NO341475B1

NO341475B1 - Anvendelse av serumfritt kulturmedium for å redusere oksiderte former av rekombinant dimerisk gonadotropin

Info

Publication number: NO341475B1
Application number: NO20080580A
Authority: NO
Inventors: Jean-Pierre Fonta; Paul Ducommun; Véronique Deparis
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2005-07-05
Filing date: 2008-01-31
Publication date: 2017-11-27
Also published as: AU2006264917A1; CN101258236A; US8093052B2; BRPI0612781A2; ES2388875T3; CA2613867A1; CY1112992T1; BRPI0612781B1; US20090124006A1; JP5059757B2; MY149621A; KR20080036599A; PT1899454E; KR101346499B1; JP2008544758A; DK1899454T3; RS52468B; TWI369401B; IL188558A0; EA200800253A1

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører. anvendelse av et serumfritt kulturmedium som omfatter en antioksidant for å redusere nivået av oksiderte former av rekombinant dimerisk gonadotropin under fremstillingsprosessen. Antioksidanten kan være valgt fra gruppen bestående av L-glutation, 2-merkaptometanol, L-metionin og en kombinasjon av askorbinsyre og av (+)-alfa-tokoferol.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Foreliggende oppfinnelse vedrører produksjon av rekombinant follikelstimulerende hormon (FSH). FSH hører til klassen av gonadotropiner.

FSH blir anvendt i behandlingen av infertilitet og reproduktive lidelser hos både kvinnelige og mannlige pasienter. FSH blir anvendt hos kvinnelige pasienter ved eggløsningsinduksjon (OI) og i kontrollert ovarie hyperstimulering (COH), f.eks. ved assistert reproduktive teknologier (ART). I et typisk behandlingsregime for eggløsningsinduksjon, blir en pasient administrert daglige injeksjoner FSH eller et derivat derav (omtrent 75 til 300 IU RFSH/dag) i en periode på fra omtrent 6 til omtrent 12 dager. I et typisk behandlingsregime for et kontrollert ovarie hyperstimulering, blir en pasient administrert daglige injeksjoner med FSH eller et derivat derav (omtrent 150-600 IU RFSH/dag) i en periode på omtrent 6 til omtrent 12 dager. FSH blir også anvendt for å indusere spermatogenese hos menn som lider av oligospermi. Et regime som anvender 150 IU FSH 3 ganger ukentlig i kombinasjon med 2.500 IU hCG to ganger ukentlig har vært vellykket for oppnåelse av en forbedring i spermantall hos menn som lider av hypegonadotropin hypogonadisme. Grunnet den store betydningen FSH har ved behandling av fertilitetslidelser, er tilveiebringelse av FSH med høy stabilitet og høy spesifikk aktivitet ønskelig.

I naturen blir FSH produsert av hypofysekjertelen. For farmasøytisk anvendelse, kan FSH bli produsert rekombinant (rFSH), eller det kan bli isolert fra urinen fra postmenopausale kvinner (uFSH). Fremstillingsprosessen av rFSH nødvendiggjør to hovedtrinn: kultivering av en genetisk konstruert celle som uttrykker FSH, og rensing av et protein. Proteinet blir så formulert med en farmasøytisk akseptabel bærer for å oppnå en farmasøytisk sammensetning.

Ved kultivering av celler tidligere, ble kulturmediumet som ble anvendt tilsatt serum, som fungerte som en universal næringskilde for veksten og opprettholdelse av alle mammalske cellelinjer. Ankomsten av BSW (bovin spongiform encefalopati), en overførbar neurodegenerativ sykdom hos kveg med en lang latent eller inkuberingsperiode, har reist regulatoriske bekymringer vedrørende anvendelsen av animalsk avledet serum i fremstilling av biologiske aktive produkter. Følgelig er det foretrukket å produsere rekombinante proteiner ved bruk av serumfritt medium. Slike medium er vel kjent innen teknikken og kommersialisert av en rekke selskaper slik som f.eks. Sigma, BioWhittaker, Gibco BRL. Cambrex og JRH.

Et av problemene man møter ved lagring av rFSH er tilstedeværelse av oksiderte former av FSH. For delvis løse dette problemet kan antioksidant bli tilsatt den farmasøytiske sammensetningen for å stabilisere FSH proteinet under lagring før administrering til pasienten som har behov for behandling. For eksempel beskriver EP 0853 945 (Skrabanja og Van den Oetelaar, 1998) væske gonadotropin-inneholdende formuleringer i blanding med en stabilisator, slik som f.eks. natriumsitrat ved 25-100 mM og L-metionin ved 1-10 mM. Det er vist at slike formuleringer tillater av FSH formulering i lengre tidsperioder. WO 92/15614 (Tanruri H., 1992) vedrører også en fremgangsmåte for å inhibere oksidering av et polypeptid i en væske eller semivæske farmasøytisk sammensetning slik som f.eks. et lagringsmedium eller en vandig øyeløsning. Spesifikt viser WO 92/15614 at en øyeløsning eller en salve som omfatter L-metionin i en konsentrasjon på 10 mg/l stabiliserer human epidermal vekstfaktor. Ovennevnte dokumenter beskriver kun bruken av en antioksidant i en farmasøytisk formulering og ikke i et kulturmedium.

Aminosyrer og forbindelser som innehar antioksidant aktivitet kan også bli tilsatt til kulturmediet, enten som næringsstoffer, eller for å beskytte cellelinjer mot celledød. For eksempel beskriver US patent nr. 4,560,655 serumfritt medium som omfatter omtrent 30 mg/l av L-metionin, hvor nevnte medium blir anvendt for kultivering av svinetestikkel celler, AG14 myeloma celler og murine miltceller. WO 95/12664 viser en fremgangsmåte hvor bakdelen grunnet en utilstrekkelig mengde av ulike vektbegrensende faktorer, hvor en av dem er L-metionin aminosyre, kan bli overvunnet for en spesiell cellelinje, Spesifikt viser WO 95/12664 en fremgangsmåte for å tilpasse CGO E5F3G cellelinjen som uttrykker human M-CSF for å vokse ved økt celletetthet. I denne fremgangsmåten blir CHO E5F3G cellene dyrket i et medium som omfatter 104 mg/l av L-metionin (se eksemplet og tabell 2). Yun et al. viser at tilsats av en kombinasjon av glutation og av jernchelatorer til kulturmediumet redusere celledød av CHO celler (Yun et al., 2003). Saito et al., viser ytterligere at ulike antioksidanter kan bli anvendt i et kulturmedium for å beskytte en cellelinje mot celledød. (Saito et al., 2003). WO 95/12664, US patent nr. 4,560,655, Yun et al., og Saito et al. nevner ingen ting om den potensielle effekt (hvis noen) av aminosyrer, glutation og jernchelatorer på oksideringstilstanden av det rekombinante protein som er fremstilt av cellelinjen.

