PT1899454E - Meio de cultura sem soro para a produção de gonadotrofinas recombinantes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MEIO DE CULTURA SEM SORO PARA A PRODUÇÃO DE GONADOTROFINAS RECOMBINANTES"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está no campo do fabrico de proteínas recombinantes. Mais especificamente, refere-se à utilização de um meio de cultura sem soro compreendendo um antioxidante para reduzir o nível de formas oxidadas de gonadotrofinas diméricas recombinantes durante o seu processo de fabrico. 0 antioxidante pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em L-glutationa, 2- mercaptoetanol, L-metionina e uma combinação de ácido ascórbico e de (+)-alfa-tocoferol.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à produção de Hormona Estimuladora do Folículo (FSH) recombinante. A FSH pertence à classe das gonadotrofinas. A FSH é utilizada no tratamento de infertilidade e distúrbios reprodutores tanto em pacientes femininos como masculinos. A FSH é utilizada em pacientes femininos na indução de ovulação (10) e na híper estimulação controlada do ovário (HCO), p. ex. para tecnologias de reprodução assistida (TRA). Num regime de tratamento típico para indução de ovulação, são administradas diariamente a um paciente injeções de FSH ou de um derivado desta (cerca de 75 a 300 UI de RFSH/dia) durante um período de cerca de 6 a cerca de 12 dias. Num regime de tratamento típico para híper estimulação controlada do ovário, são administradas diariamente a um paciente injeções de FSH ou de um derivado 2 desta (cerca de 150-600 UI de RFSH/dia) durante um período de cerca de 6 a cerca de 12 dias. A FSH é também utilizada para induzir espermatogénese em homens que sofram de oligospermia. Um regime utilizando 150 UI de FSH 3 três vezes por semana em combinação com 2500 UI de hCG duas vezes por semana teve sucesso a alcançar uma melhoria na contagem de esperma em homens sofrendo de hipogonadismo hipogonadotrófico. Devido à importância da FSH no tratamento de distúrbios de fertilidade, é desejável a provisão de FSH de elevada estabilidade e de atividade altamente específica.

Na natureza, a FSH é produzida pela glândula pituitária. Para utilização farmacêutica, a FSH pode ser produzida de forma recombinante (rFSH), ou pode ser isolada a partir da urina de mulheres pós-menopausa (uFSH). O processo de fabrico da rFSH necessita de dois passos principais: cultura de uma célula geneticamente modificada expressando FSH, e purificação da proteína. A proteína é então formulada com um transportador farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica.

Para cultura de células, no passado o meio de cultura costumava ser suplementado com soro, que serviu como nutriente universal para o crescimento e a manutenção de todas as linhas celulares de mamífero. No entanto, o evento de BSE (Encefalopatia Espongiforme Bovina), uma doença neuro-degenerativa transmissível de gado com um longo período de latência ou incubação, levantou preocupações de regulação sobre a utilização de soros derivados de animais na produção de produtos biologicamente ativos. Portanto, é atualmente preferido produzir proteínas recombinantes utilizando meios sem soro. Tais meios são bem conhecidos na 3 técnica e comercializados por várias companhias tais como p. ex., Sigma, BioWhittaker, Gibco BRL, Cambrex and JRH.

Um dos problemas encontrados quando se armazena rFSH é a presença de formas oxidadas de FSH. Para resolver parcialmente este problema, pode ser adicionado um antioxidante à composição farmacêutica para estabilizar a proteína FSH durante o armazenamento antes da administração ao paciente a necessitar de tratamento. Por exemplo, EP 0 853 945 (Skrabanja e Van den Oetelaar, 1998) descreve formulações líquidas contendo gonadotrofina em mistura com um estabilizador tal como, p. ex., citrato de sódio a 25-100 mM e L-metionina a 1-10 mM. É mostrado que tais formulações permitem o armazenamento de formulações de FSH durante tempos mais longos. WO 92/15614 (Takruri H., 1992) refere-se também a um método para inibição da oxidação de um polipéptido num líquido ou numa composição farmacêutica semilíquida tal como, p. ex., um meio de armazenamento ou uma solução oftálmica aquosa. Especificamente, WO 92/15614 mostra que uma solução oftálmica ou um unguento oftálmico compreendendo L-metionina a uma concentração de 10 mg/L estabiliza o Fator de Crescimento Epidérmico Humano. No entanto, os documentos acima apenas divulgam a utilização de um antioxidante numa formulação farmacêutica, e não num meio de cultura.

Aminoácidos e compostos que exibam atividade antioxidante podem também ser adicionados ao meio de cultura, como nutrientes, ou para proteção de linhas celulares de morte celular. Por exemplo, a patente U.S. No. 4,560,655 divulga um meio sem soro compreendendo aproximadamente 30 mg/L de L-metionina, sendo o referido meio utilizado para cultura de células testiculares de suíno, células de mieloma AG14 e 4 células de baço de murídeo. WO 95/12664 ensina um método através do qual a desvantagem devida a quantidades insuficientes de vários fatores limitadores do crescimento, um deles sendo o aminoácido L-metionina, pode ser superada para uma determinada linha celular. Especificamente, WO 95/12664 ensina um método para adaptação da linha celular CHO E5F3G, que expressa M-CSF humano, para crescer a uma maior densidade celular. Neste método, as células CHO E5F3G são criadas num meio compreendendo 104 mg/L de L-metionina (ver o Exemplo e a Tabela 2) . Yun et al. ensina que a adição de uma combinação de glutationa e de quelantes de ferro ao meio de cultura reduz a morte celular de células CHO (Yun et al., 2003) . Saito et al. ensina ainda que vários antioxidantes podem ser utilizados em meios de cultura para proteger uma linha celular de morte celular (Saito et al., 2003). No entanto, WO 95/12664, patente U.S. No. 4,560, 655, Yun et al. e Saito et al. são silenciosos sobre o potencial efeito (se houver) dos aminoácidos, da glutationa e de quelantes de ferro no estado de oxidação da proteina recombinante produzida pela linha celular. Em conclusão, estes documentos apenas divulgam a utilização de L-metionina ou de glutationa combinada com quelantes de ferro para melhorar o crescimento e/ou a viabilidade das células cultivadas. WO 99/50390 refere-se a um meio de cultura para a produção de interferão-α a partir de leucócitos, compreendendo o referido meio de cultura metionina. É demonstrado através de HPLC que a qualidade da proteina interferão-α após purificação é melhorada após adição de metionina ao meio de cultura. Os inventores de WO 99/50390 colocaram a hipótese de esta melhoria poder ser devida a menor oxidação da proteina interferão-α. WO 99/50390 indica ainda que uma 5 quantidade demasiado baixa de metionina resulta num efeito menor, e que uma quantidade demasiado elevada causa menores rendimentos de interferão. Especificamente, WO 99/50390 ensina que um intervalo de cerca de 50 a 100 mg/L é um intervalo especificamente preferido quando se produz interferão-α a partir de leucócitos. Adicionalmente, WO 99/50390 apenas contempla um meio para a produção de interferão-α, que é uma proteína monomérica. WO 99/50390 não menciona nem sugere um meio para a produção de hormonas diméricas tais como, p. ex., FSH, que é unicamente segregada após dimerização (Matzuk et ai., 1988).

