BRPI0612781A2

BRPI0612781A2 - meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotropinas recombinantes

Info

Publication number: BRPI0612781A2
Application number: BRPI0612781-9A
Authority: BR
Inventors: Fonta Jean-Pierre; Ducommun Paul; Deparis Véronique
Original assignee: Ares Trading S.A.
Priority date: 2005-07-05
Filing date: 2006-07-04
Publication date: 2010-11-30
Also published as: AU2006264917A1; CN101258236A; NO341475B1; US8093052B2; ES2388875T3; CA2613867A1; CY1112992T1; BRPI0612781B1; US20090124006A1; JP5059757B2; MY149621A; KR20080036599A; PT1899454E; KR101346499B1; JP2008544758A; DK1899454T3; RS52468B; TWI369401B; IL188558A0; EA200800253A1

Abstract

MEIO DE CULTURA LIVRE DE SORO PARA A PRODUçãO DE GONADOTROPINAS RECOMBINANTES. A presente invenção refere-se à fabricação de proteínas recombinantes. Mais especificamente, ela se refere ao uso de um meio de cultura livre de soro compreendendo um antioxidante para a produção de gonadotropinas diméricas recombinantes. O antioxidante pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em L-glutationa, 2-mercaptoetanol, L-metionina, e uma combinação de ácido ascórbico e de (+)-alfa-tocoferol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEIO DECULTURA LIVRE DE SORO PARA A PRODUÇÃO DE GONADOTROPINAS RECOMBINANTES".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à fabricação de proteínas recom-binantes. Mais especificamente, refere-se ao uso de um meio de cultura livrede soro compreendendo um antioxidante para a produção de gonadotropi-nas diméricas recombinantes. O antioxidante pode ser selecionado a partirdo grupo consistindo em L-glutationa, 2-mercaptoetanol, L-metionina, e umacombinação de ácido ascórbico e de (+)-alfa-tocoferol.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à produção de Hormônio de Es-timulação de Folículo (FSH) recombinante. O FSH pertence a classe de go-nadotropinas.

O FSH é usado-no-tratamerito-de-infertttidade e enfermidadesreprodutivas em ambos os pacientes macho e fêmea. O FSH é usado empacientes fêmeas na indução de ovulação (OI) e na hiperestimulação ovari-ana controlada (COH), por exemplo, para tecnologias reprodutivas assistidas(ART). Em um regime de tratamento típico para indução de ovulação, umpaciente é administrado diariamente com injeções de FSH ou um derivadodeste (cerca de 75 a 300 IU RFSH/dia) por um período de cerca de 6 a cercade 12 dias. Em um regime de tratamento típico para hiperestimulação ovari-ana controlada, um paciente é administrado diariamente com injeções deFSH ou um derivado deste (cerca de 150-600 IU RFSH/dia) por um períodode cerca de 6 a cerca de 12 dias. O FSH é também usado para induzir es-permatogênese em homens que sofrem de oligoespermia. Um regime usan-do 150 IU FSH 3 vezes por semana em combinação com 2'500 IU hCG duasvezes por semana tem sido bem-sucedido em alcançar um aperfeiçoamentona contagem de esperma em homens que sofrem de hipogonadismo hipo-gonadotrófico. Devido à importância do FSH no tratamento de enfermidadesde fertilidade, a provisão de FSH de alta estabilidade e de alta atividade es-pecífica é desejável.Na natureza, o FSH é produzido pela glândula pituitária. Parauso farmacêutico, o FSH pode ser produzido recombinantemente (rFSH), oupode ser isolado a partir da urina de fêmeas pós-menopausal (uFSH). Oprocesso de fabricação de rFSH necessita de duas etapas principais: cultivode FSH que expressa célula geneticamente projetada, e purificação da pro-teína. A proteína é, em seguida, formulada com um veículo farmaceutica-mente aceitável de modo a obter uma composição farmacêutica.

Para culturas de célula, no passado o meio de cultura usado pa-ra ser suplementado com soro, que servia como um nutriente universal parao crescimento e manutenção de todas as linhas de célula de mamífero. Con-tudo, o advento de BSE (Encefalopatia Espongiforme Bovina), uma doençaneurodegenerativa transmissível de gado com uma latência ou período deincubação longos, tem elevados interesses regulatórios sobre usar soro de-rivado de animal na produção de produtos biologicamente ativos. Portanto, éatualmente preferido produzir proteínas recombinantes usando-se meio livrede soro. Tais meios são bem conhecidos na técnica, e comercializados porvárias companhias, tais como, por exemplo, Sigma, BioWhittaker, GibcoBRL, Cambrex and JRH.

Um dos problemas encontrados quando se armazena rFSH é apresença de formas oxidadas de FSH. Para solucionar parcialmente esteproblema, um antioxidante pode ser adicionado à composição farmacêuticade modo a estabilizar a proteína de FSH durante armazenagem antes daadministração ao paciente em necessidade de tratamento. Por exemplo, EP0 853 945 (Skrabanja and Van den Oetelaar1 1998) descreve formulaçõescontendo gonadotropina líquida em mistura com um estabilizador, tal como,por exemplo, citrato de sódio em 25-100 mM e L-metionina em 1-10 mM. Émostrado que tais formulações permitem armazenamento de formulações deFSH por tempos mais longos, o WO 92/15614 (Takruri H., 1992) também serefere a um método para inibição de oxidação de um polipeptídeo em umacomposição farmacêutica líquida ou semilíquida, tal como, por exemplo, ummeio de armazenamento ou uma solução oftálmica aquosa. Especificamen-te, o WO 92/15614 mostra que uma solução oftálmica ou ungüento oftálmicocompreendendo L-metionina a uma concentração de 10 mg/L estabiliza oFator de Crescimento Epidermal Humano. Contudo, os documentos acimaapenas descrevem o uso de um antioxidante em uma formulação farmacêu-tica, e não em um meio de cultura.

Aminoácidos e compostos exibindo atividade antioxidante po-dem também serem adicionados ao meio de cultura, ou como nutrientes, oupara proteção de linhas de célula para morte celular. Por exemplo, a patente_ ILS-No. 4.560.655 revela um meio livre de soro compreendendo aproxima-damente 30 mg/L de L-metionina, referido meio sendo usado para cultivo decélulas de testículo suíno, células de mieloma AG14, e células de baço mu-rina. o WO 95/12664 ensina um método pelo qual a desvantagem devido aquantidades insuficientes de vários fatores de limitação de crescimento, umdeles sendo o aminoácido L-metionina, pode ser superada para uma linhade célula particular. Especificamente, o WO 95/12664 ensina um métodopara adaptar a linha de célula CHO E5F3G, que expressa M-CSF humano, adesenvolver em densidade de célula aumentada. Neste método, as célulasCHO E5F3G são desenvolvidas em um meio compreendendo 104 mg/L deL-metionina (vide o Exemplo e Tabela 2). Yun et al. ensinam que a adição deuma combinação de glutationa e de quelatores de ferro no meio de culturareduz a morte celular de células de CHO (Yun et al., 2003). Saito et al. ensi-nam adicionalmente que vários antioxidantes podem ser usados no meio decultura para proteger uma linha de célula de morte celular (Saito et al.,2003). Contudo, o WO 95/12664, a patente U.S. No. 4.560.655, Yun et al. eSaito et al. são omissos no efeito potencial (se houver) em aminoácidos, glu-tationa e quelatores de ferro no estado de oxidação da proteína recombinan-te produzida pela linha de célula. Em conclusão, estes documentos somentedescrevem o uso de L-metionina ou de glutationa combinada a quelatores deferro para aperfeiçoamento do crescimento, e/ou a viabilidade das célulascultivadas.