Oppsummert viser disse dokumentene kun anvendelsen av L-metionin eller av glutation kombinert med jernchelatorer for bedre vekst og/eller overlevelse av de kultiverte celler.

WO 99/50390 vedrører et kulturmedium for fremstilling av interferon-D fra leukocytter, hvor nevnte kulturmedium omfatter metionin. Det er vist ved HPLC at kvaliteten av interferon-D proteinet etter rensing er forbedret ved tilsats av metionin til kulturmediumet. Oppfinnerne i WO 99/50390 legger frem en hypotese om at denne forbedringen kan skyldes redusert oksidering av intereferon-D proteinet. WO 99/50390 antyder videre at en for lav mengde av metionin resulterer i en redusert effekt, og at en for høy mengde medfører lavere interferonutbytte. Spesifikt nevner WO/9950390 at et område på omtrent 50 til 100 mg/l er spesielt foretrukket område når det skal fremstilles interferon-D fra leukocytter. I tillegg er det i WO 99/50390 kun undersøkt et medium for produksjon av interferon-D, som er et monomert protein. WO 99/50390 verken foreslår eller nevner et medium for fremstilling av dimeriske hormoner slik som f.eks. FSH som utelukkende blir sekretert ved dimeritering (Matzuk et al., 1988).

Oppsummert vedrører ingen av ovennevnte dokumenter anvendelsen av en antioksidant i et serumfritt kulturmedium for å redusere oksideringen av dimeriske gonadotropiner.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende oppdagelsen at oksiderte former av rFSH kommer til syne i supernatanten av cellekulturen allerede under fremstilling av rFSH. Videre fører fremstilling av rFSH i serumfritt medium til høyere nivå av oksiderte former enn fremstilling av rFSH i seruminneholdende medium. Innen rammen av foreliggende oppfinnelse har det overraskende blitt oppdaget at nivåer av studerte former av rFSH kan bli redusert ikke kun under lagring, men også under kultiveringstrinnet. Denne reduksjonen er oppnådd uten å forstyrre produktiviteten. Reduksjonen er utført ved et tilsats av en antioksidant til kulturmediumet. Spesifikt har det blitt oppdaget at tilførsel til et serumfritt medium med enten (i) 2-merkaptoetanol, (ii) en kombinasjon av askorbinsyre og (+) alfa-tokoferol, (iii) L-metionin, eller (iv) L-glutation under kultivering av celler som uttrykker rFSH reduserer nivået av oksiderte former av rFSH.

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et serumfritt kulturmedium for å redusere nivåene av oksiderte former av et rekombinant dimerisk gonadotropin under dets fremstillingsprosess,

der nevnte kulturmedium omfatter en antioksidant valgt fra gruppen bestående av:

- L-glutation med en konsentrasjon i området fra omtrent 1 til omtrent 20 mg/l; - 2-merkaptoetanol med en konsentrasjon i området fra omtrent 5 til omtrent 15 mg/l;

- L-metionin med en konsentrasjon i området fra omtrent 200 til omtrent 400 mg/l; og

- en kombinasjon av askorbinsyre med en konsentrasjon i området fra omtrent 10 til omtrent 50 mg/l og av (+)-alfa-tokoferol med en konsentrasjon i området på omtrent 5 til omtrent 25 mg/l.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å redusere nivået av oksiderte former av en rekombinant dimer gonadotropin under dets fremstillingsprosess, karakterisert ved at cellen som uttrykker nevnte rekombinante dimere gonadotropin blir kultivert i et serumfritt kulturmedium som omfatter en antioksidant.

Videre beskrives et serumfritt kulturmedium for fremstilling av en rekombinant dimer gonadotropiner karakterisert ved at nevnte kulturmedium omfatter en antioksidant valgt fra gruppen bestående av:

- L-metionin ved en konsentrasjon i området fra omtrent 200 til omtrent 500 mg/l;

og

- en kombinasjon av askorbinsyre ved en konsentrasjon i området fra omtrent 10 til omtrent 50 mg/l og (+) alfa-tokoferol ved en konsentrasjon i området fra omtrent 5 til omtrent 25 mg/l.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tar utgangspunkt i oppdagelsen av at nivåer av oksiderte former av rFSH kan bli signifikant redusert ved kultivering av celler som uttrykker rFSH i et serumfritt medium som omfatter antioksidanter. Som vist i eksempel 3, enten (i) 2-merkaptoetanol, (ii) en kombinasjon av askorbinsyre og av (+) alfa-tokoferol, (iii) L-metionin eller (iv) L-glutation spesielt fordelaktig for å redusere nivåer av oksiderte former av rFSH under kultiveringsprosessen. Av stor betydning kan denne reduksjonen bli oppnådd uten svekking av overlevelse og metabolismen til cellen og uten svekking av rFSH titere.

Derfor er et første aspekt av foreliggende oppfinnelse rettet på anvendelse av et serumfritt kulturmedium for å redusere nivåene av oksiderte former av av rekombinant dimer gonadotropin under dets fremstillingsprosess ved at nevnte kulturmedium omfatter en antioksidant valgt fra gruppen bestående av:

- L-metionin ved en konsentrasjon i området fra omtrent 200 til omtrent 400 mg/l;

og

Serumfrie kulturmedium der L-glutation er ved en konsentrasjon i området fra omtrent 1, 1,5, 2 til omtrent, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 eller 20 mg/l er beskrevet.

Mest foretrukket omfatter det serumfrie kulturmedium L-glutation i en konsentrasjon på omtrent 2,5 eller 3 mg/l. Som anvendt heri er glutation anvendt om hverandre med L-glutation.

Det er videre beskrevet at det serumfrie mediumet omfatter 2-merkaptoetanol ved en konsentrasjon i området ved omtrent 5, 6, 7, 8, 9 til omtrent 11, 12, 13, 14 eller 15 mg/l.

Mest foretrukket i følge foreliggende oppfinnelse omfatter det serumfrie kulturmediumet 2-merkaptoetanol ved en konsentrasjon på omtrent 10 ml/l.

Foretrukket omfatter det seriumfrie kulturmediumet i samsvar med den foreliggende oppfinnelse en kombinasjon av askorbinsyre med en konsentrasjon i området på fra omtrent 10 til omtrent 50 mg/l og av (+) alfa-tokoferol ved en konsentrasjon i området fra omtrent 5 til omtrent 25 mg/l.

