JP5059757B2 - 組み換えゴナドトロピンの製造のための無血清培地 - Google Patents
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Description
本発明は、組み換えタンパク質の製造の分野にある。より詳しく述べると、それは、組み換え二量体ゴナドトロピンの製造のための抗酸化剤を含む無血清培地の使用に関する。前記抗酸化剤は、L-グルタチオン、2-メルカプトエタノール、L-メチオニン、並びにアスコルビン酸と(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物から成る群から選択されるかもしれない。
本発明は、組み換え卵胞刺激ホルモン(FSH)の製造に関する。FSHは、ゴナドトロピン類に属する。
本発明は、rFSHの製造中に、酸化型rFSHが、細胞培養上清中に既に出現しているという予想外の発見に基づいている。そのうえ、無血清培地中でのrFSHの製造は、血清添加培地中でのrFSH製造に比べてより高レベルの酸化型をもたらす。本発明の枠組みの中において、驚いたことに、酸化型rFSHのレベルが、保存中だけでなく、培養ステップ中にも低減されることがわかった。この低減は、生産性を損なうことなく達成される。低減は、培地への抗酸化剤の添加を通して行われる。具体的には、rFSHを発現する細胞の培養中、(i)2-メルカプトエタノール、(ii)アスコルビン酸と(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、(iii)L-メチオニン、又は(iv)L-グルタチオンのいずれかを無血清培地に補うことで、酸化型rFSHのレベルが低減することがわかった。
− 約1〜約20mg/Lの濃度のL-グルタチオン;
− 約5〜約15mg/Lの濃度の2-メルカプトエタノール;
− 約200〜約500mg/Lの濃度のL-メチオニン;及び
− 約10〜約50mg/Lの濃度のアスコルビン酸と約5〜約25mg/Lの濃度の(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、
から成る群から選択される抗酸化剤を含むことを特徴とする前記使用に関する。
− 約1〜約20mg/Lの濃度のL-グルタチオン;
− 約5〜約15mg/Lの濃度の2-メルカプトエタノール;
− 約200〜約500mg/Lの濃度のL-メチオニン;及び
− 約10〜約50mg/Lの濃度のアスコルビン酸と約5〜約25mg/Lの濃度の(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、
から成る群から選択される抗酸化剤を含むことを特徴とするものに関する。
本発明は、抗酸化剤を含む無血清培地中でのrFSHを発現する細胞の培養により、酸化型rFSHのレベルが、顕著に低減されるかもしれないという発見に端を発する。実施例3に示されているように、(i)2-メルカプトエタノール、(ii)アスコルビン酸と(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、(iii)L-メチオニン、又は(iv)L-グルタチオンのいずれかが、培養過程中の酸化型rFSHのレベルを低減するために特に有利である。重要なことに、この低減は、細胞の生存率及び代謝を損なうことなしに、且つ、rFSHの力価を損なうことなしに達成される。
− 約1〜約20mg/Lの濃度のL-グルタチオン;
− 約5〜約15mg/Lの濃度の2-メルカプトエタノール;
− 約200〜約500mg/Lの濃度のL-メチオニン;及び
− 約10〜約50mg/Lの濃度のアスコルビン酸と約5〜約25mg/Lの濃度の(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、
から成る群から選択される抗酸化剤を含むことを特徴とする前記使用に向けられる。
本明細書中に使用される場合に、用語「酸化型」は、酸化剤が1つ以上のアミノ酸残基の酸化を引き起こしたポリペプチドを指す。そのような形態は、例えば、FSHに関する実施例2.1に記載されているHPLC、によって検出され得る。
