PT2249869E

PT2249869E - Formulação líquida da fsh

Info

Publication number: PT2249869E
Application number: PT09708298T
Authority: PT
Inventors: Sascha Stolzenberger; Erich Kohler
Original assignee: Biogenerix Ag
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2011-12-16
Also published as: HK1149494A1; US20160303202A1; PL2249869T3; DK2249869T3; EA019530B1; AU2009211331A1; EP2249869A1; CN101970010A; US20160303238A1; RS52106B; ZA201004457B; ME01337B; JP2011514317A; EP2412385A1; HRP20110801T1; BRPI0908887B1; KR101662631B1; US20160303201A1; NZ586588A; BRPI0908887B8

Description

ΡΕ2249869 1 DESCRIÇÃO "FORMULAÇÃO LÍQUIDA DA FSH" A presente invenção é referente a uma composição farmacêutica liquida que compreende um polipeptideo da hormona estimuladora de foliculo, e o cloreto de benzal-cónio e o álcool benzilico como conservantes. A composição compreende ainda opcionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Numa forma de realização, a composição contém metionina como um antioxidante. A composição apresenta uma boa estabilidade de armazenamento e é especialmente útil para a profilaxia e o tratamento de distúrbios e indicações médicas onde as preparações da hormona estimuladora de foliculo são consideradas como fármacos úteis. A hormona estimuladora de foliculo (FSH) é produzida pelas células gonadotróficas da pituitária anterior e é libertada na circulação. A FSH actua juntamente com a hormona luteinizante (LH) no controlo da maturação do oócito em fêmeas e da espermatogénese em machos. Tanto a FSH como a LH pertencem a uma família de glicoproteínas heterodiméricas que consistem em duas cadeias α e β ligadas não covalentemente que são codificadas por genes separados. Ambas as cadeias α e β são glicosiladas. A subunidade α consiste em 92 resíduos de 2 ΡΕ2249869 aminoácidos enquanto a subunidade β consiste em 111 resíduos de aminoácidos, e cada uma das quais possui dois potenciais sítios de glicosilação ligados pela asparagina. A FSH humana é utilizada para tratar mulheres que não ovulam, para a estimulação do desenvolvimento multifo-licular (superovulação) e na preparação de uma concepção assistida tais como a IVF, ICSI, GIFT ou CIFT. Adicionalmente, a FSH humana é utilizada para estimular a maturação de folículos em mulheres com uma produção baixa ou nula de FSH e para a estimulação da espermatogénese em homens com hipogonadismo hipogonadotrófico congénito ou adquirido.

Até aos anos 80, uma fonte primária da FSH humana era a FSH derivada da urina isolada a partir da urina de mulheres em idade fértil. Uma forma purificada adicional de elevada pureza, da FSH derivada de urina foi introduzida nos anos 90, e finalmente foi desenvolvida uma FSH recom-binante e amplamente utilizada a partir do ano de 1998. Com o advento da tecnologia do DNA recombinante, tornou-se possível produzir a FSH humana em culturas de células transfectadas com as sequências de ácido nucleico que codificam para a cadeia α e β. As sequências de DNA que codificam para a cadeia α e β e os métodos para produzir a FSH recombinante foram descritos por exemplo em WO 88/10270, em WO 86/04589 e em EP 0 735 139.

Actualmente, existem dois produtos da FSH humana recombinante comercializados no mercado na Alemanha, o 3 ΡΕ2249869 GONAL-f® e o Puregon®, em que ambos são produzidos pela expressão das sequências de DNA que codificam para as cadeias α e β humanas de estirpe selvagem nas células do ovário de rato Chinês (CHO).

Normalmente, as proteínas têm uma meia-vida muito curta, e sofrem desnaturação tal como a agregação de monómeros, a dissociação de dímeros, e a adsorção na superfície dos vasos sanguíneos, após a exposição a vários factores tais como temperaturas desfavoráveis para a expressão da actividade da proteína, a água, a exposição ao ar, a alta pressão, o stress físico/mecânico, os solventes orgânicos e a contaminação microbiana.

Consequentemente, as proteínas desnaturadas perdem propriedades físico-químicas intrínsecas e efeitos fisiologicamente activos. A desnaturação das proteínas é irreversível e por isso as proteínas, uma vez desnaturadas, dificilmente poderão recuperar as suas propriedades nativas para o estado inicial.

Em particular, as proteínas que contêm uma estrutura heterodimérica que consiste em duas subunidades diferentes e que são administradas em quantidades de rastreio de menos do que algumas centenas de microgramas de cada vez, tais como a FSH humana, sofrem de problemas associados com a perda relativamente elevada de proteínas incluindo a perda de proteínas devido à dissociação dos dímeros em soluções aquosas e à adsorção de proteínas na 4 ΡΕ2249869 superfície interna dos vasos sanguíneos. As proteínas dissociadas perdem a sua actividade fisiológica própria, e os monómeros dissociados ficam imediatamente susceptíveis à agregação. Para além disso, as proteínas adsorvidas na superfície interna dos vasos sanguíneos ficam também imediatamente vulneráveis à agregação via o processo de desnaturação. Quando estas são administradas no corpo humano as proteínas desnaturadas desta forma podem servir como a causa de formação de anticorpos contra as proteínas que ocorrem naturalmente no corpo.

Algumas das proteínas farmacêuticas têm superado os problemas de estabilidade via a liofilização (criodes-secação). Apesar destas preparações liofilizadas serem suficientemente estáveis para garantirem períodos de vida útil suficientes, possuem a desvantagem de ser necessária a reconstrução antes da sua administração. Por conseguinte, o paciente tem necessariamente de reconstituir a glico-proteína liofilizada num solvente (tal como a água para injecção) antes da sua utilização, o que é uma desvantagem e uma inconveniência para o paciente. Adicionalmente, o solvente tem de ser fornecido juntamente com as preparações liofilizadas da FSH. Para um paciente que necessite de injecções de uma FSH em períodos regulares, por exemplo, um paciente que receba uma dose diária de uma FSH humana recombinante para a indução da ovulação, será importante que a formulação gonadotrófica seja fácil de manusear, de dosear e de injectar. A reconstituição de uma preparação gonadotrófica liofilizada requer prudência e rigor e deverá 5 ΡΕ2249869 ser evitada, se possível. A utilização de gonadotrofinas seria facilitada, se estas glicoproteínas pudessem ser produzidas e distribuídas como uma solução estável para o paciente que poderia injectar o medicamento directamente sem reconstituição. Além disso, um processo de liofilização é uma etapa do processo que é morosa e dispendiosa, e poderá ser vantajosa se esta etapa puder ser evitada na preparação de uma formulação gonadotrofica.

Existe assim uma necessidade de preparação de uma injecção pronta a usar, que contenha uma estabilidade suficiente para garantir um período de vida útil razoável.