Det er beskrevet et slikt medium der (+)- alfa-tokoferol er i en konsentrasjon i området fra omtrent, 5, 8, 10 eller 12 til omtrent 16, 18, 20, 22 eller 25 mg/l, og askorbinsyre ved en konsentrasjon i området fra omkring 15, 20 eller 25 til omtrent 35, 40 eller 45 mg/l.

Mest foretrukket i følge foreliggende oppfinnelse omfatter slike serumfrie kulturmedium (+) alfatokoferol ved en konsentrasjon på omtrent 14 mg/l og askorbinsyre ved en konsentrasjon på omtrent 30 mg/l. Som anvendt heri, blir ”(+)-alfatokoferol” anvendt om hverandre med ”vitamin A” og ”askorbinsyre”, er anvendt om hverandre med ”L-askorbinsyre”.

Foretrukket omfatter det serumfrie kulturmedium i samsvar med foreliggende oppfinnelse L-metionin med en konsentrasjon i området fra omtrent 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 eller 245 ml/l til omtrent 300, 325, 375, eller 400mg/l.

Mest foretrukket omfatter det serumfrie kulturmedium L-metionin ved en konsentrasjon på omtrent 250 mg/l. Som anvendt heri er ”metionin” anvendt hverandre med ”L-metionin”.

Ethvert serumfritt kulturmedium kan bli tilført antioksidanter i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Kommersielt tilgjengelig serumfrie medium som kan bli anvendt i samsvar med foreliggende oppfinnelse inkluderer, f.eks. SFM 90 (JRH,67350), SFM 90.1 (JHR, 67350), Supermed 300 eller Supermed300 modifisert (JRH, 67350), DMEM (Gibco, 7490571), DMEM/F12 (Gibco, 99.5043), SFM CHO 3a (BioWhittaker), CHO PFM (Sigma, C6970), ProCHO 5, EX-Cell medium slik som EX-CELL 302 (JHR, katalog nr. 14312-1000M) eller EX-CELL 325 (JHR, katalog nr. 14335-1000M), CHO-CD3 (Sigma, katalog nr. C-1490), CHO III PFM (Gibco, katalog nr. 96-0334SA), CHO-S-SFM II (Gibco, katalog nr. 12052-098), CHO-DHFR (Sigma, katalog nr. C-8862), ProCHO 5 (Cambrex, katalog nr. BE12-766Q), SFM4CHO (HyClone, katalog nr. SH30549.01), Ultra CHO (Cambrex, katalog nr. 12-724Q), HyQ PF CHO (HyClone, katalog nr. SH30220.01), HyQ SFX CHO (HyClone, katalog nr. SH30187.02), HyQ CDM4CHO (HyClone, katalog nr. SH30558.01), IS-CHO-CD (Irvine Scientific, katalog nr. #91119), IS CHO-V (Irvine Scientific, katalog nr. #9197) og derivater derav. Sammensetningen av SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F23m SFM CHO 3<a>og CHP PFM som kan bli anvendt i samsvar med foreliggende oppfinnelse er vist i tabell 1 nedenfor.

Tabell 1: Sammensetning av fem kommersielt tilgjengelig serumfri kulturmedium som kan bli anvendt innen rammen av foreliggende oppfinnelse

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er det serumfrie kulturmedium et kjemisk definert medium, dvs. et medium fremstilt fra rensede ingredienser og derfor hvor eksakt sammensetningen er kjent. Spesifikt inneholder kjemisk definerte medium verken animalsk avledede komponenter eller ikke-definerte hydrolysater.

Gonadotropiner som kan bli fremstilt i samsvar med foreliggende oppfinnelse inkluderer luteiniserende hormon (LH; OMIM aksesjonsnr. 152780), follikelstimulerende hormon (FSH; OMIM aksjesjonsnr. 136530), chorion gonadotraopin (CG; OMIM aksesjonsnr. 118860) og tyroidstimulerende hormon )TSH: OMIM aksesjonsnr. 188549). Gonadotropinene er dimere hormoner. Hver av disse hormoner består av en ikke-kovalent dimer av alfa og beta subenheter. Alfasubenheten er den samme for alle 4 hormoner (OMIM aksjesjonsnr. 118850), og betasubenhetene definerer den endokrine funksjon av dimeren (Talmadge et al., 1983).

En spesielt foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er gonadotropinet humant FSH. Som anvendt heri vedrører ”FSH” et dimerisk protein som omfatter en alfasubenhet som tilsvarer SwissProt aksesjonsnr. P01215 og en betasubenhet som tilsvarer SwissProt aksesjonsnr. P01225. Idet FSH er et løselig sekretert protein blir det frigjort inn i cellekultur supernatanten enten ved hjelp av dets naturlige signalpeptid eller ved hjelp av et heterologt signalpeptid, dvs. et signalpeptid avledet fra et annet sekretert protein som kan være mer effektivt i det spesielle ekspresjonssystemet som blir anvendt.

Termen FSH inkluderer videre spleisevarianter, alleliske varianter, muteiner, funksjonelle derivater, aktive fraksjoner, fuserte proteiner og sirkulærpermuterte proteiner av et dimerisk protein som omfatter en alfasubenhet som tilsvarer SwissProt aksesjonsnr. P01215 og en betasubenhet som tilsvarer SwissProt aksesjonsnr. P01225.

Som anvendt her viser termen ”mutein” til analoger av FSH hvor en eller flere av aminosyreresten av et naturlig FSH eller viralt FSH er byttet ut med en forskjellige aminosyrerest, eller er slettet, eller en eller flere aminosyrerester er skutt i den naturlige sekvensen av FSH, uten og vesentlig endre aktiviteten av det resulterende produkt som sammenliknet med villtype FSH. Disse muteiner er fremstilt ved kjente synteser og/eller ved seterettet mutageneseteknikker, eller enhver annen kjent teknikk egnet derfor.

Muteiner i samsvar med foreliggende oppfinnelse inkluderer proteiner som kodes for av nukleinsyrer, slik som DNA eller RNA, som hybridiserer til DNA eller RNA, som koder et FSH under strigente betingelser. Termen ”stringente betingelser” viser til hybridisering og etterfølgende vaskebetingelser hvor de kjent innen teknikken som konvensjonelt viser til ”stringent” (se f.eks. Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§ 6.3 og 6.4, 1987, 1992). Uten begrensning inkluderer eksempler på stringente betingelser vaskebetingelser 12-20<o>C under beregnet Tm av hybridet som studeres i f.eks. 2 x SSC og 0,5% SDS i 5 min., 2 x SSC og 0,1 SDS i 15 min.; 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 37<o>C i 30-60 min., g så en 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 68<o>C i 30-60 min. De som er kjent innen teknikken vil forstå at stringensbetingelsene også er avhengig av lengden av DNA sekvensen, oligonukleotid prober (slik som 10-40 baser) eller blandede oligonuklieotid prober. Hvis blandede prober blir anvendt er det foretrukket å anvende tetrametyl ammonium klorid (TMAC) i stedet for SSC. Se Ausubel, supra.

