JP4713567B2 - 哺乳類細胞のｉｌ−１８ｂｐの産生のための無血清細胞培地の使用 - Google Patents

Description

本発明は、無血清培養条件下における哺乳動物の培養の分野に関する。特に、哺乳類細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の成長に関する。当該細胞はインターロイキンン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と称される組換えタンパク質を産生する。

本発明は、培養液中の哺乳類細胞の成長及び維持のための無血清培地を使用する方法に関する。

細胞培養液は、多様な生物活性生成物、例えば、ウイルスワクチン、モノクローナル抗体、非抗体免疫調製剤、ポリペプチド調製因子、ホルモン、酵素、腫瘍特異性抗原等の産生のために今日広く使用される。これらの生成物は、正常な、又は形質転換され、そして遺伝子改変された細胞により産生される。

細胞を培養するために、過去において、培地は血清が補充され、生物活性生成物を産生する全ての哺乳類株化細胞の成長及び維持のための汎用性栄養分として利用される。血清は、ホルモン、成長因子、担体タンパク質、接着因子及び核酸因子、栄養分、微量元素等を含有する。培地は、通常、約１０％の動物血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又は子ウシ胎児血清（ＦＣＳ）とも称される血清を含む。

広く使用されているが血清は多くの制限を有する。これは細胞により産生される注目の所望のタンパク質の限られた量を妨げる高レベルの多くのタンパク質を含む。血清に由来するこれらのタンパク質は下流工程、例えば、注目のタンパク質の精製工程間に分離されなければならず、これはプロセスを複雑にし、かつコストを増大する。

長い潜伏期又は潜時を伴うウシの感染性神経変性疾患であるＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）の出現は動物由来の血清の使用に関する規制を生じさせた。

このため、生物活性生成物の産生において細胞成長及び細胞維持を助ける動物源を含まない他の培地の開発が強く望まれている。

一般的に細胞培地は、異なるカテゴリーの多くの成分、例えば、アミノ酸、ビタミン、塩、脂肪酸、及び更なる化合物：
−アミノ酸：例えば、米国特許第6,048, 728号(intow et al.)は、以下のアミノ酸が細胞倍地に使用できることを開示する：アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、及びバリン。
−ビタミン：米国特許第2003/0096414号(Ciccarone et al.) 又は米国特許第5,811,299号(Renner et al.)は、例えば、以下のビタミンが細胞培地に使用できることを開示する：ビオチン、パントテン酸、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、チアミン、プトレシン。
−塩：例えば、米国特許第6,399, 381号(Blum et al.)は、ＣａＣｌ₂、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＮａＣｌ、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ＣｕＳＯ₄、ＺｎＣ１₂を含んで成る培地を開示する。培地において使用できる無機塩を開示する文献の他の例は、米国特許第2003/0153042号(Arnold et al.)であり、ＣａＣｌ₂、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂、ＮａＣｌ、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、ＺｎＣｌ₂を記載する。
−脂肪酸：培地において使用容易される既知の脂肪酸は、アラキドン酸、リノレン酸、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、並びにメチル−β−シクロデキストリンである。例えば、米国特許第5,045, 468号(Darfler)を参照のこと。シクロデキストリンは、それ自体は脂質ではないが、脂質と複合体を形成する能力を有し、これにより細胞培地中に脂質を溶解させるために使用されることに注意するべきである。
−更なる成分、特に無血清細胞培地の枠組みにおいて使用される、は、例えば、グループ;コースグルタミン、Ｎａ−ピルビン酸、インスリン、又はエタノールアミン（例えば、EP 274 445)、又は保護剤、例えば、プルロニック（Pluronic）（登録商標）Ｆ６８である。プルロニック（登録商標）Ｆ６８（ポリキサマー１８８としても知られる）は、エチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）のブロックコポリマーである。

標準的な「基礎培地」もまた当業者に既知である。これらの培地はあらかじめいくつかの上述の培地成分を含む。広く適用されるこれらの培地の例は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロズウェルパークメモリアルインスティチュート培地（ＰＲＭＩ）、又はハム培地である。

生物活性生成物、例えば、治療タンパク質、又はワクチンの開発及び供給のために、大量に産生する必要がある。ポリペプチドの産生に広く使用するのに適当な細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることが判明した。

ＣＨＯ細胞は、雌のチャイニーズハムスターの卵巣の組織診からPuck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) により最初に培養された。これらの起源細胞から、いくつかの亜系統が多様な特性を伴い調製された。これらのＣＨＯ株化細胞の１つであるＣＨＯ−Ｋ１は、プロリン要求性であり、そしてジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子の二倍体である。当該株化細胞由来の他の系統は、ＤＨＦＲ欠乏性ＣＨＯ株化細胞（ＣＨＯ ＤＵＫ Ｂ１１）（ＰＮＡＳ７７，１９８０，４２１６−４２２０）であり、これはあるＤＨＦＲ遺伝子における突然変異の及び他の遺伝子の後の喪失の結果としてのＤＨＦＲ機能の喪失により特徴付けられる。

人への投与が意図されるタンパク質の産生に頻繁に使用される更なる細胞は、ヒト株化細胞、例えば、ヒト線維肉腫株化細胞ＨＴ１０８０又はヒト胎児由来腎臓株化細胞２９３である。