Como uma forma alternativa para lidar com estas limitações, a estabilidade da proteína poderá ser melhorada através da adição de um estabilizador à proteína no estado de solução. Como exemplos de estabilizadores de proteína úteis, existem surfactantes conhecidos, proteínas tais como as albuminas, os polissacarídeos, os aminoácidos, os polímeros, os sais e outros. No entanto, o estabilizador mais adequado deve ser seleccionado e utilizado tomando em consideração as propriedades físico-químicas únicas das proteínas individuais. Além disso, a utilização combinada de diferentes estabilizadores pode provocar efeitos secundários adversos como supostos efeitos esperados, devido à acção competitiva e à reacção adversa entre estabilizadores individuais. Adicionalmente, a estabilização bem-sucedida de proteínas presentes na solução requer atenção cuidada e muitos esforços, visto que os esta- 6 ΡΕ2249869 bilizadores individuais possuem uma gama de concentrações especificas favoráveis para a estabilização das proteínas correspondentes. A FSH tem sido formulada em formatos líquidos tanto em doses unitárias como em multidoses, em frasco, carpules ou ampolas. Os formatos de dose unitária devem permanecer armazenados de forma estável e activa antes da sua utilização. Os formatos em multidoses devem permanecer armazenados não só de forma estável e activa antes da sua utilização, mas devem também permanecer estáveis, activos e relativamente livres de bactérias durante o período de administração em regime de multidose, após o selo da ampola ter sido comprometido. Por esta razão, os formatos multidose contêm muitas vezes um agente bacteriostático. 0 GONAL-f®, uma preparação líquida pronta a usar da FSH humana recombinante, está disponível como uma solução para injecção administrada a partir de uma caneta de injecção. A solução contém m-cresol como conservante (ROTE LISTE 2007, No. 50 004). O Puregon® está também disponível como uma preparação líquida pronta a usar para injecção que contém álcool benzílico como conservante (ROTE LISTE 2007, No. 50 010).

As preparações líquidas de FSH contendo um conservante estão também descritas em patentes. A aplicação da patente internacional WO-A1-00/04913 descreve a FSH e as variantes das formulações da FSH contendo um conservante 7 ΡΕ2249869 seleccionado a partir do fenol, do m-cresol, do p-cresol, do o-cresol, do clorocresol, do álcool benzilico, do alquilparabeno, do cloreto de benzalcónio, do cloreto de benzetónio, do di-hidroacetato de sódio e do tiomerosal. Enquanto a utilização destes conservantes é mencionada de uma forma geral, não existe consenso quanto à combinação especifica ou mistura de conservantes numa formulação liquida da FSH humana recombinante.

Além disso, a aplicação da patente internacional WO 2004/037607 é dirigida a uma formulação aquosa da FSH humana contendo glicina, metionina, surfactante não iónico e um tampão fosfato como estabilizador. Adicionalmente, a formulação pode incluir opcionalmente um conservante, nomeadamente o álcool benzilico, o cresol, o parabeno e as misturas dai resultantes. A aplicação da patente internacional WO 2004/087213 Al descreve composições farmacêuticas líquidas da FSH que contêm um surfactante seleccionado a partir do Pluronic® F77, do Pluronic® F87, do Pluronic® F88 e do Pluronic® F68. A composição pode conter adicionalmente um agente bacteriostático seleccionado a partir do fenol, do m-cresol, do p-cresol, do o-cresol, do clorocresol, do álcool benzilico, do alquilparabeno, do cloreto de benzalcónio, do cloreto de benzetónio, do di-hidroacetato de sódio e do tiomerosal. Não estão mencionadas as misturas ou combinações de agentes bacteriostáticos. ΡΕ2249869

Assim, e embora se deseje obter formulações de gonadotrofinas contendo conservantes, tais que as formulações sejam adequadas para a administração múltipla, demonstrou-se que as preparações farmacêuticas conservadas contendo a proteína humana são difíceis de produzir. Verificou-se que quando os conservantes são utilizados, estes dão origem a problemas de estabilidade se as preparações farmacêuticas forem armazenadas durante longos períodos. Neste processo, as proteínas humanas ficam inactivadas e formam-se aglomerados que podem ser a causa da intolerância observada às soluções injectadas. Os processos usuais para a produção de formulações farmacêuticas que contêm conservantes para fins de infusão ou de injecção não podem ser utilizados no caso dos componentes activos da proteína humana, visto que as substâncias activas ficam inactivadas sob as condições de esterilização em autoclaves a 121°C sendo a sua estrutura destruída. É também sabido que os conservantes comuns utilizados em farmácia reagem com os componentes da proteína humana activa e estes ficam por sua vez inactivados. 0 tipo de conservantes utilizados desempenha um papel importante para a tolerância. Todos os conservantes possuem uma maior ou menor taxa de alergia. É assim crucial que os conservantes na formulação da proteína humana sejam seleccionados de modo a que se alcance uma boa conservação, mas também que as desvantagens dos conservantes específicos em combinação com uma certa glicoproteína humana sejam minimizadas.

Assim, existe ainda uma necessidade urgente do 9 ΡΕ2249869 desenvolvimento de uma nova formulação líquida da FSH humana recombinante conservada através da presença de conservantes e que seja capaz de manter a actividade estável da FSH humana recombinante durante um vasto período de tempo.

De acordo com a presente invenção, estes e outros problemas são resolvidos através das particularidades da reivindicação principal.

Estão definidas formas de realização vantajosas nas sub-reivindicações.

Foi inesperadamente verificado que a formulação de uma FSH humana recombinante numa composição farmacêutica líquida contendo a FSH ou uma variante daí resultante como composto activo e como conservantes tanto o cloreto de benzalcónio como o álcool benzílico fornece uma boa estabilidade da composição tal que esta possa ser utilizada para uso em doses unitárias bem como em multidoses. A composição de acordo com a invenção pode ser armazenada sem refrigeração durante um período de tempo prolongado sem perda significativa de actividade e sem significativa degradação. É assumido que a combinação do cloreto de benzalcónio e do álcool benzilico como conservantes é particularmente vantajoso em combinação com a glicohormona da FSH, visto que fornecem melhor conservação e asseguram que as interacções desvantajosas com a FSH sejam mantidas num nível mínimo. 10 ΡΕ2249869

Salvo indicação em contrário, as seguintes definições pretendem ilustrar e definir o significado e o âmbito dos vários termos utilizados para descrever a presente invenção. O termo "FSH" refere-se a um polipeptídeo da hormona estimuladora de folículo como uma proteína maturada de cadeia completa que inclui, mas não se limita a, FSH humana ou "hFSH", quer produzida recombinantemente quer isolada a partir de fontes humanas, tais como a urina de mulheres pós-menopausa. A sequência da proteína da glico-proteína humana e a sequência da proteína da subunidade β da FSH humana são conhecidas pelas pessoas qualificadas através da literatura científica e de patente (ver por exemplo WO 2004/087213) . A sequência de aminoácidos da cadeia α da FSH humana está descrita na SEQ ID No. 1, e a sequência de aminoácidos da cadeia β da FSH humana está descrita na SEQ ID No. 2 tal como anexado a esta especificação. Estas sequências de aminoácidos correspondem às sequências de aminoácidos de estirpe selvagem das cadeias α e β da FSH humana tal como depositadas na base de dados da EMBL sob o número de acesso J 00152 e na base de dados NCBI sob o número de acesso NM_000510, respectivamente.

As sequências de ácido nucleico de estirpe 11 ΡΕ2249869 selvagem que codificam para a FSH humana estão apresentadas na SEQ ID No. 3 (= cadeia a) e na No. 4 (= cadeia β). A FSH recombinante pode ser codificada pela sequência do ácido nucleico da estirpe selvagem tal como encontrada naturalmente em humanos, ou pode ser codificada por uma sequência de ácido nucleico alterada cuja expressão resulte numa FSH contendo a sequência de aminoácidos da estirpe selvagem, isto é, a sequência da proteína da estirpe selvagem tal como encontrada naturalmente em humanos. A sequência de ácido nucleico que codifica para a FSH humana pode, por exemplo, ser alterada de tal forma que uma ou ambas as sequências de ácido nucleico que codificam para a cadeia α e β da FSH humana possam ser adaptadas para a utilização do codão em células do ovário de rato Chinês (CHO) de forma a aumentar o nível de expressão e o rendimento da FSH recombinante nestas células hospedeiras.