Det er foretrukket at et FSH mutein har minst 40% identitet med sekvensen av naturlig forekomne FSH. Mer foretrukket har den minst 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% eller mest foretrukket 90%, 95%, 96%, 97%, 98% eller 99% identitet dertil.

Identitet viser et forhold mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser bestemt ved sammenlikning av sekvensene. Generelt viser identitet til en eksakt nukleotid til nukleotid eller aminosyre til aminosyre overenstemmelse mellom henholdsvis de to polynukelotid eller to polypeptidsekvenser, over lengden av sekvensen som blir sammenliknet.

For sekvenser hvor det ikke er en eksakt overenstemmelse kan ”% identitet” bli bestemt. Generelt blir to sekvenser som skal sammenliknes stilt ovenfor hverandre for å gi maksimal korrelasjon mellom frekvensene. Dette kan inkludere å sette inn ”gap” i enten en eller begge sekvenser for å øke graden av likhet. En % identitet kan bli bestemt over hele lengden av hver av sekvensene som skal sammenliknes (såkalt ”global oppstilling”), som er spesielt egnet for sekvenser med samme eller svært lik lengde, eller over kortere definerte lengder (såkalt ”lokal oppstilling”), som er mer egnet for sekvenser med forskjellig lengde. Innen rammen av foreliggende oppfinnelsen viser ”% identitet” til global prosent identitet som har blitt bestemt over hele lengden av hver av sekvensene som sammenliknes.

Kjente dataprogram kan bli anvendt for å bestemme om noen spesiell polypeptid er en prosent identisk til en sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike algoritmer og programmer inkluderer f.eks. TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, og CLUSTALW (Altschul et al., 1990: Altschul et al., 1997; Higgings et al., 1996; Pearso og Lipman, 1988; Thompson et al., 1994). Protein og nukleinsyre sekvens homologier er foretrukket evaluert ved bruk av Basic Local Alignment Search Tool (”BLAST”), som er vel kjent innen teknikken. (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997; karlin og Altschul, 1990).

BLAST programmet identifiserer homologe sekvenser ved å identifisere liknende segmenter som er vist til heri som ”høyscore segmentpar” mellom en spørrende aminosyre eller nukleinsyresekvens og en testsekvens som er foretrukket oppnådd fra en protein eller nukleinsyresekvens database. Høyscore segmentpar er foretrukket identifisert (dvs. oppstilt) ved hjelp av scoringsmatrikser hvor mange slike kjent innen teknikken. Scoringsmatriksen anvendt kan være BLOSUM62 matriks (Gonnet et al., 1992; Henikoff og Henikoff, 1993). PAM eller PAM250 matriser kan også bli anvendt (se f.eks. Schwartz og Dayhoff, eds, (1978). Matriser for å detektere distanseforhold: Atlas av proteinsekcens og struktur, Washington: National Biomedical Research Foundation). BLAST programmene evaluerer statistisk signifikant for alle høyscore segmentpar som er identifisert, og foretrukket velger de segnmenter som tilfredsstiller en brukerspesifisert grenseverdi av signifikans, slik som en brukerspesifisert prosent homologi. Foretrukket blir statistisk signifikans av et høyscore segmentpart evaluert ved bruk av statistisk signifikant formula ifølge Karlin (Karlin og Altschul, 1990). BLAST programmet kan bli anvendt med standard parametere eller med modifiserte parametere gitt av brukeren.

En foretrukket metode for å bestemme beste totalmatch mellom en spørresekvens (en sekvens) og en subjektsekvens, også vist til som en global sekvensoppstilling, kan bli bestemt ved bruk av FASTDB dataprogram basert på algoritmen til Brutlag (Brutlag et al., 1990). I en sekvensoppstilling er både spørre og subjektsekvensen aminosyresekvenser. Resultatet av nevnte globale sekvensoppstilling er i prosentidentitet. Foretrukkede parametere anvendt i en FASTDB aminosyreoppstilling er: matriks=PAM 0, k-guple=2, mismatchstraff=1, sammenføyningsstraff=20, randomiseringsgruppe=25, lengde=0, cutoff score=1, vindustrørrelse=sekvenslengde, gapstraff=5, gapstørrelsestraff=0,05, vindustørrelse=247 eller lengden av subjekt aminosyresekvensen, hvilken som er kortest.

Hvis subjektsekvensen er kortere enn spørresekvensen grunnet N- eller C-terminale delesjoner, ikke grunnet interne delesjoner, må resultatet i prosentidentitet bli manuelt korrigert idet FASTDB programmet ikke tar hensyn til en N- og C-terminale trunkeringer i subjektsekvensen ved kalkulering av globale prosentidentitet. For subjektsekvenser trunkert ved N- og C-terminer, relativt til spørresekvens, er prosentidentitet korrigert ved å beregne antall av rester av spørresekvensen som er N-og C-terminal av subjektsekvens som ikke er matchet/oppstilt med en korresponderende subjektrest, som prosent av totalebaser av spørresekvensen. Om en rest er matchet/oppstilt blir bestemt av resultatene av FASTDB sekvensoppstillingen. Denne prosentverdi blir så trukket fra prosentidentitet, beregnet av det ovennevnte FASTDB program ved bruk av spesifiserte parametere for oppnåelse av en sluttprosent identitetsscore. Denne sluttprosent identitetsscore er det som er anvendt med henblikk på forliggende oppfinnelse. Kun residuer på N- og C-terminal av subjektsekvensen, som ikke er matchet/oppstilt med spørresekvensen, er vurdert med henblikk på manuell justering av prosent identitetsscoren. Kun spørreaminosyrerester på utsiden av det ytterste N- og C-terminale restene av subjektsekvensen.

For eksempel er 90 aminosyrerest subjektsekvens oppstilt med en 100 rest spørresekvens for å bestemme prosentidentitet. Delesjon skjer ved en N-terminal i subjektsekvensen og derfor matcher/oppstiller FASTDB oppstillingen ikke med første residu med en N-terminal. De 10 upar restene representerer 10% av sekvensen (antall residuer med N- og C-terminal som ikke er matchet/total antall av rester i spørresekvensen) slik at 10% er trukket fra prosentidentitetsscore beregnet av FASTDB programmet. Hvis de gjenværende 90 restene matcher perfekt vil sluttprosent identitet bli 90%.

