성 중, 글루타민뿐만 아니라 세린 및 글리신을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 또는 아미노산 조성 중, 아르기닌을 또한 포함하지 않는 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 비심근 세포에 세포사를 유도할 수 있으므로, 그 결과, 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물을 배양함으로써, 비심근 세포에 세포사를 유도하고, 그 결과 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법을 개시할 수 있다. 본 발명에 있어서, 비심근 세포라고 할 경우, 심근 세포 및 장래적으로 심근 세포가 되는 것으로 분화·유도되고 있는 세포 이외의 모든 세포를 포함하고 있고, 예를 들면, 미분화 줄기세포, 비심근 분화 세포, 또는 주화 세포가 포함된다.

본 발명의 제2 태양에 있어서, 비심근 세포에 세포사를 유도하기 위하여, 상기 특정한 아미노산을 포함하지 않는 조건 하에서, 세포 배양을 12시간∼360시간, 바람직하게는 24∼240시간, 더욱 바람직하게는 48∼120시간 계속한다.

본 발명의 세포 배양액에, 아스코르브산 또는 알부민, 또는 이들 양쪽을 첨가할 수도 있다. 아스코르브산이나 알부민을 첨가해도, 세포 배양액의 세포사 유도 활성 심근 세포의 정제 정밀도로 영향을 미치지 않고, 심근 세포를 600시간 이상 배양할 수 있다.

본 명세서의 이하에 있어서, 실시예를 제시한다. 이들 실시예는, 본 발명을 설명하는 것을 목적으로 하는 것이며, 어떤 형식을 가지더라도 본 발명을 한정하는 것을 목적으로 하지 않는다.

[실시예]

실시예 1: 세포의 배양

본 실시예에 있어서는, 미분화 줄기세포(배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포)의 배양, 분화 세포의 배양, 및 미분화 줄기세포로부터 심근 세포로의 분화 배양을 행하였다.

인간 배아 줄기세포(인간 배아 줄기세포)는, 국립대학 법인·쿄토 대학 재생 의과학연구소 부속 줄기세포 의학 연구 센터의 나카츠지 노리오 교수로부터 입수하였고, 인간 인공 다능성 줄기세포는, 국립대학 법인·쿄토 대학 iPS 세포 연구소 야마나카 신야 교수로부터 입수했다. 이 인간 배아 줄기세포 및 인간 인공 다능성 줄기세포를, 매트리젤(matrigel)(BD Bioscience cat 354277)을 사용하여 미분화 유지 배양을 행하였다. 배양액은 mTeSR1(STEMCELL Technologies Inc. cat 11875-119)을 사용하였다. 미분화 유지 배양액에 대해서는 mTeSR1 외에, Essential 8(Life Technologies)이나 TeSR2(STEMCELL Technologies Inc.) 등, 피더 프리용 배지로서 일반적으로 사용되고 있는 것이면 사용 가능하다. 또한 매트릭스로서, 매트리젤 외에, Vitronectin(Life Technologies)나 iMatrix-511(Takara no.892001) 등이 있고, 그 외의 피더 프리용 매트릭스로서 일반적으로 사용되고 있는 것이면 사용 가능하다.

계대배양 시에는, CTK solution(Repro CELL), 37℃ 5분에서 인간 배아 줄기세포 및 인공 다능성 줄기세포의 콜로니를 분리하였다. 세포의 분산 처리에 대해서는 CTK solution 이외에 StemPro Accutase(Life Technologies no.1110501)나 TrypLE Express/Select(Life Technologies)도 사용 가능하다.

미분화 줄기세포로부터 심근 세포로의 분화·유도는, 이번 실험에서 사용하고 있는 심근 분화 유도법은

·심근 분화 시에, 인간 배아 줄기세포 또는 인간 인공 다능성 줄기세포가 50∼90 % 융합(confluent)될 때, RPMI 배지(Invitrogen)에 B27(인슐린없음, Invitrogen) 및 CHIR99021(Selleckchem or Wako) 6μM를 첨가한 것으로 배지를 교환하였다(Day 0).

·Day 1∼Day 2는, RPMI/B27 인슐린(－) 배지로 배양을 행하였다.

·이어서, Day 3∼Day 5는, RPMI/B27 인슐린(－) 배지에, 또한 IWP2 5μM 또는 IWR-1(Sigma I0161) 5μM를 첨가한 배지로 배양을 행하였다.

·또한, Day 6∼Day 7은, RPMI/B27 인슐린(－) 배지로 배양을 행하였다.

·그리고, Day 8 이후는, RPMI/B27 인슐린(＋) 배지로 배양을 행하였다(Lian, X., et al., Nat Protocol, 2013, 8, 162-175). Day 8∼Day 11의 단계에서, 박동하는 심근 세포를 확인할 수 있다.

배양액 중의 당을 계속적으로 포함하지 않는 조건으로 하기 위하여, PBS로 2회 세정하고(Gluc^－), 최종적으로 락트산(Wako Pure Chemical cat 129-02666) 4 mM를 가한 D-MEM 배양액(Lactate^＋ 조건) 중에서, 글루타민 존재 하(Gln^＋) 또는 글루타민 비존재 하(Gln^－)에서, 3∼4 일간 배양을 행하였다. 락트산 농도는 1∼10 mM의 범위에서 조정할 필요가 있다. 본 실시예에 있어서는, 4 mM의 락트산을 첨가하였다.

