KR20070073780A - 포유동물 세포용 무­혈청 세포 배양 배지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 무-혈청 배지에서 배양된 포유동물 세포에서 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

포유동물 세포용 무­혈청 세포 배양 배지 {SERUM-FREE CELL CULTURE MEDIUM FOR MAMMALIAN CELLS}
본 발명은 무-혈청 배양 조건하에 포유동물 세포를 배양하는 분야, 특히 사람 성장 호르몬 (hGH)과 같은 재조합 단백질을 생성하는 세포를 배양하는 분야에 관한 것이다.
본 발명은 배양에 있어서 포유동물 세포의 성장 및 유지를 위한 무-혈청 배지에 관한 것이다.
세포 배양은 바이러스 백신, 모노클로날 항체, 비항체 면역조절제, 폴리펩티드 성장 인자, 호르몬, 효소, 종양 특이적 항원 등과 같은 다양한 생물학적으로 활성인 생성물을 제조하기 위해 오늘날에도 널리 이용된다. 이러한 생성물은 정상 세포 또는 형질변환된 세포 및 유전자 공학처리된 세포에 의해 생성된다.
과거에는 세포를 배양하기 위하여, 배양 배지에 생물학적으로 활성인 생성물을 생성하는 모든 포유동물 세포주의 성장 및 유지를 위한 보편적인 영양소로서 기능하는 혈청을 보충하였다. 혈청은 호르몬, 성장 인자, 담체 단백질, 부착 및 보급 인자, 영양소, 미량 원소 등을 함유한다. 배양 배지는 일반적으로 약 10% 이하의 동물 혈청, 예컨대 송아지 태아 혈청(FCS)이라 불리는 소태아 혈청(FBS)를 함유 한다.
혈청은 널리 사용되고 있지만 많은 제약을 지닌다. 이것은 세포에 의해 생성된 제한된 양의 관심있는 요망되는 단백질을 방해하는 높은 수준의 수많은 단백질을 함유한다. 혈청으로부터 유래된 이러한 단백질은 관심있는 단백질의 정제와 같은 다운스트림 가공 동안 생성물로부터 제거되어야 하며, 이는 공정을 복잡하게 하고 비용을 증가시킨다.
긴 잠복기 또는 배양 기간을 지니는 소의 전염성 신경퇴행성 질병인 BSE (소 해면 뇌병증)의 출현은 생물학적으로 활성인 생성물의 제조에서 동물-유래된 혈청을 이용하는 것에 대한 조절 개념을 일으켰다.
따라서 생물학적으로 활성인 생성물의 제조 동안 세포 성장을 지지하고 세포를 유지하는 동물 혈청이 없는 대안적인 배지의 개발이 매우 요구된다.
일반적으로, 세포 배양 배지는 아미노산, 비타민, 염, 지방산 및 추가의 화합물들과 같은 상이한 범주의 많은 화합물을 포함한다:
- 아미노산: 예를 들어 미국특허 6,048,728호 (Inlow 등)는 하기 아미노산이 세포 배양 배지에 사용될 수 있다고 기술한다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글라이신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트립토판, 티로신, 트레오닌 및 발린.
- 비타민: 예를 들어 미국특허 2003/0096414호 (Ciccarone 등) 또는 미국특허 5,811,299호 (Renner 등)는 예를 들어 하기 비타민이 세포 배양 배지에 사용될 수 있다고 기술한다: 비오틴, 판토테네이트, 염화콜린, 폴산, 마이오-이노시톨, 니 아신아미드, 피리독신, 리보플라빈, 비타민 B12, 티아민, 푸트레신.
- 염: 예를 들어 미국특허 6,399,381호 (Blum 등)는 CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 나트륨 셀레나이트, CuSO4, ZnCl2를 포함하는 배지를 기술한다. 배양 배지에 사용될 수 있는 무기염을 기술하는 또 다른 문헌의 예로는 US 2003/0153042호 (Arnold 등)가 있고, 여기에 CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, CuCl2·2H2O, ZnCl2를 포함하는 배지가 기술되어 있다.
- 지방산: 배지에 사용되는 것으로 공지된 지방산은 아라키돈산, 리놀레산, 올레산, 라우르산, 미리스트산 및 메틸-베타-시클로덱스트린이다. 참조. 예컨대 미국특허 5,045,468호 (Darfler). 시클로덱스트린은 그 자체로서 지질은 아니지만 지질과 착물을 형성하는 능력을 지녀서 세포 배양 배지에서 지질을 용해시키는데 사용됨을 주목하여야 한다.
- 무­혈청 세포 배양 배지의 구성에 특히 사용되는 추가의 성분으로는 글루코오스, 글루타민, Na-피루베이트, 인슐린 또는 에탄올아민과 같은 화합물 (예컨대 EP 274 445), 또는 플루로닉(Pluronic) F68과 같은 보호제가 있다. 플루로닉
Figure 112007028374353-PCT00001
F68 (또한 폴록사머(Poloxamer) 188로서 공지되어 있음)은 산화에틸렌 (EO) 및 산화프로필렌 (PO)의 블록 공중합체이다.
표준 "기초 배지"가 또한 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 배지는 이미 여러 개의 상기 언급된 배지 성분들을 함유한다. 널리 적용되는 이러한 배지의 예로는 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM), DMEM F12(1:1), 햄의 영양소 혼합물 F-10, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지(RPMI), MCDB 131 또는 윌리암의 배지 E가 있다. 이러한 시판 배지는 예컨대 기브코(Gibco), 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수할 수 있다.
아연(Zn) 및 구리(Cu)와 같은 금속이 대사 반응에 관여한다 (Vallee and Falohuk, 1993, 또는 Lindner, 1991).
아연은 다수의 거대분자의 구조 및 기능 및 수많은 효소 반응에 필수적이다. 이것은 단백질의 적합한 폴딩에서 촉매적, 조-촉매적 또는 구조적 역할을 담당한다. Zn-ATP는 생물기원 아민 합성 및 모노아민 옥시다아제 대사에 필수적인 두 보조효소인, 피리독살-5-포스페이트 및 플라빈 아데노신 디누클레오티드 (FAD)의 합성에 필요하다.
자유 라디칼에 의한 손상으로부터 생물학적 구조를 보호함에 있어서 아연의 활성은 여러 가지 인자에 기인할 수 있다: 유리 라디칼 스캐빈져이기도 한 금속단백질의 충분한 수준 유지, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 필수적인 성분, 티올에 대한 보호제, 및 유리 라디칼을 형성하는 화학기와 철의 상호작용 억제.
이에 추가하여, Zn의 존재는 지질 과산화를 억제한다. 또한 아연은 튜불린 중합반응의 효과인자이며 시험관내에서 액틴 필라멘트 형성 및 안정화에 작용한다. 아연은 전사 단백질의 공통의 모티프인 DNA 결합 단백질의 아연 핑거 모티프의 성분이기도 하다.
아연 이온은 주로 단백질 및 핵산과 착물의 형태로 존재하며, 유전자 정보 발현의 중개 대사, 전달 및 조절, 펩티드 호르몬의 저장, 합성 및 작용 및 크로마틴 및 생체막의 구조적 유지의 모든 측면에 관여한다.
구리 또한 수많은 세포 효소의 기능에 중요한 미량 원소이다. 구리 이온은 별개의 산화환원 상태로서 산화된 Cu(II), 또는 환원된 Cu(I)를 채택할 수 있고, 금속이 효소의 산화환원-화학에서 촉매적 보조인자로서 세포 생리학에서 중요한 역할을 담당할 수 있도록 한다. 이것은 시토크롬 c 옥시다아제, 티로시나아제, 도파민-β-모노옥시게나아제, 아민 옥시다아제 및 라이실 옥시다아제를 포함하는 구리 옥시다아제의 그룹으로 기능한다. 또한 구리는 미토콘드리아 호흡, 세룰로플라스민의 성분으로서 철 항상성, 유리 라디칼 청소 및 엘라스틴 가교에 관여한다.
