KR20100123697A

KR20100123697A - Ｆｓｈ의 액체 포뮬레이션

Info

Publication number: KR20100123697A
Application number: KR1020107018371A
Authority: KR
Inventors: 자쉬아 슈톨첸베르거; 에리히 코흘러
Original assignee: 바이오제너릭스 에이지
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2010-11-24
Also published as: HK1149494A1; US20160303202A1; PL2249869T3; DK2249869T3; PT2249869E; EA019530B1; AU2009211331A1; EP2249869A1; CN101970010A; US20160303238A1; RS52106B; ZA201004457B; ME01337B; JP2011514317A; EP2412385A1; HRP20110801T1; BRPI0908887B1; KR101662631B1; US20160303201A1; NZ586588A

Abstract

본 발명은 여포 자극 호르몬 폴리펩티드(follicle stimulating hormone polypeptide), 및 보존제(preservatives)로서 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride) 및 벤질 알코올을 포함하는 액체 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 일 이상의 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 선택적으로 더 포함한다. 일 형태에서, 본 조성물은 항산화제(antioxidant)로서 메티오닌(methionine)을 함유한다. 본 조성물은 우수한 저장 안정성을 나타내며, 여포 자극 호르몬 제제가 유용한 치료약으로 여겨지는 질병 및 의학적 징후의 예방 및 치료에 특히 유용하다.

Description

ＦＳＨ의 액체 포뮬레이션{LIQUID FORMULATION OF FSH}

본 발명은 여포 자극 호르몬 폴리펩티드(follicle stimulating hormone polypeptide), 및 보존제(preservatives)로서 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride) 및 벤질 알코올(benzyl alcohol)을 포함하는 액체 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은 일 이상의 다른 약학적으로 허용가능한 부형제를 선택적으로 더 포함한다. 일 형태에서, 본 조성물은 항산화제(antioxidant)로서 메티오닌(methionine)을 함유한다. 본 조성물은 우수한 저장 안정성을 나타내며, 여포 자극 호르몬 제제가 유용한 치료약으로 여겨지는 질병 및 의학적 징후의 예방 및 치료에 특히 유용하다.

여포 자극 호르몬(Follicle stimulating hormone, FSH)은 하수체 전엽(anterior pituitary)의 생식선자극성세포(gonadotropic cells)로부터 생성되고, 순환계로 방출된다. FSH는 여성의 난모 세포 성숙 및 남성의 정자 생성의 제어에 있어서 황체 형성 호르몬(luteinising hormone, LH)과 함께 작용한다. FSH 및 LH는 개별적인 유전자에 의하여 코딩되는 2개의 비공유적으로 연결된(non-covalently linked) α- 및 β-사슬로 이루어진 헤테로다이머 당단백질(heterodimeric glycoproteins)의 군에 속한다. α- 및 β-사슬은 모두 글리코실화된다(glycosylated). α-서브유닛은 92개 아미노산 잔기로 이루어진 반면에, β-서브유닛은 111개 아미노산 잔기로 이루어지며, 이들 각각은 2개의 잠재적인 아스파라긴-연결 글리코실화 자리(asparagine-linked glycosylation sites)를 갖는다.

인간 FSH는 무배란 여성의 치료, 다난포 발생(과배란)의 자극, 및 IVF, ICSI, GIFT 또는 CIFT과 같은 보조 수정(assisted conception)용 제제에 이용된다. 또한, 인간 FSH는 FSH를 낮게 생성하거나 또는 생성하지 못하는 여성의 여포 성숙을 자극하고, 선천성 또는 후천성 저생식선 자극 호르몬성 성기능저하증을 앓는 남성의 정자생성을 자극하는데 이용된다.

1980년대까지, 인간 FSH의 주요 근원은 가임 여성의 소변으로부터 분리된 소변-유래 FSH이었다. 고순도의 소변-유래 FSH의 더 정제된 형태는 1990년대에 도입되었고, 1998년 이래 마침내 재조합 FSH가 개발되어 광범위하게 이용되었다. 재조합 DNA 기술의 출현으로, α- 및 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열로 트랜스펙트된(transfected) 세포 배양액에서 인간 FSH를 생산할 수 있게 되었다. α- 및 β-사슬을 코딩하는 DNA 서열 및 재조합 FSH의 제조방법은 예를 들어, WO 88/10270, WO 86/04589 및 EP　0　735　139에 개시되었다.

최근, 독일 시장에서 시판되는 2종의 재조합 인간 FSH 제품(products)으로 GONAL-f^® 및 Puregon^®이 있으며, 이들은 모두 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포에서 인간 야생형 α- 및 β-사슬을 코딩하는 DNA 서열의 발현에 의하여 제조된다.

일반적으로, 단백질은 매우 짧은 반감기(half-life)를 갖고, 단백질 활성의 발현에 대하여 불리한 온도, 물, 공기 인터페이스, 고압, 물리적/기계적 스트레스, 유기 용매 및 세균 오염과 같은 다양한 요인에 노출될 때, 모노머의 응집, 다이머의 분해, 및 혈관 표면 상의 흡착과 같은 변성(denaturation)을 겪는다.

결과적으로, 변성된 단백질은 본래의 물리화학적 특성 및 생리학적 활성 효과를 잃는다. 단백질의 변성은 비가역적이므로, 일단 변성되면, 단백질은 그 고유 특성을 처음 상태로 거의 회복할 수 없다.

특히, 인간 FSH와 같은, 2개의 상이한 서브유닛으로 이루어진 헤테로다이머 구조를 갖고, 매회 수백 마이크로그램 미만의 미소량(trace amount)으로 투여되는 단백질은 수용액에서 다이머의 분해 및 혈관 내부 표면 상에서의 단백질 흡착에 기인하는 단백질 손실을 포함하는 상대적으로 높은 단백질 손실과 관련된 문제를 갖고 있다. 분해된 단백질은 그들 자신의 생리학적 활성을 잃고, 분해된 모노머는 응집하기 쉬워진다. 또한, 혈관 내부 표면 상에 흡착된 단백질은 변성 과정을 통하여 응집에 쉽게 취약해진다. 이들이 인간 체내로 투여되는 경우, 이와 같이 변성된 단백질은 체내에서 자연적으로 발생된 단백질에 대하여 항체 형성의 원인으로 작용할 수 있다.

몇몇 단백질 약품은 동결 건조(lyophilisation(freeze-drying))를 통하여 안정성 문제를 극복하였다. 이러한 동결 건조된 제제는 충분한 유통기한을 보증하기에 충분히 안정적이지만, 투여 전에 재구성(reconstitution)이 필요하다는 난점을 갖고 있다. 따라서, 환자들은 사용 전에 필수적으로 건조된 당단백질을 용매(주사용 물과 같은)에서 재구성하여야만 하고, 이는 환자에게 난점이고 불편함이다. 또한, 용매가 FSH의 동결 건조 제제와 함께 공급되어야만 한다. 정기적으로 FSH 주사를 필요로 하는 환자, 예를 들어 배란 유도를 위하여 재조합 인간 FSH의 일일량(daily dose)을 수용하는 환자에 있어서, 생식선 자극 호르몬(gonadotropin) 제제는 다루기 쉽고, 복용하기 쉽고, 주사하기 쉬운 것이 중요하다. 동결 건조된 생식선 자극 호르몬 제제의 재구성은 신중함 및 조심스러움을 요구하고, 가능하면 피해야한다. 이러한 당단백질이 재구성 없이 직접적으로 의약을 주사할 수 있는 환자에게 안정적인 용액으로서 제조되고 분배될 수 있는 경우, 생식선 자극 호르몬의 이용이 용이해진다. 또한, 동결 건조 공정은 비용이 비싸고 시간이 소비되는 공정 단계이고, 생식선 자극 호르몬 제제를 제조할 때 이러한 단계를 피할 수 있으면 유리할 수 있다.

따라서, 타당한 유통 기한을 보장하기 위하여 충분한 안정성을 갖는 사용할 준비가 된(ready-for-use) 주사 제제(injection preparation)에 대한 요구가 존재한다.