WO 99/50390 se refere a um meio de cultura para produção deinterferon-α de leucócitos, referido meio de cultura compreendendo metioni-na. É demonstrado por HPLC que a qualidade da proteína interferon-α apóspurificação é aperfeiçoada após adição de metionina no meio de cultura. Osinventores do WO 99/50390 hipotetizaram que este aperfeiçoamento podeser devido à oxidação aumentada da proteína interferon-α. O WO 99/50390indica adicionalmente que uma quantidade muito baixa de metionina resultaem um efeito diminuído, e que uma quantidade muito alta causa rendimentosde interferon inferiores. Especificamente, o WO 99/50390 ensina que umafaixa de cerca de 50 a 100 mg/L é uma faixa especialmente preferida quan-do se produz interferon-α de leucócitos. Em adição, o WO 99/50390 somen-te contempla um meio para produção de interferon-α, que é uma proteínamonomérica. o WO 99/50390 nem menciona nem sugere um meio para pro-dução de hormônios diméricos, tais como, por exemplo, FSH, que é somentesecretado após dimerização (Matzuk et al., 1988).

Em suma, nenhum dos documentos acima mencionados se re-fere ao uso de um antioxidante em um meio de cultura livre de soro para aredução da oxidação de gonadotropinas diméricas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada no achado inesperado que, jádurante a fabricação de rFSH, formas oxidadas de rFSH aparecem no so-brenadante da cultura de célula. Além disso, a produção de rFSH no meiolivre de soro conduz a níveis mais altos de formas oxidadas do que produçãode rFSH em meio contendo soro. Na estrutura da presente invenção, foi sur-preendentemente verificado que níveis de formas oxidadas de rFSH podemser reduzidos não somente durante armazenamento, mas também durante aetapa de cultivo. Esta redução é alcançada sem prejudicar a produtividade.

A redução é efetuada através da adição de um antioxidante ao meio de cul-tura. Especificamente, foi verificado que a suplementação de um meio livrede soro com, qualquer de (i) 2-mercaptoetanol, (ii) uma combinação de ácidoascórbico e (+)-alfa-tocoferol, (iii) L-metionina, ou (iv) L-glutationa durantecultivo de células que expressam níveis reduzidos de rFSH de formas oxida-das de rFSH.

Portanto, em um primeiro aspecto, a invenção se refere ao usode um meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotropinas di-méricas recombinantes, caracterizado em que referido meio de cultura com-preende um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em:

- L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cer-ca de 20 mg/L;

- 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5a cerca de 15 mg/L;

- L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 acerca de 500 mg/L; e

- uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração vari-ando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma con-centração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um método dereduzir os níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina dimérica recom-binante durante seu processo de fabricação, caracterizado em que célulasque expressam referida gonadotropina dimérica recombinante são cultivadasem um meio de cultura livre de soro compreendendo um antioxidante.

Um terceiro aspecto da invenção se refere a um meio de culturalivre de soro para a produção de gonadotropinas diméricas recombinantescaracterizado em que referido meio de cultura compreende um antioxidanteselecionado a partir do grupo consistindo em:

- L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cer-ca de 20 mg/L;

- L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200mg/L a cerca de 500 mg/L; e

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção origina-se a partir do achado que os níveisde formas oxidadas de rFSH podem ser significantemente reduzidos apóscultivo de células que expressam rFSH em um meio livre de soro compreen-dendo antioxidantes. Conforme mostrado no Exemplo 3, qualquer de (i) 2-mercaptoetanol, (ii) uma combinação de ácido ascórbico e de (+)-alfa-tocoferol, (iii) L-metionina ou (iv) L-glutationa são particularmente vantajosospara redução dos níveis de formas oxidadas de rFSH durante o processo decultivo. Importantemente, esta redução pode ser alcançada sem prejudicar aviabilidade e o metabolismo da célula, e sem prejudicar os títulos de rFSH.

Portanto, um primeiro aspecto da presente invenção é dirigidoao uso de um meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotropi-nas diméricas recombinantes, caracterizado em que referido meio de culturacompreende um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em:

- L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cer-ca de 20 mg/L;

Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro de acordo com apresente invenção compreende L-glutationa a uma concentração variandode cerca de 1, 1,5, 2 a cerca de 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 15 ou 20 mg/L. Mais pre-ferivelmente, o meio de cultura livre de soro compreende L-glutationa a umaconcentração de cerca de 2,5 ou 3 mg/L. Conforme usado aqui, "glutationa"é usada intercambeavelmente com "L-glutationa".

Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro, de acordo coma presente invenção, compreende 2-mercaptoetanol a uma concentraçãovariando de cerca de 5, 6, 7, 8, 9 a cerca de 11, 12, 13, 14 ou 15 mg/L. Maispreferivelmente, o meio de cultura livre de soro compreende 2-mercaptoetanol a uma concentração de cerca de 10 mg/L.

Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro, de acordo coma presente invenção, compreende uma combinação de ácido ascórbico auma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L, e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25mg/L. Mais preferivelmente, tal meio compreende (+)-alfa-tocoferol a umaconcentração variando de cerca de 5, 8, 10 ou 12 a cerca de 16, 18, 20, 22ou 25 mg/L, e ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 15,20 ou 25 a cerca de 35, 40 ou 45 mg/L. Mais preferivelmente, tal meio decultura livre de soro compreende (+)-alfa-tocoferol a uma concentração decerca de 14 mg/L, e ácido ascórbico a uma concentração de cerca de 30mg/L. Conforme aqui usado, "(+)-alfa-tocoferol" é usado intercambeavelmen-te com "vitamina A", e "ácido ascórbico" é usado intercambeavelmente com"L-ácido ascórbico".

Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro, de acordo coma presente invenção, compreende L-metionina a uma concentração variandode cerca de 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 ou 245 mg/L a cer-ca de 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ou 500 mg/L. Mais preferivel-mente, o meio de cultura livre de soro compreende L-metionina a uma con-centração de cerca de 250 mg/L. Conforme aqui usado, "metionina" é usadaintercambeavelmente com "L-metionina".