아연 또는 구리 이온과 같은 금속 이온을 포함하는 무-혈청 배지는 당 분야에 공지되어 있다, 예컨대 미국특허 6,048,728호 (Inlow 등), 미국특허 4,767,704호 (Cleveland 등) 또는 WO 01/16294 (Life Technologies Inc.). 그러나, 이러한 문헌은 상기 이온을 표준 생성 배지에 특정 농도로 첨가시킨 경우 이들 이온의 생산성-향상 효과에 대해 기술하고 있지 않다.
치료 단백질 또는 백신과 같은 생물학적으로 활성인 생성물을 개발하고 공급하기 위해서는 많은 양이 제조되어야 한다. 폴리펩티드를 제조하기 위해 널리 사용되는 적합한 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
CHO 세포는 암컷 중국 햄스터로부터의 난소 생검으로부터 퍽(Puck) (J.Exp.Med. 108, 945, 1958)에 의해 최초로 배양되었다. 이러한 최초의 세포로부 터 다양한 특징을 지니는 수많은 서브-주가 제조되었다. 이러한 CHO 세포주의 하나인 CHO-K1은 프롤린-요구성이며 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 유전자에 대한 이배체이다. 상기 세포주에서 유래된 또 다른 주는 DHFR 결손 CHO 세포주 (CHO DUK B11)(PNAS 77, 1980, 4216-4220)이며, 이것은 하나의 DHFR 유전자에서의 돌연변이 결과, DHFR 기능의 손실 및 다른 유전자의 후속적인 손실을 특징으로 한다.
사람에게 투여할 의도로 단백질의 제조에 빈번하게 사용되는 추가의 세포는 사람 섬유육종 세포주 HT1080 또는 사람 배아 신장 세포주 293과 같은 사람 세포주이다.
뮤린 C127 세포주도 재조합 단백질을 생성하기에 매우 적합하다 (Carter 등, 1989; Oka and Rupp, 1990).
관심있는 하나의 치료 단백질은 성장 호르몬이다. 소마트로핀(INN) 또는 소마토트로핀으로도 공지되어 있는 사람 성장 호르몬(hGH)은 앞 뇌하수체의 소마토트로픽 세포에 의해 생성되고 분비되는 단백질 호르몬이다. 사람 성장 호르몬은 유년기의 신체 성장 및 성인기의 대사에서 단백질, 탄수화물 및 지질 대사에 대한 이의 영향을 통해 중요한 역할을 담당한다.
사람 성장 호르몬은 두 개의 이황화 결합을 지니는 191개 아미노산의 단일 폴리펩티드 사슬이며 (Bewly 등, 1972), 결합 중 하나는 Cys-53 및 Cys-165 사이에 존재하여 분자에 큰 루프를 형성하고, 다른 하나는 Cys-182 및 Cys-189 사이에 존재하여 C-말단 근처에 작은 루프를 형성한다. 아미노산 서열을 규명하는 DNA 서열이 마르티앨(Martial) 등에 의해 보고되었다. 정제된 hGH는 이의 동결건조된 형태 에서 백색의 무정형 분말이다. 이것은 수성 완충액에 6.5 내지 8.5의 pH에서 용이하게 용해된다 (농도 > 10 mg/L).
용액에서, hGH는 현저하게 단량체로서 존재하며 이량체로서 소 분획 및 더 높은 분자량 올리고머를 지닌다. 특정 조건하에, hGH는 다량의 이량체, 삼량체 및 더 높은 올리고머를 형성하도록 유도될 수 있다.
hGH의 여러 개의 유도체가 공지되어 있으며, 이는 천연 발생 유도체, 변이체 및 대사 생성물, 주로 생합성 hGH의 분해 생성물 및 유전자 방법에 의해 생성된 hGH의 공학처리된 유도체를 포함한다. hGH의 천연 발생 유도체의 한 예는 태반에서 발견되는 성장 호르몬의 변이체인 GH-V이다. 유전자좌의 다른 멤버가 첸(Chen) 등(1989)에 의해 기술되었다. 신체에서 길게 작용하도록 고안된 유도체를 포함하는 hGH의 임의의 유도체가 이것이 hGH의 생물학적 활성을 존속시키는 한 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
메티오닐 hGH는 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 최초의 hGH의 형태이다. 상기 화합물은 실제로 이의 N-말단에 하나의 추가적인 메티오닌 잔기를 지니는 hGH의 유도체이다 (Goeddel 등, 1979).
20-K-hGH라 불리는 hGH의 천연 발생 변이체가 뇌하수체 뿐만 아니라 혈류에서 발생한다고 보고되었다 (Lewis 등, 1978; Lewis 등, 1980). Glu-32에서 Gln-46까지 15개의 아미노산 잔기가 결여된 상기 화합물은 메신져 리보핵산의 택일적인 스플라이싱으로부터 발생한다 (DeNoto 등, 1981). 상기 화합물은 hGH의 많은 생물학적 특성을 공유하나, 모든 특성을 공유하는 것은 아니다.
20-K-hGH는 뇌하수체에서 만들어져 혈액으로 분비된다. 이것은 성인의 성장 호르몬 출력의 약 5%를 구성하며, 소아의 성장 호르몬 출력의 약 20%를 구성한다. 이것은 22 kD 성장 호르몬과 동일한 성장 촉진 활성을 지니며, 지질분해 활성의 양이 22 kD 형태와 같거나 보다 큰 것으로 보고되었다. 이것은 22 kD 성장 호르몬과 동등한 친화력으로 성장 호르몬 수용체에 결합되며, 22 kD 호르몬의 10분의 1의 락토겐 (유사-프로락틴) 생체활성을 지닌다. 22 kD와 달리, 20-K-hGH는 약한 항-인슐린 활성을 지닌다.
hGH의 다수의 유도체가 분자의 단백질분해 변형으로부터 발생한다. hGH의 대사를 위한 일차 경로는 단백질분해를 수반한다. 잔기 130-150 주위의 hGH의 영역은 단백질분해에 매우 민감하며, 이 영역에 새김눈(nick) 및 결실을 지니는 수 개의 hGH 유도체가 기술되어 있다 (Thorlaclus-Ussing, 1987). 이 영역은 hGH의 큰 루프에 존재하며, 여기에서 펩티드 결합의 절단은 Cys-53 및 Cys-165에서 이황화 결합을 통해 연결된 두 사슬의 생성을 초래한다. 수많은 이러한 두-사슬 형태가 증가된 생물학적 활성을 지니는 것으로 보고되었다 (Singh 등, 1974). 효소를 이용하여 사람 성장 호르몬의 많은 유도체를 인위적으로 생성시켰다. 효소 트립신 및 서브틸리신 등을 분자의 전체에 걸친 다양한 지점에서 hGH를 개질시키기 위해 사용해 왔다 (Lewis 등, 1977; Graff 등, 1982). 두-사슬 동화 단백질(2-CAP)이라 불리는 이러한 하나의 유도체를 트립신을 이용하여 hGH의 조절된 단백질분해를 통해 형성하였다 (Becker 등, 1989). 2-CAP는 hGH의 성장-촉진 활성이 크게 유지되고 탄수화물 대사에 대한 대부분의 효과가 파괴된다는 점에서, 완전한 hGH 분자와 매우 다른 생물학적 특성을 지니는 것으로 나타났다.
단백질의 아스파라긴 및 글루타민 잔기는 적합한 조건하에 탈아미드화 반응에 민감하다. 뇌하수체 hGH는 이러한 유형의 반응을 진행시켜 Asn-152를 아스파르트산으로 전환시키고 또한 보다 적은 한도로 Gln-137을 글루탐산으로 전환시키는 것으로 나타났다 (Lewis 등, 1981). 탈아미드화된 hGH는 효소 서브틸리신을 이용한 단백질분해에 대해 변경된 민감성을 지니는 것으로 나타났고, 이는 탈아미드화가 hGH의 단백질분해 절단을 유도하는 생리적 유의성을 지닐 수 있음을 제안한다. 생합성 hGH는 특정 저장 조건하에 분해되어 상이한 아스파라긴(Asn-149)에서 탈아미드화되는 것으로 공지되어 있다. 이것은 탈아미드화의 일차적인 부위이나, Asn-152에서의 탈아미드화 또한 보여진다 (Becker 등, 1988). Gln-137에서의 탈아미드화는 생합성 hGH에서 보고된 바 없다.