注目の１つの治療タンパク質は、インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）である。ＩＬ−１８ＢＰは、ＩＬ−１８に高い親和性を有する可溶性タンパク質である。これはヒトの尿から最初に単離され、そしてヒト及びマウスｃＤＮＡ、並びにヒト遺伝子がクローン化された(Novick et al., 1999; WO99/09063)。当該タンパク質は、ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と命名された。ＩＬ−１８ＢＰの国際一般名称はタデキニグ（tadekinig）アルファである。

ＩＬ−１８ＢＰは、既知のＩＬ−１８受容体の１つの細胞外ドメインではないが、分泌される、自然循環タンパク質である。これは、分泌タンパク質の新規なファミリーに属し、更にいくつかのポックスウイルスコード化タンパク質(Novick et al., 1999)を含む。尿中並びに組換えＩＬ−１８ＢＰは、高い親和性を伴いＩＬ−１８と特異的に結合し、そしてＩＬ−１８の生物親和性を調節する。

ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子はヒト染色体１１ｑ１３に局在化され、そして膜貫通ドメインをコードするエクソンは、８．３ｋｂのゲノム配列中に発見されなかった。選択的ｍＲＮＡスプライシングにより産生された４つのＩＬ−１８ＢＰのスプライス変異体又はアイソフォームは、今までのところヒト中に発見されていない。これらはＩＬ−１８ＢＰａ、ｂ、ｃ、及びｄと命名され、これらの全ては同じＮ末端を共有し、そしてＣ末端において異なる(Novick et al, 1999)。これらのアイソフォームは、ＩＬ−１８に結合する能力において異なる。４つのうち、ＩＬ−１８ＢＰアイソフォームａ及びｃはＩＬ−１８に中和能を有することが知られている。ヒトＩＬ−１８ＢＰアイソフォームは、マウスＩＬ−１８に結合する。

ＩＬ−１８ＢＰは、いくらかの疾患及び障害、例えば、乾癬、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、肝傷害、敗血症、粥状動脈硬化、虚血性心臓病、アレルギー等において治療タンパク質であることが示唆されており、例えば、WO9909063、WO0107480、WO0162285、WO0185201、WO02060479、WO002096456、WO03080104、WO02092008、WO02101049、WO03013577に開示される。

従って、細胞培養中のＩＬ−１８ＢＰの産生のための有効な製造方法、好ましくは無血清条件下において実施される方法の必要性が存在する。

発明の概要
本発明は、動物血清由来成分を含まず、そして同時に、哺乳類細胞培養の細胞成長及び維持に極めて有効である細胞培地における細胞の培養方法の開発に基づく。細胞中のタンパク質の産生のために細胞の培養が行われる。

本発明に関して、細胞はＩＬ−１８ＢＰを産生し、あるいはＩＬ−１８ＢＰを産生するために改変されている。当該タンパク質は、細胞培地（上清）から単離及び精製され、そしてヒト又は動物に投与される医薬組成物に処方される。

このように、第一の観点において、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰを産生する細胞の培養方法であって、動物血清に由来する成分を含まない細胞培地中で細胞を成長させる工程を含んで成り、ここで当該細胞培地が：
約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る方法に関する。

第二の観点において、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰの産生方法であって、動物血清に由来する成分を含まない細胞培地中でＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞を培養する工程を含んで成り、ここで当該細胞培地が：
約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る方法に関する。

本発明の第三の観点は、注目のタンパク質の産生のための本発明に従う培地の使用に関する。

第四の観点において、本発明は、培養液中の細胞の成長のための本発明の培地の使用に関する。

本発明の第五の観点は、注目のポリペプチドの産生段階中に培養液中の細胞を維持するための本発明に従う培地の使用に関する。

発明の詳細な説明
本発明は、無血清由来成分を含まない細胞培地中のＩＬ−１８ＢＰ発現細胞の成長及び維持のため、及びＩＬ−１８ＢＰの産生のための方法の開発に基づく。

このように、本発明は、ＩＬ−１８ＢＰの産生方法であって、無血清由来成分を含まない細胞培地におけるＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞を培養する工程を含んで成り、ここで当該細胞培地が：
約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約１〜約８ｍｇ／Ｌ、好ましくは約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る方法に関する。

本発明は、更に、ＩＬ−１８ＢＰ発現細胞の培養方法であって、動物血清に由来する成分を含まない細胞培地中でＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞を成長させる工程を含んで成り、ここで当該細胞培地が：
約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約１〜約８ｍｇ／Ｌ、好ましくは約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る方法に関する。

好ましくは、上記方法は、更に注目のタンパク質を含んで成る培地を回収する工程を含んで成る。

更に好ましい態様において、上記方法は、更に注目のタンパク質を単離することを含んで成る。

更に好ましい態様において、上記方法は、更に医薬組成物を得るために単離されたタンパク質を医薬的に許容される担体で処方することを含んで成る。

第三の観点において、本発明は、注目のポリペプチドの産生のために、
約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約１〜約８ｍｇ／Ｌ、好ましくは約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る細胞培地の使用に関する。

第四の観点において、本発明は、培養液中のＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞の成長のために、
約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約１〜約８ｍｇ／Ｌ、好ましくは約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る、細胞培地の使用に関する。

第五の観点において、本発明は、例えば、注目のポリペプチドの産生段階の間における、培養液中のＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞の維持のために、
約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約１〜約８ｍｇ／Ｌ、好ましくは約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る、細胞培地の使用に関する。