Qualquer meio de cultura livre de soro pode ser suplementadocom antioxidantes de acordo com a presente invenção. Meios livres de sorocomercialmente disponíveis que podem ser usados de acordo com a presen-te invenção incluem, por exemplo, SFM 90 (JRH, 67350), SFM 90.1 (JRH,67350), Supmed300 ou Supmed300 modificado (JRH, 67350), DMEM (Gib-co, 7490571), DMEM/F12 (Gibco, 99.5043), SFM CHO 3a (BioWhittaker),CHO PFM (Sigma, C6970), procmo 5, meio EX-CELL, tais como EX-CELL302 (JRH, Catalogue No. 14312-1000M) ou EX-CELL 325 (JRH, CatalogueNo. 14335-1000M), CHO-CD3 (Sigma, Catalogue No. C-1490), CHO Ill PFM(Gibson, Catalogue No. 96-0334SA), CHO-S-SFM Il (Gibson, Catalogue No.12052-098), CHO-DHFR (Sigma, Catalogue No. C-8862), procmo 5 (Cam-brex, Catalogue No. BE12-766Q), SFM4CHO (Cyclone, Catalogue No.SH30549.01), Ultra CHO (Cambrex, Catalogue No. 12-7240), HYQ PF CHO(Myclone, Catalogue No. SH30220.01), HYQ SFX CHO (Myclone, CatalogueNo. SH30187.01), HYQ CDM4CH0 (Myclone, Catalogue No. SH30558.01),IS CHO-CD (Irvine Scientific, Catalogue No. 91119), IS CHO-V (Irvine Scien-tific, Catalogue No. 9197), e derivados destes. A composição de SFM 90,SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3ã e CHP PFM, quepode ser usada de acordo com a presente invenção, é mostrada na Tabela 1abaixo.<table>table see original document page 10</column></row><table><table>table see original document page 11</column></row><table><table>table see original document page 12</column></row><table><table>table see original document page 13</column></row><table><table>table see original document page 14</column></row><table><table>table see original document page 15</column></row><table><table>table see original document page 16</column></row><table><table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>Em uma concretização preferida da presente invenção, o meiode cultura livre de soro é um meio quimicamente definido, isto é, um meiopreparado de ingredientes purificados e, portanto, cuja composição exata éconhecida. Especificamente, meio quimicamente definido nem contém com-ponentes derivados de animal nem hidrolisatos não-definidos.

As gonadotropinas que podem ser produzidas, de acordo com apresente invenção, incluem o hormônio de luteinização (LH; OMIM AcessoNo. 152780), o hormônio de estimulação de folículo (FSH; OMIM Acesso No.136530), a gonadotropina coriônica, (CG; OMIM Acesso No. 118860) e ohormônio de estimulação de tireóide (TSH; OMIM Acesso No. 188540). Asgonadotropinas são hormônios diméricos. Cada um destes hormônios con-siste de um dímero não-covalente de subunidades alfa e beta. A subunidadealfa é a mesma para todos os 4 hormônios (OMIM Acesso No. 118850), e as1983).

Em uma concretização mais preferida da presente invenção, agonadotropina é FSH humano. Conforme aqui usado, o termo "FSH" se refe-re a uma proteína dimérica compreendida de uma subunidade alfa corres-pondente ao SwissProt Acesso No. P01215, e de uma subunidade beta cor-respondente a SwissProt Acesso No. P01225. Visto que FSH é uma proteínasecretada solúvel, ela é liberada no sobrenadante de cultura celular, ou pormeio de seu peptídeo de sinal natural, ou por meio de um peptídeo de sinalheterólogo, isto é, um peptídeo de sinal derivado de outra proteína secretadaque pode ser mais eficiente no sistema de expressão particular usado.

O termo FSH inclui adicionalmente variantes unidas, variantesalélicas, muteínas, derivados funcionais, frações ativas, proteínas fundidas eproteínas circularmente permutadas de uma proteína dimérica compreendidade uma subunidade alfa correspondente a SwissProt Acesso No. P01215, ede uma subunidade beta correspondente a SwissProt Acesso No. P01225.

Conforme aqui usado, o termo "muteína" se refere a análogosde FSH, no qual um ou mais dos resíduos de aminoácido de um FSH naturalou FSH viral são substituídos por resíduos de aminoácido diferentes, ou sãoanulados, ou um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados à se-qüência natural de FSH, sem mudar consideravelmente a atividade dos pro-dutos resultantes comparado com o FSH não cultivado. Estas muteínas sãopreparadas por técnicas de mutagênese de síntese e/ou de local direcionadoconhecidas, ou qualquer outra técnica conhecida, portanto, adequada.

As muteínas de acordo com a presente invenção incluem prote-ínas codificadas por um ácido nucléico, tal como DNA ou RNA, que hibridizapara DNA ou RNA, que codificam um FSH sob condições severas. O termo"condições severas" se refere a condições de hibridização e lavagem subse-qüente, cujo aquelas do versado na técnica se referem a "severas" (vide, porexemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, In-terscience, N.Y., §§6.3 e 6.4, 1987, 1992). Sem limitação, exemplos de con-dições severas incluem condições de lavagem 12-20°C abaixo da Tm calcu-lada do híbrido sob estudo em, por exemplo, 2 χ SSC e 0,5% de SDS por 5minutos, 2 χ SSC e 0,1% de SDS por 15 minutos; 0,1 χ SSC e 0,5% de SDSa 37°C por 30-60 minutos e, em seguida, 0,1 χ SSC e 0,5% de SDS a 68°Cpor 30-60 minutos. Aqueles versados na técnica compreendem que as con-dições severas também dependem do comprimento das seqüências deDNA, das sondas de oligonucleotídeo (tais como 10-40 bases), ou das son-das de oligonucleotídeo misturadas. Se sondas misturadas são usadas, épreferível usar cloreto de tetrametil amônia (TMAC) ao invés de SSC. VideAusubel, supra.

Em uma concretização preferida, uma muteína de FSH tem pelomenos 40% de identidade com a seqüência de um FSH que ocorre natural-mente. Mais preferivelmente, ela tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85% ou, mais preferivelmente, pelo menos 90%, 95%,96%, 97%, 98% ou 99% de identidade.

A identidade reflete um relacionamento entre duas ou mais se-qüências de polipeptídeo, ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeo,determinadas por comparação das seqüências. Em geral, a identidade serefere a uma correspondência exata de nucleotídeo para nucleotídeo ou deaminoácido para aminoácido das duas seqüências de polinucleotídeos ouduas seqüências de polipeptídeos, respectivamente, sobre o comprimentodas seqüências sendo comparadas.