Um exemplo de sequências de ácido nucleico que codificam para a FSH humana e que foram modificadas no que se refere à utilização do codão em células CHO é descrito na aplicação da patente internacional WO 2009/000913. A sequência de ácido nucleico modificada que codifica para a cadeia β da FSH humana é a região codificante da sequência de ácido nucleico retratada na SEQ ID No. 5 (na SEQ ID No. 5 a região codificante inicia-se no nucleotídeo 56 e estende-se até ao nucleotídeo 444), e a sequência de ácido nucleico modificada que codifica para a cadeia α da FSH 12 ΡΕ2249869 humana é a região codificante da sequência de ácido nucleico fornecida na SEQ ID No. 6 (na SEQ ID No. 6 a região codificante inicia-se no nucleotideo 19 e estende-se até ao nucleotideo 336). Uma linha de células CHO contendo uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende uma primeira sequência de ácido nucleico modificada que codifica para a cadeia β da FSH humana e uma segunda sequência de ácido nucleico modificada que codifica para a cadeia α da FSH humana foi depositada em 28 de Março de 2007 na DSMZ em Braunschweig sob o número de depósito DSM ACC2833 .

Numa forma de realização preferencial, a formulação liquida de FSH de acordo com a presente invenção contém uma FSH humana recombinante da estirpe selvagem que é obtida através da expressão do gene recombinante das sequências de ácido nucleico da FSH que são modificadas em relação ao uso do codão em células CHO com respeito a ambas as cadeias α e β da FSH humana. Numa outra forma de realização preferencial, a FSH recombinante é obtida através da expressão das sequências de ácido nucleico de FSH como descrito em WO 2009/000913. A expressão "variante da FSH" pretende englobar aquelas moléculas que diferem no padrão de glicosilação da sequência de aminoácidos ou na ligação inter-subunidades da FSH humana mas que exibem a actividade da FSH. Os exemplos incluem a CTP-FSH, uma FSH recombinante modificada de acção prolongada, que consiste na subunidade α de estirpe selva- 13 ΡΕ2249869 gem e numa subunidade β híbrida nas quais o peptídeo car-boxi-terminal da hCG foi acoplado ao C-terminal da subunidade β da FSH, como descrito em LaPolt et al. (1992) Endo-crinology, 131, 2514 - 2520; ou em Klein et al. (2003) Human Reprod., 18, 50 - 56. Está também incluída uma CTP-FSH de cadeia simples, uma molécula de cadeia simples descrita por Klein et al. (2002) Fertility & Sterility, 77, 1248 - 1255. Outros exemplos de variantes da FSH incluem moléculas da FSH que contêm sitios de glicosilação adicionais incorporados na subunidade α e/ou β, como descrito em WO 01/58493, e moléculas da FSH com ligações S-S inter-subunidades, como descrito em WO 98/58957. Outros exemplos de variantes da FSH estão descritos em WO 2004/087213, e são caracterizadas pelas delecções do carboxi terminal da subunidade β. Outros exemplos de variantes de FSH incluem moléculas da FSH que contêm um nível de glicosilação alterado quando comparado com a FSH de estirpe selvagem devido a alterações na sequência de aminoácidos da proteína através das quais o(s) sitio(s) de glicosilação adicio-nal(ais) é(são) introduzido(s) ou o(s) sítio(s) de glicosilação que ocorre(m) naturalmente é(são) delectado(s).

Adicionalmente, a FSH ou a variante da FSH de acordo com a invenção pode ser uma molécula da FSH que tenha sido modificada através das partes químicas. Tais conjugados da FSH podem por exemplo compreender o poli-alquilenoglicol (tal como o PEG), o hidroxialquilo de amido (tal como o HES) ou outras fracções poliméricas. 14 ΡΕ2249869

Os heterodímeros da FSH ou os heterodímeros da variante da FSH podem ser produzidos através de qualquer método adequado, tal como recombinantemente, através do isolamento ou da purificação a partir de fontes naturais, consoante o caso, ou através de síntese química, ou qualquer combinação daí resultante.

A utilização do termo "recombinante" refere-se a preparações da FSH ou de variantes da FSH que são produzidas através da utilização da tecnologia do DNA recombinante (ver por exemplo WO 85/41958). As sequências dos clones da FSH genómica e da FSH de cDNA são conhecidas no que diz respeito às subunidades α e β de diversas espécies. São descritos em trabalhos anteriores vários métodos para a produção da FSH recombinante ou da variante da FSH utilizando a tecnologia recombinante, ver por exemplo a aplicação da patente Europeia EP 0 711 894 e a aplicação da patente Europeia EP 0 487 512. A FSH ou a variante da FSH utilizada de acordo com a presente invenção pode ser produzida não apenas através de formas recombinantes, incluindo a partir de células de mamíferos, tal como a partir das células do ovário de rato Chinês (CHO), mas podem também ser purificadas a partir de outras fontes biológicas, tal como a partir de fontes urinárias. Estão descritas em trabalhos anteriores metodologias aceitáveis. A FSH humana recombinante pode ser purificada a 15 ΡΕ2249869 partir do sobrenadante da cultura de células hospedeiras através de uma ou mais etapas de purificação. Os métodos de purificação adequados são conhecidos pelas pessoas qualificadas e incluem a cromatografia de troca iónica, a croma-tografia de interacção hidrofóbica, a cromatografia com hidroxiapatita, a cromatografia de afinidade e a filtração em gel. Os métodos para a purificação da FSH humana recombinante estão descritos por exemplo em WO 00/63248, em WO 2006/051070 e em WO 2005/063811.

Numa forma de realização preferencial da invenção, a FSH ou a variante da FSH correspondem à FSH humana ou são originadas a partir da FSH humana, respectivamente. Numa forma de realização preferencial da invenção, a FSH ou a variante da FSH são produzidas através da tecnologia recombinante.