이러한 제한에 대처하는 대안적인 수단으로서, 용액 상태에서 단백질에 안정제(stabilizer)를 첨가함으로써 단백질의 안정성이 향상될 수 있다. 유용한 단백질 안정화제의 예로, 공지의 계면활성제, 알부민(albumins)과 같은 단백질, 다당류(polysaccharides), 아미노산, 폴리머, 염 등이 있다. 그러나, 개별적인 단백질의 독특한 물리화학적 특성을 고려하여 가장 적합한 안정화제가 선택 및 이용되어야 한다. 또한, 상이한 안정화제의 조합 이용은 개별적인 안정화제 사이의 경쟁적인 작용 및 유해 반응(adverse reaction)에 기인하여 예측된 효과로 생각되는 유해한 부작용을 야기할 수 있다. 또한, 개별적인 안정화제는 상응하는 단백질의 안정화에 있어서 바람직한 특정 농도 범위를 가지므로, 용액에 존재하는 단백질의 성공적인 안정화는 신중한 주의와 많은 노력을 필요로 한다.

FSH는 바이알(vials), 카르플(carpoules) 또는 앰플(ampoules)에서 단일 용량(single-dose) 및 다용량(multi-dose) 액체 형태로 제제화되었다. 단일 용량 형태는 사용 전 저장시에 안정하고 효능이 강하게 유지되어야 한다. 다용량 포맷형태는 사용 전 저장 시에 안정하고 효능이 강하게 유지되어야 할 뿐 아니라, 앰플의 씰(seal)이 위태롭게 된 후, 다용량 사용 계획 투여 기간에 걸쳐 안정하고, 효능이 강하고, 박테리아가 상대적으로 없게 유지되어야 한다. 이러한 이유로, 다용량 형태는 종종 세균 발육 저지제(bacteriostatic agent)를 함유한다.

인간 재조합 FSH의 사용할 준비가 된 액체 제제인 GONAL-f^®는 주사 펜(injection pen)으로부터 투여되는 주사용 용액으로서 이용가능하다. 용액은 보존제(ROTE LISTE 2007, No. 50 004)로서 m-크레졸을 함유한다. Puregon^®은 보존제 (ROTE LISTE 2007, No. 50 010)로서 벤질 알코올을 함유하는 주사용 사용할 준비가 된 액체 제제로서 이용가능하다.

보존제를 함유하는 FSH 액체 제제는 특허 문헌에 기재되어 있다. 국제공개공보 WO 00/04913A1은 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(alkylparaben), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride), 소듐 디하이드로아세테이트 및 티오메로살(thiomerosal)으로부터 선택된 보존제를 포함하는 FSH 및 FSH 변이체 포뮬레이션을 기재한다. 이러한 보존제 이용이 일반적인 방법으로 언급되어 있으나, 재조합 인간 FSH의 액체 포뮬레이션에서 보존제의 특정 조합 또는 혼합물에 대하여는 개시되어 있지 않다.

또한, 국제공개공보 WO 2004/037607는 글리신(glycine), 메티오닌, 비-이온성 계면활성제 및 안정화제로서 포스페이트를 포함하는 인간 FSH의 수성 포뮬레이션에 관한 것이다. 또한, 이 포뮬레이션은 벤질 알코올, 크레졸, 파라벤 및 그 혼합물과 같은 보존제를 선택적으로 포함할 수 있다.

국제공개공보 WO 2004/087213 A1은 Pluronic^®F77, Pluronic^®F87, Pluronic^®F88 및 Pluronic^®F68로부터 선택되는 계면활성제를 포함하는 FSH의 액체 약학적 조성물을 기재하고 있다. 이 조성물은 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디하이드로아세테이트 및 티오메로살로부터 선택되는 세균 발육 저지제를 포함할 수 있다. 세균 발육 저지제의 혼합물 또는 조합은 언급되어 있지 않다.

따라서, 포뮬레이션이 다중 투여에 적합하도록 보존제를 함유하는 생식선호르몬 포뮬레이션을 제공하는 것이 바람직하지만, 인간 단백질을 함유하는 보존 약학적 제제의 제조는 어려운 것으로 증명되었다. 보존제가 이용된 경우, 보존제는 약학적 제제가 더 오랜 기간 보존되면 안정성 문제를 야기하는 것으로 관찰되었다. 이 과정에서, 인간 단백질은 불활성화되고, 응집체(agglomerates)가 형성되며, 이는 주사된 용액에 대하여 관찰된 비내성(intolerance)의 원인일 수 있다. 활성 성분은 121℃ 오토클레이브에서의 멸균 조건 하에서 비활성화되고, 그 구조가 파괴되므로, 주입 또는 주사 목적을 위한 보존 약학적 포뮬레이션의 일반적 제조 방법은 활성 인간 단백질 성분의 경우에는 이용될 수 없다. 제약에 이용되는 일반적 보존제는 활성 인간 단백질 성분과 반응하고, 이에 의하여 비활성화되는 것으로 알려져 있다. 이용된 보존제의 형태는 내성(tolerance)에 있어서 중요한 역할을 한다. 모든 보존제는 높거나 낮은 알레르기율(allergy rate)을 갖는다. 따라서, 인간 단백질 포뮬레이션 중의 보존제는 우수한 보존이 이루어지고, 어떤 인간 당단백질과 조합된 특정 보존제의 단점이 최소화되도록 선택되는 것이 중요하다.

따라서, 보존제의 존재에 의하여 보존되고, 연장된 시간 주기 동안 인간 재조합 FSH의 활성을 안정적으로 유지할 수 있는 신규한 인간 재조합 FSH의 액체 포뮬레이션의 개발에 대한 시급한 요구가 여전히 존재한다.

본 발명에 따르면, 이러한 및 다른 문제점은 독립항의 특징에 의하여 해결된다.

유리한 형태는 종속항에 정의되어 있다.

활성제(active agent)로서 FSH 또는 그의 변이체(variant), 및 보존제로서 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride) 및 벤질 알코올(benzyl alcohol) 양자를 포함하는 액체 약학적 조성물에 재조합 인간 FSH를 제제화(formulating)하면 조성물의 우수한 안정성을 제공하여, 단일 용량(single-dose) 및 다용량(multiple-dose) 용도로 이용될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 본 발명에 따른 조성물은 연장된 시간 주기 동안 냉각(cooling) 없이, 활성의 현저한 손실 없이, 및 현저한 감성(degradation) 없이 저장될 수 있다. 보존제로서 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올의 조합은 더 우수한 보존성을 제공하고, FSH와의 불리한 상호작용이 최소로 유지되므로, 당호르몬(glycohormone) FSH와 관련하여 특히 유리한 것으로 추정된다.

다르게 표시되지 않으면, 하기 정의는 본 발명을 기술하기 위하여 이용된 다양한 용어의 의미 및 범위를 설명하고 정의하기 위한 것으로 의도된다.

용어 "FSH"는 재조합적으로 제조되든지, 또는 폐경후 여성의 소변과 같은 인간 근원으로부터 분리되든지, 인간 FSH 또는 "hFSH"를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 전장 성숙 단백질(full-length mature protein)로서 여포 자극 호르몬 폴리펩티드(follicle-stimulating hormone polypeptide)를 나타낸다. 인간 당단백질의 단백질 서열 및 인간 FSH β-서브유닛의 단백질 서열은 학술 문헌 및 특허 문헌(예를 들어, WO　2004/087213 참조)으로부터 당업자에게 공지되어 있다.

인간 FSH의 α-사슬의 아미노산 서열은 본 명세서에 첨부된 서열식별번호 1에 나타내어져 있고, 인간 FSH의 β-사슬의 아미노산 서열은 서열식별번호　2에 나타내어져 있다. 이러한 아미노산 서열은 각각 EMBL 데이터베이스에 기탁번호 J 00152, 및 NCBI 데이터베이스에 기탁번호 NM_000510로 기탁된 인간 FSH의 α- 및 β-사슬의 야생형 아미노산 서열에 상응한다.