Para seqüências onde não existe uma correspondência exata,uma "% de identidade" pode ser determinada. Em geral, as duas seqüênciasa serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entreas seqüências. Isto pode incluir inserção de "folgas" em qualquer uma ouambas seqüências, para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identi-dade pode ser determinada sobre o comprimento total.de cada uma das se-qüências sendo comparada (assim denominado "alinhamento global"), que éparticularmente adequado para seqüências do mesmo ou comprimento mui-to similar, ou sobre comprimentos definidos mais curtos (assim denominado"alinhamento local"), que é mais adequado para seqüências de comprimentodesigual. Na estrutura da presente invenção, a "% de identidade" se refere apercentagem global de identidade que foi determinada sobre o comprimentototal de cada uma das seqüências sendo comparadas.

Programas de computador conhecidos podem ser usados paradeterminar se qualquer polipeptídeo particular é uma percentagem idêntica auma seqüência da presente invenção. Tais algoritmos e programas incluem,por exemplo, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, e CLUSTALW (Altschulet al., 1990; Altschul et al., 1997; Higgins et al., 1996; Pearson and Lipman,1988; Thompson et al., 1994). As homologias da proteína e seqüência deácido nucléico são preferivelmente avaliadas usando-se a Ferramenta dePesquisa de Alinhamento Local Básico ("BLAST"), que é bem conhecida natécnica (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997; Karlin and Altschul, 1990).

Os programas BLAST identificam seqüências homólogas pelaidentificação de segmentos similares, que são referidos aqui como "pares desegmento de alta classificação," entre uma seqüência amino ou ácido nu-cléico, e uma seqüência teste que é preferivelmente obtida a partir de umabase de dados de seqüência de proteína ou ácido nucléico. Pares de seg-mento de alta classificação são preferivelmente identificados (isto é, alinha-dos) por meio de uma matriz de classificação, muitas das uais sendo conhe-cidas na técnica. A matriz de classificação usada pode ser a matriz BLO-SUM62 (Gonnet et al., 1992; Henikoff e Henikoff, 1993). As matrizes PAM ouPAM250 podem também serem usadas (Vide, por exemplo, Schwartz andDayhoff, eds, (1978) Matrices for Deteeting Distanee Relationships: Atlas ofProtein Sequenee and Structure, Washington: National Biomedieal ResearchFoundation). Os programas BLAST avaliam a significância estatística de to-dos os pares de segmento de classificação alta identificados, e preferivel-mente selecionam aqueles segmentos que satisfazem um limite especificadodo usuário de significância,-tal como uma homologia de percentagem especi-ficada do usuário. Preferivelmente, a significância estatística de um par desegmentos de classificação alta é avaliada usando-se a fórmula de signifi-cância estatística de Karlin (Karlin and Altschul, 1990). Os programas BLASTpodem ser usados com os parâmetros de falta, ou com parâmetros modifi-cados providos pelo usuário.

Um método preferido para determinação da melhor equiparaçãototal entre uma seqüência de consulta (uma seqüência da presente inven-ção) e uma seqüência objeto, também referida como um alinhamento de se-qüência global, pode ser determinado usando-se o programa de computadorFASTDB baseado no algoritmo de Brutlag (Brutlag et al., 1990). Em um ali-nhamento de seqüência, as seqüências de consulta e objeto são ambas se-qüências de aminoácido. O resultado de referido alinhamento de seqüênciaglobal é em percentagem de identidade. Parâmetros preferidos usados emum alinhamento de aminoácido FASTDB são: Matriz=PAM O, k-tuple=2, Pe-nalidade de Desacordo=I, Penalidade de União=20, Grupo de Randomiza-ção=25 Comprimento=O, Classificação de Corte=I, Tamanho de jane-Ia=Comprimento de seqüência, Penalidade de Folga=5, Penalidade de Ta-manho de FoIga=O,05, Tamanho de Janela=247 ou o comprimento da se-qüência de aminoácido objeto, sempre que é mais curta.

Se a seqüência objeto é mais curta do que a seqüência de con-sulta devido as anulações de terminal N- ou C-, não devido as anulaçõesinternas, os resultados, em percentagem de identidade, devem ser corrigidosmanualmente porque o programa FASTDB não contam os truncamentos determinal N- e C- da seqüência objeto quando se calcula a percentagem deidentidade global. Para as seqüências objeto truncadas no terminal N- e C-,em relação a seqüência de consulta, a percentagem de identidade é corrigi-da pelo cálculo do número de resíduos da seqüência de consulta que sãoterminais N- e C- da seqüência objeto, que não são equiparadas/alinhadascom um resíduo objeto correspondente, como uma percentagem das basestotais da seqüência de consulta. Se um resíduo é equiparado/alinhado, édeterminado pelos resultados do alinhamento de seqüência FASTDB. Estapercentagem-é, em seguida, subtraída a partir da percentagem de identida-de, calculada pelo programa FASTDB acima usando-se os parâmetros es-pecifiçados, para chegar a uma classificação de percentagem de identidadefinal. Esta classificação de percentagem de identidade final é o que é usadopara a proposta da presente invenção. Somente resíduos aos terminais N- eC- da seqüência objeto, que não são equiparadas/alinhadas com a seqüên-cia de consulta, são considerados para a proposta de ajustar manualmente aclassificação de percentagem de identidade. Isto é, somente resíduos deaminoácido de consulta fora dos resíduos de terminal N- e C- mais distantesda seqüência objeto.

Por exemplo, uma seqüência objeto de resíduo de 90 aminoáci-dos é alinhada com uma seqüência de consulta de 100 resíduos para deter-minar a percentagem de identidade. A anulação ocorre no terminal N da se-qüência objeto e, portanto, o alinhamento de FASTDB não se equipara/sealinha com o primeiro resíduo no terminal N. Os 10 resíduos não-emparelhados representam 10% da seqüência (número de resíduos dosterminais N- e C- não equiparados/número total de resíduos na seqüência deconsulta), de modo que 10% é subtraído a partir da classificação de percen-tagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduosremanescentes estavam perfeitamente equiparados, a percentagem de iden-tidade final seria 90%.

Mudanças preferidas para muteínas, de acordo com a presenteinvenção, são as que são conhecidas como substituições "conservativas".Substituições de aminoácido conservativas de FSH podem incluir aminoáci-dos sinônimos dentro de um grupo que tem propriedades fisicoquímicas su-ficientemente similares que substituição entre membros do grupo preserva-rão a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É claro que inserçõese anulações de aminoácidos podem também serem feitas nas seqüênciasacima sem alterar sua função, particularmente se as inserções ou anulaçõessomente envolvem uns poucos aminoácidos, por exemplo, abaixo de trinta, epreferivelmente abaixo de dez, e não removem ou deslocam aminoácidosque são críticos a uma conformação funcional, por exemplo, resíduos decisteína. As proteínas^e muteínas produzidas por tais anulações e/ou inser-ções vêm dentro do campo de ação da presente invenção.

