CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se à fabricação de proteínas re- combinantes. Mais especificamente, refere-se ao uso de um meio de cultura livre de soro compreendendo um antioxidante para a produção de gonadotropinas diméricas recombinantes. O antioxidante pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em L-glutationa, 2-mercapto- etanol, L-metionina, e uma combinação de ácido ascórbico e de (+)-alfa- tocoferol.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se à produção de Hormônio de Estimulação de Folículo (FSH) recombinante. O FSH pertence a classe de gonadotropinas.
[003] O FSH é usado no tratamento de infertilidade e enfermidades reprodutivas em ambos os pacientes macho e fêmea. O FSH é usado em pacientes fêmeas na indução de ovulação (OI) e na hiperestimula- ção ovariana controlada (COH), por exemplo, para tecnologias reprodutivas assistidas (ART). Em um regime de tratamento típico para indução de ovulação, um paciente é administrado diariamente com injeções de FSH ou um derivado deste (cerca de 75 a 300 IU RFSH/dia) por um período de cerca de 6 a cerca de 12 dias. Em um regime de tratamento típico para hiperestimulação ovariana controlada, um paciente é admi-nistrado diariamente com injeções de FSH ou um derivado deste (cerca de 150-600 IU RFSH/dia) por um período de cerca de 6 a cerca de 12 dias. O FSH é também usado para induzir espermatogênese em homens que sofrem de oligoespermia. Um regime usando 150 IU FSH 3 vezes por semana em combinação com 2’500 IU hCG duas vezes por semana tem sido bem-sucedido em alcançar um aperfeiçoamento na contagem de esperma em homens que sofrem de hipogonadismo hipo- gonadotrófico. Devido à importância do FSH no tratamento de enfermidades de fertilidade, a provisão de FSH de alta estabilidade e de alta atividade específica é desejável.
[004] Na natureza, o FSH é produzido pela glândula pituitária. Para uso farmacêutico, o FSH pode ser produzido recombinantemente (rFSH), ou pode ser isolado a partir da urina de fêmeas pós-menopausal (uFSH). O processo de fabricação de rFSH necessita de duas etapas principais: cultivo de FSH que expressa célula geneticamente projetada, e purificação da proteína. A proteína é, em seguida, formulada com um veículo farmaceuticamente aceitável de modo a obter uma composição farmacêutica.
[005] Para culturas de célula, no passado o meio de cultura usado para ser suplementado com soro, que servia como um nutriente universal para o crescimento e manutenção de todas as linhas de célula de mamífero. Contudo, o advento de BSE (Encefalopatia Espongiforme Bovina), uma doença neurodegenerativa transmissível de gado com uma latência ou período de incubação longos, tem elevados interesses regu- latórios sobre usar soro derivado de animal na produção de produtos biologicamente ativos. Portanto, é atualmente preferido produzir proteínas recombinantes usando-se meio livre de soro. Tais meios são bem conhecidos na técnica, e comercializados por várias companhias, tais como, por exemplo, Sigma, BioWhittaker, Gibco BRL, Cambrex and JRH.
[006] Um dos problemas encontrados quando se armazena rFSH é a presença de formas oxidadas de FSH. Para solucionar parcialmente este problema, um antioxidante pode ser adicionado à composição far- macêutica de modo a estabilizar a proteína de FSH durante armazenagem antes da administração ao paciente em necessidade de tratamento. Por exemplo, EP 0 853 945 (Skrabanja and Van den Oetelaar, 1998) descreve formulações contendo gonadotropina líquida em mistura com um estabilizador, tal como, por exemplo, citrato de sódio em 25-100 mM e L-metionina em 1-10 mM. É mostrado que tais formulações permitem armazenamento de formulações de FSH por tempos mais longos, o WO 92/15614 (Takruri H., 1992) também se refere a um método para inibição de oxidação de um polipeptídeo em uma composição farmacêutica líquida ou semilíquida, tal como, por exemplo, um meio de armazenamento ou uma solução oftálmica aquosa. Especificamente, o WO 92/15614 mostra que uma solução oftálmica ou ungüento oftálmico compreendendo L-metionina a uma concentração de 10 mg/L estabiliza o Fator de Crescimento Epidermal Humano. Contudo, os documentos acima apenas descrevem o uso de um antioxidante em uma formulação farmacêutica, e não em um meio de cultura.
[007] Aminoácidos e compostos exibindo atividade antioxidante podem também serem adicionados ao meio de cultura, ou como nutrientes, ou para proteção de linhas de célula para morte celular. Por exemplo, a patente U.S. No. 4.560.655 revela um meio livre de soro compreendendo aproximadamente 30 mg/L de L-metionina, referido meio sendo usado para cultivo de células de testículo suíno, células de mieloma AG14, e células de baço murina. o WO 95/12664 ensina um método pelo qual a desvantagem devido a quantidades insuficientes de vários fatores de limitação de crescimento, um deles sendo o aminoá- cido L-metionina, pode ser superada para uma linha de célula particular. Especificamente, o WO 95/12664 ensina um método para adaptar a linha de célula CHO E5F3G, que expressa M-CSF humano, a desenvolver em densidade de célula aumentada. Neste método, as células CHO E5F3G são desenvolvidas em um meio compreendendo 104 mg/L de L- metionina (vide o Exemplo e Tabela 2). Yun et al. ensinam que a adição de uma combinação de glutationa e de quelatores de ferro no meio de cultura reduz a morte celular de células de CHO (Yun et al., 2003). Saito et al. ensinam adicionalmente que vários antioxidantes podem ser usados no meio de cultura para proteger uma linha de célula de morte celular (Saito et al., 2003). Contudo, o WO 95/12664, a patente U.S. No. 4.560.655, Yun et al. e Saito et al. são omissos no efeito potencial (se houver) em aminoácidos, glutationa e quelatores de ferro no estado de oxidação da proteína recombinante produzida pela linha de célula. Em conclusão, estes documentos somente descrevem o uso de L-metionina ou de glutationa combinada a quelatores de ferro para aperfeiçoamento do crescimento, e/ou a viabilidade das células cultivadas.