인간 FSH를 코딩(coding)하는 야생형 핵산서열은 서열식별번호 3(= α-사슬) 및 서열식별번호 4(= β-사슬)에 나타내어져 있다.

재조합 FSH은 인간에게서 자연적으로 발견되는 야생형 핵산 서열에 의하여 코딩될 수 있거나, 또는 그 발현이 야생형 아미노산 서열, 즉 인간에게서 자연적으로 발견되는 야생형 단백질 서열을 갖는 FSH를 야기하는 변형(altered) 핵산 서열에 의하여 코딩될 수 있다.

인간 FSH를 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 이러한 숙주 세포에서 재조합 FSH의 발현 수준(expression level) 및 수율(yield)을 증가시키기 위하여, 인간 FSH의 α- 및 β-사슬을 코딩하는 핵산 서열의 하나 또는 양자 모두가 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포에서의 코돈 선호도(codon usage)에 대하여 조절되도록, 변형될 수 있다.

인간 FSH를 코딩하고, CHO 세포에서의 코돈 선호도에 대하여 변형된 핵산 서열의 예는 국제공개공보 2009/000913에 기재되어 있다. 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 변형(modified) 핵산 서열은 서열식별번호　5에 나타내어진 핵산 서열의 코딩 영역(coding region)이고(서열식별번호 5에서, 코딩 영역은 뉴클레오타이드 56에서 시작하여, 뉴클레오타이드 442까지 연장된다), 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 변형 핵산 서열은 서열식별번호 6에 주어진 핵산 서열의 코딩 영역이다(서열식별번호 6에서, 코딩 영역은 뉴클레오타이드 19에서 시작하여, 뉴클레오타이드 366까지 연장된다). 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 제1 변형 핵산 서열 및 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 제2 변형 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 함유하는 CHO 세포주는 기탁번호 DSM ACC2833로 브라운슈바이그(Braunschweig)의 DSMZ에 2007년 3월 28일 기탁되었다.

바람직한 형태에서, 본 발명에 따른 FSH 액체 포뮬레이션은 인간 FSH의 β-사슬 및 FSH의 α-사슬 양자에 대하여 CHO 세포에서 코돈 선호도에 관하여 변형된 FSH 핵산 서열로부터 재조합 유전자 발현(recombinant gene expression)에 의하여 얻어진 재조합 인간 야생형 FSH를 함유한다. 다른 바람직한 형태에서, 재조합 FSH는 WO　2009/000913에 개시된 FSH 핵산 서열로부터의 발현에 의하여 얻어진다.

용어 "FSH 변이체(FSH variant)"는 아미노산 서열, 글리코실화 패턴(glycosylation pattern) 또는 서브유닛간 연결(inter-subunit linkage)이 인간 FSH와 상이하지만, FSH 활성을 나타내는 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 그 예는 LaPolt et al. (1992) Endocrinology, 131, 2514-2520; 또는 Klein et al. (2003) Human Reprod., 18, 50-56에 기재된, 야생형 α-서브유닛, 및 hCG의 카르복시 말단 펩타이드(carboxy terminal peptide)가 FSH의 β-서브유닛의 C-말단에 융합된(fused) 하이브리드(hybrid) β-서브유닛으로 이루어진, 지속적 작용성(long-acting) 변형 재조합 FSH인 CTP-FSH를 포함한다. 또한, Klein et al. (2002) Fertility & Sterility, 77, 1248-1255에 의하여 기재된 단일 사슬 분자(single-chain molecule)인 단일 사슬(single-chain) CTP-FSH가 포함된다. FSH 변이체의 다른 예는 WO　01/58493에 개시된, α- 및/또는 β-서브유닛에 결합되는 부가적인 글리코실화 자리(glycosylation sites)를 갖는 FSH 분자, 및 WO　98/58957에 개시된, 서브유닛간 S-S 결합을 갖는 FSH 분자를 포함한다. FSH 변이체의 다른 예는 WO　2004/087213에 개시되어 있으며, 이는 β-서브유닛의 카르복시 말단 결여(carboxy terminal deletions)에 의하여 특징지워진다. FSH 변이체의 다른 예는 단백질의 아미노산 서열이 변화하는 것에 의하여 부가적인 글리코실화 자리가 도입되거나, 또는 자연 발생 글리코실화 자리가 없어지는 것에 기인하여, 야생형 FSH에 비하여 변화된 정도(altered degree)의 글리코실화를 갖는 FSH 분자를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 FSH 또는 FSH 변이체는 화학적 부분(chemical moieties)에 의하여 변형된 FSH 분자일 수 있다. 그러한 FSH 컨주게이트(conjugates)는 예를 들어, 폴리 알킬렌 글리콜(poly alkylen glycol)(PEG와 같은), 하이드록시알킬 전분(hydroxyalkyl starch)(HES와 같은) 또는 다른 폴리머 부분(polymeric moieties)을 포함할 수 있다.

FSH 헤테로다이머 또는 FSH 변이체 헤테로다이머는 재조합적으로, 경우에 따라서 천연 근원으로부터 분리 또는 정제에 의하여, 또는 화학적 합성에 의하여, 또는 그 임의의 조합에 의한 것과 같이 임의의 적합한 방법에 의하여 제조될 수 있다.

용어 "재조합(recombinant)"의 이용은 재조합 DNA 기술의 이용을 통하여 제조된 FSH 또는 FSH 변이체의 제제(preparations)를 나타낸다(예를 들어, WO　85/01958 참조). FSH의 게놈(genomic) 또는 cDNA 클론(clones)에 대한 서열은 몇몇 종의 α- 및 β-서브유닛에 대하여 알려져 있다. 재조합 기술을 이용한 재조합 FSH 또는 FSH 변이체의 다양한 제조 방법은 선행기술에 기재되어 있고, 예를 들어, 유럽특허출원 EP　0　711　894 및 유럽특허출원 EP　0　487　512을 참조한다.

본 발명에 따라 이용된 FSH 또는 FSH 변이체는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포와 같은 포유동물 세포로부터의 것을 포함하는 재조합 수단에 의해서 제조될 수 있을뿐 아니라, 소변 근원으로부터의 것과 같은 생물학적 근원으로부터 정제될 수 있다. 수용가능한 방법론은 선행기술에 개시되어 있다.

재조합 인간 FSH는 일 이상의 정제 단계에 의하여 숙주 세포 배양 상청액으로부터 정제될 수 있다. 적합한 정제 방법은 당업자에게 알려져 있고, 이는 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 수산화인회석 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 및 겔 여과(gel filtration)를 포함한다. 재조합 인간 FSH를 정제하는 방법은 예를 들어, WO 00/63248, WO 2006/051070 및 WO 2005/063811에 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 형태에서, FSH 또는 FSH 변이체는 각각 인간 FSH에 상응하거나, 또는 인간 FSH로부터 유래된다. 본 발명의 바람직한 형태에서, FSH 또는 FSH 변이체는 재조합 기술에 의하여 제조되었다.

가장 바람직하게, FSH는 재조합적으로 제조된, 특히 바람직하게는 서열식별번호 3 및 4(= 야생형 핵산 서열), 또는 서열식별번호 5 및 6(=코돈-최적화(codon-optimized) 핵산 서열)의 어느 하나에 의하여 코딩되는, FSH의 인간 당단백질 α-서브유닛 및 β-서브유닛을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터(vector) 또는 벡터들(vectors)로 트랜스펙트된 중국 햄스터 난소 세포에서 제조된 인간 FSH이다. α- 및 β-서브유닛을 코딩하는 DNA는 동일한 또는 상이한 벡터 상에 존재할 수 있다.