Em resumo, nenhum dos documentos mencionados acima se refere à utilização de um antioxidante num meio de cultura sem soro para redução da oxidação de gonadotrofinas diméricas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na descoberta inesperada de que, já durante o fabrico de rFSH, surgem formas oxidadas de rFSH no sobrenadante da cultura celular. Além disso, a produção de rFSH em meio sem soro conduz a níveis mais elevados de formas oxidadas que a produção de rFSH em meio contendo soro. No quadro da presente invenção, verificou-se surpreendentemente que os níveis de formas oxidadas de rFSH podem ser reduzidos não só durante o armazenamento, como também durante o passo de cultura. Esta redução é alcançada sem prejudicar a produtividade. A redução é realizada através da adição de um antioxidante ao meio de cultura. Especificamente, verificou-se que a suplementação de um meio sem soro com (i) 2-mercaptoetanol, (ii) uma combinação de ácido ascórbico e (+)-alfa-tocoferol, (iii) L-metionina, ou (iv) L-glutationa durante a cultura de células 6 expressando rFSH reduz os níveis de formas oxidadas de rFSH.

Portanto, num primeiro aspeto, a invenção refere-se à utilização de um meio de cultura sem soro para reduzir os níveis de formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico, caracterizada por o referido meio de cultura compreender um antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 a cerca de 400 mg/L; e uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

Num segundo aspeto, a invenção descreve um método de redução dos níveis de formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico, caracterizado por as células expressando a referida gonadotrofina dimérica recombinante serem cultivadas num meio de cultura sem soro compreendendo um antioxidante.

Um terceiro aspeto da invenção descreve um meio de cultura sem soro para a produção de gonadotrofinas diméricas recombinantes caracterizado por o referido meio de cultura compreender um antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: 7 L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 a cerca de 500 mg/L; e uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção surge da descoberta de que os níveis de formas oxidadas de rFSH podem ser significativamente reduzidos após cultura de células que expressam rFSH num meio sem soro compreendendo antioxidantes. Tal como mostrado no Exemplo 3, um de (i) 2-mercaptoetanol, (ii) uma combinação de ácido ascórbico e (+)-alfa-tocoferol, (iii) L-metionina ou (iv) L-glutationa é particularmente vantajoso para reduzir os níveis de formas oxidadas de rFSH durante o processo de cultura. Importantemente, esta redução pode ser alcançada sem prejudicar a viabilidade e o metabolismo da célula, e sem prejudicar os títulos de rFSH.

Portanto, um primeiro aspeto da presente invenção é dirigido à utilização de um meio de cultura sem soro para reduzir os níveis de formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico, caracterizada por o referido meio de cultura compreender um antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 a cerca de 400 mg/L; e uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

De preferência, o meio de cultura sem soro de acordo com a presente invenção compreende L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1, 1,5, 2 a cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 mg/L. De maior preferência, o meio de cultura sem soro compreende L-glutationa a uma concentração de cerca de 2,5 ou 3 mg/L. Tal como aqui se utiliza, "glutationa" é utilizado alternadamente com "L-glutationa".

De preferência, o meio de cultura sem soro de acordo com a presente invenção compreende 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5, 6, 7, 8, 9 a cerca de 11, 12, 13, 14 ou 15 mg/L. De maior preferência, o meio de cultura sem soro compreende 2-mercaptoetanol a uma concentração de cerca de 10 mg/L.

De preferência, o meio de cultura sem soro de acordo com a presente invenção compreende uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e ( + ) -alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L. De maior preferência, um tal meio compreende (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5, 8, 10 ou 12 a cerca de 16, 18, 20, 22 ou 25 mg/L, e ácido ascórbico a uma 9 concentração variando de cerca de 15, 20 ou 25 a cerca de 35, 40 ou 45 mg/L. De maior preferência, tal meio de cultura sem soro compreende (+)-alfa-tocoferol a uma concentração de cerca de 14 mg/L, e ácido ascórbico a uma concentração de cerca de 30 mg/L. Tal como aqui se utiliza, "(+)-alfa-tocoferol" é utilizado alternadamente com "vitamina A", e "ácido ascórbico" é utilizado alternadamente com "L-ácido ascórbico".

De preferência, o meio de cultura sem soro de acordo com a presente invenção compreende L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 ou 245 mg/L a cerca de 300, 325, 350, 375, ou 400 mg/L. De maior preferência, o meio de cultura sem soro compreende L-metionina a uma concentração de cerca de 250 mg/L. Tal como aqui se utiliza, "metionina" é utilizada alternadamente com "L-metionina".

Qualquer meio de cultura sem soro pode ser suplementado com antioxidantes de acordo com a presente invenção. Meios sem soro comercialmente disponíveis que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem, p. ex., SFM 90 (JRH, 67350), SFM 90.1 (JRH, 67350), Supmed300 ou Supmed300 modificado (JRH, 67350), DMEM (Gibco, 7490571), DMEM/F12 (Gibco, 99.5043), SFM CHO 3a (BioWhittaker), CHO PFM (Sigma, C6970), ProCHO 5, meios EX-CELL tal como EX-CELL 302 (JRH, N°. de Catálogo 14312-1000M) ou EX-CELL 325 (JRH, N°. de Catálogo 14335-1000M), CHO-CD3 (Sigma, N°. de Catálogo C-1490), CHO III PFM (Gibco, N°. de Catálogo 96-0334SA), CHO-S-SFM II (Gibco, N°. de Catálogo 12052-098), CHO-DHFR (Sigma, N°. de Catálogo C-8862), ProCHO 5 (Cambrex, N°. de Catálogo BE12-766Q), SFM4CHO (HyClone, N°. de Catálogo SH30549.01), Ultra CHO (Cambrex, N°. de 10

Catálogo 12-724Q), HyQ PF CHO (HyClone, N° . de Catálogo SH30220.01), HyQ SFX CHO (HyClone, N°. de Catálogo SH30187.01), HyQ CDM4CH0 (HyClone, N°. de Catálogo SH30558.01), IS CHO -CD (Irvine Scientific, N°, de Catálogo #91119), IS CHO-V (Irvine Scientific, N° . de Catálogo #9197) e derivados destes. A composição de SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3a e CHP PFM, que pode ser utilizada de acordo com a presente invenção, é mostrada na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Composição de cinco meios de cultura sem soro comercialmente disponíveis que podem ser utilizados no quadro da presente invenção

Meio SFM 90 SFM 90.1 Supmed 300 modifi cado DMEM DMEM/F 12 SFM CHO 3a CHO PFM FORNECEDOR E REFERÊNCIA JRH 67350 JRH 67350 JRH 67350 Gibco 7490571 Gibco 99,504 3 BioWhitta ker Sigma C6970 mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L mg/L AMINOÁCIDOS L-ALANINA 23,36 23, 36 23, 36 84, 00 4,45 26, 73 15 Ácido L-alfa-amino-butírico L-ARGININA 585,04 585,04 585,04 820,4 200 L-ARGININA HCL 147,50 L-ASPARAGINA H20 442,07 442,07 442,07 7,50 689, 4 30 L-ASPARTATO 341,29 341,29 341,29 6, 65 458,93 15 L-CISTEÍNA L-CISTEÍNA HC1 H20 92,19 92,19 92,19 17,56 96, 68 138 L-CISTINA L-CISTINA 2HC1 23,46 23, 46 23, 46 31,29 0 L-GLUTAMATO 39,34 39, 34 39, 34 7,35 44,13 20 L-GLUTAMINA 1204,50 1204,50 1204,50 584,00 365,00 0 0 GLICINA 247,24 247,24 247,24 30,00 18,75 317,11 20 L-HISTIDINA L-HISTIDINA HC1, H20 70,77 70,77 70,77 42, 00 31,48 109, 2 100 HIDROXIPROLINA 0 11