培養は、例えば、ペトリ皿、T型フラスコ、又はローラーボトルなどのあらゆる好適な環境において、しかし、好ましくは、より大きい容量をもつ容器、例えば、バイオリアクターにおいて行われてよい。
− 前述の無血清培地中への前述の細胞の植菌;
− 増殖段階;そして、
− 製造段階、
が含まれる。
好ましくは、製造工程には、組み換え二量体ゴナドトロピンが含まれる培地を回収するステップが含まれる。
更に好ましい態様において、製造工程には、医薬として許容される担体と共に組み換え二量体ゴナドトロピンを処方して、医薬組成物を得るステップが更に含まれる。
− 抗酸化剤を含む無血清培地中で上述の組み換え二量体ゴナドトロピンを発現する細胞を培養し;
− 上述の組み換え二量体ゴナドトロピンを含む培地を回収し;そして、
− 抗酸化剤の存在下、上述の組み換え二量体ゴナドトロピンを精製する、
が含まれてよい。
− 約1〜約20mg/Lの濃度のL-グルタチオン;
− 約5〜約15mg/Lの濃度の2-メルカプトエタノール;
− 約200〜約500mg/Lの濃度のL-メチオニン;そして、
− 約10〜約50mg/Lの濃度のアスコルビン酸と約5〜約25mg/Lの濃度の(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、
から成る群から選択される抗酸化剤を含むことを特徴とするものに向けられる。
ここで本願発明について十分に説明したので、同じものが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、且つ、必要以上の実験なしに、幅広い等価のパラメーター、濃度、及び条件の中で実施される得ることが、当業者によって理解される。
1.1. 細胞株と培地
全ての実験を、ヒトFSHの両方のサブユニットを発現するCHO細胞株を用いて実施した。産生されたタンパク質は、またrFSHとも呼ばれる二量体ゴナドトロピンである。αサブユニットはSwissProt受入番号P01215に該当し、そして、βサブユニットはSwissProt受入番号P01225に該当する。
細胞培養に使用した培地は、CHO細胞の培養のために設計された基礎無血清培地(SFM)であった。SFM培地に、実施例3で詳しく述べるように試験される抗酸化剤を補った。基礎SFMで試験される抗酸化剤の初期濃度を、表Iに示す。
培養工程は、「実験(run)」とも呼ばれ、植菌ステップ、増殖段階、及び製造段階が含まれる。実験1、2、3、4、及び5と呼ばれる5種類の異なる実験を実施した。
少なくとも2.4・109の生存rFSH産生細胞を、マイクロキャリアを含む11Lの作業容量をもつ15Lのバイオリアクター(newMBR、Zurich)に移した。播種の直後に、2日間又は3日間続くバッチ段階をおこなった。次に、バイオリアクターに、1/日の希釈率まで、且つ、11L/日の潅流速度まで、SFMを連続的に与えた。
増殖段階と製造段階を、同じpH及び温度(37℃、pH=7)にて実施した。実験の間中、溶存酸素(DO)を50%の空気飽和率にて維持した。
2.1. 酸化型rFSHの測定
酸化型を、Bassett及びDriebergen(Bassett及びDriebergen、2005年)によって説明されるように未精製の採取物においてRP-HPLCによって測定した。
酸化型の割合(%)を、基準として実験2において280mg/LのL-システインを用いて得られた酸化型の割合(%)を使用して標準化した(すなわち、酸化型の割合(%)を23.4%で割った)。
総生存細胞密度は、マイクロキャリア上に付着した細胞の密度と、懸濁液の状態の生存細胞の密度の合計と規定される。マイクロキャリア上に付着した細胞の密度を、クリスタルバイオレット核計数法(Fluka 61135)を使用して測定した。懸濁液の生存細胞の密度は、トリパンブル排除法(Sigma T-8154)を使用して測定した。
総生存細胞比(TVC比)を、以下のとおり計算した:[総生存細胞密度、試験終了]/[総生存細胞密度、試験開始]、ここで、試験開始は、新しい抗酸化剤を培養物中に導入した日と規定され、そして、試験終了は、次の抗酸化剤を培養物中に導入する前の日と規定される。
rFSH力価を、Wallac-ADL製のDelphia hFSHキット(カタログ番号A017-201)を使用して免疫蛍光定量的アッセイによって計測した。
2.4. グルコース消費速度(GCR)の測定