재조합 FSH는 그의 소변 대응물(urinary counterpart)에 대하여 몇몇 장점을 갖는다. 재조합 세포를 이용하는 배양 및 분리 기술은 배치(batches) 간에 일관성(consistency)을 가능케한다. 반대로, 소변 FSH는 순도, 글리코실화 패턴, 시알화(sialylation) 및 서브유닛의 산화와 같은 특성에 있어서 배치별로 매우 변화한다. 재조합 FSH의 더 우수한 배치-대-배치 일관성(batch-to-batch consistency) 및 순도에 기인하여, 호르몬은 등전 집중(isoelectric focussing, IEF)과 같은 기술을 이용하여 쉽게 확인 및 정량화될 수 있다. 재조합 FSH가 쉽게 확인 및 정량화됨으로써, 생물검정(bioassay)에 의하여 충진되는 것보다, 많은 호르몬으로 바이알(vials)을 충진하는 것(fill-by-mass)이 가능하다.

용어 "FSH 활성"은 Steelman-Pohley assay (Steelman et al. (1953) Endocrinology 53, 604-616)에서 난소 중량 증가(ovarian weight gain), 또는 여성 환자에서 여포 성장(follicular growth)과 같은 FSH와 관련된 생물학적 반응을 유도하는 FSH 포뮬레이션의 능력을 나타낸다. 여성 환자에서의 여포 성장은 초음파(ultrasound)에 의하여, 예를 들어, 자극 8일째에 약 16 ㎜의 평균 직경을 갖는 여포의 수에 의하여 평가될 수 있다. 생물학적 활성은 FSH에 대한 허용된 표준에 대하여 평가된다.

용어 "수성 희석액(aqueous diluent)"은 물을 함유하는 액체 용매를 나타낸다. 수성 용매 시스템은 물만으로 이루어질 수 있거나, 또는 물에 더하여, 일 이상의 혼화가능한 용매로 이루어질 수 있고, 당(sugars), 완충제(buffers), 염(salts) 또는 부형제(excipients)와 같은 용해된 용질(dissolved solutes)을 함유할 수 있다. 더욱 일반적으로 이용되는 비-수성 용매는 메타올, 에탄올, 프로판올과 같은 단쇄 유기 알코올, 아세톤과 같은 단쇄 케톤, 및 글리세롤과 같은 폴리알코올이다. 본 발명의 바람직한 형태에서, 수성 희석액은 물이고, 즉, 본 발명에 따른 사용할 준비가 된 액체 포뮬레이션은 수성 포뮬레이션이다.

"장성 변형제(tonicity modifying agent)" 또는 "등장제(isotonicity agent)"는 물리적으로 내성이고, 포뮬레이션과 접촉하는 세포막을 통한 물의 실흐름을 방지하기 위하여 적합한 장성을 포뮬레이션에 부여하는 화합물이다. 적합한 등장제는 글리세롤, 아미노산 또는 단백질 (예를 들어, 글리신 또는 알부민), 염(예를 들어, 소듐 클로라이드), 당(예를 들어, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스 및 락토오스) 및 당 알코올(예를 들어, 만니톨 및 소르비톨)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "세균 발육 저지제(bacteriostatic)" 및 "세균 발육 저지제(bacteriostatic agent)" 또는 "보존제(preservative)"는 항박테리아제로서 작용하기 위하여 포뮬레이션에 첨가되는 조성물 또는 물질을 나타낸다. 본 발명의 보존 FSH 또는 FSH 변이체 함유 포뮬레이션은 바람직하게는 인간에서 상업적으로 실행가능한 다용도 제품에 있어서 보존제 유효성(preservative effectiveness)에 대한 법정 또는 허가 기준을 만족하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 포뮬레이션에 이용되는 세균 발육 저지제는 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올의 조합이다. 조성물에, 즉, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올에 더하여, 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤제토늄 클로라이드, 소듐 디하이드로아세테이트 또는 티메로살과 같은 보존제를 포함하는 것도 가능하지만, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올만이 보존제로서 존재하는 것이 바람직하다.

용어 "완충제(buffer)" 또는 "생리학적으로 허용가능한 완충제(physiologically acceptable buffer)"는 포뮬레이션에서 약학적 또는 수의학적 이용에 대하여 안전한 것으로 알려져 있고, 포뮬레이션에 대하여 바람직한 pH 범위에서 포뮬레이션의 pH를 유지 또는 제어하는 효과를 갖는 화합물의 용액을 나타낸다. 중간 정도 산성인 pH 내지 중간 정도 염기성인 pH에서 pH를 제어하기 위한 적합한 완충제는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 아르기닌, TRIS, 및 히스티딘과 같은 화합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 완충제는 포스페이트 완충제이다.

용어 "포스페이트 완충제(phosphate buffer)"는 원하는 pH로 조절된, 인산 또는 그의 염을 함유하는 용액을 나타낸다. 일반적으로, 포스페이트 완충제는 인산, 또는 소듐 및 포타슘 염을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 인산의 염으로부터 제조된다. 소듐 및 포타슘 일염기성(monobasic), 이염기성(dibasic) 및 삼염기성(tribasic) 염과 같은 인산의 염이 당업계에 알려져 있다. 인산의 염은 생성된 염의 수화물로서 생성되는 것으로 알려져 있다. 포스페이트 완충제는 약 pH 4 내지 약 pH 10과 같은 pH 범위, 약 pH 5 내지 약 pH 9의 바람직한 범위, 6.0 내지 8.0, 또는 약 6.0 내지 약 8.0의 가장 바람직한 범위, 또는 가장 바람직하게는 pH 7.0 또는 약 pH 7.0의, pH 범위를 포함할 수 있다. 바람직한 형태에서, 완충제 시스템은 포스페이트 완충액 단독으로 이루어지며, 즉 포스페이트 이외의 다른 완충제는 포뮬레이션에 존재하지 않는다.

용어 "바이알(vial)"은 액체 형태의 FSH를 고립된(contained) 멸균 상태로 유지하는데 적합한 저장기(reservoir)를 광범위하게 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바이알의 예는 앰플, 카트리지(cartridges), 블리스터 포장(blister packages), 또는 주사기, 펌프(삼투성 펌프를 포함), 카테터(catheter), 경피 패치(transdermal patch), 폐 또는 경점막 스프레이를 통하여 환자에게 FSH를 전달하는데 적합한 다른 저장기를 포함한다. 장관외, 폐, 경점막 또는 경피 투여용 포장 제품에 적합한 바이알이 잘 알려져 있으며, 당업계에 인지되어 있다.

용어 "안정성(stability)"은 본 발명의 포뮬레이션에서 FSH의 물리적, 화학적 및 형태학적 안정성을 나타낸다(생물학적 활성의 유지를 포함). 단백질 포뮬레이션의 불안정성은 더 높은 정도의 폴리머를 형성하는 단백질 분자의 화학적 감성(degradation) 또는 응집(aggregation)에 의하여, 헤테로다이머의 모노머로의 분해(dissociation), 탈글리코실화(deglycosylation), 글리코실화의 변형(modification), 산화(특히, α-서브유닛의 산화) 또는 본 발명에 포함되는 FSH 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 감소시키는 다른 구조적 변형에 의하여 야기될 수 있다.

"안정한" 용액 또는 포뮬레이션 또는 약학적 조성물은 그 내부의 단백질의 감성의 정도, 변형, 응집, 생물학적 활성의 손실 등이 허용가능하게 조절되고, 시간에 따라 허용불가능하게 증가하지 않는 것이다. 바람직하게, 포뮬레이션은 2~8℃ 또는 약 2~8℃의 온도에서, 적어도 6 개월의 기간에 걸쳐, FSH 활성의 적어도 80%, 또는 적어도 약 80%를 유지한다. FSH 활성은 Steelman-Pohley 난소 중량 증가 생물검정(ovarian weight gain bioassay)을 이용함으로써 측정될 수 있다.