[008] WO 99/50390 se refere a um meio de cultura para produção de interferon-a de leucócitos, referido meio de cultura compreendendo metionina. É demonstrado por HPLC que a qualidade da proteína inter- feron-a após purificação é aperfeiçoada após adição de metionina no meio de cultura. Os inventores do WO 99/50390 hipotetizaram que este aperfeiçoamento pode ser devido à oxidação aumentada da proteína interferon-a. O WO 99/50390 indica adicionalmente que uma quantidade muito baixa de metionina resulta em um efeito diminuído, e que uma quantidade muito alta causa rendimentos de interferon inferiores. Especificamente, o WO 99/50390 ensina que uma faixa de cerca de 50 a 100 mg/L é uma faixa especialmente preferida quando se produz interferon-a de leucócitos. Em adição, o WO 99/50390 somente contempla um meio para produção de interferon-a, que é uma proteína mono- mérica. o WO 99/50390 nem menciona nem sugere um meio para produção de hormônios diméricos, tais como, por exemplo, FSH, que é somente secretado após dimerização (Matzuk et al., 1988).
[009] Em suma, nenhum dos documentos acima mencionados se refere ao uso de um antioxidante em um meio de cultura livre de soro para a redução da oxidação de gonadotropinas diméricas.
SUMÁRIO DA INVENCÀO
[0010] A presente invenção é baseada no achado inesperado que, já durante a fabricação de rFSH, formas oxidadas de rFSH aparecem no sobrenadante da cultura de célula. Além disso, a produção de rFSH no meio livre de soro conduz a níveis mais altos de formas oxidadas do que produção de rFSH em meio contendo soro. Na estrutura da presente invenção, foi surpreendentemente verificado que níveis de formas oxidadas de rFSH podem ser reduzidos não somente durante armazenamento, mas também durante a etapa de cultivo. Esta redução é al-cançada sem prejudicar a produtividade. A redução é efetuada através da adição de um antioxidante ao meio de cultura. Especificamente, foi verificado que a suplementação de um meio livre de soro com, qualquer de (i) 2-mercaptoetanol, (ii) uma combinação de ácido ascórbico e (+)- alfa-tocoferol, (iii) L-metionina, ou (iv) L-glutationa durante cultivo de células que expressam níveis reduzidos de rFSH de formas oxidadas de rFSH.
[0011] Portanto, em um primeiro aspecto, a invenção se refere ao uso de um meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotropinas diméricas recombinantes, caracterizado em que referido meio de cultura compreende um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em: - L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; - 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; - L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 a cerca de 500 mg/L; e - uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.
[0012] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um método de reduzir os níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina dimérica recombinante durante seu processo de fabricação, caracterizado em que células que expressam referida gonadotropina dimérica recombinante são cultivadas em um meio de cultura livre de soro compreendendo um antioxidante.
[0013] Um terceiro aspecto da invenção se refere a um meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotropinas diméricas recom- binantes caracterizado em que referido meio de cultura compreende um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em: - L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; - 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; - L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 mg/L a cerca de 500 mg/L; e - uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0014] A presente invenção origina-se a partir do achado que os níveis de formas oxidadas de rFSH podem ser significantemente reduzidos após cultivo de células que expressam rFSH em um meio livre de soro compreendendo antioxidantes. Conforme mostrado no Exemplo 3, qualquer de (i) 2-mercaptoetanol, (ii) uma combinação de ácido ascórbico e de (+)-alfa-tocoferol, (iii) L-metionina ou (iv) L-glutationa são particularmente vantajosos para redução dos níveis de formas oxidadas de rFSH durante o processo de cultivo. Importantemente, esta redução pode ser alcançada sem prejudicar a viabilidade e o metabolismo da célula, e sem prejudicar os títulos de rFSH.
[0015] Portanto, um primeiro aspecto da presente invenção é dirigido ao uso de um meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotropinas diméricas recombinantes, caracterizado em que referido meio de cultura compreende um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em: - L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 a cerca de 20 mg/L; - 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 15 mg/L; - L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 a cerca de 500 mg/L; e - uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.
[0016] Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro de acordo com a presente invenção compreende L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1, 1,5, 2 a cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 mg/L. Mais preferivelmente, o meio de cultura livre de soro compreende L-glutationa a uma concentração de cerca de 2,5 ou 3 mg/L. Conforme usado aqui, "glutationa" é usada intercambeavelmente com "L-glutati- ona".
[0017] Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro, de acordo com a presente invenção, compreende 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5, 6, 7, 8, 9 a cerca de 11, 12, 13, 14 ou 15 mg/L. Mais preferivelmente, o meio de cultura livre de soro compreende 2-mercaptoetanol a uma concentração de cerca de 10 mg/L.
[0018] Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro, de acordo com a presente invenção, compreende uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L, e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L. Mais preferivelmente, tal meio compreende (+)- alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5, 8, 10 ou 12 a cerca de 16, 18, 20, 22 ou 25 mg/L, e ácido ascórbico a uma concen-tração variando de cerca de 15, 20 ou 25 a cerca de 35, 40 ou 45 mg/L. Mais preferivelmente, tal meio de cultura livre de soro compreende (+)- alfa-tocoferol a uma concentração de cerca de 14 mg/L, e ácido ascórbico a uma concentração de cerca de 30 mg/L. Conforme aqui usado, "(+)-alfa-tocoferol"é usado intercambeavelmente com "vitamina A", e "ácido ascórbico" é usado intercambeavelmente com "L-ácido ascórbico".
[0019] Preferivelmente, o meio de cultura livre de soro, de acordo com a presente invenção, compreende L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240 ou 245 mg/L a cerca de 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 ou 500 mg/L. Mais preferivelmente, o meio de cultura livre de soro compreende L-metionina a uma concentração de cerca de 250 mg/L. Conforme aqui usado, "metionina" é usada intercambeavelmente com "L-metionina".