O termo "proteína fundida" de FSH se refere a um polipeptídeocompreendendo FSH, uma muteína ou um fragmento desta, fundida comoutra proteína, que, por exemplo, tem um tempo de residência estendido emfluidos corpóreos. O FSH pode, por exemplo, ser fundido a uma imunoglobu-lina ou um fragmento desta, tal como porção Fc de imunoglobulina. A se-qüência de FSH matura pode também ser fundida a um peptídeo de sinal,e/ou uma seqüência condutora que permite secreção aumentada.

Em uma concretização da presente invenção, a subunidade betade FSH ou um fragmento desta é fundida ao peptídeo carboxil terminal(CTP) de subunidade hCG beta. A proteína resultante tem atividades recep-toras de ligação e biológicas in vitro como FSH, mas uma meia-vida de circu-lação aumentada (LaPoIt et a!., 1992).

Como "fração ativa" de FSH ou muteínas deste, a presente in-venção cobre qualquer fragmento ou precursores da cadeia de polipeptídeoda molécula de proteína sozinha ou junto com moléculas associadas ou re-síduos ligados a estas, por exemplo, resíduos de açúcar ou fosfato, ou agre-gados da molécula de proteína ou os resíduos de açúcar por si, provido quereferida fração tem atividade substancialmente similar a FSH.

"Derivados funcionais" de FSH, conforme aqui usado, cobremderivados de FSH ou uma muteína deste, que podem ser preparados a partirdos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos, ounos grupos terminais N- ou C-, por meios conhecidos na técnica, e são inclu-ídos na invenção considerando-se que eles permanecem farmaceuticamenteaceitáveis, isto é, eles não destroem a atividade da proteína que é substan-cialmente similar à atividade da gonadotropina, e não conferem propriedadestóxicas nas composições contendo-as. Estes derivados podem, por exemplo,incluir cadeias laterais de polietileno glicol, que podem mascarar locais anti-gênicos, e estender a residência de FSH nos fluidos corpóreos. Outros deri-vados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxila, amidas dos gruposcarboxila pela reação com amônia, ou com aminas primária ou secundária,derivados de N-acila de-grupos amino livres dos-resíduos de aminoácidoformados com porções de acila (por exemplo, grupos alcanoíla ou cárbocí-clica aroíla) ou derivados de O-acila de grupos hidroxila livres (por exemplo,aquele de resíduos de serila ou treonila) formados com porções de acila. Emuma concretização preferida, o derivado funcional corresponde a uma molé-cula de FSH revelando glicosilação adicional.

O termo "sais" de FSH aqui se refere a ambos sais de gruposcarboxílicos e a sais de adição ácidos de grupos amino de FSH. Sais de umgrupo carboxila podem ser formados por meios conhecidos na técnica, eincluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amônia, férricoou zinco, e similares, e sais com bases orgânicas conforme aqueles forma-das, por exemplo, com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina,piperidina, procaína e similares. Sais de adição ácidos incluem, por exemplo,sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácidosulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acéticoou ácido oxálico. Naturalmente, quaisquer tais sais podem reter a atividadebiológica da gonadotropina.

Conforme aqui usado, o termo "gonadotropina dimérica recom-binante" se refere a uma gonadotropina que foi produzida após cultivo deuma célula geneticamente projetada. A gonadotropina pode ser produzidaem uma célula de qualquer origem. A célula geneticamente projetada queexpressa uma gonadotropina dimérica expressa ambas subunidades de re-ferida gonadotropina dimérica.

Conforme aqui usado, o termo "célula geneticamente projetada"se refere a uma célula na qual DNA exógeno foi introduzido de modo a per-mitir expressão de ambas subunidades da gonadotropina desejada. O DNAexógeno pode compreender uma seqüência que codifica para as subunida-des da gonadotropina desejada. Alternativamente, o DNA exógeno podecompreender uma expressão de ativação de seqüência da seqüência endó-gena que codifica para as subunidades da gonadotropina desejada (vide, porexemplo, o WO 91/09955).

As células podem ser de, por exemplo, animal, inseto, ou de ori-gera microbial. Conforme aqui usado, o termo "célula animal" inclui célulasde mamíferos humanos e não-humanos, células de não-mamíferos, e hibri-dornas. Exemplos de células de mamíferos nas quais uma gonadotropinadimérica recombinante pode ser produzida incluem, por exemplo, células3T3, células de COS, células de osteosarcoma humano, células MRC-5, cé-lulas BHK, células VERO, células CHO, células rCHO-tPA, células de Anti-geno de Superfície CHO - Hep B, células HEK 293, células rHEK 293, célu-las de Antígeno de Superfície rC127 - Hep B, células de fibíoblasto HumanoNormal, células de Estroma, células de Hepatócitos, células PER.C6 e célu-las amniocíticas permanentes humanas. Exemplos de hibridomas nos quaisuma gonadotropina dimérica recombinante pode ser produzida incluem, porexemplo, células DA4.4, células 123A, células 127A, células GAMMA e célu-las 67-9-B.

Na estrutura da presente invenção, é preferido cultivar uma célu-la de Ovário de Hamster Chinês (célula de CHO).

Um segundo aspecto da presente invenção é dirigido a um mé-todo de reduzir os níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina diméricarecombinante durante seu processo de fabricação, caracterizado em quecélulas que expressam referida gonadotropina dimérica recombinante sãocultivadas em um meio de cultura livre de soro compreendendo um antioxi-dante.

Conforme aqui usado, o termo "formas oxidadas" se refere a umpolipeptídeo no qual um oxidante causou oxidação de um ou mais resíduosde aminoácido. Tais formas podem ser detectadas por, por exemplo, HPLC,conforme descrito no Exemplo 2.1 para FSH.O cultivo pode ser efetuado em qualquer ambiente adequado,tais como pratos Petri, frascos T ou garrafas de cilindro, mas preferivelmenteem vasos tendo volumes maiores, tais como, por exemplo, um biorreator.

A etapa de cultivo compreende as seguintes etapas:

- uma inoculação de referidas células no referido meio de culturalivre de soro;

- uma fase de crescimento; e

- uma fase de. produção.

A fase de crescimento é a parte do processo de cultura de célulana qual os parâmetros de processo são ajustados de modo a suportar cres-cimento celular. Uma vez que a densidade celular desejada tenha sido al-cançada, a cultura de célula é usualmente alterada em uma fase de produ-ção, na qual os parâmetros de processo são ajustados de modo a suportarprodutividade celular. Os parâmetros de processo podem ser os mesmosdurante a fase de crescimento e a fase de produção. Durante a fase de pro-dução, a concentração celular tem preferivelmente um valor compreendidodentro de uma faixa de 1,106 a 5,107 células/mL, por exemplo, de cerca de1,106, 5,106, 107 ou 5,107 células/mL. Mais preferivelmente, referida célula éuma célula de CHO.