Meio SFM 90 SFM 90.1 Supmed 300 modifi cado DMEM DMEM/F 12 SFM CHO 3a CHO PFM L-ISOLEUCINA 248,62 248,62 248,62 105,00 54,47 299,17 140 L-LEUCINA 368,66 368,66 368,66 105,00 59,05 490,11 150 L-LISINA 1880,70 1880,70 1880,70 146,00 582,04 200 L-LISINA-HCL 91,25 L-METIONINA 115,11 115,11 115,11 30,00 17,24 154,55 50 L-ORNITINA HCL L-FENILALANINA 37,77 37,77 37,77 66, 00 35,48 33,59 100 L-PROLINA 90,56 90,56 90,56 1500,00 17,25 140,67 200 L-SERINA 417,79 417,79 417,79 42,00 26,25 563,66 100 CISTINA SÓDICA 50,21 L-TREONINA 562,46 562,46 562,46 95, 00 53,45 741,57 125 L-TRIPTOFANO 5 6,66 5 6,66 5 6,66 16, 00 9,02 91,23 100 L-TIROSINA L-TIROSINA 2Na 2HzO 145,52 145,52 145,52 90,00 55,79 172,848 120 L-VALINA 329,66 329,66 329,66 94,00 52,85 96, 9 125 SAIS CaCl2 ANIDRO 87,45 87,45 87,45 199,32 116, 6 200,0085 65, 9 Ca (N03) 2 4H20 0 CuC12 0,034 CuS04 5H20 0,000938 0,000938 0,000938 0,0013 95 0 FeCl3 1 FeN03 9H20 0,04 0,04 0,04 0,1 0,05 0 FeS04 7H20 0,313 0,313 0,313 0,417 8612 0 KC1 569,25 569,25 569,25 400 311,8 199, 1 400 kno3 0 K3P04 0 MgCl2 ANIDRO 107,29 107,29 107,29 28,64 155 MgS04 ANIDRO 36, 63 36, 63 36, 63 97,6 48,84 77,32 0 MnCl2 0 MnS04 0,17 0,17 0,17 0 MnS04 H20 Na2HP04 71,02 Na2HP04 H20 53,4 53,4 53,4 66,206 142 Ncl^SsC^ 0,324 0,324 0,324 0,001 NaCl 5520 5520 5520 6400 6995,5 3300 5000 NaH2P04 ANIDRO 46, 88 46, 88 46, 88 108,5115 125 0 NaH2P04 H20 62,5 NaHC03 0,0375 0,0375 0,0375 0 ZnCl2 8,18 ZnS04 7H20 0,31275 0,31275 0,31275 0,432 3,329 0 ELEMENTOS VESTIGIAIS AgN03 0,00017 0,00017 0,00017 A1C13 6H20 0,00217 0,00217 0,00217 BcL (C2H3O2 ) 2 0,00255 0,00255 0,00255 CdCl2 ANID. 0,001806 0,001806 0,001806 CdS04 CoCl2 0,00238 0,00238 0,00238 CoCl2 6H20 Cr (S04) 3 CrCl3 12

Meio SFM 90 SFM 90.1 Supmed 300 modifi cado DMEM DMEM/F 12 SFM CHO 3a CHO PFM CrCl3 6H20 0,00039 0,00039 0,00039 Gs02 0,00053 0,00053 0,00053 H2Se03 KBr 0,00012 0,00012 0,00012 Kl 0,00017 0,00017 0,00017 LiCl (NH3)2Mo04 7H20 Na2Si03 9H20 0,14 0,14 0,14 Na6Mo7024 NaF 0,0042 0,0042 0,0042 (NH3) 5MO7O24 4H20 0,00124 0,00124 0,00124 nh4vo3 0,00065 0,00065 0,00065 NíC12 NíS04 6H20 0,00013 0,00013 0,00013 RbCl 0,00121 0,00121 0,00121 SnCl2 SnCl2 2HzO 0,00012 0,00012 0,00012 TiCl2 ZrOCl2 8H20 0,00322 0,00322 0,00322 HIDRATOS DE CARBONO L-GLICOSE L-FRUTOSE L-MANOSE 3225 3225 3225 4500 3,5 4300 4500 0 0 VITAMINAS ÁCIDO ASCÓRBICO BIOTINA 2,02 2000 2000 0,0035 0,032 0,5 CLORETO DE COLINA 40,13 40,13 40,13 4 8,98 86, 88 70 CIANOCOBALAMIN A(B12) 3,57 3,57 3,57 0,68 1,288 6, 8 D PANTOTENATO de Ca 4,76 4,76 4,76 4 2,24 3,544 20 ÁCIDO DL ALFA-LIPÓICO 0 ACETATO DE DL ALFA-TOCOFEROL 0,7 0,7 0,7 0 FOLATO 6, 9 6, 9 6, 9 4 2,65 13,002 20 I-INOSITOL 53, 9 53, 9 7,2 MIO-INOSITOL 53, 9 12,6 69,23 90 NIACINAMIDA 3, 6 3, 6 3, 6 2,02 20 NICOTINAMIDA 4 2,0898 PIRIDOXAL HC1 3,5 3,5 3,5 4 0 PIRIDOXINA HC1 0,163 0,163 0,163 0,031 2,3651 20 RIBOFLAVINA 0,45 0,45 0,45 0,4 2 0,5128 0,188 PANTOTENATO DE SÓDIO TIAMINA HC1 4,3 4,31 4,31 4 2, 17 2,471 10,85 TOCOFEROL 24 13

Meio SFM 90 SFM 90.1 Supmed 300 modifi cado DMEM DMEM/F 12 SFM CHO 3a CHO PFM LÍPIDOS ÁCIDO ARAQUIDÓNICO 0,02 20 20 0,595 COLESTEROL 2,2 2,2 2,2 0 ÓLEO DE FÍGADO DE BACALHAU 0 ÁCIDO LÁURICO 0,595 ÁCIDO LINOLEICO 0,321 0,321 0,321 0,042 700 0,595 ÁCIDO LINOLÉNICO 0,1 0,1 0,1 0 ÁCIDO LIPÓICO 0,105 0,788 ÁCIDO MIRÍSTICO 0,1 0,1 0,1 0,595 LINOLEATO DE Na 0,273 ÁCIDO OLEICO, Sal de Na 0,108 0,108 0,108 0,595 ÁCIDO PALMÍTICO 0,1 0,1 0,1 0 ÁCIDO PALMITOLEICO 0,1 0,1 0,1 0 ÁCIDO ESTEÁRICO 0,1 0,1 0,1 0 ÁCIDO TIÓCTICO 0 DIVERSOS 2- MERCAPTOETANOL ÁCIDO CÍTRICO (Na) 3 59 CICLODEXTRINA EDTA (Na)4 10 CITRATO FeNH3 CITRATO FÉRRICO 122,500 12,250 HIPOXANTINA 14,550 14,550 14,550 2,390 L-GLUTATIONA MOPS PIRUVATO DE Na 288,750 288,750 288,750 110,000 55,000 421,67 110 PABA VERMELHO FENOL 15 0 PUTRESCINA, 2HC1 0,423 0,423 0,423 0,081 0,9763 4 TIMIDINA 1,916 1,916 1,916 0,365 DETERGENTES E TAN 0 LAMINA HC1 FB 9,79 9,79 9,79 PLURONIC F68 1,00E+03 1,00E+03 0 1000 TWEEN 80 COMPLEMENTOS 2 HP-BETA-CICLODEXTRINA 14

Meio SFM 90 SFM 90.1 Supmed 300 modifi cado DMEM DMEM/F 12 SFM CHO 3a CHO PFM ÁCIDO AURINTRICARBO- XÍLICO 6,3 FETUÍNA ΗIDROCORTIS ΟΝΑ 0,5 0,5 0,5 3, 6 HyPep 4601 2500 Hy-Soy 0,2 1000 IGF-1 INSULINA 10 1 5 2 LIPOSSOMAS 1200 METIL-BETA- CICLODEXTRINA 115,85 PRIMATONA TRANSFERRINA Aditivos GLUTAMINA N3.2CO3 1250 2100 HEPES 2234,250 2234,250 2234,250 4766 5000 3574,5 pH especificado 7 7,2-7,4 TOTAL (g/L) 18545,60 20444,32 19431,07 16176,34 8840,2 9 27556,20 17292,18

Numa forma de realização preferida da presente invenção, o meio de cultura sem soro é um meio quimicamente definido, i.e., um meio preparado a partir de ingredientes purificados e portanto cuja composição exata é conhecida. Especificamente, o meio quimicamente definido não contém componentes derivados de animais nem hidrolisados indefinidos.