本発明の方法及び使用に関して、細胞培地は、
約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約１〜約８ｍｇ／Ｌ、好ましくは約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
を含んで成る。

本発明の枠組みにおいて、アスパラギンは、約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌのいずれかの濃度範囲、例えば、７０５，７１０，７１５，７２０，７２５，７３０，７３５，７４０，７４５，７５０，７５５，７６０，７６５，７７０，７７５，７８０，７８５，７９０，７９５，８００，８０５，８１０，８１５，８２０，８２５，８３０，８３５，８４０，８４５，８５０，８５５，８６０，８６５，８７０，８７５，８８０，８８５，８９０，８９５，９００，９０５，９１０，９１５，９２０，９２５，９３０，９３５，９４０，９４５，９５０，９５５，９６０，９６５，９７０，６７５，９８０，９８５，９９０，９９５ｍｇ／Ｌにおいて使用することができる。

本発明の枠組みにおいて、塩化ナトリウムは、約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲において、例えば、２１００，２２００，２３００，２４００，２５００，２６００，２７００，２８００，２９００，３０００，３１００，３２００，３３００，３４００，３５００，３６００，３７００，３８００，３９００，４０００，４１００，４２００，４３００，４４００，４５００，４６００，４７００，４８００，４９００ｍｇ／Ｌにおいて使用することができる。

本発明の枠組みにおいて、亜セレン酸塩は、約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌの濃度範囲において、例えば、０．００３５，０．００４．０．００４５，０．００５，０．００５５，０．００６，０．００６５，０．００７，０．００７５，０．００８，０．００８５，０．００９，０．００９５，０．０１，０．０１１，０．０１２，０．０１３，０．０１４，０．０１５，０．０１６，０．０１７，０．０１８，０．０１９，０．０２ｍｇ／Ｌにおいて使用することができる。

本発明の枠組みにおいて、小麦加水分解産物は、約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌの濃度範囲において、例えば、３５００，４０００，４５００，５０００，５５００，６０００，６５００，７０００，７５００；８０００，８５００，９０００，９５００，９６００，９７００，９８００，９９００，１００００，１０１００，１０２００，１０３００，１０４００，１０５００，１０６００，１０７００，１０８００，１０９００，１１０００，１１５００，１２０００，１２５００，１３０００，１３５００，１４０００，１４５００，１５０００，１５５００，１６０００，１６５００，１７０００，１８０００，１８５００，１９０００，１９５００ｍｇ／Ｌにおいて使用することができる。

本発明の枠組みにおいて、インスリンは、約１〜約８ｍｇ／Ｌの濃度範囲において、例えば、１．２５，１．５，１．７５，２，２．２５，２．５，２．７５，３，３．２５，３．５，３．７５，４，４．２５，４．５，４．７５，５，５．２５，５．５，５．７５．６，６．２５，６．５，６．７５，７，７．２５，７．５，７．７５，８，８．２５，８．５，８．７５ｍｇ／Ｌにおいて使用することができる。

以下の実施例に示すとおり、示された範囲内のこれらの成分を含んで成る培地の使用する本発明の方法において、長期間にわたる優れた細胞成長及び維持を裏付けた。

本発明の方法の培養工程は、いずれかの適当な環境、例えば、ペトリ皿、Ｔ型フラスコ、又はローラーボトルにおいて行うことができるが、好ましくは大容量を有する容器、例えば、バイオリアクターにおける。Ｔ型フラスコ、及びローラーボトルは、細胞の成長に特に適当であり、そして細胞のタンパク質の産生のためには、好ましくはバイオリアクター中で維持される。

本発明の多様な観点の枠組みにおいて使用される細胞は、好ましくは哺乳類細胞である。これらはヒト又は動物起源のものであってよい。本発明に従う方法において培養することができる哺乳類細胞の例は、例えば、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト骨肉種細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ｒＣＨＯ−ｔＰＡ細胞、ｒＣＨＯ−ＨｅｐＢ表面抗原細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ｒＨＥＫ２９３細胞、ｒＣ１２７−ＨｅｐＢ表面抗原細胞、正常ヒト線維芽細胞細胞、間質細胞、肝細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、及びヒト永久羊膜細胞を含む。本発明に従う方法において培養できるハイブリドーマの例は、ＤＡ４．４細胞、１２３Ａ細胞、１２７Ａ細胞、ＧＡＭＭＡ細胞及び６７−９−Ｂ細胞を含む。

本発明に関して、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を培養するために特に好ましい。

本発明に関して培養される細胞は、懸濁液中で成長することができ、又は足場依存性細胞のために、固定支持に付着される。マイクロキャリア及びＦｉｂｒａ−Ｃｅｌ（登録商標）ディスクは、足場依存性細胞の成長のために哺乳類細胞培養において使用することができ、工業的なタンパク質の産生のために確立された技術基盤におけるものである(例えば、Bohak et al. 1987; Petti et al 1994を参照のこと)。

本発明の方法及び使用の枠組みにおいて、アスパラギンは、アスパラギンＨ₂Ｏ(ＴＬＣ９９％，ＴＬＣは薄層クロマトグラフィーである)として有利に含まれる。

亜セレン酸塩は、例えば、亜セレン酸ナトリウムとして培地中に含んでよい。

小麦加水分解産物は、植物由来成分であって細胞が、ペプチド形態におけるアミノ酸を使用できるという事実に基づく本発明の培地の一部である。ペプチドは、２つのアミノ酸から複数のアミノ酸の大きさの範囲であってよい。タンパク質の加水分解に由来されるペプチドは、いくつかの細胞株／細胞型の優れた成長を助ける追加（未決定）のアミノ酸源を供する。