Mais preferencialmente, a FSH é a FSH humana que tem sido produzida recombinantemente, particularmente é preferencialmente produzida em células do ovário de rato Chinês transfectadas com um vector ou vectores que compreendem DNA que codifica para a subunidade α e para a subunidade β da glicoproteína humana da FSH, quer codificada pelas SEQ ID No. 3 e 4 (= sequências de ácido nucleico de estirpe selvagem) quer pelas SEQ ID No. 5 e 6 ( = sequências de ácido nucleico de codão optimizado). 0 DNA que codifica as subunidades α e β pode estar presente no mesmo ou em diferentes vectores. 16 ΡΕ2249869 A FSH recombinante apresenta diversas vantagens sobre a sua equivalente urinária. As técnicas de cultura e de isolamento que utilizam células recombinantes permitem a consistência entre lotes. Por contraste, a FSH urinária varia bastante de lote para lote em caracteristicas como a pureza, os padrões de glicosilação, a sialilação e a oxidação das subunidades. Devido à grande consistência de lote para lote e à pureza da FSH recombinante, a hormona pode ser prontamente identificada e quantificada utilizando técnicas tais como a focagem isoeléctrica (IEF). A facilidade com que a FSH recombinante pode ser identificada e quantificada permite o enchimento dos recipientes através da quantidade da hormona (enchimento por compressão) ao invés do enchimento através de bioensaio. 0 termo "actividade da FSH" refere-se à capacidade de uma formulação da FSH eliciar respostas biológicas associadas com a FSH, tal como o aumento de peso ovariano no ensaio de Steelman-Pohley (Steelman et al. (1953) Endocrinology 53, 604 - 616), ou crescimento folicular numa paciente feminina. O crescimento folicular numa paciente feminina pode ser testado através de ultra-sons, por exemplo, em termos do número de foliculos que contêm um diâmetro médio de cerca de 16 mm no 8 o dia da estimulação. A actividade biológica é testada no que diz respeito a um padrão adequado para a FSH. O termo "diluente aquoso" refere-se a um solvente 17 ΡΕ2249869 líquido que contém água. Os sistemas de solventes aquosos podem ser constituídos unicamente por água, ou podem ser constituídos por água e por um ou mais solventes miscíveis, e podem conter solutos dissolvidos, tais como açúcares, tampões, sais ou outros excipientes. Os solventes não aquosos mais utilizados são os álcoois orgânicos de cadeia curta, tal como o metanol, o etanol, o propanol, as cetonas de cadeia curta, tal como a acetona, e os poliálcoois, tal como o glicerol. Numa forma de realização preferencial da invenção, o diluente aquoso é a água, isto é, a formulação liquida pronta a usar de acordo com a invenção é uma formulação aquosa.

Um "agente de modificação da tonicidade" ou "agente de isotonicidade" é um composto que é fisicamente tolerado e que confere uma tonicidade adequada a uma formulação para prevenir o fluxo líquido da água através das membranas das células que estão em contacto com a formulação. Os agentes adequados à isotonicidade incluem, mas não estão limitados, ao glicerol, aos aminoácidos ou proteínas (por exemplo, a glicina ou a albumina), aos sais (por exemplo, o cloreto de sódio), aos açúcares (por exemplo, a dextrose, a sacarose, o triazol e a lactose) e os açúcar-álcoois (por exemplo, o manitol e o sorbitol). 0 termo "bacteriostático" ou "agente bacterios-tático" ou "conservante" refere-se a uma composição ou substância adicionada a uma formulação e que actua como um 18 ΡΕ2249869 agente antibacteriano. Uma FSH ou uma variante da FSH conservada contendo a formulação da presente invenção cumpre preferencialmente as directrizes regulamentares ou legais para a conservação efectiva de forma a ser um produto multiuso comercialmente viável, preferencialmente em humanos.

Os bacteriostáticos utilizados nas formulações de acordo com a invenção são o cloreto de benzalcónio e o álcool benzilico em conjunto. Embora seja possível incluir outros conservantes, tal como o fenol, o m-cresol, o p-cresol, o o-cresol, o clorocresol, o alquilparabeno (o metil, o etil, o propil, o butil e outros), o cloreto de benzetónio, o di-hidroacetato de sódio ou o tiomerosal, na composição, isto é em adição com o cloreto de benzalcónio e o álcool benzilico, é preferível que apenas o cloreto de benzalcónio e o álcool benzilico estejam presentes como conservantes. 0 termo "tampão" ou "tampão fisiologicamente aceitável" refere-se a soluções ou a compostos que são conhecidos por serem seguros para a utilização farmacêutica ou veterinária em formulações e que possuem o efeito de manter ou controlar o pH da formulação na gama de pH desejada para a formulação. Os tampões adequados para controlar o pH desde um pH moderadamente acídico a um pH moderadamente básico incluem, mas não estão limitados a, tais compostos como o fosfato, o acetado, o citrato, a 19 ΡΕ2249869 arginina, o TRIS, e a histidina. Os tampões preferenciais são os tampões fosfato. 0 termo "tampão fosfato" refere-se a soluções contendo ácido fosfórico ou sais dai resultantes, ajustadas a um pH desejado. Geralmente, os tampões fosfato são preparados a partir de ácido fosfórico ou a partir de um sal do ácido fosfórico, incluindo mas não limitados a sais de sódio e de potássio. São conhecidos na área diversos sais do ácido fosfórico tais como os sais de sódio e de potássio monobásicos, dibásicos e tribásicos do ácido. Os sais do ácido fosfórico são também conhecidos por existirem como hidratos do sal em questão. Os tampões fosfato podem abranger uma gama de pH, que vai desde cerca do pH 4 até cerca do pH 10, e preferencialmente em gamas de cerca do pH 5 até cerca do pH 9, e uma gama mais preferencial de ou cerca de 6,0 a ou cerca de 8,0, e ainda mais preferencialmente de ou cerca de pH 7,0. Numa forma de realização preferencial o sistema tampão consiste unicamente num tampão fosfato, isto é, nenhum outro agente de tamponamento está presente na formulação além do fosfato. 0 termo "recipiente" refere-se em termos gerais a um reservatório adequado para manter a FSH na forma liquida num estado de controlo da esterilidade. Exemplos de um recipiente como o utilizado aqui incluem ampolas, cartuchos, embalagens blister, ou outros reservatórios adequados 20 ΡΕ2249869 para a administração da FSH ao paciente via seringa, bomba (incluindo osmótica) , cateter, sistema transdérmico, spray pulmonar ou transmucoso. Os recipientes adequados para o armazenamento de produtos para administração parentérica, pulmonar, transmucosa, ou transdérmica são bem conhecidos e reconhecidos na área. O termo "estabilidade" refere-se à estabilidade fisica, química, e conformacional da FSH nas formulações da presente invenção (incluindo a manutenção da actividade biológica). A instabilidade de uma formulação de proteínas pode ser provocada pela degradação ou pela agregação química das moléculas da proteína que formam polímeros de ordem superior, através da dissociação dos heterodimeros em monómeros, da desglicosilação, da modificação da glicosi-lação, da oxidação (particularmente da subunidade a) ou de qualquer outra modificação estrutural que reduza pelo menos uma actividade biológica de um polipeptídeo da FSH incluído na presente invenção.

Uma solução ou formulação ou composição farmacêutica "estável" é aquela em que o grau de degradação, de modificação, de agregação, de perda de actividade biológica e outros, das proteínas nela contida, está aceitavelmente controlado e não aumenta inaceitavelmente com o tempo. Preferencialmente, a formulação retém cerca de ou pelo menos 80 % da actividade da FSH e pelo menos durante um período de 6 meses a uma temperatura de cerca de ou de 2 -8°C. A actividade da FSH pode ser medida através da 21 ΡΕ2249869 utilização do bioensaio do aumento de peso ovariano de Steelman-Pohley. 0 termo "tratar" refere-se à administração, ao acompanhamento, ao controlo e/ou à assistência de um paciente a quem a administração da FSH é desejável com o propósito da estimulação folicular ou testicular ou de qualquer outra resposta fisiológica regulada pela FSH. 0 tratamento pode assim incluir, mas não estar limitado, à administração da FSH para a indução ou para a melhoria da qualidade do esperma, à estimulação da libertação da testosterona no macho, ou ao desenvolvimento folicular ou para a indução da ovulação na fêmea. A expressão "administração em multidose" ou a "utilização em multidose" pretende incluir a utilização de um único recipiente, ampola, carpule ou cartucho de uma formulação da FSH para mais que uma injecção, por exemplo para 2, 3, 4, 5, 6 ou mais injecções. As injecções são preferencialmente administradas durante um período de cerca de ou pelo menos de 12 horas, 24 horas, 48 horas, etc., preferencialmente até um período de cerca de ou de 12 dias. As injecções podem ser espaçadas no tempo, por exemplo, por um período de 6, 12, 24, 48 ou 72 horas.