단백질의 메티오닌 잔기는 산화에 민감하며, 주로 설폭사이드에 민감하다. 뇌하수체-유래된 hGH 및 생합성 hGH 둘 모두는 Met-14 및 Met-125에서 설폭시드화를 진행한다 (Becker 등, 1988). Met-170에서의 산화가 또한 뇌하수체에서 보고되었으나 생합성 hGH에서는 보고되지 않았다. 데스아미드 hGH 및 Met-14 설폭시드 hGH 둘 모두는 완전한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 발견되었다 (Becker 등, 1988).
효소 작용 또는 유전자 방법에 의해 hGH의 절단된 형태를 생성하였다. 트립신의 조절된 작용에 의해 생성된 2-CAP는 제거된 hGH의 N-말단에서의 처음 8개의 잔기를 지닌다. 적합한 숙주에서 발현 이전에 유전자를 개질시킴에 의해 hGH의 다 른 절단된 버젼을 생성하였다. 처음 13개의 잔기를 제거시켜 폴리펩티드 사슬이 절단되지 않은 독특한 생물학적 특성을 지니는 유도체를 수득하였다 (Gertler 등, 1986).
사람 성장 호르몬은 원래 시체의 뇌하수체로부터 수득되나, 이러한 제조물은 전기영동적으로 균일하지 않고, 50% 순도의 제조물로 처리된 환자의 혈청에서 항체가 나타나며, 면역원성이 비활성 성분에 기인한다. 재조합 DNA 기술은 다수의 상이한 시스템에서 제한된 공급의 hGH의 생산을 허용하였다. 배양 배지로부터 hGH의 정제는 오직 적은 양의 오염성 단백질의 존재에 의해 촉진된다. 실제로, hGH는 단일 정제 단계에 의해 역상 HPLC 컬럼 상에서 실험실 규모로 정제될 수 있는 것으로 나타났다 (Hsiung 등, 1989).
재조합 사람 성장 호르몬인 rhGH를 세로노 인터내셔널 에스.에이.에서 세로스팀
Figure 112007028374353-PCT00002
(SEROSTIM)으로서 생성하였으며, 체중 감소를 치료하고 AIDS 환자에서의 웨이스팅(wasting)을 위해 이 생성물의 FDA 승인을 진행하고 있다. 사이젠
Figure 112007028374353-PCT00003
(SAIZEN)은 유아에서 GH 결핍, 여성의 터너 증후군, 및 유아에서 만성 신장 기능상실에 필요한 재조합 사람 성장 호르몬이다. 제넨테크 인크(Genentech, Inc. (South San Francisco, CA)에서 제조한 프로트로핀
Figure 112007028374353-PCT00004
(PROTROPIN)은 천연 서열 hGH와 구조가 약간 상이하며 N-말단에 추가의 메티오닌 잔기를 지닌다. 재조합 hGH는 일반적으로 hGH 및 추가의 부형제, 예컨대 글라이신 및 만니톨을 동결건조된 형태로 함유하는 바이알로서 시판된다. 동반하여 희석제 바이알이 제공되며, 이는 용량을 투여하기 전에 환자가 생성물을 요망되는 농도로 재구성할 수 있게 한다. 재 조합 hGH가 미리충전된 주사기 등과 같은 다른 널리 공지된 방식으로 판매될 수도 있다.
일반적으로, 재조합 천연 서열 hGH, 재조합 N-메티오닐-hGH, 또는 사람의 뇌하수체-유래된 물질의 약물동력학 또는 생물학적 활성에 유의적인 차이는 관찰되지 않았다 (Moore 등, 1988; Jorgensson 등, 1988).
성장 호르몬이 사용된 다양한 의학적 징후에 비추어 볼 때, 이를 세포 배양액, 특히 무-혈청 세포 배양 공정에서 충분한 양으로 생성하는 효과적이고도 안전한 방법에 대한 요구가 존재한다.
무-혈청 배지는 당 분야에 기술되어 있다.
예를 들어, 미국특허 6,162,643호는 미량의 황산구리 및 염화아연을 함유하는 HECK-109라 불리는 무-혈청 기초 배지를 기술하였다. 상기 배지는 사람 이식을 위한 조직 생성을 목적으로 각질세포와 같은 정상 사람 세포의 일차 및 이차 배양을 위해 특히 고안되었다. 시험관내 세포주에서 재조합 사람 단백질의 발현은 상기 미국특허에 언급되어 있지 않다.
미국특허 5,324,656호는 미량의 황산구리 및 염화아연을 포함하는 MCDB120 및 MCDB131M이라 불리는 무-혈청 기초 배지를 기술하였다. 상기 배지는 사람 근육 위성 세포의 분화를 억제할 목적으로 이러한 세포의 시험관내 배양을 위해 특히 고안되었다. 재조합 사람 단백질의 생성은 상기 문헌의 구성에 구체화되어 있지 않다.
GB 2 196 348호는 하이브리도마 및 골수종 세포의 시험관내 배양을 위한 합 성 배지를 기술하였다. 배지는 구리, 아연 및 철 이온을 함유한다. 상기 배지에서 하이브리도마 및 골수종 세포의 배양은 오로지 모노클로날 항체만을 제조하기 위한 목적이다.
미국특허 6,103,529호는 동물 세포를 시험관내 배양하기 위한 무-혈청 세포 배양 배지 제형을 제공한다. 동물 세포는 바이러스, 모노클로날 항체, 호르몬 또는 성장 인자의 생성을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 성장 호르몬의 생성은 상기 문헌에 언급되어 있지 않다.
미국특허 6,048,728호는 예컨대 항체와 같은 천연 또는 재조합 생성물을 제조하기 위해 동물 세포를 배양하기 위한 Co-, Zn- 및 Fe-이온을 포함하는 무-단백질 세포 배양 배지를 기술하였다. 배양된 세포에 의해 제조되는 상기 생성물은 성장 호르몬 또는 성장 인자를 포함하지 않으며, 배양시 세포 성장을 향상시키기 위해 무-혈청 배지의 성분으로서만 기재되어 있다.
미국특허 5,316,938호는 구연산 제2철, 황산아연 및 황산구리를 포함하는 WCM5라 명명된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 대한 생화학적으로 규정된 배양 배지를 기술하였다. 상기 배지는 CHO 세포에서 항체 및 tPA 생성을 위해 특히 고안되었다.
미국특허 5,122,459호는 CHO 세포의 배양에 특히 적합한, 아연 및 철 이온을 포함하는 무-혈청 배양 배지에서 재조합 단백질의 제조 방법을 기술하였다. 성장 호르몬의 생성은 상기 문헌에 언급되어 있지 않다.