실시예 2: 배양 조건 하에서의 배양 미분화 줄기세포의 아미노산 요구성

본 실시예에 있어서는, 미분화 줄기세포로서 인간 배아 줄기세포 또는 인간 인공 다능성 줄기세포를 사용하여, 미분화 줄기세포가 배양 조건 하에 있어서 어떤 아미노산 요구성을 가지고 있는지를 조사하였다.

인간 배아 줄기세포에 있어서, 특히 소비가 활발한 비필수 아미노산 및 준필수 아미노산을 조사하기 위하여, 배지 중의 아미노산 농도를 측정하였다. 구체적으로는, 세포마다 1.5×10⁶개의 세포를 3.5 cm의 샬레(schale) 중에서 배양하고, 그 후, 세포 배양 개시 전의 배양액 조성과 세포 배양 후의 배양액 조성을 해석했다.

아미노산 분석은 심보 등(Shimbo, K., Rapid Co㎜un. Mass Spectrom.2009, 23, 1483-1492)의 시스템에 따라 실시하였다. 세포 배양 후 상청액은 1.5 mL 튜브로 옮기고, 측정 시까지 -80℃에서 보존하였다. 샘플은 단백질 제거 처리를 실시한 후, APDS 시약으로 유도체화를 실시하여 분석 장치에 세팅하였다. 각 샘플 중의 아미노산 농도는 검량선을 사용하여 산출하였다. 분석한 37 아미노산은 하기와 같다: 글리신(Gly), 사르코신(Sar), 알라닌(Ala), γ-아미노 부티르산(GABA), β-이소아미노 부티르산(b-AiBA), α-아미노 부티르산(a-ABA), 세린(Ser), 프롤린(Pro), 발린(Val), 트레오닌(Thr), 타우린(Tau), 하이드록시프롤린(HyPro), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 아스파라긴(Asn), 오르니틴(Orn), 아스파라긴산(Asp), 글루타민(Gln), 리진(Lys), 글루타민산(Glu), 메티오닌(Met), 히스티딘(His), α-아미노아디프산(a-AAA), 하이드록시리신(HyLys), 페닐알라닌(Phe), 1-메틸히스티딘(1MeHis), 3-메틸히스티딘(3MeHis), 아르기닌(Arg), 시트룰린(Cit), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp), 시스타티오닌(cysthi), 카르노신(Car), 안세린(Ans), 시스틴(Cys2), 알라닌-글루타민(Ala-Gln), 글리신-글루타민(Gly－Gln).

세린, 아르기닌, 시스틴, 글루타민에 대하여 특히 배양 시간에 따라 배지 중의 농도가 현저하게 저하되는 것을 알았다.

다음으로, 다양한 조건 하에서 배양을 행한 경우의 세포의 생존을, 세포가 가지는 알칼리포스파타제(ALP)의 활성을, StemTAG^TM 알칼리포스파타제 염색 키트(Sigma 86-R)로 발색하는 세포를 살아있는 세포로서 확인하는 방법에 의해, 인간 배아 줄기세포(도 2) 및 인간 인공 다능성 줄기세포(도 4)에 있어서, 다양한 아미노산 조건에 대한 반응성을 조사하였다.

고(高)글루코오스 DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로(도 2의 A 및 도 4의 A, 「Gluc^＋ 조건」), 글루타민, 세린, 글리신, 아르기닌의 4개의 아미노산을 포함하지 않는 배지, 및 DMEM의 기본 조성으로부터 전술한 1개씩의 아미노산(세린만, 세린·글리신만, 아르기닌만, 글루타민만)을 포함하지 않는 배지를 제조하였다(각각, 「Ser^－」「Ser^－Gly^－」「Arg^－」「Gln^－」). 전술한 배양 조건에서 인간 배아 줄기세포 및 인간 인공 다능성 줄기세포를 약 48시간 배양한 후, ALP 염색을 행한 바, 글루코오스가 존재함에도 불구하고, 세린을 포함하지 않는 조건(Ser^－), 세린·글리신을 포함하지 않는 조건(Ser^－Gly^－), 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gln^－), 아르기닌을 포함하지 않는 조건(Arg^－)에서 세포 배양을 행함으로써, 인간 배아 줄기세포 또는 인공 다능성 줄기세포의 콜로니수가 저하되는 것을 알았다. 그러나, 48시간에도 ALP 양성의 미분화 콜로니는 많이 인정되었다(도 2의 A, 도 4의 A).

다음으로, 글루코오스를 포함하지 않는 DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 락트산(4 mM)을 첨가하고(도 2의 B 및 도 4의 B, 「Gluc^－, Lactate^＋ 조건」), DMEM의 기본 조성 중 세린, 글리신, 아르기닌, 글루타민의 4개의 아미노산을 포함하지 않는 배지, 및 DMEM의 기본 조성 중 전술한 1개씩의 아미노산(세린만, 세린·글리신만, 아르기닌만, 글루타민만)을 포함하지 않는 배지(각각, 「Ser^－」「Ser^－Gly^－」「Arg^－」「Gln^－」)를 제조하였다. 전술한 배양 조건에서 인간 배아 줄기세포 및 인간 인공 다능성 줄기세포를 약 48시간 배양한 후, ALP 염색을 행한 바, 글루코오스를 포함하지 않는 DMEM 조성으로부터 4개의 아미노산을 포함하지 않는 군 및 글루코오스를 포함하지 않는 DMEM 조성으로부터 글루타민만을 포함하지 않는 군(Gln^－)에서는, 인간 배아 줄기세포 또는 인공 다능성 줄기세포의 ALP 양성 콜로니수가 24시간 후 거의 소실하고, 48시간 후 완전히 소실하는 것을 알 수 있었다(도 2의 B, 도 4의 B).