[0020] Qualquer meio de cultura livre de soro pode ser suplementado com antioxidantes de acordo com a presente invenção. Meios livres de soro comercialmente disponíveis que podem ser usados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, SFM 90 (JRH, 67350), SFM 90.1 (JRH, 67350), Supmed300 ou Supmed300 modificado (JRH, 67350), DMEM (Gibco, 7490571), DMEM/F12 (Gibco, 99.5043), SFM CHO 3a (BioWhittaker), CHO PFM (Sigma, C6970), procmo 5, meio EX- CELL, tais como EX-CELL 302 (JRH, Catalogue No. 14312-1000M) ou EX-CELL 325 (JRH, Catalogue No. 14335-1000M), CHO-CD3 (Sigma, Catalogue No. C-1490), CHO III PFM (Gibson, Catalogue No. 96- 0334SA), CHO-S-SFM II (Gibson, Catalogue No. 12052-098), CHO- DHFR (Sigma, Catalogue No. C-8862), procmo 5 (Cambrex, Catalogue No. BE12-766Q), SFM4CHO (Cyclone, Catalogue No. SH30549.01), Ultra CHO (Cambrex, Catalogue No. 12-724Q), HYQ PF CHO (Myclone, Catalogue No. SH30220.01), HYQ SFX CHO (Myclone, Catalogue No. SH30187.01), HYQ CDM4CHO (Myclone, Catalogue No. SH30558.01), IS CHO-CD (Irvine Scientific, Catalogue No. 91119), IS CHO-V (Irvine Scientific, Catalogue No. 9197), e derivados destes. A composição de SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3ae CHP PFM, que pode ser usada de acordo com a presente invenção, é mostrada na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Composição dos meios de cultura livre de soro comercialmente disponíveis que podem ser usados na estrutura da presente invenção
[0021] Em uma concretização preferida da presente invenção, o meio de cultura livre de soro é um meio quimicamente definido, isto é, um meio preparado de ingredientes purificados e, portanto, cuja composição exata é conhecida. Especificamente, meio quimicamente definido nem contém componentes derivados de animal nem hidrolisatos não- definidos.
[0022] As gonadotropinas que podem ser produzidas, de acordo com a presente invenção, incluem o hormônio de luteinização (LH; OMIM Acesso No. 152780), o hormônio de estimulação de folículo (FSH; OMIM Acesso No. 136530), a gonadotropina coriônica, (CG; OMIM Acesso No. 118860) e o hormônio de estimulação de tireóide (TSH; OMIM Acesso No. 188540). As gonadotropinas são hormônios diméricos. Cada um destes hormônios consiste de um dímero não-co- valente de subunidades alfa e beta. A subunidade alfa é a mesma para todos os 4 hormônios (OMIM Acesso No. 118850), e as subunidades beta definem a função endócrina do dímero (Talmadge et al., 1983).
[0023] Em uma concretização mais preferida da presente invenção, a gonadotropina é FSH humano. Conforme aqui usado, o termo "FSH" se refere a uma proteína dimérica compreendida de uma subunidade alfa correspondente ao SwissProt Acesso No. P01215, e de uma subunidade beta correspondente a SwissProt Acesso No. P01225. Visto que FSH é uma proteína secretada solúvel, ela é liberada no sobrenadante de cultura celular, ou por meio de seu peptídeo de sinal natural, ou por meio de um peptídeo de sinal heterólogo, isto é, um peptídeo de sinal derivado de outra proteína secretada que pode ser mais eficiente no sistema de expressão particular usado.
[0024] O termo FSH inclui adicionalmente variantes unidas, variantes alélicas, muteínas, derivados funcionais, frações ativas, proteínas fundidas e proteínas circularmente permutadas de uma proteína dimérica compreendida de uma subunidade alfa correspondente a SwissProt Acesso No. P01215, e de uma subunidade beta correspondente a Swis- sProt Acesso No. P01225.
[0025] Conforme aqui usado, o termo "muteína" se refere a análogos de FSH, no qual um ou mais dos resíduos de aminoácido de um FSH natural ou FSH virai são substituídos por resíduos de aminoácido diferentes, ou são anulados, ou um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados à seqüência natural de FSH, sem mudar consideravelmente a atividade dos produtos resultantes comparado com o FSH não cultivado. Estas muteínas são preparadas por técnicas de mutagênese de síntese e/ou de local direcionado conhecidas, ou qualquer outra técnica conhecida, portanto, adequada.
[0026] As muteínas de acordo com a presente invenção incluem proteínas codificadas por um ácido nucléico, tal como DNA ou RNA, que hibridiza para DNA ou RNA, que codificam um FSH sob condições severas. O termo "condições severas" se refere a condições de hibridização e lavagem subseqüente, cujo aquelas do versado na técnica se referem a "severas" (vide, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 e 6.4,1987,1992). Sem limitação, exemplos de condições severas incluem condições de lavagem 12-20°C abaixo da Tm calculada do híbrido sob estudo em, por exemplo, 2 x SSC e 0,5% de SDS por 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% de SDS por 15 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 37°C por 30-60 minutos e, em seguida, 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 68°C por 30-60 minutos. Aqueles versados na técnica compreendem que as condições severas também dependem do comprimento das seqüências de DNA, das sondas de oligonucleotídeo (tais como 10-40 bases), ou das sondas de oli- gonucleotídeo misturadas. Se sondas misturadas são usadas, é preferível usar cloreto de tetrametil amónia (TMAC) ao invés de SSC. Vide Ausubel, supra.
[0027] Em uma concretização preferida, uma muteína de FSH tem pelo menos 40% de identidade com a seqüência de um FSH que ocorre naturalmente. Mais preferivelmente, ela tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou, mais preferivelmente, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade.
[0028] A identidade reflete um relacionamento entre duas ou mais seqüências de polipeptídeo, ou duas ou mais seqüências de polinucle- otídeo, determinadas por comparação das seqüências. Em geral, a identidade se refere a uma correspondência exata de nucleotídeo para nucleotídeo ou de aminoácido para aminoácido das duas seqüências de polinucleotídeos ou duas seqüências de polipeptídeos, respectivamente, sobre o comprimento das seqüências sendo comparadas.
[0029] Para seqüências onde não existe uma correspondência exata, uma "% de identidade" pode ser determinada. Em geral, as duas seqüências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as seqüências. Isto pode incluir inserção de "folgas" em qualquer uma ou ambas seqüências, para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identidade pode ser determinada sobre o comprimento total de cada uma das seqüências sendo comparada (assim denominado "alinhamento global"), que é particularmente adequado para seqüências do mesmo ou comprimento muito similar, ou sobre comprimentos definidos mais curtos (assim denominado "alinhamento local"), que é mais adequado para seqüências de comprimento desigual. Na estrutura da presente invenção, a "% de identidade" se refere a percentagem global de identidade que foi determinada sobre o comprimento total de cada uma das seqüências sendo comparadas.
[0030] Programas de computador conhecidos podem ser usados para determinar se qualquer polipeptídeo particular é uma percentagem idêntica a uma seqüência da presente invenção. Tais algoritmos e programas incluem, por exemplo, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, e CLUSTALW (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997; Higgins et al., 1996; Pearson and Lipman, 1988; Thompson et al., 1994). As homolo- gias da proteína e seqüência de ácido nucléico são preferivelmente avaliadas usando-se a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico ("BLAST"), que é bem conhecida na técnica (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997; Karlin and Altschul, 1990).