本発明の培地の枠組みにおいて使用されるインスリンは、当該培地が使用される特定の細胞株又は細胞型の成長及び維持を助ける限り、いずれかの資源及び種に由来してもよい。好ましくはインスリンは組換え型である。更に好ましくは、インスリンは細胞株又は細胞型が由来する種に対応する種に由来するものであり、あるいはヒトインスリンである。

本発明の方法において使用される培地の化合物の好ましい濃度範囲は以下のとおりである：
約８１０〜約８５０ｍｇ／Ｌの濃度範囲、最も好ましくは約８３０ｍｇ／Ｌにおけるアスパラギン；
約３４００〜約３６００ｍｇ／Ｌの濃度範囲、最も好ましくは約３５００ｍｇ／Ｌにおける塩化ナトリウム；
約０．０１〜約０．０１２ｍｇ／Ｌの濃度範囲、最も好ましくは約０．０１１０ｍｇ／Ｌにおける亜セレン酸塩；
約８０００〜約１２０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲、最も好ましくは約１００００ｍｇ／Ｌにおける小麦加水分解産物；及び
約３〜約５ｍｇ／Ｌの濃度範囲、最好ましくは約４ｍｇ／Ｌにおけるインスリン。

好ましい態様において、上記培地は、約５００〜約５５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約１０００ｍｇ／Ｌ、又は約４５００若しくは約５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるグルコースを更に含んで成る。

更に好ましい態様において、上記培地は、１又は複数のアミノ酸を含んで成る。当該アミノ酸は、グルタミン以外の、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、及びバリンから選択される。

他の態様において、グルタミンが培地に添加される。グルタミンは、好ましくは細胞培養中に培地に添加することができる（例えば、成長、維持、産生モード）。

好ましくは、本発明に従う培地は、更にビタミンを含んで成る。本発明の培地において好ましいビタミンは、ビオチン、パントテン酸、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、チアミン、及びプトレシンから選択される。

本発明に従う培地は、好ましくは更に無機塩及び微量元素を含んで成る。イオンは好ましくはＣａ²⁺，Ｋ⁺，ＭＧ²⁺，Ｎａ⁺，Ｃｌ^-，リン酸，Ｃｕ²⁺，Ｚｎ²⁺である。これらの塩及び微量元素は、好ましくは無水ＣａＣｌ₂，ＫＣｌ，無水ＭｇＣｌ₂，ＮａＣｌ，一塩基性リン酸ナトリウム，二塩基性リン酸ナトリウム，ＣｕＣｌ₂．２Ｈ₂Ｏ，及びＺｎＣｌ₂から選択される。

好ましくは、本発明の培地は、更にバッファーを含んで成る。多くのバッファーを本発明の培地の枠組みにおいて使用することができ、例えば、炭酸水素ナトリウムバッファー、トリス、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、グリシンバッファー等である。双性イオンバッファーが本発明の培地のために特に有用である。使用することができる好ましい双性イオンバッファーは、酸形態におけるＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）である。

更に他の好ましい態様において、培地は、更に脂肪酸を含んで成る。このような脂肪酸は、好ましくはアラキドン酸、リノレン酸、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、及びシクロデキストリン（これ自体は脂質ではないが、培地中の脂質の可溶化において役立つ）から選択される。シクロデキストリンは、好ましくはメチル−β−シクロデキストリンである。

更に加水分解産物は、動物源由来でない限り、本発明の枠組みにおいて使用できる。好ましくは本発明の培地は、更に大豆加水分解産物を含んで成ってよい。

本発明の培地は、更にステロイド、例えば、コルチゾン又はヒドロコルチゾン及び／又は更にエネルギー源、例えば、ピルビン酸、例えば、Ｎａピルビン酸、及び／又は保護剤、例えば、プルロニック（登録商標）Ｆ６８を含んで成る。

本発明の方法及び使用の枠組みにおいて、以下の成分：
約７００〜約１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
約２０００〜約５０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
約０．００３〜約０．０２ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
約３０００〜約２００００ｍｇ／Ｌ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
約１〜約８ｍｇ／Ｌ、好ましくは約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
が存在する限り、いずれかの適当な既知の無血清基礎培地を使用することができる。

既知の無血清基礎培地は以下に挙げられる：

本発明の方法及び使用は、好ましくは注目のポリペプチドを産生するために役立つ。

注目のポリペプチドは、例えば、自然分泌タンパク質、正常な細胞質タンパク質、正常な膜貫通タンパク質、又はヒト若しくはヒト化抗体であってよい。注目のタンパク質が、正常な細胞質又は正常な膜貫通タンパク質である場合、当該タンパク質は、好ましくは溶解性とするために遺伝子改変されている。

注目のポリペプチドは、いずれかの起源であってよい。好ましい注目のポリペプチドは、ヒト起源のものであり、そしてより好ましくは注目のタンパク質は治療タンパク質である。