용어 "치료(treating)"는 FSH 투여가 여포 또는 고환 자극, 또는 FSH에 의하여 조절되는 임의의 다른 생리학적 반응 목적을 위하여 바람직한 환자에 대한 투여(administration), 추적조사(follow-up), 관리(management) 및/또는 주의(care)를 나타낸다. 따라서, 치료는 정자 질의 유도(induction) 또는 향상(improvement), 남성에서 테스토스테론(testosterone) 방출의 자극, 또는 여포 발생(follicular development)을 위한, 또는 여성에서 배란 유도를 위한 FSH의 투여를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

표현 "다용량 투여(multi-dose administration)" 또는 "다용량 용도(multi-dose use)"는 1회를 넘는 주사(injection), 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상 회수의 주사를 위한, FSH 포뮬레이션의 단일 바이알(single vial), 앰플(ampoule), 카르플(carpoule) 또는 카트리지(cartridge)의 이용을 포함하는 것으로 의도된다. 주사는 적어도 12 시간, 24 시간, 48 시간 등, 또는 적어도 약 12 시간, 약 24 시간, 약 48 시간 등의 주기에 걸쳐, 바람직하게는 12일 또는 약 12일의 주기 이하로 이루어지는 것이 바람직하다. 주사는 예를 들어 6, 12, 24, 48 또는 72　시간의 주기로, 시간적으로 간격을 둘 수 있다.

본 발명자들은 FSH 또는 FSH 변이체를 보존제로서 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올와 함께 제제화함으로써, 높은 단백질 안정성 및 동시에 우수한 보존성을 나타내는 포뮬레이션을 얻을 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 발명에 따른 FSH 포뮬레이션 조성물은 당업계에 공지된 FSH 포뮬레이션에 비하여 향상된 국소 내성(local tolerance)(예를 들어, 주사 부위에 자극이 없음)을 나타내는 것으로 추정된다.

벤즈알코늄 클로라이드는 바람직한 저장 기간(예를 들어, 6 내지 12 내지 24 개월)에 걸쳐 FSH 안정성을 유지하기 위한 충분한 농도로, 및 박테리아 성장을 방지하기 위한 충분한 농도로 포뮬레이션 내에 존재하는 것이 바람직하다.

바람직하게, 본 발명에 따른 액체 포뮬레이션에서 벤즈알코늄 클로라이드의 농도는 0.005 mg/ml 내지 0.05 mg/ml, 또는 약 0.005 mg/ml 내지 약 0.05 mg/ml, 더욱 바람직하게 0.01 mg/ml 내지 0.04 mg/ml, 또는 약 0.01 mg/ml 내지 약 0.04, 가장 바람직하게 0.02 mg/ml(0.002 % (w/v)) 또는 약 0.02 mg/ml(0.002 % (w/v))이다.

벤질 알코올은 바람직한 저장 기간(예를 들어, 6 내지 12 내지 24개월)에 걸쳐 FSH 안정성을 유지하기 위하여 충분한 농도로, 및 박테리아 성장을 방지하기 위하여 충분한 농도로, 포뮬레이션 내에 존재하는 것이 바람직하다.

바람직하게, 본 발명에 따른 액체 포뮬레이션에서 벤질 알코올의 농도는 0.5 mg/ml 내지 20.0 mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 20.0 mg/ml, 더욱 바람직하게 1.0 mg/ml 내지 15.0 mg/ml, 또는 약 1.0 mg/ml 내지 약 15.0 mg/ml, 더욱 더 바람직하게 5.0 mg/ml 내지 12.0 mg/ml, 또는 약 5.0 mg/ml 내지 약 12.0 mg/ml, 가장 바람직하게 10.0 mg/ml (1.0 % (w/v)) 또는 약 10.0 mg/ml (1.0 % (w/v))이다.

본 발명에 따른 액체 포뮬레이션 내의 여포 자극 호르론(FSH)은 바람직하게 150　IU/ml 내지 2,000　IU/ml, 또는 약 150　IU/ml 내지 약 2,000　IU/ml, 더욱 바람직하게 300 IU/ml 내지 1,500　IU/ml, 또는 약 300 IU/ml 내지 약 1,500　IU/ml, 더욱 더 바람직하게 450 IU/ml 내지 750　IU/ml, 또는 약 450 IU/ml 내지 약 750　IU/ml, 가장 바람직하게 600 IU/ml 또는 약 600 IU/ml의 농도로 존재한다.

재조합 FSH의 특정 생체 내 생활성(in vivo bioactivity)은 일반적으로 단백질 mg 당, 약 8,000 IU FSH/mg 내지 약 16,000 IU FSH/mg의 범위이다. 예를 들어, 시판되는 제품인 Puregon (Organon)의 재조합 인간 FSH는 단백질 mg 당, 약 10,000 IE/mg의 특정 생활성을 갖고, Serono로부터의 Gonal-f에 있어서, 재조합 인간 FSH의 생활성은 단백질 mg 당, 약 13,600 IE/mg이다.

FSH 활성은 FSH 및 다른 생식선 자극 호르몬에 관련하여 공지된 방법에 의하여 결정될 수 있다. 그러한 방법은 예를 들어, 효소 면역 활성 분석(enzyme immunoactivity assay, EIA) 또는 리포터 유전자 분석(reporter gene assays)을 포함한다. 생활성은 소변 유래 FSH에 대한 유럽 약전 제5판(European Pharmacopeia, 5th Edition)에 기재된 생물검정(bioassay)에 의하여 일반적으로 결정된다. 그렇게 함으로써, 생활성은 융모성 생식선 자극 호르몬(chorionic gonadotrophin)으로 처리된 미숙한 쥐의 난소를 확대하는 FSH의 효과를, 표준 제제(Standard Preparation)의 동일한 효과와 비교함으로써 추산된다.

본 발명에 따른 액체 약학적 조성물에서 FSH 또는 FSH 변이체의 농도는 일반적으로 10 내지 200 ㎍/ml의 범위이다. 상기 조성물이 예를 들어 주사 펜(injection pen)을 이용함으로써, 다중-용도 투여(multi-use administration)를 위하여 의도되는 경우, FSH 또는 FSH 변이체의 유용한 농도는 30 내지 150 ㎍/ml의 범위, 바람직하게 40 내지 100 ㎍/ml의 범위의 범위일 것이다.

일반적으로, FSH 농도는 용도(단일 용량 또는 다용량), 투여 방식, 투여 도구(tools), FSH 또는 FSH 변이체의 생활성에 따라 달라질 것이다.

LH와 같은 다른 생식선 자극 호르몬을 포함할 수 있지만, 바람직하게 FSH 또는 FSH 변이체는 약학적 조성물 내에 존재하는 유일한 약학적 활성제이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 바이알, 앰플, 카르플, 카트리지 또는 주사기 표면 상에서 FSH 또는 FSH 변이체의 흡착을 방지하기 위하여, 계면활성제, 바람직하게 비-이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 여기에서, 비-이온성 계면활성제는 단백질 용액의 표면 장력을 낮춤으로써, 소수성 표면 상에서 단백질 흡착 또는 응집을 방지한다. 본 발명에 이용될 수 있는 비-이온성 계면활성제의 바람직한 예는 폴리소르베이트계(polysorbate-based) 비-이온성 계면활성제 및 폴록사머계(poloxamer-based) 비-이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 비-이온성 계면활성제는 단독으로, 또는 그 임의의 조합으로 이용될 수 있다. 폴리소르베이트계 비-이온성 계면활성제가 특히 바람직하다. 폴리소르베이트계 비-이온성 계면활성제의 특정 예는 폴리소르베이트 20(polysorbate 20), 폴리소르베이트 40(polysorbate 40), 폴리소르베이트 60(polysorbate 60) 및 폴리소르베이트　80(polysorbate 80)을 포함한다. 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80이 더욱 바람직하고, 폴리소르베이트 20이 가장 바람직하다. 폴리소르베이트 20은 상대적으로 낮은 임계 미셀 농도(critical micelle concentration)를 갖는다. 따라서, 폴리소르베이트 20은 낮은 농도에서도 단백질의 표면 흡착을 감소 또는 방지할 뿐 아니라, 단백질의 화학적 감성을 억제한다. 본 발명에 따른 액체 조성물에서 고농도의 비-이온성 계면활성제의 이용은 적합하지 않다. 이는, 단백질의 농도 결정 또는 안정성 평가가 UV-분광법 또는 등전 집중법 등과 같은 분석 방법을 이용하여 수행되는 경우, 고농도의 비-이온성 계면활성제의 이용은 간섭 효과(interference effects)를 야기함으로써, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하는 것을 어렵게 하기 때문이다. 따라서, 본 발명의 수성 포뮬레이션은 비-이온성 계면활성제를 1.0 mg/ml 미만, 더욱 바람직하게 0.05 내지 0.5 mg/ml의 농도로 계면활성제를 함유한다.