따라서, 본 발명의 기초가 되는 문제는 성장 호르몬, 특히 사람 성장 호르몬 (hGH)의 효과적인 생성을 위한 무-혈청 세포 배양 배지를 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 동물 혈청으로부터 유래된 성분들이 없고 동시에 배양액에서 세포 성장 및 포유동물 세포의 유지에 고도로 효과적이어서 특히 재조합 단백질의 생성을 가능하게 하는 세포 배양 배지의 개발에 근거한다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 아연 및/또는 구리를 미량으로 포함하는 동물 혈청으로부터 유래된 성분들이 없는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 배지가 미량의 철 이온을 추가로 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 배지에서 관심있는 단백질을 발현시키는 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제3 측면은 관심있는 단백질을 제조하기 위한 본 발명에 따른 배지의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제4 측면은 관심있는 폴리펩티드의 제조 단계 동안 배양액에서 세포를 유지하기 위한 본 발명에 따른 배지의 용도에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 상이한 원소를 10 μM로 DMEM 배양 배지에 지속적으로 첨가시키는 제조 단계에서 수득된 rhGH 생산성 프로필을 도시한다 (RB = 롤러 보틀, H1-H14 = 제조 단계 1일 내지 14일);
도 2는 금속(니켈, 바륨, 코발트, 크롬)을 10 μM로 DMEM 배양 배지에 지속적으로 첨가시키는 제조 단계에서 수득된, 롤러 보틀에 대한 mg rhGH로서 표시된, 평균 rhGH 생산성 수치를 도시한다;
도 3은 아연 (Zn 0.5 μM), 구리(Cu 0.02 μM), 셀렌 (Se 0.050 μM), 마그네슘 (Mn 0.001 μM) 및 구연산 제2철 (4.8 μM)의 조합물을 시험하기 위한 인자 설계 실험에서 수득된, 대조군에 대한 rhGH 생상선 증가의 평균 수치를 도시한다;
도 4는 금속 미량 원소 (Zn 0.5 μM, Cu 0.02 μM 및 구연산 제2철 4.8 μM) 및 아미노산 글루타민 (Gln 4.8 mM), 세린 (Ser 0.49 mM) 및 시스틴 (Cys 0.29 mM) 혼합물의 결과를 결정하기 위한 인자 설계 실험의 결과를 도시한다;
도 5는 DMEM에서 rhGH 생산성에 대한 아연 및 구연산 제2철 (Zn 0.5 μM, Fe 시트레이트 4.8 μM)와 조합된 상이한 농도의 구리의 효과를 도시한다;
도 6은 DMEM에서 rhGH 생산성에 대한 구리 및 구연산 제2철 (Cu 0.02 μM, Fe 시트레이트 4.8 μM)와 조합된 상이한 농도의 아연의 효과를 도시한다;
도 7은 rhGH-생성 C 127 세포를 이용한 상이한 실험으로부터 구리, 아연 및 구연산 제2철 (Zn: 1.5 및 0.5 μM, Cu: 0.02 μM 및 구연산 제2철: 4.8 μM)를 DMEM 보조물로서 첨가시킬 때 수득되는 rhGH 생산성 증가의 효과를 요약한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 동물 혈청이 없는 세포 배양 배지의 개발에 근거한다.
본 발명에 따라, 동물 혈청이 없는 세포 배양 배지는:
농도가 0.2 내지 1.75 μM인 아연(Zn), 및/또는
농도가 10 내지 75 nM인 구리(Cu), 및/또는
농도가 3 내지 10 μM인 철 이온(Fe)을 포함한다.
하기 실시예에 개시된 대로, 표준 배지에 미량의 Zn 및/또는 Cu를 첨가시키는 것은 관심있는 분비된 단백질을 발현시키는 세포의 생산성을 증가시켰다.
상기 언급된 농도로 Zn 및 Cu 둘 모두를 첨가시키는 것은 C127 세포에서 재조합 사람 성장 호르몬 (GH)의 생산성을 대조군(표준 DMEM에서 배양된 동일한 세포)에 비해 60% 넘게 증가시켰다. GH 발현 세포를 상기 언급된 농도로 Zn, Cu 및 Fe 이온을 포함하는 배지에서 배양할 때, 생산성은 대조군에 비해 약 70%까지 증가되었다.
본 발명의 배지 중 금속 이온의 바람직한 농도 범위는 하기와 같다:
- 약 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.5, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1, 1.05, 1.1, 1.15, 1.2, 1.25, 1.3, 1.35, 1.4, 1.45, 1.5, 1.55, 1.6, 1.65, 1.7, 1.75 μM의 아연.
바람직하게는, 아연은 약 0.5 μM 또는 약 1.5 μM으로 구성된다. 아연은 황산아연으로서 구성되는 것이 또한 바람직하다.
- 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75 nM의 구리.
바람직하게는 구리가 약 25 nM으로 구성된다. 구리는 황산구리로서 구성되는 것이 또한 바람직하다.
- 철 이온은 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 4.8, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 μM으로 구성된다.
바람직하게는, 철 이온은 약 5 또는 6 μM으로 구성된다. 철 이온은 구연산 제2철 및/또는 질산 제2철로서 구성되는 것이 바람직할 수 있고, 구연산 제2철이 세포 배양 배지를 구성하는 대부분의 철 이온이 되는 것이 추가로 바람직하다. 배지는 예를 들어 약 5 μM의 구연산 제2철 및 약 1 μM의 질산 제2철을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 배지는 기초적인 배지의 성분들을 추가로 포함한다. 배지는 기본적인 배지로서 둘베코의 개질된 이글 배지 (DMEM)을 함유하는 것이 바람직하다. 표준 DMEM의 조성은 하기 실시예에 보고되어 있다.
본 발명의 제2 측면은 본 발명의 배지에서 관심있는 단백질을 발현시키는 세포를 배양하는 단계를 포함하여 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 배양 단계는 페트리 디시, T-플라스크 또는 롤러 보틀과 같은 임의의 적합한 환경에서 수행될 수 있으나, 생체반응기와 같은 보다 큰 부피의 용기에서 수행될 수도 있다.
본 발명의 단백질은 사용되는 특정 세포 유형에 적합한 임의의 프로모터를 이용하여 발현될 수 있다. 매우 바람직한 구체예에서, 단백질은 금속티오네인(MT) 프로모터로부터 발현된다. 뮤린 세포를 단백질 생성에 이용하는 경우, 프로모터는 뮤린 MT-1 프로모터인 것이 바람직하다.
본 방법은 관심있는 단백질을 포함하는 배지를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 본 방법은 관심있는 단백질을 단리시키는 것을 추가로 포함한다.
추가로 바람직한 구체예에서, 본 방법은 단리된 단백질을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화시켜 약제 조성물을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
제3 측면에서, 본 발명은 관심있는 폴리펩티드를 제조하기 위한 본 발명에 따른 배지의 용도에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 관심있는 폴리펩티드의 제조 단계 동안 배양액에서 세포를 유지하기 위한 본 발명의 배지의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 측면의 구성에 사용되는 세포는 포유동물 세포인 것이 바람직하다. 이들은 사람 또는 동물 기원일 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 배양될 수 있는 포유동물 세포의 예로는, 예컨대 뮤린 C127 세포, 3T3 세포, COS 세포, 사람 골육종 세포, MRC-5 세포, BHK 세포, VERO 세포, CHO (중국 햄스터 난소) 세포, HEK 293 세포, rHEK 293 세포, 정상 사람 섬유모 세포, 기질 세포, 간세포, 또는 PER.C6 세포가 있다. 본 발명에 따른 방법으로 배양될 수 있는 하이브리도마의 예로는, 예컨대 DA4.4 세포, 123A 세포, 127A 세포, GAMMA 세포 및 67-9-B 세포가 있다.
본 발명에 따라 뮤린 C127 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 배양된 세포는 현탁액에서 성장할 수 있거나, 고정 의존성 세포인 경우, 고체 지지체에 부착될 수 있다. 미세담체 및 피브라-셀
Figure 112007028374353-PCT00005
(Fibra-Cel) 디스크가 고정-의존성 세포의 성장을 위해 포유동물 세포 배양액에 사용되며 단백질의 산업적 제조를 위해 확립된 기술적 플랫폼 중 하나이다 (참조, 예컨대 Bohak 등, 1987; Petti 등, 1994).
본 발명의 방법은 관심있는 폴리펩티드를 생성하도록 기능하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 배지는 소규모 또는 대규모로 생성이 요망되는 임의의 폴리펩티드일 수 있는 관심있는 폴리펩티드 또는 단백질의 생성에 사용된다.
관심있는 폴리펩티드는 예컨대 천연 분비된 단백질, 정상적인 세포질 단백질, 정상적인 트랜스막 단백질, 또는 사람 또는 사람화된 항체일 수 있다. 관심있는 단백질이 천연 세포질 단백질 또는 천연 트랜스막 단백질인 경우, 단백질은, 즉 이의 앞에 또는 이의 (가용성 또는 세포외) 단편 앞에 시그널 펩티드를 정위시킴에 의해 가용화되거나 분비되도록 공학처리되는 것이 바람직하다.
관심있는 폴리펩티드는 임의의 기원일 수 있다. 관심있는 바람직한 폴리펩티드는 사람 기원이고, 보다 바람직하게는 관심있는 단백질이 치료적 단백질이다.