注目のタンパク質は、ホルモン、サイトカイン結合タンパク質、インターフェロン、可溶性受容体、又は抗体であってよい。

本発明の方法に従い産生される治療タンパク質は、例えば、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性ゴナドトロピンホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えば、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ）、インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンガンマ受容体)、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ７５、ＴＡＣＩ−Ｆｃ融合タンパク質、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、抗−ＣＤ１１ａ抗体、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経婦人尿性腺刺激ホルモン、インスリン様成長因子（例えば、サマトメジン−Ｃ）、ケラチノサイト成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン、因子ＶＩＩＩ、ソマトロピン、骨形成タンパク質−２、血小板由来成長因子、ヒルジン、エポエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、及びこれらの変異タンパク質、可溶性形態、官能誘導体、融合タンパク質を含む。

上記ポリペプチドは、特に、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ルトロピン−絨毛性ゴナドトロピンホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンベータ-１ａ、インターフェロンベータ-１ｂ) インターフェロン受容体（例えば、インターフェロンガンマ受容体)、ＴＮＦ受容体ｐ５５及びｐ７５、インターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えば、インターロイキン−１８結合タンパク質）、抗−ＣＤ１１ａ抗体、及びこれらの変異タンパク質、可溶性形態、官能誘導体、融合タンパク質から成る群から選択されてよい。

更に、注目のポリペプチドは、例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経婦人尿性腺刺激ホルモン、インスリン様成長因子（例えば、サマトメジン−Ｃ）、ケラチノサイト成長因子、グリア細胞由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン、因子ＶＩＩＩ、ソマトロピン、骨形成タンパク質−２、血小板由来成長因子、ヒルジン、エポエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼ、及びこれらの変異タンパク質、可溶性形態、官能誘導体、融合タンパク質を含む。

注目のタンパク質は、医薬的に許容される担体とともに処方すべきであり、その結果医薬組成物をもたらす。

「医薬的に許容される」の定義は、活性成分の生物活性に干渉せず、そして投与される宿主に毒性でないいずれかの担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与のために、活性タンパク質は、媒体、例えば、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、及びリンゲル液における注射用の単位用量において処方することができる。

本発明に従い処方される医薬組成物は、それから多様な方法において個々に投与することができる。投与経路は、皮内、経皮（例えば、徐放性製剤）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、脳内、硬膜外、局所的、直腸、及び鼻腔内経路を含む。他のいずれかの投与の治療的に有効な経路、例えば、上皮若しくは内皮組織を介する吸収、又は生体内において活性剤が発現され、そして分泌される、当該活性剤をコードするＤＮＡ分子が患者に投与される遺伝子治療（例えば、ベクターを介して）により、使用することができる。更に、本発明に従うタンパク質は、生物活性剤の他の成分、例えば、医薬的に許容される界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤、及び媒体と一緒に投与することができる。

非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のために、活性タンパク質は、医薬的に許容される非経口用媒体（例えば、水、生理食塩水、デキストロース溶液）及び等張性を維持する添加物（例えば、マンニトール）又は化学安定性を維持する添加物（例えば、防腐剤及びバッファー）とともに、溶液、懸濁液、乳濁液、又は凍結乾燥粉末として処方することができる。当該製剤は、慣習的に使用される技術により無菌化される。

本発明の方法及び使用は、インターロイキン−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の産生を目的とする。

ＩＬ−１８ＢＰは、未変性、即ち天然のＩＬ−１８ＢＰでよい。好ましくは産生されるＩＬ−１８ＢＰはヒト起源のものである。ＩＬ−１８ＢＰは可溶性、分泌タンパク質であるため、その天然シグナルペプチドの手段により、又は異種シグナルペプチド、即ち特定の使用される発現系においてより有効と成りうる他の分泌タンパク質に由来するシグナルペプチド、の手段により細胞培地の上清に放出される。

「ＩＬ−１８結合タンパク質」の語は、本明細書中、「ＩＬ−１８ＢＰ」と同義的に使用される。当該語は、ＩＬ−１８結合タンパク質、例えば、WO 99/09063 又は Novick et al., 1999中に定義されるものに関する。ＩＬ−１８ＢＰの語は、Kim et al., 2000に定義されるものとして、ＩＬ−１８結合タンパク質のスプライス変異体及び／又はアイソフォーム、特にＩＬ−１８ＢＰのヒトアイソフォームａ及びｃを含む。本明細書中に使用される「ＩＬ−１８ＢＰ」の語は、更にWO 99/09063に定義されるとおり、ＩＬ−１８ＢＰの変異タンパク質、官能誘導体、活性フラクション、融合タンパク質、円順列変異誘導化タンパク質、及び塩を含む。

本発明の培地を使用することにより産生されるＩＬ−１８ＢＰは、好ましくはグリコシル化される。

本明細書中に使用される「変異タンパク質」の語は、ＩＬ−１８ＢＰの類似体、又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの類似体を意味し、ここで野生型のＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰと比較して、生じる生成物の活性に考慮すべき変化を伴わずに、自然ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの１又は複数のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換され、又は欠失され、あるいは１又は複数のアミノ酸残基がＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの自然配列に付加されている。これらの変異タンパク質は既知の合成により及び／又は部位特異的変異誘発技術、又はこれらに適当ないずれかの他の既知の技術により調製される。