Em uma concretização, o antioxidante é adicionado ao mesmomeio de cultura livre de soro antes da inoculação das células. Em outra con-cretização, o antioxidante é adicionado ao meio de cultura livre de soro ime-diatamente após inoculação das células (por exemplo, não mais do que 24horas após inoculação).

Preferivelmente, o processo de fabricação compreende a etapade coletar o meio compreendendo a gonadotropina dimérica recombinante.

Em uma concretização preferida, o processo de fabricaçãocompreende adicionalmente purificar a gonadotropina dimérica recombinan-te. Métodos de purificação de gonadotropinas são bem conhecidos na técni-ca. FSH pode, por exemplo, ser purificado conforme descrito no EP 04 105639.1, o WO 98/20039, o WO 00/63248 ou WO 88/10270.

Em uma concretização preferida adicional, o processo de fabri-cação compreende adicionalmente formular a gonadotropina dimérica re-combinante com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter umacomposição farmacêutica.

O termo "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme aquiusado, é significativo para envolver qualquer veículo que não interfere com aeficiência da atividade biológica do ingrediente ativo, e que não seja tóxicoao hospedeiro ao qual ele é administrado. Por exemplo, para administraçãoparenteral, a(s) .proteína.(s) ativa(s) pode(m) ser formulada(s) em uma formade dosagem de unidade para injeção em veículos, tais como solução salina,solução de dextrose, albumina de soro, e solução de Ringer.

A composição farmacêutica formulada de acordo com a inven-ção pode, em seguida, ser administrada a um indivíduo em uma variedadede modos. As rotas de administração incluem rotas intradermal, transdermal(por exemplo, em formulações de liberação lenta), intramuscular, intraperito-neal, intravenosa, subcutânea, oral, intracraniãl, epidural, tópica, retal, e in-tranasal. Qualquer rota terapeuticamente eficaz de administração pode serusada, por exemplo, absorção através de tecidos epitelial ou endotelial, oupor terapia de gene na qual uma molécula de DNA que codifica o agenteativo é administrada ao paciente (por exemplo, via um vetor), que faz comque o agente ativo seja expresso e secretado in vivo. Em adição, a(s) proteí-na(s) de acordo com a presente invenção pode(m) ser administrada(s) juntocom outros componentes de agentes biologicamente ativos, tais como ten-soativos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, transportadores, diluen-tes e veículos. Para administração parenteral (por exemplo, intravenosa,subcutânea, intramuscular), a(s) proteína(s) ativa(s) pode(m) ser formula-da(s) como uma solução, suspensão, emulsão ou pó Iiofilizado em associa-ção com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável (por exemplo,água, salina, solução de dextrose) e aditivos, que mantêm isotonicidade (porexemplo, manitol), ou estabilidade química (por exemplo, conservantes etampões). A formulação é esterilizada por técnicas comumente usadas.

Em uma concretização preferida da presente invenção, o méto-do de redução dos níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina diméri-ca recombinante durante seu processo de fabricação é caracterizado emque pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis etapas de referido processode fabricação são efetuadas na presença de um antioxidante. Preferivelmen-te, todas as etapas de referido processo de fabricação são efetuadas napresença de um antioxidante, isto é, o processo de fabricação total é efetua-do na presença de um antioxidante.

Por exemplo, o método de redução dos níveis de formas oxida-das de uma gonadotropina dimérica recombinante durante seu processo defabricação pode compreender as etapas de:

- Cultivo das células que expressam referida gonadotropina di-mérica recombinante em um meio de cultura livre de soro compreendendoum antioxidante;

- Coleta do meio compreendendo referida gonadotropina diméri-ca recombinante; e

- Purificação de referida gonadotropina dimérica recombinantena presença de um antioxidante.

Preferivelmente, o método de reduzir os níveis de formas oxida-das de uma gonadotropina dimérica recombinante durante seu processo defabricação compreende adicionalmente a etapa de formular referida gonado-tropina dimérica recombinante em uma composição farmacêutica compreen-dendo um antioxidante.

O antioxidante pode ser o mesmo em todas as etapas do pro-cesso de fabricação nas quais o antioxidante é usado. Alternativamente, an-tioxidantes diferentes podem ser usados na etapa de cultivo, na etapa depurificação, e/ou na etapa de formulação. Numerosos compostos tendo umefeito antioxidante são conhecidos na técnica. Estes compostos incluem, porexemplo, cisteína, ácido ascórbico, L-metionina, L-glutationa, 2-mercaptoetanol, alfa-tocoferol e derivados destes, BO-653, t-butil-4-metoxi-fenol, 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metil fenol; bimeta-bissulfito de potássio ousódio, bissulfito de sódio, histidina, taurina, glicina, alanina, carnosina, anse-rina e 1-metilistidina.

Um terceiro aspecto da invenção é dirigido a um meio de culturalivre de soro para a produção de gonadotropina dimérica recombinante ca-racterizado em que referido meio de cultura compreende um antioxidanteselecionado a partir do grupo consistindo em:

- L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 mg/La cerca de 20 mg/L;

- 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5mg/L a cerca de 15 mg/L;

L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200mg/L a cerca de 500 mg/L; e

O meio de cultura livre de soro usualmente compreende água,um regulador de osmolaridade, um tampão, uma fonte de energia, aminoáci-dos, uma fonte inorgânica ou de ferro recombinante, um fator de crescimentorecombinante ou sintético, e, opcionalmente, íons de metal não-ferroso, vi-taminas e co-fatores. Por exemplo, quaisquer dos meios livre de soro co-mercialmente disponíveis listados acima podem ser modificados de acordocom a presente invenção.

Tendo-se agora descrito totalmente esta invenção, será apreci-ado por aqueles versados na técnica que a mesma pode ser realizada comuma ampla faixa de parâmetros, concentrações e condições equivalentessem fugir do escopo e espírito da invenção, e sem experimentação indevida.

Conquanto esta invenção tenha sido descrita em conjunto comconcretizações específicas desta, será compreendido que ela é capaz deoutras modificações. Este pedido é pretendido para cobrir quaisquer varia-ções, usos ou adaptações da invenção, seguindo, em geral, os princípios dainvenção, e incluindo tais afastamentos a partir da presente descrição comoestando dentro da prática conhecida e costumeira dentro da técnica a qual ainvenção pertence, e pode ser aplicada às características essenciais aquiabaixo colocadas conforme segue no escopo das reivindicações em anexo.

Todas as referências aqui citadas, incluindo artigos de jornal ouresumos, pedidos de patente estrangeiros ou norte-americanos publicadosou não publicados, patentes estrangeiras ou norte-americanas publicadas,ou quaisquer outras referências, são totalmente incorporados por referênciaaqui, incluindo todos os dados, tabelas, figuras e texto apresentados nasreferências citadas. Adicionalmente, os conteúdos totais das referências ci-tadas dentro das referências citadas aqui são também totalmente incorpora-dos por referência.