Foretrukkede endringer for muteiner som er beskrevet er hva som er kjent som ”konservative” substitusjoner. Konservative aminosubstitusjoner av FSH kan inkludere synonyme aminosyrer innen gruppe som har tilstrekkelig lik fysiokjemiske egenskaper slik at substitusjon mellom medlemmer innen gruppen vil bibeholde biologisk funksjon av molekylet (Grantham, 1974). Det er klart at innskudd og delesjoner av aminosyrer også kan bli gjort i de ovenfor definerte sekvenser uten å endre deres funksjon, spesielt hvis innskuddene eller delesjonene kun involverer noen få aminosyrer, f.eks. under 30, og foretrukket under 10, og som ikke fjernes eller forflytter aminosyrer som er kritisk for funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinrester. Proteiner og muteiner fremstilt ved slike delesjoner og/eller insersjoner ligger innenfor området av foreliggende oppfinnelse.

Termen ”fusjonerte proteiner” av FSH viser til et polypeptid som omfatter FSH, et mutein eller fragment derav fusjonert med et annet protein som f.eks. har en utvidet oppholdstid i kroppsvæske. FSH kan for eksempel bli fusjonert til et immunoglobulin eller fragment derav slik som et immunoglobulin Fc del. Sekvensen av en moden FSH kan også bli fusjonert til et signalpeptid og/eller til en ledersekvens som tillater forbedret sekresjon.

En foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er FSH betasubenhetene eller et fragment derav fusjonert til karboksylterminal peptid (CTP) av hCG betasubenhet. Det resulterende protein har identisk in vitro reseptorbindig og biologiske aktiviteter som FSH, men en økt sirkulatorisk halveringstid (LaPolt et al., 1992).

Som ”aktiv fraksjon” av FSH eller mutein derav dekker foreliggende oppfinnelse ethvert fragment eller forløper av et polypeptid i kjeden av et proteinmolekyl alene eller sammen med assosierte molekyler eller rester koblet dertil, f.eks. sukker eller fosfatrester, eller aggregater av et proteinmolekyl eller sukkerrester i seg selv, forutsatt at nevnte fraksjon har hovedsakelig lik aktivitet som FSH.

”Funksjonelle derivater” av FSH som anvendt heri dekker derivater av FSH eller et mutein derav som kan bli fremstilt fra funksjonelle grupper som forekommer som sidekjeder på restene eller N- eller C-terminale grupper, ved hjelpemidler kjent innen teknikken, og er inkludert i oppfinnelsen så fremt de forblir farmasøytisk akseptable, dvs. at de ikke ødelegger aktiviteten til proteinet som er hovedsakelig lik aktiviteten til gonadotropinet, og som ikke gir toksiske egenskaper i sammensetninger inneholdende det. Disse derivater kan for eksempel inkludere polyetylen glykol sidekjeder som kan maskere antigene seter og utvide oppholdstiden av FSH i kroppsvæsker. Andre derivater inkluderer alifatiske estere av karboksylgrupper, amider av karboksylgrupper med reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-asylderivater av frie aminogrupper av aminosyrerestene dannet med asylenheter (f.eks. alkanoyl eller karboksykliske aroylgrupper) eller O-asylderivater av frie hydroksylgrupper (f.eks. det fra seryl eller treonylrester) formet med asylenheter. I en foretrukket utførelsesform tilsvarende de funksjonelle derivater til et FSH molekyl som oppviser tilleggsglykosilering.

Termen ”salter” av FSH heri viser til både til salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av aminogrupper av FSH. Salter av en karboksylgruppe kan bli dannet ved midler kjent innen teknikken og inkluderer uorganiske salter, for eksempel, natrium, kalsium, ammonium, jern eller sinksalter og lignende og salter med organiske baser som de dannet for eksempel med aminer, slik som trietanolamin, arginin eller lysin, piperdin, procain og lignende. Syreaddisjonssalter inkluderer for eksempel salt med mineralsyre, slik som for eksempel saltsyre eller svovelsyre og salter med organiske syrer slik som for eksempel eddiksyre eller oksalsyre. Ethvert slikt salt må selvfølgelig bibeholde biologisk aktivitet av gonadotropin.

Som anvendt heri viser termen ”rekombinant dimert gonadotropin” til et gonadotropin som har blitt fremstilt ved kultivering av en genetisk konstruert celle. Gonadotropinet kan bli fremstilt i en celle av enhver opprinnelse. Den genetiske konstruerte celle som uttrykker en dimerisk gonadotropin uttrykte begge subenheter av nevnte dimere gonadotropin.

Som anvendt heri viser termen ”genetisk konstruert celle” til en celle hvor eksogent DNA har blitt introdusert på en slik måte at det tillates ekspresjon av begge subenheter av det ønskede gonadotropin. Det eksogene DNA kan omfatte en sekvens som koder for subenhetene av det ønskede gonadotropin. Alternativt kan det eksogene DNA omfatte en sekvens som aktiverer ekspresjon av det endogene sekvens som koder for subenheten av det ønske gonadotropin (se f.eks. WO 91/09955).

Cellene kan f.eks. være av animalsk, insekt eller mikrobiell opprinnelse. Som anvendt heri inkluderer termen ”dyrecelle” humane og ikke-humane mammalske celler, ikkemammalske celler og hybridomaceller. Eksempler på mammalske celler hvor rekombinante dimer gonadotropin kan bli fremstilt inkluderer f.eks. 3T3 celler, COS celler, human osteosarkoma celler, MRC-5 celler, BHK celler, VERO celler, CHO celler, rCHO-tPA celler, rCHO-Hep B overflate antigen celler, HEK 293 celler, rHEK 293 celler, rC127-Hep B overflate antigen celler, normal human fibroplast celler, Stroma celler, Hepatocytt celler, PER.C6 celler og humant permanent amniocytte celler. Eksempler på hybridomaceller hvor rekombinant dimer gonadotropin kan fremstilt inkluderer f.eks. DA4.4 celler, 123A celler, 127A celler, GAMME celler og 67-9-B celler.

Innen rammen av foreliggende oppfinnelse er det foretrukket å kultivere en kinesisk hamster ovariecelle (CHO celle).

Det er beskrevet en fremgangsmåte for å redusere nivået av oksiderte former av et rekombinant dimerisk gonadotropin under dets fremstillingsprosess, karakterisert ved at cellene som uttrykker nevnte rekombinante dimer gonadotropin blir kultivert i et serumfritt kulturmedium som omfatter en antioksidant.

Som anvendt heri viser termen ”oksiderte former” til et polypeptid hvor en oksidant har medført oksidering av en eller flere aminosyrerester. Slike former kan bli detektert f.eks. ved HPLC som beskrevet i eksempel 2.1 for FSH.