本発明に関する変異タンパク質は、核酸、例えば、ストリンジェントな条件下において、ＩＬ−１８ＢＰをコードし、あるいはウイルスＩＬ−１８ＢＰ(WO99/09063)をコードするＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされるタンパク質を含む。「ストリンジェントな条件」の語は、当業者が慣習的に「ストリンジェント」として意味する、ハイブリダイゼーション及び続く洗浄条件を意味する。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N. Y., 6.3 and 6.4 (1987, 1992) を参照のこと。制限することなく、ストリンジェント条件の例は、実験下におけるハイブリッドの算出されたＴｍの１２〜２０℃以下において、例えば、２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで５分、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで１５分；０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで３７℃で３０〜６０分、それから０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで６８℃で３０〜６０分の洗浄条件を含む。当業者は、ストリンジェント条件もまた、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドプローブの長さ（例えば、１０〜４０塩基）、又は混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解する。混合プローブが使用される場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウムを使用することが好ましい。上記 Ausubel を参照のこと。

同一性は、二つ以上のポリペプチド配列、又は二つ以上のポリヌクレオチド配列、の間にある、配列を比較して決定される関係を反映する。一般に、同一性とは、比較される配列の全長にわたる、二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の、それぞれ、ヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の厳密な対応を指す。

厳密な対応が存在しない配列の場合、「％同一性」を決定することができる。一般に、比較される二つの配列を整列させて配列の間に最大の相関が得られるようにする。いずれか一方又は両方の配列に「ギャップ」を挿入してアライメントの度合いを強めることも含まれる。％同一性は、比較される配列の各々の全長にわたって決定される場合（いわゆるグローバルアライメント）もあり、これは同じ又は非常に近い長さの配列で特に適当であり、又はもっと短い、定められた長さにわたって決定される場合（いわゆる、ローカルアライメント）もあり、これは長さが等しくない配列に適当である。

二つ以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法は当業者には周知である。例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux et al., 1984) にあるプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ及びＧＡＰなどのプログラム、を用いて、二つのポリヌクレオチドの間の％同一性、及び二つのポリペプチド配列の間の％同一性と％相同性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith と Waterman (Smith and Waterman, 1981)の「局所的相同性」アルゴリズムを用いて、二つの配列の間の最良の単一の類似領域を見つける。配列の間の同一性及び／又は類似性を決定する他のプログラムも当業者には公知である、例えば、ＢＬＡＳＴ系列のプログラム（Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997はwww.ncbi.nim.nih.govでＮＣＢＩのホームページからアクセスできる）及びＦＡＳＴＡ (Pearson, 1990; Pearson and Lipman, 1988)。

このようないずれかの変異タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰに類似する活性を実質的に有するように、ＩＬ−１８ＢＰに十分重複する、又はウイルスＩＬ−１８ＢＰに十分重複するアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１８ＢＰの１つの活性は、ＩＬ−１８に結合する能力である。当該変異タンパク質が実質的にＩＬ−１８に対する結合活性を有する限り、ＩＬ−１８ＢＰに類似する活性を有することを考慮することができる。従って、いずれかの与えられた変異タンパク質がＩＬ−１８ＢＰと実質的に同じ活性を有するか否かは、このような変異タンパク質を、例えば、それが適当に標識されたＩＬ−１８に結合するか否かを決定する簡単なサンドイッチ比較アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ又はＥＬＩＳＡアッセイにかけることを含んで成る慣習的な実験手段により測定することができる。

好ましい態様において、WO99/09063に定義されるとおり、いずれかのこのような変異タンパク質は、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスコード化ＩＬ−１８ＢＰ類似体のいずれかの配列と少なくとも４０％同一性又は相同性を有する。より好ましくは、これは少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は最も好ましくは、少なくとも９０％又は９５％同一性又は相同性を有する。

本発明による変異タンパク質の好ましい変化は「同類」置換として知られるものである。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチド若しくはタンパク質又はウイルスＩＬ−１８ＢＰの同類アミノ酸置換としては、十分に類似した物理化学的性質を有するグループで、グループのメンバーの間の置換によって分子の生物的機能が保存される同義的アミノ酸置換が含まれる（Grantham, 1974）。上で定義された配列において、その機能を変化させることなくアミノ酸の挿入及び欠失が可能であり、特に挿入や欠失が少数のアミノ酸、例えば３０未満の、好ましくは１０未満のアミノ酸しか含まず、機能的なコンフォメーションに重要なアミノ酸、例えばシステイン残基、を除去又は移動していない場合には可能であることは明らかである。このような欠失及び／又は挿入によって生ずるタンパク質及び変異タンパク質は本発明の範囲内にある。

「融合タンパク質」の語は、ＩＬ−１８ＢＰ若しくはウイルスＩＬ−１８ＢＰ、又はこれらの変異タンパク質若しくは断片を含んで成るポリペプチドを意味し、他のタンパク質と融合し、例えば、体液中で延長した滞留時間を有する。このように、ＩＬ−１８ＢＰ又はウイルスＩＬ−１８ＢＰは、他のタンパク質、ポリペプチド等、例えば、免疫グロブリン、又はその断片と融合してよい。

ＩＬ−１８ＢＰ、又はウイルスＩＬ−１８ＢＰ、変異タンパク質及び融合タンパク質の「活性画分」として、本発明は、当該タンパク質分子のみのポリペプチド鎖、あるいはこれに結合する関連分子又は残基、例えば、糖若しくはリン酸残基、又はタンパク質分子若しくは糖残渣自体の凝集体、を一緒に伴ういずれかの断片又は前駆体を網羅し、供された上記画分は実質的にＩＬ−１８ＢＰに類似する活性を有する。