[0031] Os programas BLAST identificam seqüências homólogas pela identificação de segmentos similares, que são referidos aqui como "pares de segmento de alta classificação," entre uma seqüência amino ou ácido nucléico, e uma seqüência teste que é preferivelmente obtida a partir de uma base de dados de seqüência de proteína ou ácido nucléico. Pares de segmento de alta classificação são preferivelmente identificados (isto é, alinhados) por meio de uma matriz de classificação, muitas das uais sendo conhecidas na técnica. A matriz de classificação usada pode ser a matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992; Henikoff e Henikoff, 1993). As matrizes PAM ou PAM250 podem também serem usadas (Vide, por exemplo, Schwartz and Dayhoff, eds, (1978) Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation). Os programas BLAST avaliam a significância estatística de todos os pares de segmento de classificação alta identificados, e preferivelmente selecionam aqueles segmentos que satisfazem um limite especificado do usuário de significância, tal como uma homologia de percentagem especificada do usuário. Preferivelmente, a significância estatística de um par de segmentos de classificação alta é avaliada usando-se a fórmula de significância estatística de Karlin (Karlin and Altschul, 1990). Os programas BLAST podem ser usados com os parâmetros de falta, ou com parâmetros modificados providos pelo usuário.
[0032] Um método preferido para determinação da melhor equiparação total entre uma seqüência de consulta (uma seqüência da pre- sente invenção) e uma seqüência objeto, também referida como um alinhamento de seqüência global, pode ser determinado usando-se o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag (Bru- tlag et al., 1990). Em um alinhamento de seqüência, as seqüências de consulta e objeto são ambas seqüências de aminoácido. O resultado de referido alinhamento de seqüência global é em percentagem de identidade. Parâmetros preferidos usados em um alinhamento de aminoácido FASTDB são: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, Penalidade de Desacordo=1, Penalidade de União=20, Grupo de Randomização=25 Comprimento^, Classificação de Corte=1, Tamanho de janela=comprimento de seqüência, Penalidade de Folga=5, Penalidade de Tamanho de Folga=0,05, Tamanho de Janela=247 ou o comprimento da seqüência de aminoácido objeto, sempre que é mais curta.
[0033] Se a seqüência objeto é mais curta do que a seqüência de consulta devido as anulações de terminal N- ou C-, não devido as anulações internas, os resultados, em percentagem de identidade, devem ser corrigidos manualmente porque o programa FASTDB não contam os truncamentos de terminal N- e C- da seqüência objeto quando se calcula a percentagem de identidade global. Para as seqüências objeto truncadas no terminal N- e C-, em relação a seqüência de consulta, a percentagem de identidade é corrigida pelo cálculo do número de resíduos da seqüência de consulta que são terminais N- e C- da seqüência objeto, que não são equiparadas/alinhadas com um resíduo objeto correspondente, como uma percentagem das bases totais da seqüência de consulta. Se um resíduo é equiparado/alinhado, é determinado pelos resultados do alinhamento de seqüência FASTDB. Esta percentagem é, em seguida, subtraída a partir da percentagem de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima usando-se os parâmetros especificados, para chegar a uma classificação de percentagem de identidade final. Esta classificação de percentagem de identidade final é o que é usado para a proposta da presente invenção. Somente resíduos aos terminais N- e C- da seqüência objeto, que não são equiparadas/alinhadas com a seqüência de consulta, são considerados para a proposta de ajustar manualmente a classificação de percentagem de identidade. Isto é, somente resíduos de aminoácido de consulta fora dos resíduos de terminal N- e C- mais distantes da seqüência objeto.
[0034] Por exemplo, uma seqüência objeto de resíduo de 90 amino- ácidos é alinhada com uma seqüência de consulta de 100 resíduos para determinar a percentagem de identidade. A anulação ocorre no terminal N da seqüência objeto e, portanto, o alinhamento de FASTDB não se equipara/se alinha com o primeiro resíduo no terminal N. Os 10 resíduos não-emparelhados representam 10% da seqüência (número de resíduos dos terminais N- e C- não equiparados/número total de resíduos na seqüência de consulta), de modo que 10% é subtraído a partir da classificação de percentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduos remanescentes estavam perfeitamente equiparados, a percentagem de identidade final seria 90%.
[0035] Mudanças preferidas para muteínas, de acordo com a presente invenção, são as que são conhecidas como substituições "con- servativas". Substituições de aminoácido conservativas de FSH podem incluir aminoácidos sinônimos dentro de um grupo que tem propriedades fisicoquímicas suficientemente similares que substituição entre membros do grupo preservarão a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É claro que inserções e anulações de aminoácidos podem também serem feitas nas seqüências acima sem alterar sua função, particularmente se as inserções ou anulações somente envolvem uns poucos aminoácidos, por exemplo, abaixo de trinta, e preferivelmente abaixo de dez, e não removem ou deslocam aminoácidos que são críticos a uma conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína. As proteínas e muteínas produzidas por tais anulações e/ou inserções vêm dentro do campo de ação da presente invenção.
[0036] O termo "proteína fundida" de FSH se refere a um polipeptí- deo compreendendo FSH, uma muteína ou um fragmento desta, fundida com outra proteína, que, por exemplo, tem um tempo de residência estendido em fluidos corpóreos. O FSH pode, por exemplo, ser fundido a uma imunoglobulina ou um fragmento desta, tal como porção Fc de imu- noglobulina. A seqüência de FSH matura pode também ser fundida a um peptídeo de sinal, e/ou uma seqüência condutora que permite secreção aumentada.
[0037] Em uma concretização da presente invenção, a subunidade beta de FSH ou um fragmento desta é fundida ao peptídeo carboxil terminal (CTP) de subunidade hCG beta. A proteína resultante tem atividades receptoras de ligação e biológicas in vitrocomo FSH, mas uma meia-vida de circulação aumentada (LaPolt et al., 1992).
[0038] Como "fração ativa" de FSH ou muteínas deste, a presente invenção cobre qualquer fragmento ou precursores da cadeia de poli- peptídeo da molécula de proteína sozinha ou junto com moléculas associadas ou resíduos ligados a estas, por exemplo, resíduos de açúcar ou fosfato, ou agregados da molécula de proteína ou os resíduos de açúcar por si, provido que referida fração tem atividade substancialmente similar a FSH.