Kultiveringen kan bli utført i ethvert egnet miljø, slik som petriskåler, T-flasker eller rulleflasker, men foretrukket i brønner som har større volum slik som f.eks. en bioreaktor:

Kultiveringstrinnet omfatter følgende trinn:

- inokulering av nevnte celler i nevnte serumfrie kulturmedium;

- vekstfast; og

- produksjonsfase.

Vekstfasen er den delen av cellekulturprosessen hvor prosessparameteret blir satt for å støtte cellevekst. Når den ønskede celletetthet har blitt nådd er cellekulturen normalt skiftet i produksjonsfase hvor prosessparameterne blir satt for å støtte celleproduktivitet. Prosessparameterne kan være like under vekst og produksjonsfasen. Under produksjonsfasen har cellekonsentrasjonen foretrukket en verdi som ligger innefor området 1·10<6>til 5·10<7>celler/ml, f.eks. på omtrent 1·10<6>, 5·10<6>, 10<7>eller 5·10<7>celler/ml, mest foretrukket er nevnte celle en CHO celle.

I en utførelsesform blir antioksidanten tilsatt det serumfrie kulturmedium før inokulering av cellene. I en annen utførelsesform blir antioksidanten tilsatt til det serumfrie kulturmedium kort tid etter inokulering av cellene (f.eks. ikke mer enn 24 timer etter inokulering).

Foretrukket omfatter fremstillingsprosessen beskrevet her trinnene med å innsamle mediumet som omfatter det rekombinante dimere gonadotropin.

Det beskrives videre at fremstillingsprosessen omfatter videre rensing av det rekombinante dimere gonadotropin. Metode for å rense gonadotropiner er vel kjent innen teknikken. FSH kan for eksempel bli renset som beskrevet i EP 04105 639.1, WO 98/20039, WO 00/63248, WO 88/10270.

Fremstillingsprosessen beskriver videre formulering av den rekombinante dimere gonadotropin med en farmasøytisk akseptabel bærer for å oppnå en farmasøytisk sammensetning.

Termen ”farmasøytisk akseptabel bærer” som anvendt heri er ment å omfavne enhver bærer som ikke interfererer med effektiviteten av biologisk aktivitet av den aktive ingrediens og som ikke toksisk for verten som blir administrert dette. For eksempel, for parenteral administrering, kan aktive protein(er) være formulert i en enhetdoseform for injeksjon i bærerne slik som salin, dekstrose, løsning, serum albumin og Ringer’s løsning.

Den farmasøytiske sammensetningen formulert som beskrives kan så bli administrert til et individ på en rekke forskjellige måter. Administreringsmåter inkluderer intradermal, transdermal (f.eks. i sakte frigivelsesformuleringer), intramuskulært, intraperitonealt, intravenøs, subkutan, oral, intrakranial, epidural, topikal, rektal, og intranasale ruter. Enhver annen terapeutisk effektiv rute for administrering kan bli anvendt, for eksempel adsorpsjon gjennom epitel- eller endotelvev eller ved genterapi hvori et DNA molekyl som koder for det aktive middel blir administrert til pasienten (f.eks. via en vektor), som medfører at det aktive middel blir uttrykt og sekretert in vivo. I tillegg kan proteinet blir administrert sammen med andre komponenter av biologisk aktive midler slik som farmasøytisk akseptable surfaktanter, eksipienter, bærer, diluenter og vehikler. For parenteral (f.eks. intravenøs, subkutan, intramuskulær) administrering, kan det aktive protein bli formulert som en løsning, suspensjon, emulsjon eller lyofilisert pulver i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel parenteral vehikkel (f.eks. vann, salin, dekstroseløsning) og additiver som opprettholder isotonisitet (f.eks. mannitol) eller kjemisk stabilitet (f.eks. oreservatorer og buffere). Formuleringen blir sterilisert ved allment anvendte teknikker.

Fremgangsmåten som er beskrevet for å redusere nivåer av oksiderte former av et rekombinant dimert gonadotropin under dets fremstillingsprosess karakterisert ved at minst to, tre, fire, fem eller seks trinn av nevnte fremstillingsprosess, blir utført under tilstedeværelse av en antioksidant. Foretrukket blir alle trinn i nevnte fremstillingsprosess utført i tilstedeværelse av en antioksidant, dvs. at hele fremstillingsprosessen er utført ved tilstedeværelse av en antioksidant.

For eksempel kan fremgangsmåten for å redusere nivåer av oksiderte former av et rekombinant dimert gonadotropin under det fremstillingsprosess omfatte trinnene med å:

- kultivere celler som uttrykker nevnte rekombinante dimere gonadotropin i serumfritt kulturmedium som omfatter en antioksidant;

- innsamling av mediumet som omfatter nevnte rekombinante dimere gonadotropin; og

- rensing av nevnte rekombinante dimere gonadotropin ved tilstedeværelse av en antioksidant.

Foretrukket omfatter fremgangsmåten for å redusere nivået av oksiderte former av det rekombinant dimerte gonadotropin under dets fremstillingsprosess videre trinnet med å formulere nevnte rekombinante dimere gonadotropin i en farmasøytisk sammensetning som omfatter en antioksidant.

Antioksidanten kan være den samme i samtlige trinn i fremstillingsprosessen hvor en antioksidant er anvendt. Alternativt kan forskjellige antioksidanter bli anvendt ved kultiveringstrinnet, rensetrinnet og/eller formuleringstrinnet. En rekke forbindelser som har en antioksidant effekt er kjent innen teknikken. Disse forbindelser inkluderer f.eks. cystein, askorbinsyrem L-metionin, L-glutation, 2-merkaptoetanol, alfa-tokoferol og derivater derav, BO-653, t-butyl-4-metoksy-fenol, 2,6-bis(1,1-dimetylety)-4-metyl fenol; kalium eller natrium bimeta-bisulfitt, natrium bisulfitt, histidin, taurin, glysin, alanin, carnosin, anserin og 1-metylhistidin.

Det beskrives videre et serumfritt kulturmedium for fremstilling av rekombinante dimere gonadotropiner som er karakterisert ved at nevnte kulturmedium omfatter en antioksidant valgt fra gruppen bestående av:

- L-glutation ved en konsentrasjon i området fra omtrent 1 til omtrent 20 mg/l; - 2-merkaptoetanol ved en konsentrasjon i området fra omtrent 5 til omtrent 5 mg/l

og

- en kombinasjon av askorbinsyre og en konsentrasjon i området fra omtrent 10 til omtrent 50 mg/l og av (+) alfa-tokoferol i en konsentrasjon i området fra omtrent 5 til omtrent 25 mg/l.