Os inventores descobriram que através da formulação da FSH ou de variantes da FSH com o cloreto de benzalcónio e com o álcool benzílico como conservantes, obtinham uma formulação que apresentava uma elevada estabi- 22 ΡΕ2249869 lidade da proteína com uma boa conservação simultânea. Além disso é assumido que as composições da formulação da FSH de acordo com esta invenção apresentam uma tolerância local melhorada (por exemplo não existe irritação no ponto de injecção) quando comparadas com as formulações da FSH conhecidas na área.

Preferencialmente, o cloreto de benzalcónio está presente na formulação a uma concentração que é suficiente para manter a estabilidade da FSH durante o período de armazenamento desejado (por exemplo durante 6 a 12 a 24 meses), e também a uma concentração que seja suficiente para evitar o crescimento bacteriano.

De acordo com a invenção, a concentração do cloreto de benzalcónio na formulação líquida está preferencialmente de cerca de ou a 0, 005 mg/ml até cerca de ou a 0,05 mg/ml, mais preferencialmente de cerca de ou a 0,01 mg/ml até cerca de ou a 0,04 mg/ml, ainda mais preferencialmente a cerca de ou a 0,02 mg/ml (0,002 % (p/v)).

Preferencialmente, o álcool benzílico está pre sente na formulação a uma concentração que é suficiente para manter a estabilidade da FSH durante o período de armazenamento desejado (por exemplo durante 6 a 12 a 24 meses ) , e também a uma concentração que seja suficiente para evitar o crescimento bacteriano.

De acordo com a invenção, a concentração do 23 ΡΕ2249869 álcool benzílico nas formulações líquidas está preferencialmente de cerca de ou a 0, 5 mg/ml até cerca de ou a 20,0 mg/ml, mais preferencialmente de cerca de ou a 1,0 mg/ml até cerca de ou a 15,0 mg/ml, mais particularmente preferível de cerca de ou a 5,0 mg/ml até cerca de 12,0 mg/ml, e ainda mais preferencialmente a cerca de ou a 10,0 mg/ml (1,0 % (p/v)). A hormona estimuladora de folículo (FSH) que se encontra nas formulações líquidas de acordo com a invenção está presente preferencialmente a uma concentração de cerca de ou a 150 IU/ml a cerca de ou a 2000 IU/ml, mais preferencialmente de cerca de ou a 3000 IU/ml a cerca de ou a 1500 IU/ml, mais particularmente preferível de cerca de ou a 450 IU/ml a cerca de ou a 750 IU/ml, ainda mais preferencialmente a cerca de ou a 600 IU/ml. A bioactividade específica in vivo da FSH recombinante está normalmente dentro da gama de cerca de 8000 IU de FSH/mg de proteína a cerca de 16000 IU de FSH/mg de proteína. Por exemplo, a FSH humana recombinante no produto comercialmente disponível Puregon (da Organon) possui uma bioactividade específica de cerca de 10000 IE/mg de proteína, e para o Gonal-f da Serono a bioactividade da FSH humana recombinante é de cerca de 13600 IE/mg de proteína. A actividade da FSH pode ser determinada através de métodos conhecidos relativos à FSH e a outras - 24 - ΡΕ2249869 gonadotrofinas. Tais métodos incluem por exemplo, o ensaio da imunoactividade da enzima (EIA) ou os ensaios de genes repórter. A bioactividade é normalmente determinada pelo bioensaio descrito na European Pharmacopeia, 5th Edition para a FSH derivada de urina. Ao fazê-lo desta forma, a bioactividade é estimada através da comparação do efeito da FSH no desenvolvimento dos ovários de ratos imaturos tratados com gonadotrofinas coriónicas com o mesmo efeito de uma Preparação Padrão.

De acordo com a invenção, a concentração da FSH ou da variante da FSH na composição farmacêutica líquida encontra-se normalmente na gama de 10 a 200 pg/ml. Se a composição pretende ser utilizada para a administração em multidose, por exemplo, através da utilização de uma caneta de injecção, uma concentração recomendável da FSH ou da variante da FSH deverá estar na gama de 30 a 150 pg/ml, preferencialmente na gama de 40 a 100 pg/ml.

Em geral, a concentração da FSH irá depender da utilização (dose unitária ou multidose), da via de administração, do dispositivo de administração e da bioactividade da FSH ou da variante da FSH.

Preferencialmente, a FSH ou a variante da FSH é o único composto farmaceuticamente activo presente na composição farmacêutica, apesar de ser possível incluir outras gonadotrofinas, tal como a LH. 25 ΡΕ2249869 A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode conter adicionalmente um surfactante, preferencialmente um surfactante não iónico, de forma a prevenir a adsorção da FSH ou da variante da FSH na superfície do recipiente, da ampola, do carpule, do cartucho ou da seringa. Aqui, o surfactante não iónico diminui a tensão superficial de uma solução de proteínas, evitando assim a adsorção ou a agregação das proteínas na superfície hidrofóbica. Os exemplos preferidos dos surfactantes não iónicos que podem ser utilizados na presente invenção podem incluir um surfactante não iónico baseado no polissorbato e um surfactante não iónico baseado no poloxâmero. Estes surfactantes não iónicos podem ser utilizados sozinhos ou em qualquer combinação dai resultante. É particularmente preferido um surfactante não iónico baseado no polissorbato. Os exemplos específicos do surfactante não iónico baseado no polissorbato incluem o polissorbato 20, o polissorbato 40, o polissorbato 60 e o polissorbato 80. Mais particularmente preferível é o polissorbato 20 e o polissorbato 80, ainda mais preferencial é o polissorbato 20. O polissorbato 20 possui uma concentração micelar crítica relativamente baixa. Nesse sentido, o polissorbato 20 não só reduz ou previne a adsorção à superfície das proteínas mesmo a baixas concentrações, como também inibe uma degradação química das proteínas. A utilização de surfactante não iónico de elevada concentração na composição líquida de acordo com a invenção não é apropriada. Isto é devido à utilização do surfactante não iónico a elevadas concentrações resultar em efeitos de interfe- 26 ΡΕ2249869 rência, tornando assim difícil a avaliação com precisão da estabilidade das proteínas, quando a determinação da concentração ou a avaliação da estabilidade das proteínas é efectuada utilizando um método de análise tal como o espectroscópio de UV ou a focagem isoeléctrica. Desta forma, a formulação aquosa da presente invenção contém o surfactante não iónico a uma concentração de menos de 1,0 mg/ml e mais preferencialmente entre 0,05 a 0,5 mg/ml.

Numa forma de realização preferencial, o polis-sorbato 20 é o único surfactante presenta na formulação. Preferencialmente, as formulações da FSH da presente invenção possuem um pH entre cerca de ou de 6,0 e cerca de ou de 8,0, mais preferencialmente entre cerca de ou de 6,5 a cerca de ou de 7,5, incluindo cerca de pH 6,8, pH 7,0, pH 7,2 e pH 7,4. O tampão preferencial é o fosfato, sendo os iões de sódio ou de potássio os contra-iões preferidos.