[0039] "Derivados funcionais" de FSH, conforme aqui usado, cobrem derivados de FSH ou uma muteína deste, que podem ser preparados a partir dos grupos funcionais que ocorrem como cadeias laterais nos resíduos, ou nos grupos terminais N- ou C-, por meios conhecidos na técnica, e são incluídos na invenção considerando-se que eles permanecem farmaceuticamente aceitáveis, isto é, eles não destroem a atividade da proteína que é substancialmente similar à atividade da gonadotropina, e não conferem propriedades tóxicas nas composições con- tendo-as. Estes derivados podem, por exemplo, incluir cadeias laterais de polietileno glicol, que podem mascarar locais antigênicos, e estender a residência de FSH nos fluidos corpóreos. Outros derivados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxila, amidas dos grupos carboxila pela reação com amónia, ou com aminas primária ou secundária, derivados de N-acila de grupos amino livres dos resíduos de aminoácido formados com porções de acila (por exemplo, grupos alcanoíla ou car- bocíclica aroíla) ou derivados de O-acila de grupos hidroxila livres (por exemplo, aquele de resíduos de serila ou treonila) formados com porções de acila. Em uma concretização preferida, o derivado funcional corresponde a uma molécula de FSH revelando glicosilação adicional.
[0040] O termo "sais" de FSH aqui se refere a ambos sais de grupos carboxílicos e a sais de adição ácidos de grupos amino de FSH. Sais de um grupo carboxila podem ser formados por meios conhecidos na técnica, e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amónia, férrico ou zinco, e similares, e sais com bases orgânicas conforme aqueles formadas, por exemplo, com aminas, tais como trietano- lamina, arginina ou lisina, piperidina, procaína e similares. Sais de adição ácidos incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tais como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Naturalmente, quaisquer tais sais podem reter a atividade biológica da gonado- tropina.
[0041] Conforme aqui usado, o termo "qonadotropina dimérica re- combinante" se refere a uma gonadotropina que foi produzida após cultivo de uma célula geneticamente projetada. A gonadotropina pode ser produzida em uma célula de qualquer origem. A célula geneticamente projetada que expressa uma gonadotropina dimérica expressa ambas subunidades de referida gonadotropina dimérica.
[0042] Conforme aqui usado, o termo "célula geneticamente projetada" se refere a uma célula na qual DNA exógeno foi introduzido de modo a permitir expressão de ambas subunidades da gonadotropina desejada. O DNA exógeno pode compreender uma seqüência que codifica para as subunidades da gonadotropina desejada. Alternativamente, o DNA exógeno pode compreender uma expressão de ativação de seqüência da seqüência endógena que codifica para as subunidades da gonadotropina desejada (vide, por exemplo, o WO 91/09955).
[0043] As células podem ser de, por exemplo, animal, inseto, ou de origem microbial. Conforme aqui usado, o termo "célula animal" inclui células de mamíferos humanos e não-humanos, células de não-mamí- feros, e hibridomas. Exemplos de células de mamíferos nas quais uma gonadotropina dimérica recombinante pode ser produzida incluem, por exemplo, células 3T3, células de COS, células de osteosarcoma humano, células MRC-5, células BHK, células VERO, células CHO, células rCHO-tPA, células de Antígeno de Superfície CHO - Hep B, células HEK 293, células rHEK 293, células de Antígeno de Superfície rC127 - Hep B, células de fibroblasto Humano Normal, células de Estroma, células de Hepatócitos, células PER.C6 e células amniocíticas permanentes humanas. Exemplos de hibridomas nos quais uma gonadotropina dimérica recombinante pode ser produzida incluem, por exemplo, células DA4.4, células 123A, células 127A, células GAMMA e células 67-9- B.
[0044] Na estrutura da presente invenção, é preferido cultivar uma célula de Ovário de Hamster Chinês (célula de CHO).
[0045] Um segundo aspecto da presente invenção é dirigido a um método de reduzir os níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina dimérica recombinante durante seu processo de fabricação, caracterizado em que células que expressam referida gonadotropina dimérica recombinante são cultivadas em um meio de cultura livre de soro compreendendo um antioxidante.
[0046] Conforme aqui usado, o termo "formas oxidadas" se refere a um polipeptídeo no qual um oxidante causou oxidação de um ou mais resíduos de aminoácido. Tais formas podem ser detectadas por, por exemplo, HPLC, conforme descrito no Exemplo 2.1 para FSH.
[0047] O cultivo pode ser efetuado em qualquer ambiente adequado, tais como pratos Petri, frascos T ou garrafas de cilindro, mas preferivelmente em vasos tendo volumes maiores, tais como, por exemplo, um biorreator.
[0048] A etapa de cultivo compreende as seguintes etapas: - uma inoculação de referidas células no referido meio de cultura livre de soro; - uma fase de crescimento; e - uma fase de produção.
[0049] A fase de crescimento é a parte do processo de cultura de célula na qual os parâmetros de processo são ajustados de modo a suportar crescimento celular. Uma vez que a densidade celular desejada tenha sido alcançada, a cultura de célula é usualmente alterada em uma fase de produção, na qual os parâmetros de processo são ajustados de modo a suportar produtividade celular. Os parâmetros de processo podem ser os mesmos durante a fase de crescimento e a fase de produção. Durante a fase de produção, a concentração celular tem preferivelmente um valor compreendido dentro de uma faixa de 1,106 a 5,107 cé- lulas/mL, por exemplo, de cerca de 1,106, 5,106,107 ou 5,107 células/mL. Mais preferivelmente, referida célula é uma célula de CHO.
[0050] Em uma concretização, o antioxidante é adicionado ao mesmo meio de cultura livre de soro antes da inoculação das células. Em outra concretização, o antioxidante é adicionado ao meio de cultura livre de soro imediatamente após inoculação das células (por exemplo, não mais do que 24 horas após inoculação).
[0051] Preferivelmente, o processo de fabricação compreende a etapa de coletar o meio compreendendo a gonadotropina dimérica re- combinante.
[0052] Em uma concretização preferida, o processo de fabricação compreende adicionalmente purificar a gonadotropina dimérica recom- binante. Métodos de purificação de gonadotropinas são bem conhecidos na técnica. FSH pode, por exemplo, ser purificado conforme descrito no EP 04 105 639.1, o WO 98/20039, o WO 00/63248 ou WO 88/10270.