Referência a.etapas de método conhecidas, etapas de métodosconvencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é, dequalquer modo, uma admissão que qualquer aspecto, descrição ou concreti-zação da presente invenção é descrito, ensinado ou sugerido na técnica re-levante.

A descrição precedente das concretizações específicas será,desse modo, totalmente revelada na natureza da invenção que outros po-dem, pela aplicação do conhecimento dentro do versado na técnica (incluin-do os conteúdos das referências aqui citadas), modificar prontamente e/ouadaptar as várias aplicações de tais concretizações específicas, sem expe-rimentação indevida, sem fugir do conceito geral da presente invenção. Por-tanto, tais adaptações e modificações são pretendidas para estarem dentrodo significado de uma faixa de equivalentes das concretizações descritas,baseado nos ensinamentos e orientação aqui apresentados. É para sercompreendido que a fraseologia ou terminologia aqui é para a proposta dedescrição e não de limitação, tal que a terminologia ou fraseologia do pre-sente relatório é para ser interpretada pelo versado na técnica à luz dos en-sinamentos e orientação aqui apresentados, em combinação com o conhe-cimento de um versado na técnica.

EXEMPLO 1: Processo de Cultura de Célula

1.1. Linhagens de célula e meio

Todos os experimentos foram realizados com uma linhagem decélula de CHO expressando ambas subunidades de FSH humano. A proteí-na produzida é uma gonadotropina dimérica adicionalmente referida comorFSH. A subunidade alfa corresponde a SwissProt Acesso No. P01215, e asubunidade beta corresponde a SwissProt Acesso No. P01225.

O meio usado para cultivo da célula foi um meio livre de sorobásico (SFM) designado para cultivo de células de CHO. O meio de SFM foisuplementado com o antioxidante a ser testado conforme detalhado no E-xemplo 3. A concentração inicial dos antioxidantes a serem testados no SFMbásico é mostrada na Tabela I.

Tabela I: Concentração inicial de antioxidantes no meio livre

<table>table see original document page 34</column></row><table>

1.2. Condições de inoculação, crescimento e produção

O processo de cultura, também referido como "curso", compre-ende uma etapa de inoculação, uma fase crescimento e uma fase de produ-ção. Cinco cursos diferentes, referidos como cursos 1, 2, 3, 4 e 5, foram rea-lizados.

Pelo menos 2,4.109 de células de produção de rFSH viáveis fo-ram transferidas para um bioreator de 15 L com um volume de operação efi-caz de 11 L (newMBR, Zürich) compreendendo microtransportadores. Ime-diatamente após semeadura seguiu-se uma fase de batelada que durou doisou três dias. O bioreator foi então continuamente alimentado com SFM auma taxa de diluição de 1 dia"1 e a uma taxa de perfusão a 11 L.dia"1.

A fase de crescimento e a fase de produção foram realizadas nomesmo pH e temperatura (37°C, pH = 7). O Oxigênio Dissolvido (DO) foimantido a 50 % de saturação de ar durante o curso total.EXEMPLO 2: Métodos analíticos

2.1. Determinação de formas oxidadas de rFSH

As formas oxidadas foram determinadas por RP-HPLC em co-lheita bruta, conforme descrito por Bassett e Driebergen (Bassett and Drie-bergen, 2005).

As percentagens de formas oxidadas foram normalizadas usan-do-se a percentagem de formas oxidadas obtidas com L-cisteína a 280 mg/Lno curso 2 como um referência (isto á, as.percentagens de formas oxidadasforam divididas por 23,4%).

2.2. Medição da concentração de célula viável total

A concentração de célula viável total é definida como a soma daconcentração de células fixadas em microveículos e a concentração de célu-las viáveis em suspensão. A concentração de células fixadas nos micro-transportadores foi determinada usando-se o método de contagem nucléicade cristal violeta (Fluka 61135). A concentração de células viáveis na sus-pensão foi determinada usando-se método de exclusão de Trypan azul(Sigma T-8154).

A Razão de Células Viáveis Totais (Razão de TVC) foi calculadaconforme segue: concentração de célula viável total, final de teste / concen-tração de célula viável total, início de teste, no qual o início de teste é defini-do como o dia no qual um novo antioxidante é introduzido na cultura, e ofinal do teste é definido como o dia antes do próximo oxidante ser introduzi-do na cultura.

2.3. Medição das titulações de rFSH

A titulação de rFSH foi medida por um ensaio imunofluorimétri-co, usando-se o kit Delphia hFSH de WaIIac-ADL (cat. n°A017-201).

2.4. Medição da taxa de consumo de glicose (GCR)

A taxa de consumo de glicose (GCR), expressa em grama por li-tro e por dia, foi calculada conforme segue: GCR = (G0 - Gt) Dt + (Gt-i - Gt)G significa "Concentração de Glicose" e D significa "taxa de dilu-ição". Os índices se referem ao seguinte:

- 0: alimentação de SFM;-1: medido no tempo t; e

-1-1: medido no tempo t-1.

EXEMPLO 3: Efeito de vários antioxidantes

De modo a reduzir o nível de formas oxidadas obtidas com oprocesso livre de soro, dois cursos de 15 L (cursos 1 e 2) foram realizadostestando-se o efeito de vários antioxidantes. Um curso sem adição de qual-quer antioxidante foi realizado como um controle (curso 3).

SFM foi suplementado com vários antioxidantes, ou combinaçãode antioxidantes, de modo a alcançar a concentração final mostrada na Ta-bela II. Cada antioxidante ou combinação de antioxidantes foi testado por umperíodo de cerca de dez dias. No primeiro dia de teste, o volume de soluçãode antioxidante necessário para alcançar o ponto de ajuste foi adicionado.

Todo dia, em seguida, uma certa quantidade de antioxidante foi lavada apartir do bioreator por perfusão e substituída por adição de um tempo (parauma taxa de diluição de 1 d"1, 63,2% do volume do bioreator foi renovadotoda 24 hora, e isto representa a quantidade de antioxidante a ser substituí-da todo dia). No final do período de teste, o antioxidante foi lavado a partir dobioreator por perfusão, e substituído por outro antioxidante a ser testado.

A percentagem de formas oxidadas de rFSH foi medida no finalde cada teste (tabela II). Um valor normalizado inferior a 1,0 indica que oantioxidante testado é mais eficiente do que L-cisteína para diminuir os ní-veis de formas oxidadas de rFSH.