도 1에 있어서, 인간의 배아 줄기세포에 있어서, Cys2, 및 Met의 소비량이 비교적 많은 점을 고려하여, 락트산을 첨가한, 당류를 포함하지 않는 조건 하(Lactate^＋, Gluc^－), 이들 아미노산 중 어느 하나를 포함하지 않는 배지를 사용하여, 미분화 줄기세포(인간 배아 줄기세포)를 생존할 수 있는지의 여부에 대하여 검토했다. 배양액으로서는, 글루코오스를 포함하지 않는 DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 락트산(4 mM)을 첨가하고(「Gluc^－, Lactate^＋ 조건」), 이 DMEM의 기본 조성으로부터 전술한 1개씩의 아미노산(글루타민만, 시스틴만, 메티오닌만, 트레오닌만)을 포함하지 않는 배지(각각, 「Gln^－」「Cys2^－」「Met^－」「Thr^－」)를 제조·사용하고, 세포를 각각의 배지를 사용하여 24시간 배양한 후, 세포가 가지는 알칼리포스파타제(ALP)의 활성을, StemTAG^TM 알칼리포스파타제 염색 키트(Sigma 86-R)로 발색시켜, 적색으로 염색된 세포를 살아있는 세포로서 확인하였다. 그 결과, 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Lactate^＋, Gln^－)의 경우와 비교하여, Cys2를 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Lactate^＋, Cys2^－) 및 Met를 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Lactate^＋, Met^－)의 세포사 유도 활성은, 대조군으로서 사용한 트레오닌을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Lactate^＋, Thr^－)와 동일한 정도의 세포사 유도 활성 밖에 가지지 않는 것으로 밝혀지고, 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Lactate^＋, Gln^－)의 세포사 유도 활성이 뛰어난 것으로 밝혀졌다(도 5). 이 결과는, 비특허 문헌 3 및 비특허 문헌 4에서 나타내는 미분화 줄기세포에서의 트레오닌이나 메티오닌에 비하여, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지가 잔존 미분화 줄기세포 제거 능력이 보다 우수한 것을 시사하는 것이다.

실시예 3: 다양한 배양액 조건에 대한 세포의 반응성

본 실시예에 있어서는, 미분화 줄기세포 또는 심근 세포를 다양한 배양액 조건 중에서 배양한 경우에, 세포의 생존율이 어떻게 변화하는지를 명확하게 했다.

본 실시예에 있어서 사용하는 배양액으로서, 글루코오스를 포함하지 않는 DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 락트산(4 mM)을 첨가하고(Gluc^－, Lactate^＋) 또는 락트산을 첨가하지 않는(Gluc^－, Lactate^－) 조건 중 어느 하나의 조건에, 또한, 아르기닌, 글루타민, 세린, 글리신의 4개의 아미노산 중 1개(아르기닌만, 글루타민만, 세린만, 또는 글리신만)를 포함하지 않는 조건을 추가한 배지(각각, 「Arg^－」「Gln^－」「Ser^－」「Gly^－」)를 제조하였다. 전술한 배양 조건에서 미분화 줄기세포(인간 배아 줄기세포) 또는 랫 신생아 심근 세포를 약 24시간 배양한 후, 생 세포·사 세포 동시 염색 키트(TaKaRa Bio, Inc.)에 의한 염색을 행하고, 촬상하는 동시에(도 3의 A 및 도 6의 A), 세포 생존율을 카운트했다(도 3의 B 및 도 6의 B).

미분화 줄기세포(인간 배아 줄기세포)를 사용하여, 도 1에서 소비가 많았던 다양한 비필수 아미노산을 포함하지 않는 조건 하에서 배양한 경우의 미분화 줄기세포에서의 생사를 관찰하여, 세포 생존율을 측정한 결과를 도 3에 나타낸다. 그 결과, 미분화 줄기세포의 경우에는, 락트산을 첨가하거나 하지 않거나 그와 관계없이, 글루타민을 포함하지 않는 배지(「Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－」 또는 「Lactate^－, Gluc^－, Gln^－」)에 있어서, 생존율이 현저하게 저하되는 것으로 밝혀졌다(도 3).

한편, 랫 신생아 심근 세포를 사용하여, 동일한 방법으로, 도 1에서 소비가 많았던 다양한 비필수 아미노산을 포함하지 않는 조건 하에서 배양한 경우의 심근 세포에서의 생사를 관찰하여, 세포 생존율을 측정한 결과를 도 6에 나타낸다. 그 결과, 신생아 심근 세포의 경우에는, 락트산을 첨가함으로써, 글루타민을 포함하지 않는 배지(Lactate^＋, Gluc^－, Gln^－)의 경우라도, 생존율을 현저하게 개선시키는 것, 즉 락트산의 첨가에 기초하여, 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gln^－)에 의해 일어나는 세포사 유도 활성이, 저감하는 것이 밝혀졌다(도 6).