[0053] Em uma concretização preferida adicional, o processo de fabricação compreende adicionalmente formular a gonadotropina dimérica recombinante com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica.
[0054] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme aqui usado, é significativo para envolver qualquer veículo que não interfere com a eficiência da atividade biológica do ingrediente ativo, e que não seja tóxico ao hospedeiro ao qual ele é administrado. Por exemplo, para administração parenteral, a(s) proteína(s) ativa(s) pode(m) ser formulada^) em uma forma de dosagem de unidade para injeção em veículos, tais como solução salina, solução de dextrose, albumina de soro, e solução de Ringer.
[0055] A composição farmacêutica formulada de acordo com a invenção pode, em seguida, ser administrada a um indivíduo em uma variedade de modos. As rotas de administração incluem rotas intradermal, transdermal (por exemplo, em formulações de liberação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracranial, epidural, tópica, retal, e intranasal. Qualquer rota terapeuticamente eficaz de administração pode ser usada, por exemplo, absorção através de tecidos epitelial ou endotelial, ou por terapia de gene na qual uma molécula de DNA que codifica o agente ativo é administrada ao paciente (por exemplo, via um vetor), que faz com que o agente ativo seja expresso e secretado in vivo. Em adição, a(s) proteína(s) de acordo com a presente invenção pode(m) ser administrada(s) junto com outros componentes de agentes biologicamente ativos, tais como tensoativos far- maceuticamente aceitáveis, excipientes, transportadores, diluentes e veículos. Para administração parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), a(s) proteína(s) ativa(s) pode(m) ser formulada^) como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em as-sociação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água, salina, solução de dextrose) e aditivos, que mantêm iso- tonicidade (por exemplo, manitol), ou estabilidade química (por exemplo, conservantes e tampões). A formulação é esterilizada por técnicas comumente usadas.
[0056] Em uma concretização preferida da presente invenção, o método de redução dos níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina dimérica recombinante durante seu processo de fabricação é caracterizado em que pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis etapas de referido processo de fabricação são efetuadas na presença de um antioxidante. Preferivelmente, todas as etapas de referido processo de fabricação são efetuadas na presença de um antioxidante, isto é, o processo de fabricação total é efetuado na presença de um antioxidante.
[0057] Por exemplo, o método de redução dos níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina dimérica recombinante durante seu processo de fabricação pode compreender as etapas de: - Cultivo das células que expressam referida gonadotropina dimérica recombinante em um meio de cultura livre de soro compreendendo um antioxidante; - Coleta do meio compreendendo referida gonadotropina di-mérica recombinante; e - Purificação de referida gonadotropina dimérica recombinante na presença de um antioxidante.
[0058] Preferivelmente, o método de reduzir os níveis de formas oxidadas de uma gonadotropina dimérica recombinante durante seu processo de fabricação compreende adicionalmente a etapa de formular referida gonadotropina dimérica recombinante em uma composição farmacêutica compreendendo um antioxidante.
[0059] O antioxidante pode ser o mesmo em todas as etapas do processo de fabricação nas quais o antioxidante é usado. Alternativamente, antioxidantes diferentes podem ser usados na etapa de cultivo, na etapa de purificação, e/ou na etapa de formulação. Numerosos compostos tendo um efeito antioxidante são conhecidos na técnica. Estes compostos incluem, por exemplo, cisteína, ácido ascórbico, L-metio- nina, L-glutationa, 2-mercaptoetanol, alfa-tocoferol e derivados destes, BO-653, t-butil-4-metoxi-fenol, 2,6-bis(1,1 -dimetiletil)-4-metil fenol; bi- meta-bissulfito de potássio ou sódio, bissulfito de sódio, histidina, taurina, glicina, alanina, carnosina, anserina e 1-metilistidina.
[0060] Um terceiro aspecto da invenção é dirigido a um meio de cultura livre de soro para a produção de gonadotropina dimérica recombinante caracterizado em que referido meio de cultura compreende um antioxidante selecionado a partir do grupo consistindo em: - L-glutationa a uma concentração variando de cerca de 1 mg/L a cerca de 20 mg/L; - 2-mercaptoetanol a uma concentração variando de cerca de 5 mg/L a cerca de 15 mg/L; - L-metionina a uma concentração variando de cerca de 200 mg/L a cerca de 500 mg/L; e - uma combinação de ácido ascórbico a uma concentração variando de cerca de 10 a cerca de 50 mg/L e de (+)-alfa-tocoferol a uma concentração variando de cerca de 5 a cerca de 25 mg/L.
[0061] O meio de cultura livre de soro usualmente compreende água, um regulador de osmolaridade, um tampão, uma fonte de energia, aminoácidos, uma fonte inorgânica ou de ferro recombinante, um fator de crescimento recombinante ou sintético, e, opcionalmente, íons de metal não-ferroso, vitaminas e co-fatores. Por exemplo, quaisquer dos meios livre de soro comercialmente disponíveis listados acima podem ser modificados de acordo com a presente invenção.
[0062] Tendo-se agora descrito totalmente esta invenção, será apreciado por aqueles versados na técnica que a mesma pode ser realizada com uma ampla faixa de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem fugir do escopo e espírito da invenção, e sem experimentação indevida.
[0063] Conquanto esta invenção tenha sido descrita em conjunto com concretizações específicas desta, será compreendido que ela é capaz de outras modificações. Este pedido é pretendido para cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, em geral, os princípios da invenção, e incluindo tais afastamentos a partir da presente descrição como estando dentro da prática conhecida e costumeira dentro da técnica a qual a invenção pertence, e pode ser aplicada às características essenciais aqui abaixo colocadas conforme segue no escopo das reivindicações em anexo.
[0064] Todas as referências aqui citadas, incluindo artigos de jornal ou resumos, pedidos de patente estrangeiros ou norte-americanos publicados ou não publicados, patentes estrangeiras ou norte-americanas publicadas, ou quaisquer outras referências, são totalmente incorporados por referência aqui, incluindo todos os dados, tabelas, figuras e texto apresentados nas referências citadas. Adicionalmente, os conteúdos totais das referências citadas dentro das referências citadas aqui são também totalmente incorporados por referência.
[0065] Referência a etapas de método conhecidas, etapas de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é, de qualquer modo, uma admissão que qualquer aspecto, descrição ou concretização da presente invenção é descrito, ensinado ou sugerido na técnica relevante.