A concentração de célula viável total, a GCR e as titulações derFSH foram medidas diariamente. A Tabela Il indica a razão de células viá-veis totais (razão de TVC). Uma razão de TVC superior ou igual a 1,0 indicaque o antioxidante testado não tem efeito tóxico nas células.<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table>Os resultados mostrados na tabela Il indicam que 2-mercaptoetanol, uma combinação de ácido ascórbico e (+)-alfa-tocoferol, L-metionina, e L-glutationa são os melhores antioxidantes para obtenção deníveis baixos de formas oxidadas de rFSH.

Uma razão de TVC de células viáveis totais inferior a 1,0 é obti-da somente no caso de 2-mercaptoetanol. Portanto, todos os antioxidantestestados nos Cursos 1 & 2, mas 2-mercaptoetanol, são não-tóxicos. Em adi-ção, a medição da GCR e das titulações de rFSH mostraram que nenhumdos vários antioxidantes tem qualquer impacto maior no metabolismo e mo-delos de produtividade (dados não mostrados).

L-metionina e L-glutationa foram escolhidas para otimização a-dicional do processo de produção. Um curso (curso 3) foi realizado para tes-tar várias concentrações de L-glutationa (de 1 a 20mg/L), e um curso (curso4) foi realizado para testar várias concentrações de L-metionina (de 0,25 a3g/L). No Curso 3, o teste de L-glutationa foi prematuramente cessado naprodução de 30 dias porque os microtransportadores foram danificados. Asconcentrações testadas de L-glutationa ou L-metionina durante os cursos 3 e4 são mostradas na Tabela III. Operação de Dia zero (WDO) é definida comoo dia durante o qual o bioreator é semeado. Produção de Dia zero (PDO) édefinida como o dia durante o qual o processo de cultura de célula é alteradoda fase de crescimento para fase de produção. Em adição, um curso foi rea-lizado sem variar a concentração de antioxidante. Neste curso, a L-metioninafoi adicionada a 250 mg/L a partir do começo (curso 5). Para todos os cur-sos, a percentagem de formas oxidadas de rFSH foi medida regularmente(tabela IV).Tabela III: Concentração de antioxidante nos cursos 3 e 4

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Tabela IV: Efeito de antioxidantes nas formas oxidadas de rFSH

<table>table see original document page 40</column></row><table>A análise de formas oxidadas de rFSH quando o antioxidante foiadicionado ao meio de cultura mostrou que L-metionina é um bom antioxi-dante. No curso 5, no qual as células foram cultivadas na presença de L-metionina a 250 mg/L, a percentagem média de formas oxidadas foi diminuí-da por ao redor de 40%, conforme comparado aos resultados obtidos nocurso 1 e curso 2 com L-cisteína como antioxidante (vide Tabela Il & IV). L-Glutationa é um bom antioxidante também, especialmente a uma concentra-ção de cerca de 2,5 mg/L. No curso 3, a percentagem de formas oxidadas foidiminuída por ao redor de 35% quando as células foram cultivadas na pre-sença de L-glutationa a 2,5 mg/L, conforme comparado aos resultados obti-dos no curso 1 e curso 2 com L-cisteína como antioxidante (vide Tabela Il & IV).

O aumento das concentrações da L-metionina parece ter umatendência diminuída na percentagem de formas oxidadas entre 250 e 2000mg/L no curso 4. Contudo, parece que as diferenças observadas estão den-tro da variabilidade do método conforme variações comparáveis foram ob-servadas no Curso 5 que testa uma concentração de L-metionina de 250mg/L para o curso total. Em adição, foi confirmado que L-glutationa e L-metionina não têm qualquer impacto maior na viabilidade das células, meta-bolismo e modelos de produtividade na faixa de concentração que foi testa-da (dados não mostrados).REFERÊNCIAS

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Claims

1. Uso de um meio de cultura livre de soro para a produção degonadotropinas diméricas recombinantes, caracterizado pelo fato de o quereferido meio de cultura compreende um antioxidante selecionado a partir dogrupo consistindo em:- L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cer-ca de 20 mg/L;- 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5a cerca de 15 mg/L;- L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 acerca de 400 mg/L; e- uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração vari-ando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma con-centração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, no qual referido oxi-dante é selecionado a partir do grupo consistindo em:- L-glutationa a uma concentração de cerca de 3 mg/L;- 2-mercaptoetanol a uma concentração de cerca de 10 mg/L;- L-metionina a uma concentração de cerca de 250 mg/L; e- uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração decerca de 30 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração de cerca de 14mg/L.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual referidomeio de cultura é um meio quimicamente definido.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,no qual referido meio de cultura é selecionado a partir do grupo consistindoem SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3a,CHP PFM, ProCHO 5, EX-CELL, CHO-CD3, CHO Ill PFM, CHO-S-SFM II,CHO-DHFR, SFM4CHO, Ultra CHO1 HyQ PF CHO1 HyQ SFX CHO, HyQCDM4CHO, IS CHO-CD, IS CHO-V, e derivados dos mesmos.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, no qual referida gona-dotropina dimérica é Hormônio de Estimulação de Folículo (FSH).

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,no qual referida gonadotropina dimérica recombinante é produzida nas célu-las de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

7. Método de reduzir os níveis de formas oxidadas de uma go-nadotropina dimérica recombinante durante seu processo de fabricaçãocompreendendo a etapa de cultivar células que expressam referida gonado-tropina dimérica recombinante em um meio de cultura livre de soro compre-endendo um antioxidante.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, no qual referidomeio de cultura livre de soro compreendendo um antioxidante é um meiocomo definido em qualquer das reivindicações 1 a 4.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, no qual a eta-pa de cultivo compreende as etapas de:a) uma inoculação de referidas células no referido meio de cultu-ra livre de soro;b) uma fase de crescimento; ec) uma fase de produção.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, no qual referido processo de fabricação compreende adicionalmente aetapa de coletar o meio compreendendo referida gonadotropina diméricarecombinante.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, no qual referido processo de fabricação compreende adicionalmente aetapa de purificar referida gonadotropina dimérica recombinante.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, no qual referido processo de fabricação compreende adicionalmente aetapa de formular referida gonadotropina dimérica recombinante em umacomposição farmacêutica.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado em que pelo menos duas etapas de referido processo defabricação são efetuadas na presença de um antioxidante.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a-13, no qual referida gonadotropina é FSH.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a-14, no qual referida gonadotropina dimérica recombinante é produzida emcélulas de CHO.

16. Meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotro-pina dimérica recombinante caracterizado em que referido meio de culturacompreende um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em:- J glutationa.a uma concentração variando de cerca de 3 mg/L;- 2-mercaptoetanol a uma concentração de cerca de 10 mg/L;- L-metionina a uma concentração de cerca de 250 mg/L; e- uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração vari-ando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma con-centração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

17. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 16, no qualreferido antioxidante é uma combinação de ácido ascórbico a uma concen-tração de cerca de 30 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração decerca de 14 mg/L.

18. Meio de cultura, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, noqual referido meio de cultura é um meio quimicamente definido.