바람직하게는, 관심있는 단백질이 호르몬, 사이토킨-결합 단백질, 인터페론, 가용성 수용체 또는 항체로부터 선택된다.
본 발명에 따라 생성될 수 있는 치료적 단백질로는, 예컨대 융모 생식샘자극호르몬, 난포-자극 호르몬, 루트로핀-융모 생식샘자극호르몬, 갑상샘 자극 호르몬, 성장 호르몬, 특히 사람 성장 호르몬, 인터페론 (예컨대, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b), 인터페론 수용체 (예컨대, 인터페론 감마 수용체), TNF 수용체 p55 및 p75 및 이의 가용성 버젼, TACI 수용체 및 이의 Fc 융합 단백질, 인터루킨 (예컨대, 인터루킨-2, 인터루킨-11), 인터루킨 결합 단백질 (예컨대, 인터루킨-18 결합 단백질), 항-CD11a 항체, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-매크로파지 콜로니-자극 인자, 뇌하수체 펩티드 호르몬, 폐경 생식샘자극호르몬, 유사 인슐린 성장 인자 (예컨대, 소마토메딘-C), 각질세포 성장 인자, 아교 세포주-유래된 신경 인자, 트롬보모듈린, 기초 섬유모세포 성장 인자, 인슐린, 인자 VIII, 소마트로핀, 골 형태발생 단백질-2, 혈소판-유래 성장 인자, 히루딘, 에포이에틴, 재조합 LFA-3/IgG1 융합 단백질, 글루코세레브로시다아제, 및 이의 뮤테인, 단편, 가용성 형태, 기능적 유도체, 융합 단백질이 있다.
바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 융모 생식샘자극호르몬(CG), 난포-자극 호르몬(FSH), 루트로핀-융모 생식샘자극호르몬(LH), 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 사람 성장 호르몬(hGH), 인터페론 (예컨대, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b), 인터페론 수용체 (예컨대, 인터페론 감마 수용체), TNF 수용체 p55 및 p75, 인터루킨 (예컨대, 인터루킨-2, 인터루킨-11), 인터루킨 결합 단백질 (예컨대, 인터루킨-18 결합 단백질), 항-CD11a 항체, 및 이의 뮤테인, 단편, 가용성 형태, 기능적 유도체, 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가로 바람직한 관심있는 폴리펩티드는, 예컨대 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-매크로파지 콜로니-자극 인자, 뇌하수체 펩티드 호르몬, 폐경 생식샘자극호르몬, 유사 인슐린 성장 인자 (예컨대, 소마토메딘-C), 각질세포 성장 인자, 아교 세포주-유래된 신경 인자, 트롬보모듈린, 기초 섬유모세포 성장 인자, 인슐린, 인자 VIII, 소마트로핀, 골 형태발생 단백질-2, 혈소판-유래 성장 인자. 히루딘, 에포이에틴, 재조합 LFA-3/IgG1 융합 단백질, 글루코세레브로시다아제, 및 이의 뮤테인, 단편, 가용성 형태, 기능적 유도체, 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 방법에서 생성된 관심있는 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되어, 공정 결과로서 약제 조성물을 제공한다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 정의는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고 이것이 투여되는 숙주에 대해 독성이지 않은 임의의 담체를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 비경구 투여를 위해, 활성 단백질(들)을 염수, 덱스토로스 용액, 혈청 알부민 및 링거액과 같은 비히클에서 주사용 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다.
이후 본 발명에 따라 제형화된 약제 조성물을 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로로는 진피내, 경피 (예컨대 느린 방출성 제형), 근내, 복막내, 정맥내, 피하, 경구, 두개내, 경막외, 국소, 직장 및 비내 경로가 있다. 임의의 다른 치료학적으로 유효한 투여 경로를 이용할 수 있으며, 예를 들어 상피 또는 내피 조직을 통한 흡수 또는 활성 작용제를 엔코딩하는 DNA 분자를 환자에게 투여하여 (예컨대, 벡터를 통해) 활성 작용제가 생체내에서 발현되고 분비되도록 하는 유전자 치료법이 있다. 또한, 본 발명에 따른 단백질(들)은 약제학적으로 허용되는 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제 및 비히클과 같은 생물학적으로 활성인 작용제의 다른 성분들과 함께 투여될 수 있다.
비경구 (예컨대, 정맥내, 피하, 근내) 투여를 위해, 활성 단백질(들)을 약제학적으로 허용되는 비경구 비히클(예컨대, 물, 염수, 덱스로오스 용액) 및 등장성 (예컨대, 만니톨) 또는 화학적 안정성 (예컨대, 보존제 및 완충액)을 유지하는 첨가제와 함께 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말로서 제형화시킬 수 있다. 제형은 일반적으로 사용되는 기술에 의해 살균된다.
본 발명에 따라, 성장 호르몬을 생성하기 위해 본 발명의 배지를 사용하는 것이 매우 바람직하다.
GH는 원시, 즉 천연 발생 GH일 수 있다. 바람직하게는, 생성되는 GH가 사람 기원이다. GH가 가용성의 분비 단백질이기 때문에, 이것은 천연 시그널 펩티드, 또는 이종성 시그널 펩티드, 즉 사용된 특정 발현 시스템에서 보다 효과적일 수 있는 또 다른 분비된 단백질로부터 유래된 시그널 펩티드에 의해 세포 배양 상청액으로 방출된다.
"성장 호르몬"이라는 용어는 본원에서 "GH"와 동의어로 사용된다. 상기 용어는 천연 또는 원시 GH, 재조합에 의해 생성된 GH 뿐만 아니라 "배경 기술"에서 상세하게 설명된 GH 변이체를 포함한다. 본원에서 사용된 "GH"라는 용어는 GH의 뮤테인, 기능적 유도체, 활성 분획, 융합 단백질, 순환에 의해 치환된 단백질 및 염을 추가로 포함한다. GH는 사람인 것이 바람직하나, 또한 다른 종, 특히 포유동물로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 "뮤테인"이라는 용어는 GH의 유사체를 언급하며, 여기서 초래되는 생성물의 활성을 야생형 GH에 비해 현저하게 감소시키지 않으며 천연 GH의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 상이한 아미노산 잔기에 의해 교체 또는 결실되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 GH의 천연 서열에 첨가된다. 이러한 뮤테인은 공지된 합성 및/또는 부위-유도된 돌연변이유발 기술, 또는 이에 적합한 임의의 다른 공지된 기술에 의해 제조된다.
본 발명에 따른 뮤테인은 DNA 또는 RNA에 하이브리드화되고 엄격한 조건하에 GH를 엔코딩하는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 의해 엔코딩되는 단백질을 포함한다. GH를 엔코딩하는 DNA는 선행 기술에 공지되어 있다. "엄격한 조건"이라는 용어는 당업자가 통상적으로 "엄격"하다고 언급하는 하이브리드화 및 후속적인 세척 조건을 언급한다. 참조 문헌[Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, 상술함, Interscience, N.Y., §§6.3 및 6.4 (1987, 1992)]. 비제한적으로, 엄격한 조건의 예는 예컨대 2 x SSC 및 0.5% SDS 5분, 2 x SSC 및 0.1% SDS 15분; 0.1 x SSC 및 0.5% SDS 37℃에서 30-60분에 이어서 0.1 x SSC 및 0.5% SDS 68℃에서 30-60분의 연구에서 하이브리드의 계산된 Tm 보다 낮은 12-20℃에서의 세척 조건을 포함한다. 당업자는 엄격한 조건이 DNA 서열, 올리고누클레오티드 프로브 (예컨대 10-40개 염기) 또는 혼합된 올리고누클레오티드 프로브의 길이에도 의존적임을 이해할 것이다. 혼합된 프로브를 사용하는 경우, SSC 대신 테트라메틸 암모늄 클로라이드(TMAC)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 참조 Ausubel, 상술함.
서열 비교에 의해 결정된 동정은 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리누클레오티드 서열간의 상관관계를 반영한다. 일반적으로, 동정은 비교되는 서열의 길이 상에서, 두 폴리누클레오티드 또는 두 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 누클레오티드 대 누클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 언급한다.