As gonadotrofinas que podem ser produzidas de acordo com a presente invenção incluem a hormona luteinizante (LH; Entrada OMIM No. 152780), a hormona estimuladora do foliculo (FSH; Entrada OMIM No. 136530), a gonadotrofina coriónica, (CG; Entrada OMIM No. 118860) e a hormona estimuladora da tiroide (TSH; Entrada OMIM No. 188540). As gonadotrofinas são hormonas diméricas. Cada uma destas hormonas consiste num dimero não covalente de subunidades alfa e beta. A subunidade alfa é a mesma para todas as 4 15 hormonas (Entrada OMIM No. 118850), e as subunidades beta definem a função endócrina do dímero (Talmadge et al., 1983).

Numa forma de realização preferida da presente invenção, a gonadotrof ina é FSH humana. Tal como aqui se utiliza, o termo "FSH" refere-se a uma proteína dimérica constituída por uma subunidade alfa correspondendo à Entrada SwissProt No. P01215 e por uma subunidade beta correspondendo à Entrada SwissProt No. P01225. Uma vez que FSH é uma proteína solúvel segregada, é libertada para o sobrenadante da cultura celular, por meio do seu péptido sinal natural ou por meio de um péptido sinal heterólogo, i.e. um péptido sinal derivado de outra proteína segregada que possa ser mais eficiente no sistema de expressão particular utilizado. O termo FSH inclui ainda variantes de processamento, variantes alélicas, muteínas, derivados funcionais, frações ativas, proteínas fundidas e proteínas permutadas circularmente de uma proteína dimérica constituída por uma subunidade alfa correspondendo à Entrada SwissProt No. P01215 e por uma subunidade beta correspondendo à Entrada SwissProt No. P01225.

Tal como aqui se utiliza o termo "muteína" refere-se a análogos de FSH, nos quais um ou mais dos resíduos de aminoácidos de uma FSH natural ou FSH virai são substituídos por diferentes resíduos de aminoácidos, ou são suprimidos, ou um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à sequência natural de FSH, sem mudar consideravelmente a atividade dos produtos resultantes em comparação com a FSH selvagem. Estas muteínas são 16 preparadas através de síntese conhecida e/ou através de técnicas de mutagénese dirigida ao local, ou qualquer outra técnica conhecida adequada para tal.

As muteínas de acordo com a presente invenção incluem proteína codificadas por um ácido nucleico, tal como ADN ou ARN, que híbrida com ADN ou ARN, que codifica uma FSH sob condições rigorosas. 0 termo "condições rigorosas" refere-se às condições de hibridação e subsequente lavagem, que os vulgares peritos na técnica referem convencionalmente como "rigorosas" (ver, p. ex., Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", supra, Interscience, N.Y., §§6.3 e 6.4, 1987, 1992). Sem limitação, exemplos de condições rigorosas incluem condições de lavagem a 12-20°C, abaixo da Tm calculada do híbrido em estudo em, p. ex., SSC 2x e SDS a 0,5% durante 5 minutos, SSC 2x e SDS a 0,1% durante 15 minutos; SSC Ο,ΐχ e SDS a 0,5% a 37°C durante 30-60 minutos e depois, SSC 0,1χ e SDS a 0,5% a 68°C durante 30-60 minutos. Os vulgares peritos na técnica compreendem que as condições de rigor também dependem do comprimento das sequências de ADN, das sondas oligonucleotídicas (tais como 10-40 bases) ou das sondas oligonucleotídicas mistas. Se forem utilizadas sondas mistas, é preferível utilizar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel, supra.

Numa forma de realização preferida, uma muteína de FSH tem pelo menos uma identidade de 40% com a sequência de uma FSH de ocorrência natural. De preferência, tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou, de maior preferência, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com esta. 17 A identidade reflete uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotidicas, determinada através da comparação das sequências. Em geral, a identidade refere-se a uma correspondência exata nucleótido a nucleótido ou aminoácido a aminoácido dos dois polinucleótidos ou das duas sequências polipeptídicas, respetivamente, ao longo do comprimento das sequências a comparar.

Para sequências onde não existe uma correspondência exata, pode ser determinada uma "% de identidade". Em geral, as duas sequências a comparar são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de "intervalos" numa ou em ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento de cada uma das sequências a comparar (designado "alinhamento global"), o que é particularmente adequado para sequências do mesmo comprimento ou de um muito semelhante, ou ao longo de comprimentos definidos mais curtos (designado "alinhamento local"), o que é mais adequado para sequências de comprimento desigual. No quadro da presente invenção, a "% de identidade" refere-se à percentagem global de identidade que foi determinada ao longo de todo o comprimento de cada uma das sequências a comparar.

Podem ser utilizados programas de computador conhecidos para determinar se qualquer polipéptido particular é percentualmente idêntico a uma sequência da presente invenção. Tais algoritmos e programas incluem, p. ex. TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA e CLUSTALW (Altschul et al. , 1990; Altschul et al., 1997; Higgins et al., 1996; Pearson e Lipman, 1988; Thompson et al., 1994). As homologias das 18 sequências proteicas e de ácido nucleico são de preferência avaliadas utilizando a Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), que é bem conhecida na técnica (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997; Karlin e Altschul, 1990) .

Os programas BLAST identificam sequências homólogas através da identificação de segmentos semelhantes, que são aqui referidos como "pares de segmentos de registo elevado", entre uma sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico de pesquisa e uma sequência de teste que é de preferência obtida a partir de uma base de dados de sequências proteicas ou de ácido nucleico. Os pares de segmentos de registo elevado são de preferência identificados (i.e., alinhados) por meio de uma matriz de registo, muitas das quais são conhecidas na técnica. A matriz de registo utilizada pode ser a matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992; Henikoff e Henikoff, 1993) . As matrizes PAM ou PAM250 podem também ser utilizadas (Ver, p. ex., Schwartz e Dayhoff, eds, (1978) "Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure", Washington: National Biomedical Research Foundation). Os programas BLAST avaliam a significância estatistica de todos os pares de segmentos de registo elevado identificados, e selecionam de preferência os segmentos que satisfazem um limiar de significância especificado pelo utilizador, tal como uma percentagem de homologia especificada pelo utilizador. De preferência, a significância estatistica de um par de segmentos de registo elevado é avaliada utilizando a fórmula de significância estatistica de Karlin (Karlin e Altschul, 1990). Os programas BLAST podem ser utilizados com os parâmetros por defeito ou com parâmetros modificados proporcionados pelo utilizador. 19

Um método preferido para determinação da melhor correspondência global entre uma sequência de pesquisa (uma sequência da presente invenção) e uma sequência sujeita, também referido como alinhamento global de sequências, pode ser determinado utilizando o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag (Brutlag et ai., 1990) . Num alinhamento de sequências, as sequências de pesquisa e sujeita são ambas sequências de aminoácidos. O resultado do referido alinhamento global de sequências é em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento de aminoácidos FASTDB são: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, Penalidade de Desemparelhamento=l, Penalidade de Junção=20, Grupo de Randomização=25, Comprimento=0, Registo de Separação=l, Tamanho da Janela=comprimento da sequência, Penalidade de Intervalo=5, Penalidade de Tamanho do lntervalo=0,05, Tamanho da Janela=247 ou o comprimento da sequência de aminoácidos sujeita, o que for mais curto.