실시예 4: 배양 조건 하에서의 인공 다능성 줄기세포로부터 심근 세포로의 분화·유도

본 실시예는, 인간 인공 다능성 줄기세포로부터 심근 세포로의 분화·유도의 수순을 명확하게 하는 것을 목적으로 하여 행해진 것이다.

·심근 분화 시에, 인간 인공 다능성 줄기세포가 50∼90 % 융합될 때, RPMI 배지(Invitrogen)에 B27(인슐린없음, Invitrogen) 및 CHIR99021(Selleckchem or Wako) 6μM를 첨가한 것으로 배지를 교환하였다(Day 0).

·Day 1∼Day 2는, RPMI/B27 인슐린(－) 배지로 배양을 행하였다.

·이어서, Day 3∼Day 5는, RPMI/B27 인슐린(－) 배지에, 또한 IWP2 5μM 또는 IWR-1 5μM를 첨가한 배지로 배양을 행하였다.

·그리고, Day 8 이후에는, RPMI/B27 인슐린(＋) 배지로 배양을 행하였다(Lian, X., et al., Nat Protocol, 2013, 8, 162-175). Day 8∼Day 11의 단계에서, 박동하는 심근 세포를 확인할 수 있었다(도 4의 A).

배양액 중의 당이 실질적으로 포함되지 않도록 하기 위하여, PBS로 2회 세정하고(Gluc^－), 최종적으로 락트산(Wako Pure Chemical cat 129-02666) 4 mM를 가한 D-MEM 배양액(Lactate^＋ 조건) 중에서, 글루타민 존재 하(Gln^＋) 또는 글루타민 비존재 하(Gln^－)에서, 3∼4일간 배양을 행하였다. 락트산 농도는 1∼10 mM의 범위에서 조정할 필요가 있다. 본 실시예에 있어서는, 4 mM의 락트산을 첨가하였다.

실시예 5: 배양 조건 하에서의 심근 분화 세포의 아미노산 요구성

본 실시예에 있어서는, 인간 인공 다능성 줄기세포로부터 분화·유도된 심근 세포를 사용하여, 심근 분화 세포가, 배양 조건 하에 있어서, 어떤 아미노산 요구성을 가지고 있는지를 조사하였다.

당 존재 조건(도 7의 A), 글루코오스를 포함하지 않고 락트산 첨가 배지(Cell Stem Cell 2013 12: 127-37)(Gluc^－, All^＋, Lactate^＋)(도 7의 B), 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)(도 7의 C)에서 3일간 배양한 후, 면역 염색한 사진을 도 7에 나타낸다.

면역 염색에서는, 세포를 4% 파라포름알데히드에 의해 15∼30 분간 고정한 후, 세포핵에 대해서는 DAPI(Invitrogen), 및 횡문(橫紋) 구조에 대해서는 항α액티닌 항체(Sigma)와 Alexa546 donkey anti-mouse IgG(Invitrogen)를 사용하여, 형광을 검출하였다.

3일간 배양한 후의 면역 사진에서는, 글루코오스를 포함하지 않는 락트산 첨가 배지(글루타민있음)(Gluc^－, Gln^＋, Lactate^＋)에서는, DAPI로 염색된 세포핵에 대하여, 심근 마커인 α액티닌 음성의 세포에서 매우 약간 인정된 것에 비해(도 7의 B), 락트산을 첨가한 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에서는, DAPI로 염색된 세포핵에 대하여, 100%에 가까운 세포가 α액티닌 양성의 세포였다(도 7의 C).

이 결과는, 글루타민을 포함하는 배양 조건(도 7의 B)에 있어서는, 심근 세포 이외의 세포가 매우 약간 생존하고 있는 데 비해, 글루타민을 포함하지 않는 배양 조건(도 7의 C)에 있어서는, 심근 세포는 생존하고 있지만, 심근 세포 이외의 세포(미분화 줄기세포, 비심근 세포)는 세포사를 유도하여, 완전히 존재하지 않게 된 것을 나타내고 있다.

당 대사의 경로와의 관련에서 이와 같은 차이가 생긴 기작을 예상하면, 일반의 세포(미분화 줄기세포나 비심근 세포)에서는, 당 대사의 일련의 흐름에 있어서, 해당계로부터의 피루브산 공급 경로, 글루타민으로부터의 글루타민산을 경유한 α-케토글루타르산 공급 경로가, 세포의 생존에 크게 기여하고 있지만, 락트산으로부터의 피루브산 공급 경로는, 일반적으로 기여도가 매우 낮은 상태로 유지되고 있다. 이에 비해, 심근 세포에 있어서는, 해당계로부터의 피루브산 공급 경로, 글루타민으로부터의 글루타민산을 경유한 α-케토글루타르산 공급 경로뿐만 아니라, 락트산으로부터의 피루브산 공급 경로도 심근 세포의 생존에 대하여 실질적인 기여를 하고 있는 것으로 예상되었다.