ＩＬ−１８ＢＰの配列及びそのスプライス変異体／アイソフォームは、W099/09063 から又は Novick et al., 1999から、並びにKim et al., 2000から得ることができる。

本発明のＩＬ−１８ＢＰが医薬組成物として使用する場合、このような医薬組成物はいくつかの疾患又は障害の治療及び／又は予防のために使用することができる。このような疾患又は障害は、好ましくはＩＬ−１８介在性障害である。特に、精製ＩＬ−１８ＢＰは、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、関節リウマチ、肝傷害、例えば、アルコール性肝硬変、敗血症、粥状動脈硬化、虚血性心臓病、アレルギー等、特に、遅延型過敏、及び閉鎖性頭部外傷であり、そしてWO9909063、WO0107480、WO0162285、WO0185201、WO02060479、WO02096456、WO03080104、WO02092008、WO02101049、WO03013577に開示される。

このたび、本発明は十分に説明されたことから、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、そして過度の実験をすることなく、等価なパラメータ、濃度及び条件の広い範囲において同様のことが実施できることが当業者に理解されるであろう。

本発明は具体的な態様とともに記載されるが、更なる変更が可能であることが理解される。本願は、一般的に本発明の原理に従う発明のいずれかの変更、使用、又は適応を網羅することが意図され、そして本発明が属する当業界に既知又は慣習的に実施されるような、そして本明細書、及び付随する特許請求の範囲の範囲に説明された本質的特長に適用できるような開示からの逸脱を含む。

本発明に引用される全ての参考文献、例えば、学術論文、又は要約公開された若しくは公開されていない米国若しくは外国特許出願、発行された米国若しくは外国特許、又はいずれかの他の参考文献は、本明細書中に、引用文献中に示される全てのデータ、表、図、及び文章を含みその全体が組み入れられている。従って、本明細書に引用される参考文献中に引用される参考文献の全ての内容もまた参考文献により組み入れられている。

公知の方法の工程、従来の方法の工程、公知の方法、又は従来の方法、への言及はいかなる意味でも、本発明の様態、記述、又は実施形態が関連技術において開示、教示、又は示唆されたということを認めるものではない。

特定の実施形態についてのこれまでの記述は本発明の一般的な特徴を十分に明らかにしているので、当業者の知識を（ここで引用した参照文献の内容も含めて）応用することによって、他の人たちも過大な実験をすることなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、これらの特定の実施形態を多様な用途のために容易に変更及び／又は適合させることができる。したがって、このような適合や変更は、本明細書で述べた教示と指針に基づいて、開示された実施形態の等価物という意味と範囲に含まれるものとする。本明細書における言い方や用語は説明のためのものであり、制限することを目的とせず、本明細書における用語や表現は、当業者の知識と組み合わせてここで述べた教示と指針に照らして解釈されるものとする。

実施例１：無血清培地中のＩＬ−１８ＢＰ発現ＣＨＯ細胞の成長
１．１ 「ＳＭ−００５」と命名された無血清培地（ＳＦＭ）の調製
下記の１．２の実験に使用した細胞培地は、以下の濃度において以下の成分を含むように適応させた培地である：
−８３０ｍｇ／Ｌの濃度におけるアスパラギン；
−３５００ｍｇ／Ｌの濃度における塩化ナトリウム；
−０．０１１０ｍｇ／Ｌの濃度における亜セレン酸塩；
−１００００ｍｇ／Ｌの濃度における小麦加水分解産物；及び
−４ｍｇ／Ｌの濃度におけるインスリン。

また、当該培地は４．５ｇ／ｌのグルコースを含んだ。当該培地が産生モードに使用される場合、グルコース濃度を１ｇ／ｌに減少させてもよい。当該培地は更にグルタミン以外の全てのアミノ酸を含んだ。また、ビタミン、塩、脂肪酸、バッファーとしてのＨＥＰＥＳ、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、ヒドロコルチゾン、ピルビン酸ナトリウム、及び大豆加水分解産物も当該培地中に存在した。以下、当該培地はＳＭ−００５とする。

１．２ 懸濁液中の細胞の成長
Ｔ型フラスコ又はローラーボトルを、寄託されていたＩＬ−１８ＢＰ発現及び分泌ＣＨＯクローン由来の細胞とともにインキュベートした。これらの細胞は懸濁液中で成長させ、そしてまず増殖させた。細胞増殖工程中、細胞は懸濁液中で培養され、そして一定日において規定量の新鮮なＳＭ−００５培地で系統的に希釈した。監視目的のために、細胞密度、グルコース及び乳酸濃度を各希釈工程（図を参照のこと）において測定した。

０日目、寄託されていたMaster Cell Bank由来のバイアルを解凍した。当該バイアルの細胞をそれから総量３０ｍＬの新鮮なＳＭ−００５培地中で、７５ｃｍ²組織培養フラスコ（ＴＣＦ７５ｃｍ²）においてインキュベートした。ＴＣＦにおいて生じる細胞濃度は、約２０万細胞／ｍＬに達した。最後に、ＴＣＦを３７℃の温度で撹拌しながらインキュベートした。