Se a sequência sujeita for mais curta que a sequência de pesquisa devido a deleções no terminal N ou C, não devido a deleções internas, os resultados, em percentagem de identidade, têm de ser manualmente corrigidos porque o programa FASTDB não conta com truncagens N e C-terminais da sequência sujeita quando calcula a percentagem de identidade global. Para sequências sujeitas truncadas nos terminais N e C, relativamente à sequência de pesquisa, a percentagem de identidade é corrigida através do cálculo do número de resíduos da sequência de pesquisa que são N e C-terminais à sequência sujeita, que não coincidem/alinham com um resíduo sujeito correspondente, como percentagem das bases totais da sequência de pesquisa. Um resíduo coincidir/alinhar é determinado através dos resultados do alinhamento de sequências FASTDB. Esta percentagem é então 20 subtraída da percentagem de identidade, calculada através do programa FASTDB de cima utilizando os parâmetros especificados, para chegar a um registo final da percentagem de identidade. Este registo final da percentagem de identidade é o que é utilizado para os fins da presente invenção. Apenas os resíduos do terminal N ou C da sequência sujeita, que não coincidem/alinham com a sequência de pesquisa, são considerados para fins de ajuste manual do registo da percentagem de identidade. Isto é, apenas os resíduos de aminoácidos de pesquisa fora dos resíduos N e C-terminais mais afastados da sequência sujeita.

Por exemplo, uma sequência sujeita de 90 resíduos de aminoácidos é alinhada com uma sequência de pesquisa de 100 resíduos para determinar a percentagem de identidade. A deleção ocorre no terminal N da sequência sujeita e, portanto, o alinhamento FASTDB não coincide/alinha com os primeiros resíduos no terminal N. Os 10 resíduos desemparelhados representam 10% da sequência (número de resíduos nos terminais N e C não coincidentes/número total de resíduos na sequência de pesquisa), assim são subtraídos 10% do registo da percentagem de identidade calculada através do programa FASTDB. Se os 90 resíduos restantes fossem perfeitamente coincidentes a percentagem de identidade final seria de 90%.

As mudanças preferidas para muteínas de acordo com a presente invenção são as que são conhecidas como substituições "conservativas". Substituições conservativas de aminoácidos de FSH podem incluir aminoácidos sinónimos dentro de um grupo que tenha propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes de forma que a substituição 21 entre membros do grupo conservará a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É claro que inserções e deleções de aminoácidos podem também ser feitas nas sequências acima definidas sem alterar a sua função, particularmente se as inserções ou deleções apenas envolvem alguns aminoácidos, p. ex., abaixo de trinta e de preferência abaixo de dez, e não removem ou deslocam os aminoácidos que são criticos para uma conformação funcional, p. ex., resíduos de cisteína. As proteínas e muteínas produzidas por tais deleções e/ou inserções entram na alçada da presente invenção. 0 termo "proteína de fusão" de FSH refere-se a um polipéptido compreendendo FSH, uma muteína ou um fragmento desta, fundido com outra proteína, que, p. ex., tem um tempo de residência prolongado nos fluidos corporais. A FSH pode por exemplo ser fundida com uma imunoglobulina ou um fragmento desta tal como uma porção Fc de imunoglobulina. A sequência da FSH madura pode ser fundida com um péptido sinal e/ou com uma sequência líder permitindo uma maior secreção.

Numa concretização preferida da invenção, a subunidade beta de FSH ou um fragmento desta é fundido com o péptido carboxi-terminal (CTP) da subunidade beta de hCG. A proteína resultante tem atividades de ligação ao recetor in vitro e biológicas idênticas às de FSH, mas uma maior semivida em circulação (LaPolt et al., 1992).

Como "fração ativa" de FSH ou de muteínas desta, a presente invenção cobre qualquer fragmento ou precursores da cadeia polipeptídica da molécula da proteína sozinhos ou junto com moléculas associadas ou resíduos ligados a estas, p. ex., 22 resíduos de açúcar ou fosfato, ou agregados da molécula proteica ou os resíduos de açúcar por si próprios, desde que a referida fração tenha uma atividade substancialmente semelhante à de FSH. "Derivados funcionais" de FSH tal como aqui se utiliza, cobrem derivados de FSH ou uma muteína desta, que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos ou nos grupos N ou exterminais, através de meios conhecidos na técnica, e estão incluídos na invenção desde que permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, i.e. não destroem a atividade da proteína que é substancialmente semelhante à atividade da gonadotrofina, e não conferem propriedades tóxicas às composições que as contêm. Estes derivados podem, por exemplo, incluir cadeias laterais de polietilenoglicol, que podem mascarar locais antigénicos e prolongar a residência da FSH nos fluidos corporais. Outros derivados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxilo, amidas dos grupos carboxilo através de reação com amónia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados N-acilo de grupos amino livres dos resíduos de aminoácidos formados com porções acilo (p. ex. grupos alcanoilo ou aroílo carbocíclico) ou derivados O-acilo de grupos hidroxilo livres (por exemplo o dos resíduos serilo ou treonilo) formados com porções acilo. Numa concretização preferida, o derivado funcional corresponde a uma molécula de FSH apresentando glicosilação adicional. 0 termo "sais" de FSH aqui refere-se tanto a sais dos grupos carboxilo como a sais de adição ácida dos grupos amino de FSH. Os sais de um grupo carboxilo podem ser formados através de meios conhecidos na técnica e incluem 23 sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amónio, férricos ou de zinco, e semelhantes, e sais com bases orgânicas tais como as formadas, por exemplo, com aminas, tais como trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaina e semelhantes. Sais de adição ácida incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Claro que, qualquer um desses sais tem de manter a atividade biológica da gonadotrofina.

Tal como aqui se utiliza, o termo "gonadotrofina dimérica recombinante" refere-se a uma gonadotrofina que foi produzida após cultura de uma célula geneticamente modificada. A gonadotrofina pode ser produzida numa célula de qualquer origem. A célula geneticamente modificada expressando uma gonadotrofina dimérica expressou ambas as subunidades da referida gonadotrofina dimérica.

Tal como aqui se utiliza, o termo "célula geneticamente modificada" refere-se a uma célula na qual o ADN exógeno foi introduzido de modo a permitir a expressão de ambas as subunidades da gonadotrofina desejada. 0 ADN exógeno pode compreender uma sequência codificando para as subunidades da gonadotrofina desejada. Alternativamente, o ADN exógeno pode compreender uma sequência que ativa a expressão da sequência endógena codificando para as subunidades da gonadotrofina desejada (ver, p. ex., WO 91/09955).

