KR20180099922A - 세포 배양에서 재조합 고분자량 ｖＷＦ를 생산하는 방법 - Google Patents

세포 배양에서 재조합 고분자량 ｖＷＦ를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

다른 측면들 중에서, 본 발명은 고분자량 vWF, 특히, 고특이적 활성을 갖는 고 멀티머 WF 및 고특이적 활성을 갖는 ADAMTS13를 생산하기 위한 세포 배양 조건에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 조건, 예를 들면, 증가된 구리 농도를 갖는 세포 배양 배지 및/또는 낮은 암모늄 (NH4 +) 농도를 갖는 세포 배양 상청액을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 고특이적 활성을 갖는 고분자량 vWF 및 rA13를 발현시키기 위해 세포 배양물에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.

Description

세포 배양에서 재조합 고분자량 ｖＷＦ를 생산하는 방법{METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT HIGH MOLECULAR WEIGHT vWF IN CELL CULTURE}
출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2010년 7월 8일에 출원된 미국 가출원 제61/362,635호를 우선권으로 주장하며, 이의 전문이 모든 목적을 위해 참고로써 본 출원에 통합되어 있다.
진핵 세포 배양 및 보다 구체적으로 포유동물 세포 배양을 포함하는 세포 배양 (특히 대규모 세포 배양)에서의 치료 단백질의 재조합 발현은 세포의 효율적인 성장을 위한 영양 물질을 제공하는 특별한 배양 배지의 사용을 필요로 한다. 세포 배양 배지 배합은 보통 우태아혈청 (FCS), 동물 유래 단백질 및/또는 소 유래 단백질 가수분해물뿐만 아니라 식물 또는 효모로부터 유래된 단백질 가수분해물을 포함하는 다양한 첨가물로 보충된다. 이러한 배양의 한 가지 도전은, 세포 배양 배지용 배합이 변하지 않는 경우에도, 단백질의 양 및 생산된 단백질의 총 활성 및 비활성이 상이한 세포 배양에 걸쳐 변하기 쉽다는 점이다. 이 가변성은 10 리터 내지 20,000 리터 이상의 세포 배양 부피를 이용하는 대규모 제조 공정의 경우에 특히 명백하다. 가수분해물을 함유하는 세포 배양 배지는 하나의 세포 배양으로부터 다음 세포 배양까지 특히 변하기 쉬어, 총 단백질의 생산 감소뿐만 아니라 총 활성 및 비활성 (specific activity)의 감소를 야기한다.
상이한 세포 배양에 걸쳐 나타나는 가변성에 대한 한 가지 잠재적인 이유는 가수분해물과 같은 첨가물 내의 오염물이 한 회분 (batch)에서 다음 회분까지 다르다는 점이다. 일반적으로, 혈청, 또는 예컨대, 알부민, 트랜스페린 또는 인슐린과 같은 혈청-유래 물질들은 세포 배양과 그 수득된 생물학적 산물을 오염시킬 수 있는 원치 않는 제제를 포함할 수 있다. 나아가, 인간 혈청 유래의 첨가물들은 혈청을 통해 전염될 수 있는 간염 바이러스 및 HIV를 포함하는 모든 공지된 바이러스에 대해 시험해야 한다. 더욱이, 소 혈청 및 그 유래 산물들은 BSE 오염 위험성을 지닌다. 또한, 모든 혈청 유래 산물들은 미지의 물질에 의해 오염될 수 있다. 세포 배양에서 인간이나 동물 공급원으로부터 유래된 혈청 또는 단백질 첨가물을 사용하는 경우, 특히 상기 세포가 인간 투여용 약물 또는 백신의 제조에 사용되면, 수많은 문제가 존재한다 (예컨대, 상이한 회분의 조성에서의 품질 변화 및 마이코플라스마 (mycoplasma), 바이러스 또는 BSE의 오염 위험성). 그러므로, 혈청 또는 기타 동물 단백질 화합물을 필요로 하지 않는 효율적인 숙주 시스템 및 배양 조건을 제공하기 위한 많은 시도가 이루어져 왔다.