바람직한 형태에서, 폴리소르베이트 20은 포뮬레이션에 존재하는 유일한 계면활성제이다.

바람직하게, 본 발명의 FSH 포뮬레이션은 6.0 내지 8.0, 또는 약 6.0 내지 약 8.0의 pH, 더욱 바람직하게, 6.5 내지 7.5, 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 가지며, 이는 약 pH 6.8, pH 7.0, pH 7.2 및 pH 7.4를 포함한다. 바람직한 완충제는 포스페이트이며, 바람직한 카운터-이온(counter-ions)은 소듐 또는 포타슘 이온이다.

전체 용액 중의 완충제 농도는 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200　mM, 250 mM 내지 500 mM로 변화될 수 있다. 바람직하게, 완충제 농도는 50　mM 또는 약 50 mM이다. pH 7.0을 갖는 포스페이트 이온의 완충제 50 mM이 특히 바람직하다.

포뮬레이션의 pH는 적합한 산 또는 염기를 적당한 양으로 첨가함으로써 조절될 수 있다. 일 형태에서, 액체 약학적 조성물의 pH는 NaOH를 이용하여 조절된다.

바람직하게, 본 발명의 포뮬레이션은 메티오닌, 소듐 비설파이트(sodium bisulfite), 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)의 염, 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 및 부틸레이티드 하이드록실 아니솔(butylated hydroxyl anisole, BAH)과 같은 항산화제를 함유한다. 가장 바람직한 것은 메티오닌이다. 항산화제는 FSH(특히, α-서브유닛)의 산화를 방지한다.

액체 약학적 조성물 중의 메티오닌은 바람직하게 0.1 내지 1.0 mg/ml, 또는 약 0.1 내지 약 1.0 mg/ml, 더욱 바람직하게 0.2 내지 0.8 mg/ml, 또는 약 0.2 내지 약 0.8 mg/ml, 가장 바람직하게 0.5 mg/ml 또는 약 0.5 mg/ml의 농도로 존재한다.

바람직한 형태에서, 메티오닌은 본 발명의 포뮬레이션에 존재하는 유일한 항산화제이다.

바람직하게, 본 발명의 포뮬레이션은 안정화제 및 장성 조절제(tonicity adjusting agent)로서, 수크로오스, 덱스트로오스, 락토오스, 소르비톨 및/또는 글리세롤과 같은 단당류, 이당류, 또는 당 알코올을 함유한다. 당알코올이 가장 바람직하고, 만니톨이 특히 바람직하다.

당 또는 당 알코올은 바람직하게, 1.0 내지 10 mg/ml, 또는 약 1.0 내지 약 10 mg/ml의 농도로, 가장 바람직하게 5.0 mg/ml, 또는 약 5.0 mg/ml의 농도로 존재한다. 일 형태에서, 만니톨은 5.0 mg/ml의 양으로 본 발명에 따른 조성물에 존재한다.

바람직한 형태에서, 만니톨은 본 발명의 조성물에 존재하는 유일한 장성 조절제이다.

바람직한 형태에서, 본 발명에 따른 포뮬레이션은 글리신을 함유하지 않는다.

일 형태에서, 본 발명의 액체 약학적 조성물은 활성제로서 FSH 또는 그의 변이체, 계면활성제로서 폴리소르베이트 20 및/또는 폴리소르베이트 80, 장성 조절제로서 만니톨, 완충제로서 포스페이트, 안정화제로서 메티오닌, 및 보존제로서 벤질 알코올 및 벤즈알코늄 클로라이드, 및 물을 함유하며, 추가적인 부형제를 함유하지 않는다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 적어도 2종의 세균 발육 저지제를 함유하는, 단일 용도 및 다용량 용도를 위한 액체 포뮬레이션을 제공한다. 본 발명의 포뮬레이션은 약학적 또는 수의학적 용도에 적합하다.

일 형태에서, 본 발명은 포장재료(packaging material), 및 수성 희석액 중의, 선택적으로 완충제 및/또는 추가적인 부형제를 갖는, FSH 또는 FSH 변이체 및 벤질 알코올 및 벤즈알코늄 클로라이드의 용액을 포함하는 용기(container)를 포함하는, 인간 약학적 용도를 위한 제조물(article of manufacture)을 제공하며, 상기 포장재료는 그러한 용액이 최초 이용 후에 24시간 이상의 기간에 걸쳐 유지될 수 있음을 나타내는 기록재(written material)를 포함한다. 용기는 바람직하게 주사기(syringe), 바이알(vial), 주입병(infusion bottle), 앰플(ampoule) 또는 카르플(carpoule)이다. 가장 바람직하게, 용기는 주사펜(injection pen) 내의 카르플이다.

최초 이용 전에, 즉 용기, 바이알, 앰플, 카르플, 또는 카트리지의 밀봉이 깨지기 전에, 본 발명의 포뮬레이션은 적어도 6개월, 또는 약 6개월, 12개월 또는 약 12개월 또는 24개월 또는 약 24개월 동안 유지될 수 있다. 바람직한 저장 조건 하에서, 최초 이용 전에, 본 발명의 약학적 조성물은 2 내지 8℃, 또는 약 2 내지 약 8℃의 온도에서, 밝은 빛을 피하여(바람직하게 어두운 곳에) 있게 된다.

본 발명의 포뮬레이션은 알려진 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 이러한 단일 바이알 시스템(single vial systems)을 포함하는 예는 EasyJect^®, GONAL-F^®Pen, Humaject^®, Novopen^®, B-D^® Pen, AutoPen^®, Follistim^®-Pen, Puregon^®-Pen 및 OptiPen^®으로서 또는 이들로부터 알려진 것과 같은 용액 전달용 펜-주입 장치(pen-injector devices)를 포함한다.

안정한 보존 포뮬레이션은 투명한 용액으로서 환자에게 제공될 수 있다. 용액은 단일 이용을 위한 것일 수 있고, 또는 복수회(multiple times) 재사용될 수 있으며, 단일 또는 복수 사이클의 환자 치료를 위하여 충분할 수 있으므로, 현재 이용가능한 것보다 더욱 편리한 치료를 제공하게 된다.

본 발명에 따른 수성 포뮬레이션은 사용할 준비가 된(ready-to-use) 용액이고, 어떤 시점에서도 FSH 제제의 재구성이 없다.

본 명세서에 기재된 안정한 보존 포뮬레이션에서 FSH 또는 FSH 변이체는 피하(s.c.) 주사 또는 근육내(i.m.) 주사, 경피, 폐, 경점막, 이식(implant), 삼투 펌프(osmotic pump), 카트리지, 마이크로 펌프, 경구 또는 당업자에 의하여 당업계에 잘 알려진 것으로 인지되는 다른 수단을 포함하는 다양한 전달 방법을 통하여 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.

하기 실시예는 단지 본 발명의 포뮬레이션 및 조성물의 제조를 더욱 설명하기 위하여 제공된다. 본 발명의 범위는 단지 하기 실시예로만 이루어지는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 발명은 본 발명의 액체 약학적 조성물을 함유하는 약학적 용기(container)에 관한 것이다. 적합한 약학적 용기는 선행기술로부터 알려져 있다. 용기는 예를 들어, 주사기, 바이알, 주입병, 앰플 또는 카르플일 수 있다. 바람직한 형태에서, 용기가 주사기인 경우, 주사기는 바늘 보호 시스템(needle protection system)을 구비한다. 선행기술로부터 잘 알려져 있는 그러한 바늘 보호 시스템은 손상 위험을 감소시키는데 도움을 준다. 다른 형태에서, 용기는 주사 펜 내의 카르플이다.