As concentrações do tampão na solução total podem variar entre os 5 mM, os 10 mM, os 50 mM, os 100 mM, os 150 mM, os 200 mM, os 250 mM e os 500 mM. Preferencialmente, a concentração do tampão encontra-se a cerca de ou a 50 mM. É particularmente preferido um tampão a 50 mM em iões de fosfato com um pH de 7,0. O pH da formulação pode ser ajustado através da adição de um ácido ou de uma base adequados numa quantidade apropriada. Numa forma de realização, o pH da composição farmacêutica líquida é ajustado utilizando NaOH. 27 ΡΕ2249869

Preferencialmente, as formulações da invenção contêm um antioxidante, tal como a metionina, o bissulfito de sódio, os sais do ácido etilenodiamina tetracético (EDTA), o hidroxitolueno butilado (BHT), e o hidroxianisol butilado (BAH). 0 mais preferencial é a metionina. 0 antioxidante previne a oxidação da FSH (particularmente a subunidade a). A metionina na composição farmacêutica liquida está preferencialmente presente a uma concentração de cerca de ou de 0,1 mg/ml até cerca de ou 1,0 mg/ml, mais preferencialmente de cerca de ou de 0,2 mg/ml até 0,8 mg/ml, ainda mais preferencialmente de cerca de ou de 0,5 mg/ml.

Numa forma de realização preferencial, a metionina é o único antioxidante presente na formulação da invenção .

Preferencialmente, as formulações da invenção contêm um mono- ou um dissacarideo ou um açúcar-álcool como um estabilizador e um agente de regulação da tonicidade, tal como a sacarose, a dextrose, a lactose, o sorbitol e/ou o glicerol. É mais preferencial um açúcar-álcool, sendo particularmente preferível o manitol. 0 açúcar ou o açúcar-álcool está preferencialmente presente a uma concentração de cerca de ou de 1,0 até 10 mg/ml, mais preferencialmente a uma concentração de 28 ΡΕ2249869 cerca de ou de 5,0 mg/ml. Numa forma de realização, o manitol está presente na composição de acordo com a invenção numa quantidade de 5,0 mg/ml.

Numa forma de realização preferencial, o manitol é o único agente de regulação da tonicidade presente na formulação da invenção.

Numa forma de realização preferencial, a formulação de acordo com a invenção não contém qualquer gli-cina.

Numa forma de realização, a composição farmacêutica liquida da invenção contêm a FSH ou uma variante dai resultante como composto activo, o Polissorbato 20 e/ou o Polissorbato 80 como surfactante, o manitol como modificador da tonicidade, o fosfato como tampão, a metionina como agente de estabilização e o álcool benzilico e o cloreto de benzalcónio como conservantes, e água, e nenhum outro excipiente.

Como mencionado acima, a invenção fornece formulações liquidas para a utilização em doses unitárias e utilização em multidoses, contendo uma combinação de pelo menos dois agentes bacteriostáticos. As formulações da invenção são adequadas para a utilização farmacêutica ou veterinária. 29 ΡΕ2249869

Numa forma de realização, a invenção fornece um artigo de produção para a utilização farmacêutica humana, compreendendo material de embalamento e um recipiente contendo uma solução de FSH ou de uma variante da FSH e álcool benzilico e cloreto de benzalcónio, opcionalmente com tampões e/ou outros excipientes, num diluente aquoso, em que o dito material de embalamento compreende a literatura que indica que tal solução pode ser guardada por um periodo de 24 horas ou mais após a primeira utilização. 0 recipiente é preferencialmente, uma seringa, um frasco, um frasco de infusão, uma ampola ou um carpule. Mais preferencialmente, o recipiente é um carpule dentro de uma caneta de injecção.

Antes da primeira utilização, isto é, antes do selo do recipiente, do frasco, da ampola, do carpule ou do cartucho ser quebrado, as formulações da invenção podem ser guardadas pelo menos até ou cerca de 6 meses, 12 meses, ou 24 meses. Sob condições de armazenamento preferenciais, antes da primeira utilização, as composições farmacêuticas da invenção são mantidas ao abrigo da luz (preferencialmente no escuro), a temperaturas de ou cerca de 2-8°C. A formulação da invenção pode ser administrada utilizando dispositivos reconhecidos. Os exemplos contendo estes sistemas de frasco único incluem os dispositivos de caneta injectora para a administração de uma solução como os conhecidos como, ou da EasyJect®, GONAL-F® Pen, 30 ΡΕ2249869

Humaject®, Novopen®, B-D® Pen, AutoPen®, Follistim®-Pen, Puregon®-Pen e OptiPen®.

As formulações estavelmente conservadas podem ser administradas aos pacientes como soluções puras. A solução pode ser de utilização única ou pode ser reutilizada múltiplas vezes e deve ser suficiente para ciclos únicos ou múltiplos do tratamento do paciente e providenciar assim um regime de tratamento mais conveniente do que o actualmente disponível. A formulação aquosa de acordo com a invenção é uma solução pronta a usar, não existindo nenhuma reconstituição da preparação da FSH em qualquer momento. A FSH ou a variante da FSH na formulação estavelmente conservada aqui descrita pode ser administrada a um paciente de acordo com a presente invenção, via uma variedade de métodos de administração, incluindo o de injecção s.c. ou i.m., o transdérmico, o pulmonar, o trans-mucoso, o implante, o de bomba osmótica, o de cartucho, o de micro bomba, o oral, ou outros meios apreciados pelos peritos, bem conhecidos na área.

Os seguintes exemplos são fornecidos meramente para ilustrar adicionalmente a preparação das formulações e composições da invenção. O âmbito da invenção não se deve restringir somente aos seguintes exemplo. 31 ΡΕ2249869 A invenção refere-se também a um recipiente farmacêutico contendo a composição farmacêutica liquida da invenção. Os recipientes farmacêuticos adequados são conhecidos a partir de trabalhos anteriores. 0 recipiente pode, por exemplo, ser uma seringa, um frasco, um frasco de infusão, uma ampola ou um carpule. Numa forma de realização preferencial quando o recipiente é uma seringa, esta será equipada com um sistema de protecção de agulhas. Tais sistemas de protecção de agulhas que são bem conhecidos de trabalhos anteriores ajudam a reduzir o risco de lesões. Noutra forma de realização, o recipiente é um carpule dentro de uma caneta de injecção. A invenção refere-se também a um método de preparação de uma composição farmacêutica liquida de acordo com a invenção, em que a FSH ou a variante da FSH como composto activo é formulada numa preparação aquosa contendo cloreto de benzalcónio e álcool benzilico como conservantes e excipientes farmacêuticos adicionais.

Noutro aspecto a invenção refere-se à utilização de uma composição farmacêutica líquida de acordo com a invenção para administração em multidoses. A composição farmacêutica da invenção pode ser vantajosamente utilizada no tratamento da infertilidade e de outros distúrbios associados com a FSH. Numa forma de realização preferencial a formulação da FSH de acordo com a invenção é utilizada para o tratamento de um humano. No entanto, de um modo geral, a composição farmacêutica da invenção pode também 32 ΡΕ2249869 ser administrada em outros mamíferos, tal como em ovelhas, em vacas, em porcos ou em cavalos.