As células podem ser de origem, p.ex. animal, de inseto ou microbiana. Tal como aqui se utiliza, o termo "célula animal" inclui células humanas e de mamífero não humano, células sem ser de mamífero e hibridomas. Exemplos de 24 células de mamífero nas quais uma gonadotrofina dimérica recombinante pode ser produzida incluem, p. ex., células 3T3, células COS, células de osteossarcoma humano, células MRC-5, células BHK, células VERO, células CHO, células rCHO-tPA, células rCHO - Antigénio de Superfície Hep B, células HEK 293, células rHEK 293, células rC127 -Antigénio de Superfície Hep B, células de fibroblastos Humanos Normais, células do Estroma, células Hepatócitos, células PER.C6 e células amniocíticas permanentes humanas. Exemplos de hibridomas nos quais uma gonadotrofina dimérica recombinante pode ser produzida incluem, p. ex., células DA4.4, células 123A, células 127A, células GAMMA e células 67-9-B.

No quadro da presente invenção, é preferido cultivar uma célula de Ovário de Hamster Chinês (célula CHO).

Num segundo aspeto a presente invenção descreve um método de redução dos níveis das formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico, caracterizado por células expressando a referida gonadotrofina dimérica recombinante serem cultivadas num meio de cultura sem soro compreendendo um antioxidante.

Tal como aqui se utiliza, o termo "formas oxidadas" refere-se a um polipéptido no qual um oxidante causou oxidação de um ou mais resíduos de aminoácidos. Tais formas podem ser detetadas através, p. ex., de HPLC tal como descrito no Exemplo 2.1 para FSH. A cultura pode ser realizada em qualquer ambiente adequado, tal como caixas de Petri, balões T ou garrafas rolantes, 25 mas de preferência em vasos possuindo volumes maiores tais como, p. ex., um biorreator. 0 passo de cultura compreende os seguintes passos:

Uma inoculação das referidas células no referido meio de cultura sem soro;

Uma fase de crescimento; e Uma fase de produção. A fase de crescimento é a parte do processo de cultura de células na qual os parâmetros do processo são estabelecidos para suportar o crescimento celular. Uma vez alcançada a densidade celular desejada, a cultura celular é habitualmente mudada para uma fase de produção, na qual os parâmetros do processo são estabelecidos para suportar a produtividade celular. Os parâmetros do processo podem ser os mesmos durante a fase de crescimento e a fase de produção. Durante a fase de produção, a concentração celular tem de preferência um valor compreendido dentro de um intervalo de ΙχΙΟ6 a 5><107 células/mL, p. ex., de cerca de ΙχΙΟ8, 5*106, 107 ou 5χ107 células/mL. De maior preferência, a referida célula é uma célula CHO.

Numa forma de realização, o antioxidante é adicionado ao meio de cultura sem soro antes da inoculação das células. Noutra forma de realização, o antioxidante é adicionado ao meio de cultura sem soro pouco após a inoculação das células (p. ex., não mais de 24 h após a inoculação).

De preferência, o processo de fabrico aqui descrito compreende o passo de colheita do meio compreendendo a gonadotrofina dimérica recombinante. 26

Numa forma de realização preferida, o processo de fabrico aqui descrito compreende ainda a purificação da gonadotrofina dimérica recombinante. Métodos de purificação de gonadotrofinas são bem conhecidos na técnica. A FSH pode ser por exemplo purificada tal como descrito em EP 04 105 639.1, WO 98/20039, WO 00/63248 ou WO 88/10270.

Noutra forma de realização preferida, o processo de fabrico aqui descrito compreende ainda a formulação da gonadotrofina dimérica recombinante com um transportador farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica. 0 termo "transportador farmaceuticamente aceitável", tal como aqui se utiliza, pretende englobar qualquer transportador que não interfira com a eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo e que não seja tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a proteina ou proteinas ativas podem ser formuladas numa forma de dosagem unitária para injeção em veiculos tais como solução salina, solução de dextrose, solução de albumina do soro e de Ringer. A composição farmacêutica aqui descrita pode então ser administrada a um indivíduo numa variedade de modos. As vias de administração incluem a via intradérmica, transdérmica (p. ex. em formulações de libertação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracraniana, epidural, tópica, retal, e intranasal. Pode ser utilizada qualquer outra via de administração terapeuticamente eficaz, por exemplo absorção através de tecidos epiteliais ou endoteliais ou através de terapia génica em que uma molécula de ADN codificando o agente 27 ativo é administrada ao paciente (p. ex. através de um vetor), que faz com que o aqente ativo seja expresso e segregado in vivo. Adicionalmente, a proteina ou proteínas aqui descritas podem ser administradas em conjunto com outros componentes de agentes biologicamente ativos tais como tensioativos, excipientes, transportadores, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis. Para administração parentérica (p. ex. intravenosa, subcutânea, intramuscular), a proteína ou proteínas ativas podem ser formuladas como uma solução, suspensão, emulsão ou um pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável (p. ex. água, solução salina, solução de dextrose) e aditivos que mantenham a isotonicidade (p. ex. manitol) ou estabilidade química (p. ex. conservantes e tampões). A formulação é esterilizada através de técnicas vulgarmente conhecidas. 0 método de redução dos níveis das formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico é caracterizado por pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis passos do referido processo de fabrico serem realizados na presença de um antioxidante. De preferência, todos os passos do referido processo de fabrico são realizados na presença de um antioxidante, i.e., todo o processo de fabrico é realizado na presença de um antioxidante.

Por exemplo, o método de redução dos níveis das formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico pode compreender os passos de:

Cultura de células expressando a referida gonadotrofina dimérica recombinante num meio de cultura sem soro compreendendo um antioxidante; 28

Colheita do meio compreendendo a referida gonadotrofina dimérica recombinante; e

Purificação da referida gonadotrofina dimérica recombinante na presença de um antioxidante.

De preferência, o método de redução dos niveis das formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico aqui descrito compreende ainda o passo de formulação da referida gonadotrofina dimérica recombinante numa composição farmacêutica compreendendo um antioxidante. 0 antioxidante pode ser o mesmo em todos os passos do processo de fabrico em que é utilizado um antioxidante. Alternativamente, podem ser utilizados diferentes antioxidantes no passo de cultura, no passo de purificação e/ou no passo de formulação. Numerosos compostos possuindo um efeito antioxidante são conhecidos na técnica. Estes compostos incluem, p. ex., cisteina, ácido ascórbico, L-metionina, L-glutationa, 2-mercaptoetanol, alfa-tocoferol e derivados destes, BO-653, t-butil-4-metoxi-fenol, 2,6-bis(1,1-dimetiletil)-4-metilfenol; bimeta-bisulfito de potássio ou sódio, bisulfito de sódio, histidina, taurina, glicina, alanina, carnosina, anserina e 1-metil-histidina.

Num terceiro aspeto a presente invenção descreve um meio de cultura sem soro para a produção de gonadotrofinas diméricas recombinantes caracterizado por o referido meio de cultura compreender um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em: L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; 29 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 a cerca de 500 mg/L; e uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

Os meios de cultura sem soro compreendem habitualmente água, um regulador da osmolaridade, um tampão, uma fonte de energia, aminoácidos, uma fonte de ferro inorgânica ou recombinante, um fator de crescimento recombinante ou sintético e opcionalmente iões metálicos não ferrosos, vitaminas e cofatores. Por exemplo, qualquer um dos meios sem soro comercialmente disponíveis listados acima pode ser modificado de acordo com a presente invenção.

Tendo agora descrito totalmente esta invenção, será apreciado pelos peritos na técnica que a mesma pode ser efetuada dentro de um amplo intervalo de parâmetros, concentrações e condições equivalentes, sem sair do espirito e do âmbito da invenção e sem demasiada experimentação.