본 발명은 본 발명에 따른 액체 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 여기에서, 활성제로서 FSH 또는 FSH 변이체는 보존제로서 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올, 및 다른 약학적 부형제를 포함하는 수성 제제에서 제제화된다.

다른 측면에서, 본 발명은 다용량 투여를 위한 본 발명에 따른 액체 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 불임 및 FSH와 관련된 다른 질병 치료에 유리하게 이용될 수 있다. 바람직한 형태에서, 본 발명에 따른 FSH 포뮬레이션은 인간 치료에 이용된다. 그러나, 일반적으로 본 발명의 약학적 조성물은 양, 소, 돼지 또는 말과 같은 다른 포유동물에게도 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 액체 포뮬레이션은 매우 우수한 저장 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 범위 내에서, 용어 "저장 안정한(storage stable)"은 25℃에서 포뮬레이션을 3개월 동안 저장한 후에, 활성 FSH 또는 FSH 변이체의 함량이 초기 농도의 80% 이상인 것을 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게, 25℃에서 3개월 동안 저장한 후에, FSH 활성의 잔류 함량이 본래 활성의 적어도 85%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%에 달한다.

FSH 또는 FSH의 변이체의 생물학적 활성은 소정 조건 하, 융모성 생식선 자극 호르몬으로 치료받은 미성숙 쥐의 난소 확대 효과를, 국제 표준 제제(International Standard preparation) 또는 국제 단위(International Units)로 보정된(calibrated) 참조 제제(reference preparation)의 동일한 효과와 비교함으로써 추정될 수 있다(European Pharmacopeia, 5^th Edition).

시험관 내에서 FSH 활성의 측정은 예를 들어, Albanese et. al. (1994) Mol. Cell Endocrinol. 101:211-219에 의하여 기재되어 있다.

본 발명에 따른 포뮬레이션에 이용된 FSH 또는 FSH 변이체의 순도는 적어도 95%, 바람직하게 적어도 97%, 더욱 바람직하게 적어도 99%이며, 가장 바람직하게 99%를 넘는다. 순도의 정도는 HPLC 분석에 의하여 결정될 수 있다. 그러한 분석을 수행하기 위하여 적합한 재료 및 프로토콜은 Vydac 또는 TOSOH Bioscience와 같은 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있다.

본 발명에 따른 용액을 제제화하기 위한 구성성분(components)은 예를 들어, Sigma 또는 Merck와 같은 상업적 공급원으로부터 얻어질 수 있다.

본 발명의 포뮬레이션의 제조는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 포뮬레이션의 구성성분은 수성 완충제에 용해될 수 있다. 대안으로, FSH 또는 FSH 변이체는 정제 공정의 결과로서 이미 수성 완충제 중에서 얻어질 수 있다.

마지막으로, 완성된 액체 포뮬레이션은 투여시까지 저장되는 적합한 약학적 용기 내에 충진된다.

하기 실시예들은 그 범위를 제한하지 않고 본 발명을 설명하기 위하여 의도된다.

실시예 1

재조합 기술에 의한 재조합 인간 FSH의 제조

재조합 인간 FSH는 표준 방법에 의하여 트랜스펙트된 CHO 숙주 세포에서 제조된다. 이러한 방법은 인간 FSH의 α-사슬 및 β-사슬을 코딩하는 일 이상의 재조합 핵산 분자로부터 재조합 인간 FSH를 제조하는 CHO 세포의 생성(generation), 적합한 조건 하에서 숙주 세포의 배양(cultivation), 및 세포 배양액으로부터 재조합 인간 FSH의 정제를 포함한다. 적합한 공정은 전술한 바와 같은 선행기술에 기재되어 있다.

바람직한 형태에서, 재조합 인간 FSH는 국제공개공보 WO 2009/000913에 기재된 바와 같이 제조된다.

실시예 2

액체 FSH 포뮬레이션

재조합 인간 FSH를 포함하는 액체 포뮬레이션은 수성 포스페이트 완충제 용액에서 하기 구성성분을 제제화함으로써 제조되었다.

성분
제조합 인간 FSH	600 IU/ml
폴리소르베이트 20	0.2 mg/ml
소듐 포스페이트	50 mM
만니톨	5.0 mg/ml
L-메티오닌	0.5 mg/ml
벤질 알코올	10.0 mg/ml
벤즈알코늄 클로라이드	0.02 mg/ml
주사용 물
pH	7.0

재조합 인간 FSH의 생활성은 약 10,000 IU/mg로 결정되었다.

조성물의 pH 값은 NaOH를 첨가함으로써 조절되었다. 모든 성분들은 유럽 약전(European Pharmacopoeia (Ph. Eur.))에 따른 양이다. 포뮬레이션은 254　mOsmol/kg의 장성(tonicity)을 갖는다.

또한, 2종의 선행기술 FSH 포뮬레이션이 비교 포뮬레이션으로 준비되었다:

A) 비교 포뮬레이션 Gonal-f: 10 mM 소듐 포스페이트, 60　mg/ml 수크로오스, 0.1　mg/ml 메티오닌, 0.1 mg/ml 폴록사머(poloxamer) 188, 3　mg/ml m-크레졸, pH　7.0.

B) 비교 포뮬레이션 Puregon: 50 mM 소듐 시트레이트, 50 mg/ml 수크로오스, 0.5　mg/ml 메티오닌, 0.2 mg/ml 폴리소르베이트(polysorbate 20), 10 mg/ml 벤질 알코올, pH　7.0.

실시예 3

본 발명에 따른 포뮬레이션의 안정성 시험

실시예 2에 기재된 수성 제제를 1 ml/vial로 분취하고, 2~8℃, 25℃, 및 37℃에서 저장하였다. 25℃에서 12주 동안, 및 37℃에서 9주 동안 저장한 후에, 다양한 시험 파라미터에 대하여 샘플들을 시험하였다. 유럽 약전 제5판(European Pharmacopoeia, 5^th edition)에 따라 충분한 보존이 시험되었다. FSH의 %　회수(recovery), 다이머 FSH의 % 감소(decrease)(FSH의 모노머로의 분해), 및 FSH의 순도를 SE-HPLC 및 SDS-PAGE에 의하여 측정하였다.

본 발명의 포뮬레이션은 2~8℃, 25℃, 및 37℃에서 저장하에, 95%가 넘는 재조합 인간 FSH의 회수(recovery)를 나타내었다. 또한, 포뮬레이션은 2~8℃, 25℃, 및 37℃에서 저장하에, 5%보다 작은 다이머 FSH의 감소(decrease)를 나타내었다. 또한, 포뮬레이션은 2~8℃, 25℃, 및 37℃에서 저장하에, 95%가 넘는 FSH의 순도를 나타내었다.

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른, 계면활성제로서 폴리소르베이트(Polysorbate) 20, 장성 조절제로서 만니톨, 완충제로서 포스페이트, 안정화제로서 메티오닌, 및, 보존제로서 벤질 알코올 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함하는 FSH 수성 포뮬레이션은 단백질 손실 및 변성, 단백질의 구성 모노머로의 분해를 방지하고, 연장된 시간 기간 동안 FSH를 안정화하는 것으로 나타내어질 수 있다. 또한, 이와 같은 유익한 보존 성능에 기인하여, 본 포뮬레이션은 다용량 투여를 위하여 유용한 제제이다.

본 발명에 따른 FSH 포뮬레이션의 항균 보존 효능은 유럽 약전 제5판(European Pharmacopoeia, 5th Edition)에 따라 유발 검사(challenge test)에 의하여 결정되었다. 이 검사는 수성 포뮬레이션 조성물에 소정 미생물의 규정된 접종원(prescribed inoculum)을 유발시키고(challenging), 규정된 온도에서 접종된 포뮬레이션을 저장하고, 특정 시간 간격으로 포뮬레이션에서 샘플을 빼내고, 그렇게 제거된 샘플에서 유기체를 계수하는 것으로 이루어진다. 미생물 수의 현저한 감소가 있거나, 또는 적어도 증가가 없는 경우에, 제제의 보존 특성은 충분하다.