정확한 대응이 존재하지 않는 서열에 대하여, "% 동일성"이 결정될 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열을 정렬시켜 서열간의 최대 상관성을 수득한다. 이것은 하나 또는 두 서열 모두에 "갭(gap)"을 삽입시켜 정렬의 정도를 향상시키는 것을 포함할 수 있다. % 동일성은 동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 특히 적합한, 비교되는 서열 각각의 전체 길이 상에서 결정될 수 있고 (소위 완전 정렬), 동일하지 않은 길이의 서열에 보다 적합한 보다 짧은 길이 상에서 결정될 수 있다 (소위 국소 정렬).
둘 이상의 서열의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 위스콘신 서열 분석 패키지, 버젼 9.1 (Devereux J 등, 1984)로 시판되는 프로그램, 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP를 이용하여 두 폴리누클레오티드간 % 동일성 및 두 폴리펩티드 서열간 % 동일성 및 % 상동성을 결정할 수 있다. BESTFIT는 스미스 앤 워터맨(1981)의 "국소 상동성" 알고리즘을 사용하며 두 서열간에 유사성이 가장 좋은 단일 영역을 찾아낸다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 결정하는 다른 프로그램도 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 BLAST 패밀리의 프로그램 (Altschul S F 등, 1990, Altschul S F 등, 1997, NCBI 홈페이지 www.ncbi.nlm.nih.gov를 통해 입수할 수 있음) 및 FASTA (Pearson W R, 1990)가 있다.
임의의 상기 뮤테인은 예컨대 GH와 실질적으로 유사한 활성을 지니도록 GH와 충분히 중복되는 아미노산 서열을 지닌다. GH의 한 활성은 GH 수용체와의 결합능이다. 뮤테인이 GH 수용체 (GHR)에 실질적인 결합 활성을 지니는 한, 이것은 GH와 실질적으로 유사한 활성을 지니는 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 임의의 주어진 뮤테인이 GH와 실질적으로 동일한 활성을 지니는 지를, 상기 뮤테인을 예컨대 단순한 샌드위치 경쟁 검정에 가하여 이것이 적합하게 표지된 GHR 또는 세포 발현 GHR에 결합하는지 결합하지 않는지를 결정하는 통상적인 실험, 예컨대 방사성면역검정 또는 ELISA 검정에 의해 결정할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 임의의 상기 뮤테인은 GH의 아미노산 또는 DNA 서열과 40% 이상의 동일성 또는 상동성을 지닌다. 이러한 서열이 예컨대 문헌[DeNoto 등, 1981 또는 Martial 등, 1979]으로부터 공지되어 있다.
보다 바람직하게는, 이것이 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 상동성을 갖는다.
본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변경은 "보존적" 치환으로 공지되어 있는 것이다. GH 폴리펩티드의 보존적 아미노산 치환은 충분히 유사한 생리화학적 특성을 지니는 그룹내에서 그룹 멤버간의 치환이 분자의 생물학적 기능을 보존할 이명 아미노산을 포함할 수 있다 (Grantham, 1974). 아미노산의 삽입 및 결실은, 특히 삽입 또는 결실이 소수의 아미노산, 예컨대 30개 미만, 및 바람직하게는 10개 미만의 아미노산만을 포함하는 경우 이들의 기능을 변경시키지 않으며 상기 정의된 서열에서 이루어질 수 있으며, 작용기 형태에 필요한 아미노산, 예컨대 시스테인 잔기를 제거하거나 교체시키지 않음이 명백하다. 상기 결실 및/또는 삽입에 의해 생성된 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범위내에 있다.
"융합 단백질"이란 용어는 GH, 또는 이의 뮤테인 또는 단편을 포함하고, 예컨대 체액에서 연장된 체류 시간을 지니는 다른 단백질에 융합된 폴리펩티드를 언급한다. 따라서, GH는 또 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예컨대 면역글로불린 또는 이의 단편에 융합될 수 있다. IgG의 Fc 부분은 면역글로불린-융합 단백질의 제조에 적합하다. Ig 융합 단백질은 예를 들어 EP 314 317 A1 (Genentech) 또는 EP 0 325 224 A2 (Zymogenetics Inc.)에 개시되어 있다.
GH의 "활성 분획", 또는 뮤테인 및 융합된 단백질로서, 본 발명은 단백질 분자 단독 또는 이에 결합된 관련 분자 또는 잔기, 예컨대 당류 또는 인산염 잔기와 함께 상기 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의의 단편 또는 전구체를 포함하거나, 단백질 분자 또는 당류 잔기 자체의 응집물을 포함하며, 단 상기 분획은 GH와 실질적으로 유사한 활성을 지닌다.
본 발명의 GH는 약제 조성물로서 사용될 것이며, 이러한 약제 조성물은 수많은 질환 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 질환 또는 질병은 불충분한 내인성 GH 생성과 관련되는 것이 바람직하다. 정제된 GH는 특히 소아과에서의 예컨대 GH 결핍, AIDS 웨이스팅, 지방이상증 (또는 HARS-HIV-관련 형태이상/이상대사 증후군이라 불림), 또는 작은 창자 증후군을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 성장 호르몬의 투여가 지시될 수 있는 추가의 질병으로는 간 경화, 성인 성장 결핍, 죽상경화증, 크론병 및 궤양 결장염, 골관절염, 심장 악액질, 울혈 심부전증, 만성 신장 기능부족, 혈액 세포 재구성 또는 동원, 남성 불임증, 조혈 줄기 세포 동원, 다발성 경화증, 뇌졸중, 다발성 시스템 위축, 또는 암이 있다.
지금까지 본 발명을 충분히 설명하였으며, 당업자는 과도한 실험 없이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으며 등가의 파라미터, 농도 및 조건의 광범한 범위내에서 동일하게 수행할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명을 이의 특정 구체예와 관련하여 설명하였으나, 추가의 개질이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따라서 본 발명의 임의의 변형, 용도 또는 적용을 포함하도록 의도되며, 본 발명이 속하는 분야에 공지되거나 통례의 실시내에 있거나 첨부된 하기 청구범위에 기술된 본질적인 특징에 적용될 수 있는 본 설명으로부터의 이탈을 포함한다.
정기 간행물 또는 초록, 공개되거나 공개되지 않은 미국 또는 외국 특허 출원, 등록된 미국 또는 외국 특허 또는 임의의 다른 참조 문헌을 포함하는 본원에 인용된 모든 참조 문헌이, 인용된 참조 문헌들에 개시된 모든 데이터, 표, 도면 및 본문을 포함하여, 본원에 참조로서 그 전체가 포함된다. 추가로, 본원에 인용된 참조 문헌내에 인용되는 참조 문헌들의 전체 내용이 또한 참조로서 포함된다.
공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법들에 대한 참조는 어떠한 방식으로든 본 발명의 임의의 측면, 설명 또는 구체예가 관련 분야에 기술, 교시 또는 제안된 것을 인정하는 것은 아니다.
특정 구체예의 상기 설명은 본 발명의 일반적인 특징을 충분히 나타내며, 당해 기술내의 지식을 적용시켜 (본원에 인용된 참조 문헌의 내용 포함) 다양한 응용을 위해 과도한 실험 없이 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않으며 그러한 특정 구체예를 용이하게 개질 및/또는 적용시킬 수 있을 것이다. 따라서, 상기 적용 및 개질은 본원에 제시된 교시 및 안내에 근거하여, 기술된 구체예와 등가의 범위의 효능 내에서 의도된다. 본원의 어구 또는 술어는 설명을 목적으로 비제한적으로 이해되어야 하며, 본 출원의 어구 또는 술어는 당업자의 기술과 조합하여 본원에 제시된 교시 및 안내에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.
hGH 발현 C127 세포에 대한 신규한 무-혈청 생성 배지의 개발
1. 소개
본 연구는 미량 금속 원소를 첨가시킨 생성 배양 배지(DMEM, "둘베코의 개질된 이글 배지)의 개발과 관련된 실험적인 작업을 기술한다. 상기 개발 결과, C127 세포 배양액에서 r-hGH의 현저한 생산성 증가를 수득하였다.