Embora esta invenção tenha sido descrita em ligação com formas de realização especificas desta, será entendido que é capaz de mais modificações. Pretende-se que este pedido cubra quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais afastamentos da presente divulgação tal como estão dentro da prática conhecida ou habitual na técnica a que a invenção se refere e tal como pode ser aplicado às 30 características essenciais supramencionadas estabelecidas como se segue no âmbito das reivindicações anexas. A referência a passos de métodos conhecidos, a passos de métodos convencionais, a métodos conhecidos ou a métodos convencionais não é de forma alguma uma admissão de que qualquer aspeto, descrição ou forma de realização da presente invenção esteja divulgada, ensinada ou sugerida na técnica relevante. A descrição anterior das formas de realização especificas revelará tão completamente a natureza geral da invenção que outros podem, através da aplicação do conhecimento dentro da pericia na técnica (incluindo o conteúdo das referências aqui citadas), modificará facilmente e/ou adaptará para várias aplicações tais formas de realização especificas, sem demasiada experimentação, sem sair do conceito geral da presente invenção. Portanto, pretende-se que tais adaptações e modificações estejam dentro do significado e intervalo de equivalentes das formas de realização divulgadas, com base nos ensinamentos e orientação aqui apresentados. Deve entender-se que a fraseologia ou terminologia aqui é com o objetivo de descrição e não de limitação, tal que a terminologia ou fraseologia da presente descrição deve ser interpretada pelo perito na técnica à luz dos ensinamentos e aqui orientação apresentados, em combinação com o conhecimento de um vulgar perito na técnica. 31 EXEMPLO 1: Processo de Cultura de Células 1.1. Linhas celulares e meios

Todas as experiências foram efetuadas com uma linha celular CHO expressando ambas as subunidades da FSH humana. A proteina produzida é uma gonadotrofina dimérica referida ainda como rFSH. A subunidade alfa corresponde à Entrada SwissProt No. P01215 e a subunidade beta corresponde à Entrada SwissProt No. P01225. 0 meio utilizado para a cultura de células foi um meio sem soro (SFM) básico desenhado para cultura de células CHO. 0 meio SFM foi suplementado com o antioxidante a testar tal como detalhado no Exemplo 3. A concentração inicial dos antioxidantes a testar no SFM básico é mostrada na Tabela I.

Tabela I: Concentração inicial de antioxidantes no meio sem soro básico

Composto Concentração inicial em SFM básico L-cisteína 138 mg/L Cistina-2HCL 0 mg/L N-acetil-L-cisteína (NAC) 0 mg/L Ácido L-ascórbico 0 mg/L L-metionina 50 mg/L L-glutationa 0 mg/L 2-mercaptoetanol 0 mg/L (+)-alfa-tocoferol 0 mg/L 1.2. Inoculação, condições de crescimento e produção 0 processo de cultura, também referido como "execução", compreende um passo de inoculação, uma fase de crescimento e uma fase de produção. Foram realizadas cinco execuções diferentes, referidas como execuções 1, 2, 3, 4 e 5. 32

Pelo menos 2,4*109 células produtoras de rFSH viáveis foram transferidas para um biorreator de 15 L com um volume de trabalho efetivo de 11 L (newMBR, Zurich) compreendendo microtransportadores. Imediatamente após a sementeira seguiu-se uma fase de lotes que durou dois ou três dias. 0 biorreator foi então alimentado continuamente com SFM para uma taxa de diluição de 1 por dia e para uma taxa de perfusão de 11 L por dia. A fase de crescimento e produção foram efetuadas ao mesmo pH e temperatura (37°C, pH=7). 0 Oxigénio Dissolvido (OD) foi mantido a 50% de saturação do ar durante toda a execução. EXEMPLO 2: Métodos Analíticos

2.1. Determinação das formas oxidadas de rFSH

As formas oxidadas foram determinadas através de RP-HPLC em colheita bruta tal como descrito por Bassett e Driebergen (Bassett e Driebergen, 2005).

As percentagens de formas oxidadas foram normalizadas utilizando a percentagem de formas oxidadas obtida com L-cisteina a 280 mg/L na execução 2 como referência (i.e., as percentagens das formas oxidadas foram divididas por 23,4%). 2.2. Medição da concentração total de células viáveis A concentração total de células viáveis é definida como a soma da concentração de células aderentes aos microtransportadores e a concentração de células viáveis em suspensão. A concentração de células aderentes aos microtransportadores foi determinada utilizando o método de 33 contagem dos núcleos de violeta cristal (Fluka 61135) . A concentração de células viáveis em suspensão foi determinada utilizando o método de exclusão de azul Tripano (Sigma T-8154) . A Razão de Células Viáveis Totais (Razão TVC) foi calculada como se segue: [concentração total de células viáveis, final do teste]/[concentração total de células viáveis, inicio do teste] em que o inicio do teste é definido como o dia em que é introduzido um novo antioxidante na cultura, e o final do teste é definido como o dia antes da introdução do antioxidante seguinte na cultura.

2.3. Medição dos títulos de rFSH 0 título de rFSH foi medido através de um ensaio imunofluorimétrico, utilizando o estojo Delphia hFSH de Wallac-ADL (n° de cat. A017-201). 2.4. Medição da taxa de consumo de glicose (GCR) A taxa de consumo de glicose (GCR), expressa em gramas por litro e por dia, foi calculada como se segue: GCR = (Go-Gt)Dt+(Gt-i-Gt) G significa "Concentração de glicose" e D significa "taxa de diluição". Os índices referem-se ao seguinte: 0: no SFM alimentado; t: medido no tempo t; e t-1: medido no tempo t-1 EXEMPLO 3: Efeito de Vários Antioxidantes

Para reduzir o nível das formas oxidadas obtido com o processo sem soro, duas execuções de 15 L (execuções 1 e 2) foram efetuadas testando o efeito de vários antioxidantes. 34

Uma execução sem adição de qualquer antioxidante foi efetuada como controlo (execução 3) . SFM foi suplementado com vários antioxidantes ou uma combinação de antioxidantes para alcançar a concentração final mostrada na Tabela II. Cada antioxidante ou combinação de antioxidantes foi testada durante um período de cerca de dez dias. No primeiro dia do teste, foi adicionado o volume da solução de antioxidante necessário para alcançar o ponto estabelecido. Todos os dias daí em diante, uma certa quantidade de antioxidante foi lavada do biorreator através de perfusão e substituída pela adição de uma vez (para uma taxa de diluição de 1 d-1, 63,2% do volume do biorreator foram renovados cada 24h e isto representa a quantidade de antioxidante a ser substituída todos os dias) . No final do período de teste, o antioxidante foi lavado do biorreator através de perfusão, e substituído por outro antioxidante a testar. A percentagem de formas oxidadas de rFSH foi medida no final de cada teste (tabela II) . Um valor normalizado inferior a 1,0 indica que o antioxidante testado é mais eficiente que a L-cisteína para diminuição dos níveis das formas oxidadas de rFSH. A concentração total de células viáveis, a GCR e os títulos de rFSH foram medidos diariamente. A Tabela II indica a razão de células viáveis totais (razão TVC). Uma razão TVC superior ou igual a 1,0 indica que o antioxidante testado não tem efeito tóxico nas células. 35

Tabela II: Efeito de antioxidantes nas formas oxidadas de

rFSH

Dias de trabalho (DT) nos quais o antioxidante foi testado DT nos quais as fornas oxidadas foram medidas