Verificou-se que a formulação farmacêutica líquida de acordo com a invenção exibe uma óptima estabilidade de armazenamento. Dentro do âmbito da presente invenção, o termo "armazenamento estável" significa que o conteúdo da FSH ou da variante da FSH activa ainda contém até 80 % ou mais da concentração inicial após três meses de armazenamento da formulação a 25°C. Preferencialmente, após o armazenamento durante três meses a 25°C, o restante conteúdo da actividade da FSH contém até pelo menos 85 %, mais preferencialmente até pelo menos 90 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos 95 % da actividade original. A actividade biológica da FSH ou da variante da FSH pode ser estimada através da comparação, sob determinadas condições, dos seus efeitos no desenvolvimento dos ovários dos ratos imaturos tratados com gonadotrofinas coriónicas com o mesmo efeito de uma preparação Padrão Internacional ou de uma preparação de referência calibrada em Unidades Internacionais (European Pharmacopeia, 5th Edition). A medição da actividade da FSH in vitro é por exemplo descrita por Albanese et al. (1994) Mol. Cell

Endocrinol. 101: 211-219. 33 ΡΕ2249869 A pureza da FSH ou da variante da FSH utilizada na formulação de acordo com a invenção deve ser de pelo menos 95 %, preferencialmente, de pelo menos 97 %, mais preferencialmente de pelo menos 99 % e ainda mais preferencialmente mais do que 99 %. 0 grau de pureza pode ser determinado através da análise por HPLC. Os materiais e protocolos adequados para conduzir essas análises podem ser obtidos através de fornecedores comerciais tais como a Vydac ou a TOSOH Bioscience.

Os componentes para formular as soluções de acordo com a invenção podem ser obtidos a partir de fontes convencionais, por exemplo através de companhias tais como a Sigma ou a Merck. A produção da formulação da invenção pode ser efectuada de acordo com métodos convencionais. Os componentes da formulação podem ser dissolvidos num tampão aquoso. Alternativamente, a FSH ou a variante da FSH podem ser adquiridos já num tampão aquoso como resultado do processo de purificação.

Finalmente, a formulação liquida final é introduzida num recipiente farmacêutico adequado, onde é guardada até à administração.

Os seguintes exemplos pretendem ilustrar a invenção sem limitar o seu âmbito. 34 ΡΕ2249869

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de uma FSH humana recombinante através de tecnologias recombinantes A FSH humana recombinante é produzida em células CHO hospedeiras transfectadas através de métodos padrão. Estes métodos incluem a criação de um clone de células CHO que produz a FSH humana recombinante a partir de uma ou de mais moléculas de ácido nucleico recombinante que codificam para a cadeia α e para a cadeia β da FSH humana, a cultura das células hospedeiras sob condições adequadas e a purificação da FSH humana recombinante a partir da cultura de células. Os processos adequados estão descritos em trabalhos anteriores, como mencionado anteriormente.

Numa forma de realização preferencial, a FSH humana recombinante é produzida como descrito na aplicação da patente internacional WO 2009/000913.

Exemplo 2

Formulação da FSH liquida

Uma formulação liquida que compreende a FSH humana recombinante foi preparada através da formulação dos seguintes componentes numa solução aquosa de tampão fosfato. 35 ΡΕ2249869

Componente FSH humana recombinante 600 IU/ml Polissorbato 20 0,2 mg/ml Fosfato de sódio 5 0 mM Manitol 5,0 mg/ml L-metionina 0,5 mg/ml Álcool benzílico 10,0 mg/ml Cloreto de benzalcónio 0,02 mg/ml Água para injecção pH 7,0 A bioactividade da FSH humana recombinante foi determinada como sendo cerca de 10,000 IU/ml. O valor de pH da composição foi ajustado através da adição de NaOH. Todos os componentes são de qualidade de acordo com a European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). A formulação possui uma tonicidade de 254 mOsmol/kg.

Além disso, duas formulações da FSH de trabalhos anteriores foram preparadas como formulações comparativas: A) Formulação comparativa da Gonal-f: fosfato de sódio a 10 mM, sacarose a 60 mg/ml, metionina a 0,1 mg/ml, poloxâmero 188 a 0,1 mg/ml, m-cresol a 3 mg/ml, pH 7,0. ΡΕ2249869 36 B) Formulação comparativa da Puregon: citrato de sódio a 50 mM, sacarose a 50 mg/ml, metionina a 0,5 mg/ml, polissorbato 20 a 0,2 mg/ml, álcool benzilico a 10 mg/ml, pH 7,0.

Exemplo 3

Testes de estabilidade das formulações de acordo com a presente invenção

As preparações aquosas como descrito no Exemplo 2 foram aliquotadas em 1 ml/recipiente e armazenadas a 2-8°C, a 25°C e a 37°C. Após o armazenamento durante 12 semanas a 25°C e 9 semanas a 37°C as amostras foram testadas no diz respeito a vários parâmetros de teste. O nivel de conservação foi testado de acordo com a European Pharmacopoeia, 5th edition. A % de recuperação da FSH, a % da diminuição da FSH dimérica (a dissociação da FSH nos monómeros) e a pureza da FSH foram medidas através de SE-HPLC e de SDS-PAGE . A formulação da invenção exibia mais do que 95 % de recuperação da FSH humana recombinante no armazenamento a 2-8°C, a 25°C e a 37°C. Adicionalmente, a formulação exibia menos do que 5 % de decréscimo da FSH dimérica no armazenamento a 2-8°C, a 25°C e a 37°C. Além disso, a formulação exibia mais do que 95 % de pureza da FSH no armazenamento a 2-8°C, a 25°C e a 37°C. 37 ΡΕ2249869

Face a estes resultados, pode concluir-se que a formulação aquosa da FSH contendo o Polissorbato 20 como surfactante, o manitol como modificador da tonicidade, o fosfato como tampão, a metionina como agente de estabilização e o álcool benzílico e o cloreto de benzalcónio como conservantes de acordo com a invenção previne a perda e a desnaturação de proteínas e a dissociação da proteína nos monómeros constituintes, e estabiliza a FSH durante um período de tempo prolongado. Adicionalmente, devido à sua performance de conservação benéfica a formulação é uma preparação útil para a administração em multidoses. A eficácia da conservação antimicrobiana das formulações da FSH de acordo com esta invenção foi determinada com um teste de estimulação de acordo com a European Pharmacopoeia, 5th Edition. 0 teste consiste na estimulação das composições de formulação aquosa com um determinado inoculo de microorganismos definidos, armazenando a formulação inoculada a uma temperatura determinada, retirando amostras da formulação em intervalos de tempo específicos e contando os organismos nas amostras assim removidas. As propriedades de conservação da preparação são adequadas se, existir uma quebra significativa ou não existir pelo menos aumento do número de microorganismos.

As formulações da FSH de acordo com esta invenção apresentam uma diminuição significativa no número de micro- 38 ΡΕ2249869 organismos e apresentam assim propriedades de conservação bastante boas.

Além disso, foi observado que as formulações da presente invenção apresentam uma estabilidade que é comparável à estabilidade das formulações de comparação de trabalhos anteriores, Gonal-f e Puregon.