하기 표 1은 본 실시예의 범주에서 제시된 DMEM의 조성 및 개발을 요약한다.
표 1: 성장 배지, DMEM 및 생성 배지의 제형
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Figure 112007028374353-PCT00007
Figure 112007028374353-PCT00008
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2. 재료 및 방법
시약 및 용액
모든 화학 시약은 머크
Figure 112007028374353-PCT00010
(Merck) 사로부터 입수하였다: 황산아연 (ZnSO4·7H2O), 황산구리 (CuSO4·5H2O), 염화바륨 (BaCl2·2H2O), 염화코발트 (CoCl2·6H2O), 황산크롬칼륨 (K[Cr(SO6H4)2(H2O)2]·6H2O), 질산니켈 (Ni(NO3)2·6H2O), 나트륨 셀레 나이트 (Na2SeO3·5H2O). 구연산 제2철 (FeC6H5O7 시그마
Figure 112007028374353-PCT00011
(Sigma) 카탈로그 F3388)을 철 공급원으로서 이용하였다.
성장 배지의 미량 원소 혼합물 (100,000X)을 제이알에이치
Figure 112007028374353-PCT00012
(JRH) 바이오사이언스로부터 제공받았다.
검정되는 모든 미량 원소 용액을 증류수 중 농축된 용액으로서 제조하고 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과시켜 살균하였다.
다른 실험에서 검정되는 상이한 보조물 (금속 용액 등)의 첨가는 새로운 배양 배지에 대해 직접 수행되었다.
세포 배양
유전적으로 개질된 C127 뮤린 세포 (ATCC CRL 1616)를 재조합 사람 성장 호르몬 (rhGH)의 발현에 사용하였다. 벡터는 마우스 금속티오네인-1 (MT-1)의 조절하에 pBR322 다수 클로닝 부위 및 1.6 kb의 rhGH 미니유전자를 포함하는 BPV69T에 기초한다. 상이한 rhGH 생성 배치로부터 수득된 하나의 워킹 셀 뱅크(Working Cell Bank)로부터 유래된 배양액을 실험에 이용하였다.
세포 배양액을 375 ml ± 15 ml의 배양 배지를 함유하는 2125 cm2의 롤러 보틀 또는 300 ml의 배양 배지를 함유하는 1700 cm2의 롤러 보틀에서 36℃±0.5℃ 및 0.4 rpm으로 계속 인큐베이션시켰다.
배양 배지
rhGH 생성 단계에 사용된 배양 배지는 중탄산나트륨 (3.7 g/l)으로 완충된 4.5 g/l의 글루코오스를 지닌 DMEM이었다.
RHGH 적정
배양 배지 중 rhGH의 측정을 매일 역상 HPLC 적정으로 수행하였다:
재료
싱크로팩(Synchropak) RP4, 100 x 4.6 mm i.d., 300 Å Cat# C4R103-10 (Eichrom).
리소스 RPC 1 ml, 30 mm x 6.4 mm i.d., 15 ㎛, art 17-1181-01, 아머샴 바이오사이언시스 (Amersham Biosciences).
시메트리300, 50 mm x 4.6 i.d., C4 5 ㎛, P/N 186000287 (Waters).
시약
트리플루오로아세트산 (TFA) (Pierce, Cat#28904 또는 등가물)
아세토니트릴 (ACN) (Merck 1.00030 또는 등가물)
정제수, PW (예컨대 밀리큐(MilliQ) 수 또는 등가물)
헬륨
용액
이동상 A: H2O 중 TFA 0.08% (v/v)
눈금이 매겨진 플라스크에서 PW 수의 부피 측정 및 하기 표에 따라 TFA 첨가. 휘저음 및 표지.
상 A의 부피 밀리큐 수의 부피 TFA의 부피
1 L 1 L 0.8 mL
0.5 L 0.5 L 0.4 mL
0.25 L 0.25 L 0.2 mL
이동상 B: 아세토니트릴 중 TFA 0.08% (v/v)
용적 플라스크에서 PW 수의 부피 측정 및 하기 표에 따라 TFA 첨가. 휘저음 및 표지.
상 B의 부피 ACN의 부피 TFA의 부피
1 L 1 L 0.8 mL
0.5 L 0.5 L 0.4 mL
0.25 L 0.25 L 0.2 mL
크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
- 구배에 의한 용리: 60/40의 상 A/상 B의 혼합물에서 출발하여 20/80의 상 A/상 B에서 종료. 구배는 5분 후에 완료됨 (사용 지시에 따라 약간 변동가능)
- 주입 부피 50 ㎕
- 검출: 215 nm에서 UV 흡광도
- 눈금 곡선: 10, 50, 100, 120 및 150 ㎍/ml에서 r-hGH 표준
샘플의 r-hGH 농도를 표준 r-hGH 농도와 비교하여 결정하였다.
GH 생산성
생산성을 롤러 보틀에 대한 rhGH의 mg으로서 표시한다. 원래 데이터는 수확물에서의 rhGH 농도 (HPLC에 의해 측정) 및 수확된 롤러 보틀의 총 수이다. 통상적으로 수확 단계 동안 롤러 보틀은 약 109개의 세포를 함유한다.
3. 결과
일련의 제1 실험에서, 배양 배지에 간헐적으로 첨가된 높은 코발트 농도(20 μM CoCl2·6H2O)의 효과를 검정하였다. 첨가는 한 배치의 생성기의 초기 단계 (세정 및 PM=생성 배지, 즉 수확 단계의 0 포인트) 및 중간 단계 (수확물 6 및 7)에서 2 배지 교환 동안 수행되었다. 결과 (제시하지 않음)는 프로모터가 활성이고 조절될 수 있음을 제안한다.
상승된 생산성이 다른 금속 원소를 이용하여 추가로 확인되었다. 10 μM 농도의 바륨 (BaCl2·2H2O), 코발트 (CoCl2·6H2O), 크롬 (K[Cr(SO6H4)2(H2O)2]·6H2O) 및 니켈 (Ni(NO3)2·6H2O)을 각각 연속하여 배치에 첨가시키는 검정을 수행하였다. 실험 결과를 도 1 및 2에 도시한다.
도 1은 검정되는 원소를 함유하는 배지에서 배양시 실험 시간에 따라 (14일) hGH 발현 C127 세포에 의해 분비되는 hGH의 양을 나타낸다. 도 2는 검정되는 각 원소에 대해 도달된 평균 생산성 수치를 도시한다. 미량 원소 없이 대조군 값에 비해 수득된 평균 생산성 증가 %는 바륨에 대해 1.1% 및 코발트에 대해 32.4% 범위였다. 코발트로 연속적 대 간헐적 유도로 검정시 rhGH 생산성은 대조군 값에 비해 9% 내지 32.5% 증가하는 것으로 나타났다. 바륨이나 크롬은 DMEM에서 검정된 농도에서 생산성 증가를 나타내지 않았다.
개별적인 미량 원소의 측정
DMEM에 하기 표 2에 제시된 농도로 미량 원소 Zn, Cu. Se 및 Co를 보충하였다. 상기 농도는 성장 배지에서 금속 원소의 농도에 상응한다. DMEM에 미량 원소를 보충시킴에 의해 달성된 rhGH 생산성의 증가를 표 2에 나타낸다.
표 2: 제시된 μM 농도로 DMEM 중 금속 이온을 검정할 때 rhGH 생산성의 증가 %
이온 농도(μM) 생산성 증가 %
Zn 1.50300 12.10%
Cu 0.02560 37.50%
Se 0.11400 -3.10%
Co 0.00840 -3.20%
아연의 경우, 1.5 μM의 검정된 농도는 "박리(peeling-off)" 현상, 즉 롤러 보틀의 플라스틱 기질로부터 세포 단층의 탈착을 야기하였음을 주목하여야 한다. 몇몇 경우, 이러한 박리는 최종 수확 단계에서 배양액의 손실을 야기하였다 (일반적으로 수확물 12-14). 박리 현상은 코닝
Figure 112007028374353-PCT00013
(Corning)으로부터 셀바인드
Figure 112007028374353-PCT00014
(Cellbind)의 상표명으로 시판되는 롤러 보틀과 같은 적합한 세포 배양 용기를 이용하여 방지될 수 있다.