본 발명에 따른 FSH 포뮬레이션은 미생물 수의 현저한 감소를 나타내었고, 따라서 매우 우수한 보존 특성을 입증하였다.

또한, 본 발명의 포뮬레이션은 선행기술의 비교 포뮬레이션 Gonal-f 및 Puregon의 안정성과 비교할만한 안정성을 갖는 것으로 관찰되었다.

서열목록:

서열식별번호 1: 인간 FSH의 α-사슬의 아미노산 서열

서열식별번호 2: 인간 FSH의 β-사슬의 아미노산 서열

서열식별번호 3: 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 야생형 핵산 서열

서열식별번호 4: 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 야생형 핵산 서열

서열식별번호 5: 인간 FSH의 β-사슬을 코딩하는 코돈 최적화 핵산 서열

서열식별번호 6: 인간 FSH의 α-사슬을 코딩하는 코돈 최적화 핵산 서열

<110> BIOGENERIX AG <120> LIQUID FORMULATION OF FSH <130> P10MP034 <150> EP 08151231.1 <151> 2009-02-08 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (1)..(116) <223> alfa-chain of human FSH <400> 1 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CHAIN <222> (1)..(129) <223> beta-chain of human FSH <400> 2 Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 1 5 10 15 Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys 20 25 30 Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60 Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg 65 70 75 80 Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val 85 90 95 Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110 Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125 Glu <210> 3 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cttaattaag ccgccagcat ggattactac agaaaatatg cagctatctt tctggtcaca 60 ttgtcggtgt ttctgcatgt tctccattcc gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc 120 acgctacagg aaaacccatt cttctcccag ccgggtgccc caatacttca gtgcatgggc 180 tgctgcttct ctagagcata tcccactcca ctaaggtcca agaagacgat gttggtccaa 240 aagaacgtca cctcagagtc cacttgctgt gtagctaaat catataacag ggtcacagta 300 atggggggtt tcaaagtgga gaaccacacg gcgtgccact gcagtacttg ttattatcac 360 aaatcttaa 369 <210> 4 <211> 474 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aggatccccg ggctacctcc ccgcggggag gcgcgcccct taattaagcc gccaccatga 60 agacactcca gtttttcttc cttttctgtt gctggaaagc aatctgctgc aatagctgtg 120 agctgaccaa catcaccatt gcaatagaga aagaagaatg tcgtttctgc ataagcatca 180 acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag gacccagcca 240 ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca gtgagagtgc 300 ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc cagtgtcact 360 gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg cccagctact 420 gctcctttgg tgaaatgaaa gaataaacat gccatggcat gcgagctcga attc 474 <210> 5 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized nucleic acid sequence coding for the beta-chain of human FSH <400> 5 aggatccccg ggtacctccc cgcggggagg cgcgcccctt aattaagccg ccaccatgaa 60 gaccctgcag ttcttcttcc tgttctgctg ctggaaggcc atctgctgca acagctgcga 120 gctgaccaac atcaccatcg ccatcgagaa ggaggagtgc aggttctgca tcagcatcaa 180 caccacctgg tgcgccggat actgctacac cagggacctg gtgtacaagg accccgccag 240 gcccaagatc cagaagacct gcaccttcaa ggagctggtg tacgagaccg tgagggtgcc 300 cggctgcgcc caccacgccg acagcctgta cacctacccc gtggccaccc agtgccactg 360 cggcaagtgc gacagcgaca gcaccgactg caccgtgagg ggcctgggcc ccagctactg 420 cagcttcggc gagatgaagg agtaatgacc atggcatgcg agctcgaatt c 471 <210> 6 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized nucleic acid sequence coding for the alfa-chain of human FSH <400> 6 cttaattaag ccgccagcat ggactactac aggaagtacg ccgccatctt cctggtgacc 60 ctgagcgtgt tcctgcacgt gctgcacagc gccccagacg tgcaggactg ccccgagtgc 120 accctgcagg agaacccatt cttcagccag cccggagccc ccatcctgca gtgcatgggc 180 tgctgcttca gcagggccta ccccaccccc ctgaggagca agaagaccat gctggtgcag 240 aagaacgtga ccagcgagag cacctgctgc gtggccaaga gctacaacag ggtgaccgtg 300 atgggcggct tcaaggtgga gaaccacacc gcctgccact gcagcacctg ctactaccac 360 aagagctaat ga 372

Claims

여포 자극 호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH) 또는 그 변이체(variant), 및 보존제로서 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride) 및 벤질 알코올(benzyl alcohol)을 포함하는 액체 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 벤즈알코늄 클로라이드는 0.005 내지 0.03 mg/ml의 농도로 존재하고, 상기 벤질 알코올은 5.0 내지 12.0 mg/ml의 농도로 존재하는
액체 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 FSH 또는 그 변이체는 10 내지 200 ㎍/ml의 농도로 존재하는
액체 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 항산화제로서 메티오닌을 더 포함하는
액체 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 메티오닌은 0.1 내지 1.0 mg/ml의 농도로 존재하는
액체 약학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 계면활성제를 더 포함하는
액체 약학적 조성물.
제6항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 알킬 에스테르(polyoxy ethylene sorbitan alkyl ester)인
액체 약학적 조성물.
제7항에 있어서,
상기 폴리옥시 에틸렌 소르비탄 알킬 에스테르는 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20) 또는 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80)인
액체 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80은 0.05 내지 0.5 mg/ml의 농도로 존재하는
액체 약학적 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 장성 조절제(tonicity modifying agent)를 더 포함하는
액체 약학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 장성 조절제는 당 알코올(sugar alcohol) 또는 당(sugar)인
액체 약학적 조성물.
제11항에 있어서,
상기 장성 조절제는 만니톨인
액체 약학적 조성물.
제12항에 있어서,
상기 만니톨은 1.0 내지 10 mg/ml의 농도로 존재하는
액체 약학적 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 6.5 내지 7.5의 pH를 갖는
액체 약학적 조성물.
제14항에 있어서,
상기 pH는 6.8 내지 7.2의 범위인
액체 약학적 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 pH는 NaOH를 이용하여 조절되는
액체 약학적 조성물.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 생리학적으로 허용가능한 완충제를 더 포함하는
액체 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 완충제는 포스페이트(phosphate)인
액체 약학적 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서,
상기 완충제는 10 내지 100 mmol/l의 농도로 존재하는
액체 약학적 조성물.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 활성제로서 FSH 또는 그 변이체, 계면활성제로서 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20) 및/또는 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80), 장성 조절제로서 만니톨, 완충제로서 포스페이트, 안정화제로서 메티오닌, 및 보존제로서 벤질 알코올 및 벤즈알코늄 클로라이드를 함유하고, 추가적인 부형제는 함유하지 않는
액체 약학적 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 액체 약학적 조성물을 함유하는 약학적 용기.
제21항에 있어서,
상기 용기는 주사기(syringe), 바이알(vial), 주입병(infusion bottle), 앰플(ampoule) 또는 카르플(carpoule)인
약학적 용기.
제21항 또는 제22항에 있어서,
상기 용기는 주사펜(injection pen) 내의 카르플(carpoule)인
약학적 용기.
보존제로서 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올, 및 추가적인 약학적 부형제를 포함하는 수성 제제에, 활성제로서 FSH 또는 그 변이체를 제제화하는, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 액체 약학적 조성물의 제조방법.
FSH 또는 그 변이체, 및 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤질 알코올을 바이알(vial), 앰플(ampoule), 카르플(carpoule) 또는 카트리지(cartridge)에 배치하는 것을 포함하는, 포장 약학적 조성물(packaged pharmaceutical composition)의 제조방법.
다용량 투여(multi-dose administration)를 위한, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 액체 약학적 조성물의 용도.