1リットルあたり、及び1日あたりのグラム単位で表されるグルコース消費速度(GCR)を、以下のとおり計算した:GCR=(G0−Gt)Dt+(Gt-1−Gt)、ここで、Gが「グルコース濃度」を表し、そして、Dが「希釈率」を表す。指数は、以下の:
− 0:SFMを与えた状態のもの;
− t:時間tに計測されたもの;及び
− t−1:時間t−1に計測されたもの、
を指す。
無血清工程で得られる酸化型のレベルを低減するために、2通りの15L実験(実験1及び2)を実施し、様々な抗酸化剤の効果を試験した。いずれの抗酸化剤も添加しない実験を、対照として実施した(実験3)。
SFMに、表IIに示した終濃度に達するように数種類の抗酸化剤、又は抗酸化剤の組み合わせ物を補った。各抗酸化剤、又は抗酸化剤の組み合わせ物を、約10日間の間、試験した。試験の初日に、設定値に達するのに必要な容量の抗酸化剤溶液を加えた。それから毎日、1回の添加による潅流及び置き換えによって、特定の量の抗酸化剤をバイオリアクターから洗い流した(1d-1の希釈率に関して、バイオリアクター容量の63.2%が24時間ごとに入れ替えられるので、これが毎日置き換えられる抗酸化剤の量を表す)。試験期間の終了時に、抗酸化剤を、潅流によってバイオリアクターから洗い流し、そして、試験される他の抗酸化剤によって置き換えた。
総生存細胞密度、GCR、及びrFSH力価を毎日計測した。表IIは、総生存細胞比(TVC比)を示す。1.0より高いか又は等しいTVC比は、試験した抗酸化剤が細胞に対して中毒作用を持っていないことを示す。
1.0より低いTVC比の総生存細胞は、2-メルカプトエタノールの場合においてのみ得られた。それ故に、2-メルカプトエタノールを除いて、実験1及び2で試験した全ての抗酸化剤が無毒である。加えて、GCRとrFSH力価の測定は、様々な抗酸化剤のいずれもが代謝及び生産性パターンに対して大きな影響を及ぼさないことを示した(データ未掲載)。
Claims (6)
- 組み換え二量体ゴナドトロピンの製造中において、酸化型の組み換え二量体ゴナドトロピンのレベルを低減するための無血清培地の使用であって、ここで上記培地には、以下の:
− 1〜20mg/Lの濃度のL-グルタチオン;
− 5〜15mg/Lの濃度の2-メルカプトエタノール;
− 200〜400mg/Lの濃度のL-メチオニン;及び
− 10〜50mg/Lの濃度のアスコルビン酸と5〜25mg/Lの濃度の(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、
から成る群から選択される抗酸化剤が含まれる、上記使用。 - 前記抗酸化剤が、以下の:
− 3mg/Lの濃度のL-グルタチオン;
− 10mg/Lの濃度の2-メルカプトエタノール;
− 250mg/Lの濃度のL-メチオニン;及び
− 30mg/Lの濃度のアスコルビン酸と14mg/Lの濃度の(+)-α-トコフェロールの組み合わせ物、
から成る群から選択される、請求項1に記載の使用。 - 前記培地が、化学的に規定されている培地である、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記培地が、SFM 90、SFM 90.1、SupMed300、DMEM、DMEM/F12、SFM CHO 3a、CHP PFM、ProCHO 5、EX-CELL、CHO-CD3、CHO III PFM、CHO-S-SFM II、CHO-DHFR、SFM4CHO、Ultra CHO、HyQ PF CHO、HyQ SFX CHO、HyQ CDM4CHO、IS CHO-CD、IS CHO-V、及びその誘導体から成る群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記の二量体ゴナドトロピンが、卵胞刺激ホルモン(FSH)である、請求項4に記載の使用。
- 前記の組み換え二量体ゴナドトロピンが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞により産生される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
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