Serumfrie kulturmedium omfatter normalt vann, en osmolaritet regulator, en buffer, en energikilde, aminosyrer, en uorganisk eller rekombinant jernkilde, en rekombinant eller syntetisk vekstfaktor, alternativt ikke-jernmetall ioner, vitaminer og kofaktorer. For eksempel kan hvilket som helst av de kommersielt tilgjengelige serumfrie medium listet ovenfor bli modifisert i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Nå som oppfinnelsen er beskrevet fullt ut vil det være åpenbart for fagmannen at samme kan bli utført innen et bredt område av ekvivalente parametere, konsentrasjoner og betingelser uten å avvike fra ånden og omfanget av oppfinnelsen og uten unødig eksperimentering.

Referanse til kjente metodetrinn, konvensjonelle metodetrinn, kjente metoder eller konvensjonelle metoder er på ingen måte en innrømmelse av at hvilket som helst aspekt, beskrivelse eller utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er beskrevet påtenkt eller foreslått innen teknikken.

Den tidligere beskrivelse av spesifikke utførelsesformer vil fullt ut belyse den generelle egenskapen til oppfinnelsen slik at andre kan ved å anvende fagmessig kunnskap (inkludert innholdet av referansene sitert heri) lett modifisere og/eller tilpasse for ulike anvendelser av slike spesifikke utførelsesformer, uten unødig eksperimentering, uten å avvike fra det generelle konseptet av foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1: Cellekulturprosess

1.1 Cellelinjer og medium:

Alle eksperimenter ble utført med en CHO cellelinje som uttrykker begge subenheter av human FSH. Det fremstilte protein er et dimert gonadotropin som videre er vist til som rFSH. Alfasubenheten tilsvarer SwissProt aksesjonsnr. P01215 og betasubenheten tilsvarer SwissProt aksesjonsnr. P01225.

Mediumet anvendt for cellekultivering var et basisk serumfritt medium (SFM) utformet for kultivering av CHO celler. SFM mediumet ble supplementert med antioksidant som skal testes som detaljer beskrevet i eksempel 3. Den initielle konsentrasjon av antioksidant som skal testes i basisk SFM er vist i tabell 1.

Tabell 1: Initiale konsentras oner av antioksidanter i basisk serumfritt medium

1.2 Inokulering, vekst og produksjonsbetingelser

Kultiveringsprosessen, også vist til som ”kjøre”, omfatter et inokuleringstrinn, en vekstfase og en produksjonsfase. Fem ulike kjøringer, vist til som kjøring 1, 2, 3, 4 og 5 ble utført.

Minst 2,4·10<9>levedyktige rFSH produserende celler ble overført til en 15 l bioreaktor med et effektivt arbeidsvolum på 11 l (nyMBR, Zürich) som omfatter mikrobærere. Rett etter utsåing fulgte en batch fase som varte i to eller tre dager. Bioreaktoren ble så kontinuerlig tilført SFM til en fortynningsrate på 1 dag<-1>og til en pefusjonsrate ved 11 L-dag<-1>.

Vekstfase og produksjonsfase ble utført med samme pH og temperatur (37<o>C. pH = 7). Det oppløste oksygen (DO) ble opprettholdt ved 50% luftmetning under hele kjøringen.

EKSEMPEL 2: Analytiske metoder

2.1 Bestemmelse av oksiderte former av rFSH

Oksiderte former ble bestemt ved RP-HPLC på et råinnhøstningsprodukt som beskrevet av Bassett og Driebergen (Bassett og Driebergetn, 2005).

Prosentandelen av oksiderte former ble normalisert ved bruk av prosentandel av oksiderte former oppnådd med L-cystein ved 280 mg/l i kjøring 2 som en referanse (dvs. prosentandel av oksiderte former ble delt med 23,4%).

2.2 Måling av total levedyktig cellekonsentrasjon

Total levedyktig cellekonsentrasjon er definert som summen av konsentrasjoner av celler som er festet på mikrobærere og konsentrasjonen av levedyktige celler i suspensjon. Konsentrasjoner av celler festet på mikrobærere ble bestemt ved bruk av krystallfiolett kjernetellingmetode (Fluka 61135) Konsentrasjonen av levedyktige celler i suspensjon ble bestemt ved bruk av Trypan blå eksklusjonsmetode (Sigma T-8154).

Total levedyktig celleratio (TVC ratio) ble beregnet som følger: [total levedyktig cellekonsentrasjon, slutt av test] / [total levedyktig cellekonsentrasjon, start av test] hvor start av test er definert som dagen hvor ny antioksidant blir introdusert i kulturen, og slutten av test er definert som dagen før neste antioksidant blir introdusert i kulturen.

2.2 Måling av rFSH titere

rFSH titere ble målt ved en immunofluorimetrisk assay, ved bruk av delfia hFSH kit fra Wallac-ADL (katalog nr. A017-201).

2.3 Måling av glukoseforbruksrate (GCR)

Glukoseforbruksrate (GCR) uttrykt i gram per liter og per dag ble beregnet som følger: GCR = (G0– Gt) Dt+ (Gt-1– Gt)

G står for ”glukosekonsentrasjon” og D står for ”fortynningsrate”. Indeksene viser til følgende:

- 0: tilførsel av SFM;

- t: målt ved tid t; og

- t-1: målt ved tid t-1

EKSEMPEL 3: Effekt av ulike antioksidanter

For å redusere nivå av oksiderte former oppnådd med den serumfrie prosess, ble to 15 l kjøringer (kjøring 1 og 2) utført for å teste effekten av ulike antioksidanter. En kjøring uten tilsatt av noe antioksidant ble utført som en kontroll (kjøring 3).

SFM ble supplementert med en rekke antioksidanter eller kombinasjon av antioksidanter for å nå sluttkonsentrasjonen vist i tabell II. Hver antioksidant eller kombinasjon av antioksidanter ble testet i en periode på omtrent 10 dager. Første dag i testen ble volumet av antioksidantløsning som er nødvendig for å nå det fastsatte punkt til satt. Hver dag deretter ble en viss mengde av antioksidant vasket ut fra bioreaktoren med perfusjon og byttet ut med engangs tilsats (for en fortynningsrate på 1 d<-1>, 63,2% av bioreaktorvolumet ble fornyet hver 24. time og dette representerer mengden av anitoksidant som skal byttes ut hver dag. PÅ slutten av testperioden, ble antioksidanten vasket ut fra bioreaktoren ved perfusjon og byttet ut med en annen antioksidant som skulle testes.

Prosentandel av oksiderte former av rFSH ble målt ved slutten av hver test (tabell II). En normalisert verdi lavere enn 1,0 indikerer at den testede antioksidant er mer effektiv enn L-cystein for fjerning av nivåer av rFSH oksiderte former.