그리고, 이 결과, 인간 배아 줄기세포 또는 인간 인공 다능성 줄기세포로부터 유도된 심근 세포(미분화 줄기세포나 비심근 세포를 포함하는 상태)를, 락트산을 첨가한 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배양 조건 하(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에서 배양함으로써, 락트산을 첨가한 글루코오스를 포함하지 않는 배양 조건 하(글루타민 있음)(Gluc^－, Gln^＋, Lactate^＋)에서 배양할 때와 비교하여 단시간에 효율적으로 심근 세포를 선택적으로 취득할 수 있는 것으로 판명되었다(도 7의 B).

락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에서 4일간 배양한 후의 심근 세포괴를, 0.25% Trypsin EDTA에 의해 분산하고, 피브로넥틴(Sigma)으로 코팅한 배양 접시에 파종하고, 면역 염색한 것이 도 8이다. 면역 염색에서는, 4% 파라포름알데히드에 의해 고정한 후, 항α액티닌 항체(Sigma), 항트로포닌 I 항체(Santacruz), 항Tra1-60(Millipore)을 사용하였다. 여기서, α액티닌은 심근 세포 특이적 마커, 트로포닌 I도 또한 심근 세포 특이적 마커, 그리고, Tra1-60은 다능성 줄기세포 특이적 마커이다.

그 결과, DAPI로 핵염색된 거의 모든 세포가, α액티닌 양성, 트로포닌 I 양성인 것을 알 수 있었다(도 8의 A 및 도 8 B). 세포가 심근 세포인지의 여부를 확인하기 위하여, α액티닌과 트로포닌 I를 거듭해서 염색을 행한 바, α액티닌에서의 염색 세포와 트로포닌 I에서의 염색 세포가 완전히 일치하였다(도 8의 C). 한편, 잔존 미분화 줄기세포를 확인하기 위하여, Tra1-60 양성 세포를 확인한 바, 모든 세포가 Tra1-60 음성이었다(도 8의 D의 우상(右上)). 이로써, 미분화 줄기세포가 완전히 제거되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 6: 잔존 미분화 줄기세포의 검출

잔존 미분화 줄기세포의 검출 방법 중에서, 감도가 높은 방법으로서 Lin28의 유전자 발현을 Q-PCR에 의해 정량화하는 방법이 보고되어 있다(PLOS ONE 2012; 7(5): e37342). 락트산을 첨가한 글루코오스를 포함하지 않는 배지(Gluc^－, All^＋, Lactate^＋)와 락트산을 첨가한 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에 있어서 인간 인공 다능성 줄기세포로부터 분화·유도된 심근 세포를 각각 4일간 순화 정제한 것으로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 제조하였다. 18S로 정규화(normalize)한 결과, 락트산을 첨가한 글루코오스를 포함하지 않는 배지(Gluc^－, All^＋, Lactate^＋)에서는 Lin28이 발현하고 있는 데 비해 락트산을 첨가한 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에서는 전혀 발현하고 있지 않았다(도 9). 이 결과로부터도 락트산을 첨가한 글루코오스를 포함하지 않는 배지(Gluc^－, All^＋, Lactate^＋)에 비해 락트산을 첨가한 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lactate^＋)에 있어서 미분화 줄기세포 제거능이 우수한 것을 나타낸다.

실시예 7: 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지 배양 하에서의 심근 세포에서의 락트산 플럭솜(fluxome)(대사(代謝) 유속(流速)) 해석

본 실시예에 있어서는, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배양 조건 하에 있어서, 심근 세포가 어떻게 락트산을 대사하고, 생존하고 있지에 대한 메커니즘을 캐필러리(capillary) 전기 영동 및 질량 분석을 사용하여 검토했다.

인간 배아 줄기세포 및 신생아 랫 심근 세포에 있어서, 배양액을, 4 mM의 [¹³C]-표지 락트산(Isotec)을 첨가한 개변 글루코오스 불포함 DMEM(Invitrogen)로 변경하였다. 1시간 후에, 이들 세포를 10% 만니톨(Wako) 중에서 세정하고, 그리고, 내부 표준(양이온에 대해서는 200μM의 L-메티오닌술폰, 그리고 음이온에 대해서는 200μM의 MES)을 함유하는 메탄올 중에 회수하였다. 세포 및 배양액을 회수하고, 에어 압력 펌프를 부속된 Agilent 캐필러리 전기 영동 시스템, Agilent 1100 시리즈 질량 선택 검출기 질량 분석계, Agilent 1100 시리즈 등용매(isocratic) 고속 액체 크로마토그래피 펌프, G1603A Agilent 캐필러리 전기 영동 및 질량 분석계 어댑터 키트, 및 G1607A Agilent 캐필러리 전기 영동 및 질량 분석계 스프레이어키트(Agilent Technologies)를 사용하여, 캐필러리 전기 영동 및 질량 분석을 행하였다. 수치는, 세포수에 대하여 보정하였다. 심근 세포에 있어서, TCA 사이클내 대사 산물이 유의하게 많이 검출되었다(도 10의 A, B). 한편, 배아 줄기세포에서는, 이들 대사 산물은 매우 조금 밖에 관찰되지 않았다(도 10의 B). 이러한 사실로 부터, 배아 줄기세포를 포함한 비심근 세포와 비교하여, 심근 세포에 있어서, 외래성의 락트산이, TCA 사이클을 통하여 보다 효율적으로 대사되고 있는 것이 시사되었다. 놀랍게도, 심근 세포에 있어서 [¹³C]가 2-옥소글루타르산 및 글루타민산에 있어서 유의하게 많이 검출되었다(도 10의 C, D). 이러한 결과는, 락트산이 TCA 사이클을 이용한 ATP 발생에 있어서 크게 기여하고 있는 것을 나타낼 뿐만 아니라, 배지 중에 글루타민 및 글루타민산을 포함하지 않는 조건 하에서도, 락트산이 2-옥소글루타르산 및 글루타민산의 생합성에 기여하고, 보충하고 있으므로, 심근 세포가 생존 가능한 것이 시사되었다.