그러한 무혈청 배지들은 식물 또는 효모로부터 유래된 단백질 추출물에 기초하여 개발되어 왔다. 예를 들어, 대두 가수분해물은 발효 공정에 유용한 것으로 알려져 있으며 많은 까다로운 생물인 효모 및 진균의 성장을 향상시킬 수 있다. WO 96/26266호는 대두 가루의 파파익 (papaic) 분해물이 탄수화물과 질소의 공급원이며 많은 성분들이 조직 배양에 사용될 수 있음을 기술하고 있다. Franek 등 (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692)은 한정된 대두 및 밀 가수분해물 펩타이드 분획의 성장 및 생산성 촉진 효과를 기술하고 있다.
WO 96/15231호는 척추동물 세포의 증식 및 바이러스 생산 공정을 위한 합성 최소 필수 배지 및 효모 추출물로 구성된 무혈청 배지를 개시하고 있다. 쌀 펩타이드 및 효모의 추출물 및 이의 효소 분해물을 포함하는 기저 세포 배양 배지, 및/또는 동물 세포의 성장을 위한 식물 지질로 구성된 배지 배합이 WO 98/15614호에 개시되어 있다. 재조합 세포의 배양을 위한 정제된 대두 가수분해물을 포함하는 배지가 WO 01/23527호에 개시되어 있다. WO 00/03000호는 대두 가수분해물 및 효모 추출물을 포함할 뿐만 아니라, 성장 인자와 같은 동물 단백질의 재조합 형태의 존재를 필요로 하는 배지를 개시하고 있다.
EP-A-0481791호는 조작된 CHO 세포를 배양하기 위한 생화학적으로 규명된 배양 배지를 기술하고 있으며, 이는 동물 공급원으로부터 분리된 단백질, 지질 및 탄수화물이 없으며, 재조합 인슐린 또는 인슐린 유사체, 1% 내지 0.025% w/v 파파인 분해 대두 펩톤 및 푸트레신 (putrescine)을 추가로 포함한다. WO 98/08934호는 가수분해된 대두 펩타이드 (1-1000 mg/L), 0.01 내지 1 mg/L의 푸트레신, 및 알부민, 페투인 (fetuin), 다양한 호르몬 및 기타 단백질을 포함하는 다양한 동물 유래 성분을 포함하는 무혈청 진핵 세포 배양물을 기술하고 있다. 이와 관련해서, 또한 푸트레신이 0.08 mg/L의 농도로 DMEM/햄스 (Ham's) F12와 같은 표준 배지에 포함되는 것으로 알려져 있음에 유의해야 한다.
하지만, 식물 및/또는 효모 가수분해물은 올리고펩타이드 및 기타 미지의 성분과 오염물의 비한정된 혼합물이다. 더욱이, 상업적으로 이용 가능한 로트 (lot)의 가수분해물의 품질은 상당히 다르다. 그 결과, 사용된 가수분해물의 로트의 함수 ("로트 대 로트 (lot-to-lot) 변이")로서 재조합 단백질 또는 바이러스 산물의 생산에서 큰 변화가 있다 (최대 세 가지 인자의 변화). 이 단점은 세포의 증식 뿐만 아니라 각 세포의 단백질 발현에 영향을 미친다. US 2007/0212770호는 재조합 단백질 생물 약제의 대규모 생산에 유용한, 다양한 동물 단백질이 없고 올리고펩타이드가 없는, 화학적으로 규명된 배양 배지를 기술하고 있다.
지혈 (Hemostasis)은 최종적으로 혈전 형성을 야기하는 다양한 지혈 반응 경로들의 상호작용을 수반한다. 혈전은 혈관 벽의 표면상의 혈액 성분들의 침착물로서 주로 응고된 혈소판 및 불용성 가교된 피브린으로 이루어진다. 피브린 형성은 응고 효소인 트롬빈에 의한 피브리노겐의 제한된 단백질 분해의 결과이다. 트롬빈은 활성화된 혈소판과 백혈구, 및 다양한 혈관 세포들의 표면상에서 일어나는 일련의 자이모겐 (zymogen) 활성화인 응고 연쇄반응의 최종 산물이다 (조사를 위해, 문헌 [K. G. Mann 등, Blood, 1990, Vol. 76, pp. 1-16] 참조).