[0066] A descrição precedente das concretizações específicas será, desse modo, totalmente revelada na natureza da invenção que outros podem, pela aplicação do conhecimento dentro do versado na técnica (incluindo os conteúdos das referências aqui citadas), modificar prontamente e/ou adaptar as várias aplicações de tais concretizações específicas, sem experimentação indevida, sem fugir do conceito geral da presente invenção. Portanto, tais adaptações e modificações são pretendidas para estarem dentro do significado de uma faixa de equivalentes das concretizações descritas, baseado nos ensinamentos e orientação aqui apresentados. É para ser compreendido que a fraseologia ou terminologia aqui é para a proposta de descrição e não de limitação, tal que a terminologia ou fraseologia do presente relatório é para ser interpretada pelo versado na técnica à luz dos ensinamentos e orientação aqui apresentados, em combinação com o conhecimento de um versado na técnica.
EXEMPLO 1: Processo de Cultura de Célula 1.1. Linhagens de célula e meio
[0067] Todos os experimentos foram realizados com uma linhagem de célula de CHO expressando ambas subunidades de FSH humano. A proteína produzida é uma gonadotropina dimérica adicionalmente referida como rFSH. A subunidade alfa corresponde a SwissProt Acesso No. P01215, e a subunidade beta corresponde a SwissProt Acesso No. P01225.
[0068] O meio usado para cultivo da célula foi um meio livre de soro básico (SFM) designado para cultivo de células de CHO. O meio de SFM foi suplementado com o antioxidante a ser testado conforme detalhado no Exemplo 3. A concentração inicial dos antioxidantes a serem testados no SFM básico é mostrada na Tabela I. Tabela I: Concentração inicial de antioxidantes no meio livre de soro básico Composto Concentração initial em SFM básico
1.2. Condições de inoculação, crescimento e produção
[0069] O processo de cultura, também referido como "curso", compreende uma etapa de inoculação, uma fase crescimento e uma fase de produção. Cinco cursos diferentes, referidos como cursos 1,2, 3, 4 e 5, foram realizados.
[0070] Pelo menos 2,4.109 de células de produção de rFSH viáveis foram transferidas para um bioreator de 15 L com um volume de operação eficaz de 11 L (newMBR, Zürich) compreendendo microtransporta- dores. Imediatamente após semeadura seguiu-se uma fase de batelada que durou dois ou três dias. O bioreator foi então continuamente alimentado com SFM a uma taxa de diluição de 1 dia-1 e a uma taxa de perfusão a 11 L.dia-1.
[0071] A fase de crescimento e a fase de produção foram realizadas no mesmo pH e temperatura (37°C, pH = 7). O Oxigênio Dissolvido (DO) foi mantido a 50 % de saturação de ar durante o curso total.
EXEMPLO 2: Métodos analíticos 2.1. Determinação de formas oxidadas de rFSH
[0072] As formas oxidadas foram determinadas por RP-HPLC em colheita bruta, conforme descrito por Bassett e Driebergen (Bassett and Driebergen, 2005).
[0073] As percentagens de formas oxidadas foram normalizadas usando-se a percentagem de formas oxidadas obtidas com L-cisteína a 280 mg/L no curso 2 como um referência (isto é, as percentagens de formas oxidadas foram divididas por 23,4%).
2.2. Medição da concentração de célula viável total
[0074] A concentração de célula viável total é definida como a soma da concentração de células fixadas em microveículos e a concentração de células viáveis em suspensão. A concentração de células fixadas nos microtransportadores foi determinada usando-se o método de contagem nucléica de cristal violeta (Fluka 61135). A concentração de células viáveis na suspensão foi determinada usando-se método de exclusão de Trypan azul (Sigma T-8154).
[0075] A Razão de Células Viáveis Totais (Razão de TVC) foi calculada conforme segue: concentração de célula viável total, final de teste / concentração de célula viável total, início de teste, no qual o início de teste é definido como o dia no qual um novo antioxidante é introduzido na cultura, e o final do teste é definido como o dia antes do próximo oxidante ser introduzido na cultura.
2.3. Medição das titulações de rFSH
[0076] A titulação de rFSH foi medida por um ensaio imunofluorimé- trico, usando-se o kit Delphia hFSH de Wallac-ADL (cat. n°A017-201).
2.4. Medição da taxa de consumo de glicose (GCR)
[0077] A taxa de consumo de glicose (GCR), expressa em grama por litro e por dia, foi calculada conforme segue: GCR = (Go - Gt) Dt + (GM- Gt) G significa "Concentração de Glicose" e D significa "taxa de diluição". Os índices se referem ao seguinte: - 0: alimentação de SFM; -1: medido no tempo t; e -1-1: medido no tempo t-1.
EXEMPLO 3: Efeito de vários antioxidantes
[0078] De modo a reduzir o nível de formas oxidadas obtidas com o processo livre de soro, dois cursos de 15 L (cursos 1 e 2) foram realizados testando-se o efeito de vários antioxidantes. Um curso sem adição de qualquer antioxidante foi realizado como um controle (curso 3).
[0079] SFM foi suplementado com vários antioxidantes, ou combinação de antioxidantes, de modo a alcançar a concentração final mostrada na Tabela II. Cada antioxidante ou combinação de antioxidantes foi testado por um período de cerca de dez dias. No primeiro dia de teste, o volume de solução de antioxidante necessário para alcançar o ponto de ajuste foi adicionado. Todo dia, em seguida, uma certa quantidade de antioxidante foi lavada a partir do bioreator por perfusão e substituída por adição de um tempo (para uma taxa de diluição de 1 d- 1, 63,2% do volume do bioreator foi renovado toda 24 hora, e isto representa a quantidade de antioxidante a ser substituída todo dia). No final do período de teste, o antioxidante foi lavado a partir do bioreator por perfusão, e substituído por outro antioxidante a ser testado.
[0080] A percentagem de formas oxidadas de rFSH foi medida no final de cada teste (tabela II). Um valor normalizado inferior a 1,0 indica que o antioxidante testado é mais eficiente do que L-cisteína para diminuir os níveis de formas oxidadas de rFSH.
[0081] A concentração de célula viável total, a GCR e as titulações de rFSH foram medidas diariamente. A Tabela II indica a razão de células viáveis totais (razão de TVC). Uma razão de TVC superior ou igual a 1,0 indica que o antioxidante testado não tem efeito tóxico nas células. Tabela II: Efeito de antioxidantes nas formas oxidadas de rFSH
Tabela II - continuação
[0082] Os resultados mostrados na tabela II indicam que 2-mercap- toetanol, uma combinação de ácido ascórbico e (+)-alfa-tocoferol, L-me- tionina, e L-glutationa são os melhores antioxidantes para obtenção de níveis baixos de formas oxidadas de rFSH.