실시예 8: 인간 인공 다능성 줄기세포를 분화 유도하여 얻은 세포군을, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건 하에서 배양하는 효과

인간 인공 다능성 줄기세포를, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 인간 인공 다능성 줄기세포(hiPSC)를 심근 세포로 분화 유도했다. 얻어진 세포군(hiPSC-CMs)을 순화 정제하기 위하여, DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)로 5일간 배양했다.

락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에서 배양을 개시한 후 2일째 및 5일째의 세포군을 FACS로 해석했다. 결과를 도 11에 나타낸다. FACS 상(上), 2일째의 세포군 중의 트로포닌 T 양성 세포는 93.5%, 5일째의 세포군 중의 트로포닌 T 양성 세포는 98.7%였다.

이러한 사실로부터, 심근 세포의 에너지원으로서 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에서 배양한 경우에, 심근 세포를 정제할 수 있는 것을 알 수 있다.

실시예 9: 피루브산을 첨가한 글루타민을 포함하지 않는 배양 조건 하에서의, 미분화 줄기세포 및 심근 세포의 생존의 여부

본 실시예에서는, 피루브산을 첨가한, 글루타민을 포함하지 않는 배양 조건 하에서의, 미분화 줄기세포로서의 인간 배아 줄기세포, 및 심근 세포로서의 랫 신생아 심근 세포의 생존 여부에 대하여 조사하였다.

글루코오스를 포함하지 않는 DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, DMEM의 기본 조성의 아미노산의 모든 것을 포함하는 배지(「Gluc^－, ALL^＋」조건), DMEM의 기본 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 배지(「Gluc^－, Gln^－」 조건), DMEM의 기본 조성 중 글루타민을 포함하지 않고, α-케토글루타르산을 4 mM 포함하는 배지(「Gluc^－, Gln^－, DM-αKG^＋」), DMEM의 기본 조성 중 글루타민을 포함하지 않고, 피루브산을 2 mM 포함하는 배지(「Gluc^－, Gln^－, Pyr^＋」)를 제조하였다. 인간 배아 줄기세포를 각각의 배지를 사용하여 48시간 배양했다. 그 후, 인간 배아 줄기세포가 가지는 알칼리포스파타제(ALP)의 활성을, StemTAG^TM 알칼리포스파타제 염색 키트(Sigma 86-R)로 발색시키고, 적색으로 염색된 세포를 살아있는 세포로서 확인하였다(도 12). 그 결과, α-케토글루타르산을 포함하는 배지에서는, ALP 양성의 미분화 콜로니는 많이 인정되었지만, 피루브산을 첨가한 배지에서는 ALP 양성의 미분화 콜로니는 인정되지 않았다. 이러한 사실로부터, 글루타민산을 포함하지 않는 조건 하에서는, 피루브산을 첨가해도 단시간에 사멸하는 것을 알 수 있다.

다음으로, 랫 신생아 심근 세포를 사용하여, 글루코오스를 포함하지 않는 DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, DMEM의 기본 조성의 아미노산을 모두 포함하는 배지(Gluc^－, ALL^＋), DMEM의 기본 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－), DMEM의 기본 조성 중 글루타민을 포함하지 않고, 피루브산을 2 mM 첨가한 배지(Gluc^－, Gln^－, Pyr^＋), DMEM의 기본 조성 중 글루타민을 포함하지 않고, 락트산을 4 mM 첨가한 배지(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)를 제조하였다. 인간 배아 줄기세포를 각각의 배지를 사용하여 48시간 배양한 후, 생 세포·사 세포 동시 염색 키트(TaKaRa Bio, Inc.)에 의한 염색을 행하고, 촬상하였다(도 13). 녹색이 살아있는 세포, 적색이 죽은 세포를 나타내고 있다. 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건 하에서는, 락트산 및 피루브산을 첨가하지 않는 조건 하에서 배양한 심근 세포와 비교하여, 심근 세포의 에너지원으로서의 락트산 또는 피루브산을 첨가한 조건 하에서 배양한 심근 세포는, 생존율이 현저하게 높았다. 이러한 사실로부터, 피루브산의 첨가에 의해, 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gln^－)에 의한 심근 세포에 대한 세포사 유도 활성이 저감되는 것으로 밝혀졌다.