Total levedyktig cellekonsentrasjon GCR og rFSH titere ble målt daglig. Tabell II indikerer totalt levedyktig celleration (TVC ratio). En TVC ratio overlegen eller like 1,0 indikerer at den testede antioksidant ikke har noen toksisk effekt på cellene.

Tabell II: Effekt av antioksidanter på de oksiderte former av rFSH

Resultatene vist i tabell II indikerer at 2-merkaptoetanol, en kombinasjon av askorbinsyre og (+)-alfa-tokoferol, L-metionin og L-glutation er de beste antioksidanter for å oppnå lave nivåer av rFSH oksiderte former. En TVC ration total levedyktige celler underlegen 1,0 er oppnådd kun i tilfelle av 2-merkaptoetanol. Derfor er samtlige antioksidanter testet i kjøring 1 & 2 med unntak av 2-merkaptoetanol ikke-toksisk. I tillegg viste måling av GCR og av rFSH titere at ingen av de ulike antioksidanter hadde noen vesentlig påvirkning på metabolisme og produktivitetsmønster (data ikke vist).

L-metionin og L-glutation ble valgt for videre optimalisering av produksjonsprosessen. En kjøring (kjøring 3) ble utført for å teste ulike konsentrasjoner av L-glutation. (fra 1 til 20 mg/l), og en kjøring (kjøring 4) ble utført for å teste ulike konsentrasjoner av L-metionin (fra 0,25 til 3 g/l) og. Kjøring 3, hvor L-glutation ble testet ble stoppet tidlig produksjonsdag 30 idet mikrobærere ble skadet. Testede konsentrasjoner av L-glutation eller L-metionin under kjøring 3 og 4 er vist i tabell III. Arbeidsdag null (WD0) er definert som dagen hvor bioreaktoren blir utsådd. Produksjonsdag null (PD0) er definert som dagen hvor cellekulturprosessen er skiftet fra vektfase til produksjonsfase. I tillegg ble en kjøring utført uten å variere antioksidantkonsentrasjon. I denne kjøringen ble L metionin tilsatt ved 250 mg/l fra starten av (kjøring 5), For samtlige kjøringer ble prosentandel av oksiderte former av rFSH målt jevnlig (tabell IV).

Tabell III: Konsentras on av antioksidant i k ørin 3 o 4

Tabell IV: Effekt av antioksidanter på de oksiderte former av rFSR

Analysene av oksiderte rFSH former når antioksidant ble tilsatt til kulturmediet viste at L-metionin er en god anitoksidant. I kjøring 5, hvori cellene ble kultivert under tilstedeværelse av L-metionin ved 250 mg/l, var gjennomsnittlig prosentandel oksiderte former redusert med omtrent 40% sammenliknet med resultatene av oppnådd i kjøring 1 og kjøring 2 med L-cystein som antioksidant (se tabell II & V). L-glutation er en god antioksidant også, spesielt ved en konsentrasjon på omtrent 2,5 mg/l. I kjøring 3 var prosentandel av oksiderte former redusert med omtrent 35% når cellene ble kultivert under tilstedeværelse av L-glutation med 2,5 mg/l, sammenliknet med resultatene oppnådd i kjøring 1 og 2 med L-cystein som antioksidant (se tabell II & IV).

Ved å øke konsentrasjonen av L-metionin ser ut til å ha en reduserende trend på prosentandel av oksidertre former mellom 250 og 2000 mg/l i kjøring 4. Men det ser ut til at forskjellene observert ligger innenfor metoden variabilitet idet sammenliknbare variasjoner ble observert i kjøring 5 testet på en L-metionin konsentrasjon med 250 mg/l for hele kjøringen. I tillegg ble det bekreftet at L-glutation og L-metionin ikke hadde noen vesentlig påvirkning på levedyktighet av cellene, metabolismen og produktivitetsmønsterne i konsentrasjonsområdene som ble testet ut (data ikke vist).

REFERANSER

1. Altschul S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., and Lipman, D.J. (1990).

Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410.

2. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.J. (1997). Gappend BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search program. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.

3. Bassett. R.M. and Driebergen, R. (2005), Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod. Biomed. Online. 10, 169-177.

4. Brutlag, D.L., Dautricourt, J.P., Maulik, S., and Relph J. (1990). Improved sensitivity of biological sequence database searches. Comput. Appl. Biosci. 6, 237-245.

5. Gonnet, G.H., Cohen, M.A., and Benner, S.A. (1992). Exhaustive matching of the entire protein sequence database. Science 256, 1443-1445.

6. Grantham, R. (1974). Amino acid difference formula to help explain protein evolution. Science 185, 862-864.

7. Henikoff, S. and Henikoff, J.G. (1993). Performance evalution of amino acid substitution matrices. Proteins 17, 49-61.

8. Higgins, D.G., Thompson, J.D., and Gibson T.J. (1996). Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol. 266, 383-402.

9. Karling, S. and Altschul, S.F. (1990). Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence feature by using general scoring schemes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87, 2264-2268.

10. LaPolt, P.S., Nishimori, K. Fares, F.A., Perlas, E., Boime, I., and Hsueh, A.J.

(1992). Enchanced stimulation of follicle maturation and ovulatory potential by long acting follicle-stimulating hormone agonists with extended carboxylterminal peptides. Endocrinology 131, 2514-2520.

11. Matzuk, M.M., Kornmeier, C.M., Whitfield, G.K., Kourides, I.A., and Boime. I.

(1988). The glycoprotein alpha-subunit is critical for secretion and stability of the human thyrotropin beta-subunit. Mol. Endocrinol. 2, 95-100.

12. Pearson, W.R. and Lipman, D.J. (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl- Acad. Sci. U.S.A 85, 2444-2448.

13. Saito, Y., Akazawa, T., Takahashi, K., and Nike, E. (2003). Cell death caused by selenium deficiency and protective effect of antioxidants. J. Biol. Chem. 278, 39428-39434.

14. Skrabanja, A. and Van den Oetelaar, P. Liquid gonadotropin containing formulations. EP 0853 945 A1. 22-7-1998.

15. Takruri H. Method for the stabilisation of methionine-containing polypeptides.

WO 92/15614. 17-9-1992.

16. Talmagde, K., Boorstein, W.R., and Fiddes, J.C. (1983). The human genome contains seven genes for the beta-subunit of chorionic gonadotropin but only on gene for the beta-subunit of luteizing hormone. DNA 2, 281-289.

17. Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994). CLUSTAL Q;

improving the sensitivity of progressive multiple sequence through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680.

18. Yun, Z., Takagi, M., and Yoshida, T. (2003). Combined addition of glutathione and iron chelators for decrease of intracellular level of reactive oxygen species and death of Chinese hamster ovary cells. J. Biosi. Bioeng. 95, 124-127.