Antioxidante

Concentração média (mg/L) % de formas oxidadas formas oxidadas (valor normalizado)

RazãoTVC

Execução 1 DT10 a DT20 DT20 L-cisteína 280 21,5 0,92 CD co DT20 a DT30 DT30 Ácido L-ascórbico 10 17,3 0,74 1,3 DT30 a DT40 DT38 L-metionina 186 14,3 0,61 1,4 DT40 a DT50 DT50 L-glutationa 3 14,2 0,61 1,2 DT50 a DT60 DT59 2-mercaptoetanol 10 12,3 0,53 0,8 DT60 a DT7 0 DT7 0 L-metionina 734 14,0 0,60 1,0 DT7 0 a DT80 DT7 9 Ácido L-ascórbico + (+)-alfa-tocoferol 30 14 14,8 0,63 1,0

Execução 2 DT0 a DT20 DT20 L-cisteína 280 23,4 1,00 6, 3 DT20 a DT30 DT30 Cisteína 2HC1 50 17,3 0,74 1,4 DT30 a DT40 DT38 N-acetil-L- cisteína 260 18,1 0,77 1,3 DT40 a DT50 DT50 L-cisteína 350 20,5 0,88 1,0 DT50 a DT56 DT56 L-Cisteína + ácido L-ascórbico + 2-mercaptoetanol 280 10 10 19,0 0,81 1,0

Os resultados mostrados na Tabela II indicam que 2-mercaptoetanol, uma combinação de ácido ascórbico e ( + )-alfa-tocoferol, L-metionina, e L-glutationa são os melhores antioxidantes para obtenção de niveis baixos de formas oxidadas de rFSH.

Uma razão TVC (células viáveis totais) inferior a 1,0 é obtida apenas no caso de 2-mercaptoetanol. Portanto, todos os antioxidantes testados nas Execuções 1 e 2 exceto 2-mercaptoetanol são não tóxicos. Adicionalmente, a medição 36 da GCR e dos títulos de rFSH mostrou que nenhum dos vários antioxidantes tinha qualquer impacto significativo no metabolismo e padrões de produtividade (dados não mostrados). A L-metionina e L-glutationa foram escolhidas para mais otimização do processo de produção. Uma execução (execução 3) foi efetuada para testar várias concentrações de L-glutationa (de 1 a 20 mg/L) , e foi efetuada uma execução (execução 4) para testar várias concentrações de L-metionina (de 0,25 a 3 g/L) e a execução 3, testando L-glutationa foi prematuramente parada no dia de produção 30 porque os microtransportadores estavam danificados. As concentrações testadas de L-glutationa ou L-metionina durante as execuções 3 e 4 são mostradas na Tabela III. O Dia de Trabalho zero (DTO) é definido como o dia durante o qual o biorreator é semeado. O Dia de Produção zero (DPO) é definido como o dia durante o qual o processo de cultura celular é mudado da fase de crescimento para a fase de produção. Adicionalmente, foi efetuada uma execução sem variar a concentração de antioxidante. Nesta execução, a L-metionina foi adicionada a 250 mg/L desde o início (execução 5) . Para todas as execuções, a percentagem de formas oxidadas de rFSH foi medida regularmente (Tabela IV) . 37 TABELA III: Concentração de antioxidante nas execuções 3 e 4

Execução 3 Execução 4 DTO da Fase de crescimento Sem L-glutationa L-metionina 50 mg/L DT1 da fase de crescimento até DPO (não incluído) L-glutationa 1 mg/L L-metionina 250 mg/L PD0-PD9 L-glutationa 1 mg/L L-metionina 250 mg/L PD10-PD19 L-glutationa 2,5 mg/L L-metionina 500 mg/L PD20-PD29 L-glutationa 5 mg/L L-metionina 1000 mg/L PD30-PD39 L-glutationa 10 mg/L L-metionina 2000 mg/L PD40-PD49 L-glutationa 20 mg/L L-metionina 3000 mg/L TABELA IV: Efeito de antioxidantes nas formas oxidadas de

rFSH DT no qual as formas oxidadas foram medidas Antioxidante Concentração média (mg/L) % de formas oxidadas Execução 3 DT19 L-glutationa 1 18,31 DT2 8 L-glutationa 2,5 14,26 DT4 0 L-glutationa 5 23, 99 Execução 4 DT19 L-metionina 250 15,37 DT2 8 L-metionina 500 14,26 DT40 L-metionina 1000 13,56 DT4 9 L-metionina 2000 9, 77 DT59 L-metionina 3000 12,66 Execução 5 DT16-17 L-metionina 250 mg/L 16, 91 DT20-21 14,45 DT22-23 12,94 DT24-25 12,16 DT26-27 10,54 DT28-29 12,83 DT30-31 13,21 A análise das formas oxidadas de rFSH quando foi adicionado antioxidante ao meio de cultura mostrou que a L-metionina é um bom antioxidante. Na execução 5, em que as células foram cultivadas na presença de L-metionina a 250 mg/L, a percentagem média de formas oxidadas foi reduzida em torno de 40% em comparação com os resultados obtidos na execução 1 e na execução 2 com L-cisteina como antioxidante (ver Tabela II & IV) . A L-Glutationa é também um bom 38 antioxidante, especialmente a uma concentração de cerca de 2,5 mg/L. Na execução 3, a percentagem de formas oxidadas foi reduzida em torno de 35% quando as células foram cultivadas na presença de L-glutationa a 2,5 mg/L, em comparação com os resultados obtidos na execução 1 e na execução 2 com L-cisteina como antioxidante (ver Tabela II & IV) .

Concentrações crescentes de L-metionina parecem ter uma tendência decrescente na percentagem de formas oxidadas entre 250 e 2000 mg/L na execução 4. No entanto, parece que as diferenças observadas estão dentro da variabilidade do método uma vez que foram observadas variações comparáveis na Execução 5 testando uma concentração de L-metionina de 250 mg/L para toda a execução. Adicionalmente, foi confirmado que a L-glutationa e a L-metionina não tinham qualquer impacto significativo na viabilidade das células, no metabolismo e nos padrões de produtividade no intervalo de concentração que foi testado (dados não mostrados).

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Lisboa, 14 de Junho de 2012

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um meio de cultura sem soro para redução dos niveis das formas oxidadas de uma gonadotrofina dimérica recombinante durante o seu processo de fabrico em que o referido meio de cultura compreende um antioxidante selecionado a partir do grupo que consiste em: L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 a cerca de 400 mg/L; e uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido antioxidante é selecionado a partir do grupo que consiste em: L-glutationa a uma concentração de cerca de 3 mg/L; 2-mercaptoetanol a uma concentração de cerca de 10 mg/L; L-metionina a uma concentração de cerca de 250 mg/L; e uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração de cerca de 30 mg/L e (+)-alfa-tocoferol a uma concentração de cerca de 14 mg/L. 2

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido meio de cultura é um meio quimicamente definido.

4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido meio de cultura é selecionado a partir do grupo que consiste em SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3a, CHP PFM, ProCHO 5, EX-CELL, CHO-CD3, CHO III PFM, CHO-S-SFM II, CHO-DHFR, SFM4CHO, Ultra CHO, HyQ PF CHO, HyQ SFX CHO, HyQ CDM4CHO, IS CHO-CD, IS CHO-V, e derivados destes.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que a referida gonadotrofina dimérica é a Hormona Estimuladora do Foliculo (FSH).

6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida gonadotrofina dimérica recombinante é produzida em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Lisboa, 14 de Junho de 2012