실시예 10: 잔존 미분화 줄기세포의 검출

laminin-521 및 Essential 8 배지를 조합하여 사용하는, 다른 잔존 미분화 줄기세포의 검출 방법(Tano et al., PLOS ONE 2014)의 검출 감도를 조사하였다. 배양액을 mTeSR1, 바탕재로서 iMatrix(닛피사 제조)를 사용한 경우의 미분화 줄기세포 검출 감도를 평가했다. 먼저, HEK293 세포의 세포군에, 인간 인공 다능성 줄기세포(hiPSC)를 혼입시킨 조건(0%) 및 0.1%, 0.01% 또는 0.001%의 비율로 혼입시킨 조건에서 촬상하였다(도 14의 A). 0.001%의 비율로 인간 인공 다능성 줄기세포를 혼입시킨 경우에도 인간 인공 다능성 줄기세포가 검출되므로, 이 방법에 의해 0.001%의 비율로 혼입되는 미분화 줄기세포까지 검출 가능한 것을 확인할 수 있었다.

그리고, 인간 인공 다능성 줄기세포 유래의 분화 세포에 잔존하는 미분화 줄기세포를 평가했다. 먼저, 실시예 4의 방법에 의해, 인간 인공 다능성 줄기세포를 심근 세포로 분화 유도하고 촬상하였다(도 14의 B). 그리고, 동일한 조건에서 분화 유도한 세포군을 순화 정제하기 위하여, DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 락트산을 첨가하고, 글루코오스를 포함하지 않고 글루타민을 포함하는 조건(Gluc^－, Gln^＋, Lac^＋) 또는, DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에서 4일간 배양한 후, 촬상하였다(도 14의 B). 순화 정제 전의 세포군, 및 4 mM의 락트산을 첨가한, 글루코오스를 포함하지 않고 4 mM의 글루타민을 포함하는 조건 하(Gluc^－, Gln^＋, Lac^＋)에서 순화 정제한 세포군에는 TRA1-60 양성 세포가 관찰되었다. 이에 비해, 락트산을 첨가한 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건 하(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에서 순화 정제한 세포군에는, TRA1-60 양성 세포가 관찰 되지 않았다.

이러한 사실로부터, 락트산을 첨가한 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에서는, 잔존 미분화 줄기세포는 0.001% 미만인 것을 알 수 있다.

실시예 11: 증식성 비심근 세포에 대한 세포사 유도 활성

본 실시예에서는, 글루타민을 포함하지 않는 배양 조건에 의한, 증식성 비심근 세포에 대한 세포사 유도 활성에 대하여 조사하였다.

인간 배아 줄기세포를 DMEM(10% FBS, bFGF 불포함) 조건에서 2주간 배양하고, 심근 세포가 포함되지 않은, 증식성의 비심근 세포의 세포군을 얻었다. 이 세포군에는, 섬유아 세포나 심근 세포 이외의 분화 세포가 포함된다. 이 세포군을, DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 글루코오스를 포함하지 않고, 4 mM의 글루타민을 포함하는 조건(Gluc^－, Gln^＋)에서 48시간 배양한 후 관찰한 바, 생존 세포가 인정되었다(도 15). 이에 비해, 증식성 비심근 세포를, 4 mM의 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에서 48시간 배양한 후 관찰한 바, 생존 세포는 전혀 인정되지 않고, 완전히 사멸되어 있었다(도 15).

이러한 사실로부터, 락트산을 첨가한, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 조건에서는, 증식형 비심근 세포를 사멸시킬 수 있는 것을 알 수 있다. 최근, 세포 이식 후의 종양 형성의 원인으로서 미분화 줄기세포뿐만 아니라, 미성숙한 증식성 세포도 관여하고 있는 것으로 보고되어 있지만(Nori et al., Stem Cell Report 2015), 본 방법에 의해 미분화 줄기세포뿐만 아니라, 증식성 세포도 단시간에 사멸시키는 것이 가능하다.

실시예 12: 정제용 배지에 첨가할 수 있는 화합물

본 실시예에서는, 정제용 배지에, 심근 세포에 있어서 영양소가 되는 화합물을 첨가한 경우에, 미분화 줄기세포나 비심근의 분화 세포는 생존하지 않고, 심근 세포가 보다 장기간 생존하는 조건을 탐색했다.

DMEM(Invitrogen)의 조성을 베이스로, 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지(Gluc^－, Gln^－, Lac^＋)에, 아스코르브산(25 mg/L) 또는 알부민(0.1%)을 첨가한 배지를 각각 제조하였다.

다음으로, 제조한 배지로 인간 인공 다능성 줄기세포를 배양했다. 배양 개시로부터 24시간 후에 관찰하면, 어느 배지에서도 인간 인공 다능성 줄기세포는 사멸되어 있었다(도 16).

다음으로, 인간 인공 다능성 줄기세포를 DMEM(10% FBS, bFGF 불포함) 조건에서 2주간 배양하고, 심근 세포가 포함되지 않은, 증식성 비심근 세포의 세포군을 얻었다. 얻어진 세포군을 제조한 배지로 배양했다. 배양 개시로부터 48시간 후에는, 세포는 사멸했다(도 17).

다음으로, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 인간 인공 다능성 줄기세포를 심근 세포로 분화 유도했다. 얻어진 세포괴를 아스코르브산 또는 알부민을 첨가한 배지로 배양한 바, 600시간 배양 후에도 심근 세포가 생존하고 있었다(도 18).