금속간 상호작용의 측정
hGH 생성의 생산성에 대한 구리 및 아연의 효과에 근거하여, 금속들의 가능한 조합 효과를 검정하기 위해 인자 설계 실험을 수행하였다.
결과의 통계적인 분석을 표 3에 제시한다. Cu 및 Zn을 함께 이용시 생산성에 대한 강한 상승 효과가 관찰되었다 (p≤0.0001).
표 3. 3-인자의 인자 설계 검정의 통계적 분석
Figure 112007028374353-PCT00015
박리는 구리가 존재하는지와 무관하게 1.5 μM 농도의 아연으로 처리된 모든 배양액에서 관찰되었다.
아연 농도가 감소될 때 (Zn 0.5 μM) 및 생산성과 기질에 대한 배양액의 부착을 개선시킬 수 있는 망간, 셀렌 또는 구연산 제2철과 같은 다른 미량 원소를 성장 배지에 첨가시 아연 및 구리 둘 모두의 첨가 효과를 연구하기 위해 후속적인 인자 설계 실험을 수행하였다.
보틀에 대해 약 20 mg rhGH의 보통의 생산성 출발점으로부터 표준 DMEM을 이용한 대조군 배양의 30 mg의 rhGH에 대해 70 mg에 근접한 rhGH/RB의 종료 값을 지니는 연속적인 성장에 도달하였다 (제시되지 않음). 대조군에 대한 GH 생산성 증가의 평균 값을 도 3에 도시한다 (즉, 14일에 측정된 생산성 mg/RB).
이러한 일련의 실험으로, 박리 현상이 감소되었다.
아미노산 첨가
hGH의 생산성 증가가 아미노산의 이용가능성에 의해 제한되는지를 측정하기 위해 아미노산 분석을 수행하였다. 표 4는 아연 및 구리를 첨가하거나 첨가하지 않은 배지에서 배양한 지 2일 후의 수확물 중 아미노산의 백분율을 나타낸다.
표 4: 표준 DMEM 배양액 또는 Zn 0.5 μM, Cu 0.02 μM 및 구연산 제2철 4.8 μM가 보충된 DMEM을 이용하여 유지된 배양액으로부터 비롯된, 배양한 지 2일 후에 수확된 미정제 배지 중 아미노산의 농도 %
아미노산 표준 DMEM 보충된 DMEM
L-글루타민 31% 13%
L-세린 28% 11%
L-시스틴 20% 13%
나머지 L-아미노산 50%-100% 39%-86%
구리, 아연 및 구연산 제2철 (Zn 0.5 μM, Cu 0.02 μM 및 구연산 제2철 4.8 μM)의 혼합물을 가장 높은 비율로 소비된 아미노산의 조합물로 검정하였다: L-글루타민 (Gln 4.8 mM), L-세린 (Ser 0.49 mM) 및 L-시스틴 (Cys 0.29 mM). 이 결과를 도 4에 도시한다.
개별적이든 조합이든 간에 시험된 임의의 아미노산에 의한 생산성에 대하여 아무런 긍정적인 효과도 관찰되지 않았다.
아미노산과 함께 금속을 첨가한 경우, 생산성에 대한 적은 효과만이 관찰되었다: 글루타민의 약간 긍정적인 효과 (78.2%에서 81.1%) 및 시스틴의 부정적인 효과 (78.2% 에서 69.9%). 이러한 차이는 유의하지 않은 것으로 고려된다.
생산성은 DMEM 중 금속의 혼합물로 처리된 배양액 (수확물에 대해 평균값은 약 50 mg의 rhGH/RB)과 금속을 포함하는 것들(수확물에 대해 약 30 mg의 rhGH/RB) 간에 명백히 상이하였다. 이러한 결과에 비추어 볼때, 생성 배지의 원래 아미노산 조성을 개질시키는 것은 필요하지 않은 것으로 고려된다.
구리 및 아연 효과의 적정
구리의 최적 농도를 결정하기 위해, 구연산 제2철 농도 (4.8 μM) 및 아연 농도 (0.5 μM)를 일정하게 유지하고 구리 농도를 변화시키며 (도 5) 실험을 수행하였다.
도 5에 도시된 대로, 용량-반응 실험에 의해 지시된 아연 및 구연산 제2철 농도에서 검정시 DMEM에서 구리의 최적 보충 농도는 25.6 nM임을 확인하였다.
또 다른 실험에서, 구연산 제2철 농도 (4.8 μM) 및 구리 (0.025 μM) 농도는 일정하게 유지하고 아연 농도를 변화시켰다 (도 6): 최대 생산성 수준 (안정기)이 200 nM을 넘는 아연 농도에서 수득되었고, 평균 대조군 값에 비해 약 60%에서 생산성을 안정화시켰다.
결과의 요약
도 7은 철 이온과 함께 또는 이것 없이, 미량 농도의 Zn 및 Cu 이온으로 수득된 결과를 요약한다.
하기 값은 DMEM 배지에 금속 미량 원소를 첨가시키며 생산성의 증가에 대해 수득된 데이터에 기초하여 수득되었다.
아연 1.5 μM: 10.3% ± 5.0%, 아연 0.5 μM: 16.8% ± 1.6%
구리 0.02 μM: 32.1% ± 9.4%
아연 1.5 μM + 구리 0.02 μM: 66.3% ± 16%
아연 0.5 μM + 구리 0.02 μM: 61.2% (±10%)
아연 0.5 μM + 구리 0.02 μM + 구연산 제2철 4.8 μM: 69.4% ± 19%
상기 데이터에 기초하여, 하기 혼합물이 DMEM 배지에 첨가제로서 최적이었다:
·25 nM의 황산구리 (CuSO4·5H2O)로서의 구리
·50 nM 내지 1500 nM, 바람직한 농도가 200 내지 500 nM인 황산아연 (ZnSO4·7H2O)으로서의 아연
·질산 제2철이 DMEM에 이미 존재하는 경우 4.8 μM 내지 이온의 최종 농도가 약 6 μM가 되게 하는 구연산 제2철.
결론
DMEM 배지에 보조물로서 미량의 구리, 아연 및 철 이온을 사용하여 rhGH 생산성을 표준 DMEM에 비해 50% 넘게 증가시켰다.
참조 문헌
Figure 112007028374353-PCT00016
Figure 112007028374353-PCT00017

Claims (21)

  1. 동물 혈청으로부터 유래된 성분이 없고 0.2 μM 내지 1.75 μM 농도의 아연 및 10 nM 내지 75 nM 농도의 구리를 포함하는 세포 배양 배지에서 성장 호르몬을 발현시키는 세포주의 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 성장 호르몬을 생성하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 배지가 1 내지 10 μM 농도의 철 이온(ferric ion)을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 배지가 0.2 μM의 아연을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 0.5 μM의 아연을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 아연을 황산아연으로서 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 25 nM의 구리를 포함함 을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 구리를 황산구리로서 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 5 또는 6 μM의 철 이온(ferric ion)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 철 이온(ferric ion)을 구연산 제2철 및/또는 질산 제2철로서 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 배지가 기초 배지의 성분들을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 기초 배지가 둘베코의 개질된 이글 배지 (DMEM)임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 호르몬이 금속티오네인(MT) 프로모터의 조절하에 발현됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 금속티오네인 프로모터가 마우스 MT-1 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양액으로부터 성장 호르몬을 수집하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 호르몬을 정제하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 성장 호르몬을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화시켜 약제 조성물을 수득하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 호르몬이 사람 성장 호르몬임을 특징으로 하는 방법.
  18. 성장 호르몬을 생성하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 정의된 배지의 용도.
  19. 성장 호르몬의 생성 단계 동안 배양액에 세포를 유지하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 정의된 배지의 용도.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 성장 호르몬이 사람 성장 호르몬임을 특징으로 하는 용도.
  21. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 세포가 마우스 C127 세포임을 특징으로 하는 용도.
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