Listagem de sequências: SEQ ID No. 1: sequência de aminoácidos da cadeia α da FSH humana SEQ ID No. 2: sequência de aminoácidos da cadeia β da FSH humana SEQ ID No. 3: sequência do ácido nucleico de estirpe selvagem que codifica para a cadeia α da FSH humana SEQ ID No. 4: sequência do ácido nucleico de estirpe selvagem que codifica para a cadeia β da FSH humana SEQ ID No. 5: sequência do ácido nucleico de codão opti-mizado que codifica para a cadeia β da FSH humana SEQ ID No. 6: sequência do ácido nucleico de codão opti-mizado que codifica para a cadeia α da FSH humana 39 ΡΕ2249869 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Biogenerix AG <120> formulação líquida da FSH <130> B 8299 < 16 0 > 6 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CADEIA <222> (1)..(116) <223> cadeia alfa da FSH humana <400> 1

«et Asp Tyr Tyr Aro Lys Tyr Ala Ala Xlê Pite ceut Vai Thr Lfiií ser 1 3 IO 1:5 vai Phe LSlí His val Ley Hls ser Ala ΡΠ3 Asp val Cl n Asp Cys Pro 20 2$ 30 oka Cys Thr L&u <sln ©lo Asrs ΑΓΟ rhe pha ser si a Pra ely a! a Pret 35 40 45 xle 5ΐίΐ cys «et c«lv cys cys pite ser Arg Alá Tyr Pre Thr pro 30 53 60 teu Arg Sèr i.y.s uys Thr «et teu Vãl Slh Lys Asa vai rhr Ser G"}y és 70 75 10 ser Thr çys Cys vai Ala i-y$ ser Tyr Asa Arg val rhr val «et sly ss so 95 Sly Lys Vai sIm Tfir Ala Cys Hi s Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His LV5 ser I1S

<210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> CADEIA <222> (1)..(129) <223> cadeia beta da FSH humana <400> 2 40 teu Phe cys Cys Trp Lys Ala ile 10 15 Asn xle Thr ile Ala il e Glu Lys 25 30 ile Asn Thr Thr Trp cys Ala Gly 45 Tyr tys ASp Pro Ala 60 Arg pro tys Glu teu Vai Tyr Glu Thr vai Arg 75 80 Asp ser Leu Tyr rhr Tyr pro vai 90 95 Cys ASp Ser Asp Ser Thr ÃSP cys 105 110 Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met lys ΡΕ2249869 mt Lys rhr Leu Gin Phe Phe Phe

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<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequência do ácido nucleico de estirpe selvagem que codifica para a cadeia alfa da FSH humana <400> 3 cttaattaag ccgceagcat ggattactac agaaaatâtg cagctatctt tctggtcaca 60 ttgtcggtgt ttetgeatgt tctccattcc gctcctgatg tgcaggattg cccagaatgc 120

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<210> 4 <211> 474 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequência do ácido nucleico de estirpe selvagem que codifica para a cadeia beta da FSH humana <400> 4 41 ΡΕ2249869 aggatcccctj ggctacctcc ctgcggggag gcgcgcccct taattaagcc gccaccatga 60 agacactcca gtttttcttc cttttctgtt gctggaaagc aatctgctgc aatagctgtg 120 agctgatcaa catcaccatt gcaatagaga ãagaagaatg tcgtttctgc ataagcatca 180 acaccacttg gtgtgctggc tactgctaca ccagggatct ggtgtataag gacccagcca 240 ggcccaaaat ccagaaaaca tgtaccttca aggaactggt atatgaaaca gtgagagtgc 300 ccggctgtgc tcaccatgca gattccttgt atacataccc agtggccacc cagtgtcact 360 gtggcaagtg tgacagcgac agcactgatt gtactgtgcg aggcctgggg cccagctact 420 gctcctttgg tgaaatgaaa gaataaacat gccatggcat gcgagctcga attc 474 <210> 5 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequência do ácido nucleico de codão optimizado que codifica para a cadeia beta da FSH humana <400> 5 aggatccccg ggtacctccc cgcggggagg cgcgcccctt aattaagccg ccaccatgaa 60 gaccttgcâg ttcttcttcc tgttctgctg ctggaaggcc atctgctgca acagctgcga 120 gctgaccaac atcaccatcg ccatcgagaa ggaggagtgc aggttctgca tçagcatcaa 180 caccacctgg tgcgccggat actgctacac cagggacctg gtgtacaagg accccgccag 240 gcccaagatc cagaagatct gcactttcaa ggagctggtg tactjagatcg tgagggtgcc 300 cggctgcgcc catcacgctg acagcctgta cacctactcc gtggccaccc agtgccactg 360 cggcaagtgc gatagtgaca gcaccgactg tatcgtgagg ggcctgggcc ccagctactg 420 cagcttcggc gagatgaagg agtaatgacc âtggcatgcg agctcgaatt c 47.1 <210> 6 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequência do ácido nucleico de codão optimizado que codifica para a cadeia alfa da FSH humana <400> 6 cttaattaag ccgccagcat ggactactac aggaagtacg ccgccatctt cctggtgacc 60 ctgagcgtgt tcctgcacgt gctgcacagc gccccagacg tgcaggactg ccccgagtgc 120 accctgcagg agaacccatt cttcagccag cccggagcct ctatcctgca gtgcatgggc 180 tgctgcttca gcagggccta ccccaccecc ctgaggagca agaagaccat gctggtgcag 240 42 ΡΕ2249869 aagaacgtga ccagcgagag cacctgetgc gtggccaaga gctacaacag ggtgaccgtg atgggcggct tcaaggtgga gaaccacacc gcctgccact gcagcacctg ctaetaccac aagagctaat ga

Lisboa, 22 de Novembro de 2011

Claims

ΡΕ2249869 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica liquida compreendendo a hormona estimuladora de foliculo (FSH) ou uma variante daí resultante, e tanto o cloreto de benzalcónio como o álcool benzílico como conservantes.
2. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com a reivindicação 1, em que o cloreto de benzalcónio está presente a uma concentração de 0,005 mg/ml-0,03 mg/ml e o álcool benzílico está presente a uma concentração de 5,0 mg/ml a 12,0 mg/ml.
3. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a FSH ou uma variante daí resultante está presente a uma concentração de 10 pg/ml a 200 pg/ml.
4. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, contendo adicionalmente a metionina como um antioxidante.
5. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, contendo adicionalmente um surfactante.
6. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com a reivindicação 5, em que o surfactante é um éster de alquilo do polioxietileno-sorbitano. 2 ΡΕ2249869
7. Uma composição farmacêutica liquida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, contendo adicionalmente um agente de regulação da tonicidade.
8. Uma composição farmacêutica liquida de acordo com a reivindicação 7, em que o agente de regulação da tonicidade é um açúcar-álcool ou um açúcar.
9. Uma composição farmacêutica liquida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que apresenta um pH na gama de 6,5 a 7,5.
10. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, contendo adicionalmente um agente de tamponamento fisiologi-camente aceitável.
11. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a composição contém a FSH ou uma variante daí resultante como composto activo, o Polissorbato 20 e/ou o Polissorbato 80 como surfactante, o manitol como modificador da tonicidade, o fosfato como tampão, a metionina como agente de estabilização e o álcool benzílico e o cloreto de benzalcó-nio como conservantes, e sem excipiente adicionais.
12. Um recipiente farmacêutico contendo uma composição farmacêutica líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes. 3 ΡΕ2249869
13. Um método para preparar uma composição farmacêutica líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, em que a FSH ou uma variante daí resultante como o composto activo é formulada numa preparação aquosa contendo tanto o cloreto de benzalcónio como o álcool benzílico como conservantes e excipientes farmacêuticos adicionais.
14. Um método para produzir uma composição farmacêutica embalada que compreende a colocação de uma solução contendo a FSH ou uma variante daí resultante, e o cloreto de benzalcónio e o álcool benzílico num frasco, numa ampola, num carpule ou num cartuxo.
15. Uma composição farmacêutica líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 para a utilização nas administrações em multidose. Lisboa, 22 de Novembro de 2011