배양을 더 계속하여 744시간 배양 후에 관찰한 바, 어느 조건에 있어서도, 여전히 박동하는 심근 세포가 많이 인정되었다. 다음으로, 죽은 세포 염색용 형광 색소 PI(Propidium Iodide)를 사용하여 염색하여 관찰했다(도 19). 아스코르브산 및 알부민을 첨가하고 있지 않은 조건(첨가(-))과 비교하면, 아스코르브산 또는 알부민을 첨가한 조건 쪽이, 살아있는 세포가 많이 인정되었다. 이상의 결과로부터, 아스코르브산 또는 알부민을 첨가한, 심근 세포의 에너지원으로서 락트산을 첨가하고, 글루코오스 및 글루타민을 포함하지 않는 배지를 사용하여, 심근 세포를 정제할 수 있는 것을 알았다. 또한, 이 배지를 사용하면, 심근 세포를 더욱 장기간 생존시킬 수 있는 것을 알았다.

[산업상 이용가능성]

본 발명의 제1 태양에 의해, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액을 조제함으로써, 미분화 줄기세포에 세포사를 일으키기 위해 사용되는 세포 배양액을 제공할 수 있다. 이 제1 태양의 세포 배양액을 사용하여 단순하게 세포 배양을 행하는 것에만 의해, 간편하게 미분화 줄기세포에 대하여 세포사를 유도할 수 있다. 또한, 본 발명의 제2 태양에 의해, 락트산, 피루브산, 또는 지방산을 첨가하지만, 당류(글루코오스)를 포함하지 않고, 그리고 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액을 조제함으로써, 심근 세포를 선택적으로 선발하기 위해 사용되는 세포 배양액을 제공할 수 있다. 이 제2 태양의 세포 배양액을 사용하여 단순하게 세포 배양을 행하는 것에만 의해, 간편하게 인간의 배아 줄기세포나 인공 다능성 줄기세포를 포함하는 다능성을 가지는 줄기세포 등의 미분화 줄기세포나, 심근 세포 이외의 분화 세포, 주화 세포에 대하여 세포사를 유도할 수 있고, 결과적으로 심근 세포를 선택적으로 선발할 수 있다.

Claims

아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는, 세포 배양액.
제1항에 있어서,
미분화 줄기세포에 세포사(cell death)를 일으키기 위해 사용되는, 세포 배양액.
제1항 또는 제2항에 있어서,
아미노산 조성 중, 세린 및 글리신을 포함하지 않는, 세포 배양액.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 조성 중, 아르기닌을 포함하지 않는, 세포 배양액.
제4항에 있어서,
미분화 줄기세포가, 다능성(pluripotent)을 가지는 줄기세포 또는 다분화능(multipotent)을 가지는 줄기세포인, 세포 배양액.
아미노산 조성 중, 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서 배양함으로써, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하는 방법.
제6항에 있어서,
미분화 줄기세포가, 다능성을 가지는 줄기세포 또는 다분화능을 가지는 줄기세포인, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서,
세포 배양액이, 아미노산 조성 중, 세린 및 글리신을 포함하지 않는 것인, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하는 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 배양액이, 아미노산 조성 중, 아르기닌을 포함하지 않는 것인, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하는 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
특정한 상기 아미노산을 포함하지 않는 조건 하에서, 세포 배양을 12시간∼360시간 계속하는, 미분화 줄기세포에 세포사를 유도하는 방법.
락트산이 첨가되고, 당류를 포함하지 않고, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는, 세포 배양액.
피루브산이 첨가되고, 당류를 포함하지 않고, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는, 세포 배양액.
지방산이 첨가되고, 당류를 포함하지 않고, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는, 세포 배양액.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 조성 중, 세린 및 글리신을 포함하지 않는, 세포 배양액.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 조성 중, 아르기닌을 포함하지 않는, 세포 배양액.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
심근 세포와 비심근 세포의 혼합물로부터, 심근 세포를 선택적으로 선발하기 위해 사용되는, 세포 배양액.
제16항에 있어서,
비심근 세포가, 미분화 줄기세포, 심근 세포 이외의 분화 세포 및 주화(株化) 세포를 포함하는 세포인, 세포 배양액.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
아스코르브산 또는 알부민이 첨가된, 세포 배양액.
락트산이 첨가되고, 당류를 포함하지 않고, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서, 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물을 배양하는 것을 포함하는, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.
피루브산이 첨가되고, 당류를 포함하지 않고, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서, 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물을 배양하는 것을 포함하는, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.
지방산이 첨가되고, 당류를 포함하지 않고, 아미노산 조성 중 글루타민을 포함하지 않는 세포 배양액 중에서, 심근 세포와 비심근 세포의 혼합물을 배양하는 것을 포함하는, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.
제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
비심근 세포가, 미분화 줄기세포, 비심근의 분화 세포, 또는 주화 세포인, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.
제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 배양액이, 아미노산 조성 중, 세린 및 글리신을 포함하지 않는 것인, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 배양액이, 아미노산 조성 중, 아르기닌을 포함하지 않는 것인, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
특정한 상기 아미노산을 포함하지 않는 조건 하에서, 세포 배양을 12시간∼360시간 계속하는, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
아스코르브산 또는 알부민을 첨가한, 심근 세포를 선택적으로 선발하는 방법.