[0083] Uma razão de TVC de células viáveis totais inferior a 1,0 é obtida somente no caso de 2-mercaptoetanol. Portanto, todos os antioxidantes testados nos Cursos 1 & 2, mas 2-mercaptoetanol, são não- tóxicos. Em adição, a medição da GCR e das titulações de rFSH mostraram que nenhum dos vários antioxidantes tem qualquer impacto maior no metabolismo e modelos de produtividade (dados não mostrados).
[0084] L-metionina e L-glutationa foram escolhidas para otimização adicional do processo de produção. Um curso (curso 3) foi realizado para testar várias concentrações de L-glutationa (de 1 a 20mg/L), e um curso (curso 4) foi realizado para testar várias concentrações de L-me- tionina (de 0,25 a 3g/L). No Curso 3, o teste de L-glutationa foi prematuramente cessado na produção de 30 dias porque os microtransporta- dores foram danificados. As concentrações testadas de L-glutationa ou L-metionina durante os cursos 3 e 4 são mostradas na Tabela III. Operação de Dia zero (WD0) é definida como o dia durante o qual o bioreator é semeado. Produção de Dia zero (PD0) é definida como o dia durante o qual o processo de cultura de célula é alterado da fase de crescimento para fase de produção. Em adição, um curso foi realizado sem variar a concentração de antioxidante. Neste curso, a L-metionina foi adicionada a 250 mg/L a partir do começo (curso 5). Para todos os cursos, a percentagem de formas oxidadas de rFSH foi medida regular-mente (tabela IV). Tabela III: Concentração de antioxidante nos cursos 3 e 4
Tabela IV: Efeito de antioxidantes nas formas oxidadas de rFSH
[0085] A análise de formas oxidadas de rFSH quando o antioxidante foi adicionado ao meio de cultura mostrou que L-metionina é um bom antioxidante. No curso 5, no qual as células foram cultivadas na presença de L-metionina a 250 mg/L, a percentagem média de formas oxidadas foi diminuída por ao redor de 40%, conforme comparado aos resultados obtidos no curso 1 e curso 2 com L-cisteína como antioxidante (vide Tabela II & IV). L-Glutationa é um bom antioxidante também, especialmente a uma concentração de cerca de 2,5 mg/L. No curso 3, a percentagem de formas oxidadas foi diminuída por ao redor de 35% quando as células foram cultivadas na presença de L-glutationa a 2,5 mg/L, conforme comparado aos resultados obtidos no curso 1 e curso 2 com L-cisteína como antioxidante (vide Tabela II & IV).
[0086] O aumento das concentrações da L-metionina parece ter uma tendência diminuída na percentagem de formas oxidadas entre 250 e 2000 mg/L no curso 4. Contudo, parece que as diferenças observadas estão dentro da variabilidade do método conforme variações comparáveis foram observadas no Curso 5 que testa uma concentração de L- metionina de 250 mg/L para o curso total. Em adição, foi confirmado que L-glutationa e L-metionina não têm qualquer impacto maior na viabilidade das células, metabolismo e modelos de produtividade na faixa de concentração que foi testada (dados não mostrados). REFERÊNCIAS 1. Altschul.S.F., Gish,W., Miller,W., Myers,E.W., and Lipman,D.J. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410. 2. Altschul,S.F., Madden,T.L., Schaffer,A.A., Zhang,J., Zhang,Z., Miller,W., and Lipman,D.J. (1997). Gapped BLAST and PSI- BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. 3. Bassett,R.M. and Driebergen,R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod. Biomed. Online. 10, 169-177. 4. Brutlag,D.L., Dautricourt,J.P., Maulik,S., and Relph,J. (1990). Improved sensitivity of biological sequence database searches. Comput. Appl. Biosci. 6, 237-245. 5. Gonnet,G.H., Cohen,M.A., and Benner,S.A. (1992). Exhaustive matching of the entire protein sequence database. Science 256, 1443-1445. 6. Grantham,R. (1974). Amino acid difference formula to help explain protein evolution. Science 185, 862-864. 7. Henikoff,S. and Henikoff,J.G. (1993). Performance evaluation of amino acid substitution matrices. Proteins 17, 49-61. 8. Higgins,D.G., Thompson,J.D., and Gibson,T.J. (1996). Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods Enzymol. 266, 383-402. 9. Karlin,S. and Altschul,S.F. (1990). Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 2264-2268. 10. LaPolt,P.S., Nishimori,K., Fares,F.A., Perlas,E., BoirneJ., and Hsueh,A.J. (1992). Enhanced stimulation of follicle maturation and ovulatory potential by long acting follicle-stimulating hormone agonists with extended carboxyl-terminal peptides. Endocrinology 131, 2514-2520. 11. Matzuk,M.M., Kornmeier,C.M., Whitfield,G.K., Kouri- des,I.A., and BoimeJ. (1988). The glycoprotein alpha-subunit is critical for secretion and stability of the human thyrotropin beta-subunit. Mol. Endocrinol. 2, 95-100. 12. Pearson,W.R. and Lipman,D.J. (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448. 13. Saito,Y., Yoshida,Y., Akazawa,T., Takahashi,K., and Niki,E. (2003). Cell death caused by selenium deficiency and protective effect of antioxidants. J. Biol. Chem. 278, 39428-39434. 14. Skrabanja, A. and Van den Oetelaar, P. Liquid gona-dotropin containing formulations. EP 0 853 945 A1.22-7-1998. 15. Takruri H. Method for the stabilisation of methionine- containing polypeptides, o WO 92/15614. 17-9-1992. 16. Talmadge,K., Boorstein,W.R., and Fiddes,J.C. (1983). The human genome contains seven genes for the beta-subunit of chorionic gonadotropin but only one gene for the beta-subunit of luteinizing hormone. DNA 2, 281-289. 17. Thompson,J.D., Higgins,D.G., and Gibson,T.J. (1994). CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680. 18. Yun,Z., Takagi,M., and Yoshida,T. (2003). Combined addition of glutathione and iron chelators for decrease of intracellular level of reactive oxygen species and death of Chinese hamster ovary cells. J. Biosci. Bioeng. 95, 124-127.