４日目、培養液をＴＣＦ１７５ｃｍ²に移し、そして新鮮な予熱した培地ＳＭ−００５を添加することにより１２０ｍＬに希釈した。

８日目、培養液をＲＢ８５０ｃｍ²に移し、そして新鮮な予熱した培地ＳＭ−００５を添加することにより４００ｍＬに希釈した。

１２日目、培養液を新鮮な予熱した培地ＳＭ−００５を添加することにより１２００ｍＬ（１／３の希釈率）に希釈し、それから３つのローラーボトルＲＢ８５０ｃｍ²（各４００ｍＬを含む）に分けた。

１６日目、培養液を新鮮な予熱した培地ＳＭ−００５を添加することにより４８００ｍＬ（１／４の希釈率）に希釈し、それから６つのローラーボトルＲＢ１７５０ｃｍ²（各８００ｍＬを含む）に分けた。

２０日目から（Ｄ２０、Ｄ２３、Ｄ２６、・・・Ｄ６２まで）、１／４の希釈率において、３日ごとの反復的な手段により希釈した。各希釈日において、必要とされる数のＲＢ１７５０ｃｍ²を産生した（少なくとも４つのＲＢ１７５０ｃｍ²）。このように、新鮮な予熱した培地を添加することにより各ＲＢ１７５０ｃｍ²を８００ｍｌから３２００ｍＬに希釈し、それから４つのＲＢ１７５０ｃｍ²（各８００ｍＬを含む）に分けた。

バイオリアクターに接種するために、希釈日（Ｄ２０〜Ｄ６０）において、必要数のローラーボトルを回収し、無菌ガラスボトル中に貯蔵し、そしてバイオリアクター中に移した。

表１：接種調製方法の模式的な記載。２０日目から、細胞は１／４の固定希釈率で希釈した。

図１〜４は、接種調製工程の間に測定されたデータを示す（ｎ＝１０）。図１は生細胞密度を示し、図２は累積生細胞を示し、図３は倍増時間を示し、そして図４は上清中のグルコース及び乳酸濃度を示す。

２０日の適応段階後、細胞の成長は無血清培地中で極めて一貫しており、再現性を有している。安定な成長条件は、連続した期間（図１、２、３、４において示されるとおり、試験される６２日目まで）にわたり、１：４の割合での連続希釈により細胞を容易に継代培養することを可能にする。

ＩＬ−１８ＢＰ発現ＣＨＯ細胞は、６０日間（ｎ＝１０）の新鮮な培地の連続希釈により、本発明に従う無血清培地における懸濁液中で培養した。図１は生細胞密度を示す。 接種された生細胞を示す。 倍増時間を示す。 上清中のグルコース及び乳酸濃度を示す。

Claims (22)

1. ＩＬ−１８ＢＰを産生する細胞の培養方法であって、動物血清に由来する成分を含まない細胞培地中で細胞を成長させる工程を含んで成り、ここで当該細胞培地が：
   約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
   約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
   約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
   約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
   約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
   を含んで成る方法。
2. ＩＬ−１８ＢＰの産生方法であって、動物血清に由来する成分を含まない細胞培地中でＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞を培養する工程を含んで成り、ここで当該細胞培地が：
   約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
   約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
   約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
   約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
   約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
   を含んで成る方法。
3. ＩＬ−１８ＢＰを含んで成る培地を回収する工程を更に含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。
4. ＩＬ−１８ＢＰを単離することを更に含んで成る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 医薬組成物を得るために、前記単離されたＩＬ−１８ＢＰを医薬的に許容される担体とともに処方することを更に含んで成る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記培地が、約５００〜約５５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるグルコースを更に含んで成る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記培地が、グルタミン以外であって、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、及びバリンから選択されるアミノ酸を更に含んで成る、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記培地が、グルタミンを更に含んで成る、請求項８に記載の方法。
10. 前記培地が、ビオチン、パントテン酸、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、チアミン、及びプトレシンから選択されるビタミンを更に含んで成る、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記培地が、ＣａＣｌ₂、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂、リン酸ナトリウム、ＣｕＣｌ₂、及びＺｎＣｌ₂から選択される塩を更に含んで成る、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記培地が、バッファーを更に含んで成る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. アラキドン酸、リノレン酸、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸から選択される脂肪酸を更に含んで成る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記培地が、シクロデキストリンを更に含んで成る、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記培地が、大豆加水分解産物を更に含んで成る、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記培地が、ヒドロコルチゾンを更に含んで成る、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記培地が保護剤を更に含んで成る、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記保護剤がプルロニック（登録商標）Ｆ６８である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記培地が、ピルビン酸を更に含んで成る、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 培養液中のＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞の成長のために、
    約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
    約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
    約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
    約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
    約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
    を含んで成る、細胞培地の使用。
21. ＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞におけるＩＬ−１８ＢＰの産生のために、
    約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
    約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
    約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
    約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
    約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
    を含んで成る、細胞培地の使用。
22. 培養液中のＩＬ−１８ＢＰを発現する細胞の維持のために、
    約８００〜約９００ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるアスパラギン；
    約３０００〜約４５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における塩化ナトリウム；
    約０．００５〜約０．０１５ｍｇ／Ｌの濃度範囲における亜セレン酸塩；
    約５０００〜約１５０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲における小麦加水分解産物；及び
    約２．５〜約６ｍｇ／Ｌの濃度範囲におけるインスリン、
    を含んで成る、細胞培地の使用。

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