응고 연쇄반응에서의 중요한 기능은 활성화된 인자 Ⅸ (인자 Ⅸa) 및 활성화된 인자 Ⅷ (인자 Ⅷa)의 복합체에 의한 인자 X의 활성화에 있다. 이 복합체 성분의 결핍 또는 기능장애가 혈우병으로 알려진 혈액 질병과 관련되어 있다 (J. E. Sadler & E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B, and von Willebrand's Disease, in G. Stamatoyannopoulos 등, (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). 혈우병 A는 인자 Ⅷ 활성의 결핍과 관련된 반면, 혈우병 B는 인자 Ⅸ 결핍과 관련이 있다. 현 치료법은 정상 응고 인자로 구성된 약제학적 제제를 이용한 대체 요법으로 이루어진다. 이들 혈소판 장애 (thrombopathy) 중, 혈우병 A가 더 흔하게 발생하여 대략 10,000명 중 1명에게 영향을 미친다. 혈우병 A 환자에서 대체요법은 정맥내 주입에 의한 정상 인자 Ⅷ을 함유하는 제제의 반복 투여를 포함한다. 상기 주입들 사이의 간격은 혈액 순환에서 인자 Ⅷ 활성 분해의 함수이다. 주입 후 인자 Ⅷ 활성의 반감기는 개체마다 상이하며, 10 내지 30 시간의 범위이다. 따라서, 예방 요법은 2일 내지 3일마다 주입을 필요로 한다. 이는 특히, 정맥 내 주입을 위한 잦은 침 천자 이후 국소적 구연산염화 (citratization)로 인해 정맥에 접근이 어렵게 되는 경우, 혈우병 환자의 삶에 무거운 짐을 지운다.
연장된 반감기를 갖는 인자 Ⅷ를 사용하여 주입의 빈도가 줄어들 수 있다면 특히 유익할 것이다. 비활성화된 인자 Ⅷ 이종다이머 (heterodimer)의 반감기가 인자 Ⅷ에 대해 강한 친화도를 나타내고 (인자 Ⅷa에 대해서는 그렇지 않음) 전달 단백질로서 작용하는 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자의 존재에 크게 좌우된다는 것이 본 기술분야에 잘 알려져 있다 (J. E. Sadler 및 E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B 및 von WiUebrand's disease, in G. Stamatoynnopoulos 등, (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, pp. 576-602). 혈액 순환 내에 검출가능한 폰 빌레브란트 인자가 없는 폰 빌레브란트병 유형 3을 겪고 있는 환자들이 2차적인 인자 Ⅷ 결핍을 겪는다는 것도 알려져 있다. 또한, 상기 환자에서 정맥 내로 투여된 인자 Ⅷ의 반감기는 2 내지 4 시간이며, 이는 혈우병 A 환자에게서 관찰되는 10 내지 30 시간보다 상당히 더 짧다. 이러한 발견으로부터 인자 Ⅷ가 혈액 순환으로부터 빠르게 제거되기 쉬우며, 그 과정이 그 천연 전달자, 폰 빌레브란트 인자와의 복합체화에 의해 어느 정도 억제될 수 있다는 결론이 얻어진다.
폰 빌레브란트 인자 (vWF)는 통상적으로 약 500 내지 20,000 kD 크기 범위의 일련의 멀티머 (또는 vWF의 2 내지 40 다이머)로서 혈장 내에서 순환하는 당단백질이다. vWF의 다이머 및 멀티머 형태는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 250 kD 폴리펩타이드 서브유닛으로 구성된다. vWF는 손상된 혈관 벽의 내피하층 (sub-endothelium)에 대한 초기 혈소판 부착을 매개하며, 또한 더 큰 멀티머만이 지혈 활성을 나타낸다. 멀티머화된 VWF는 혈소판 부착을 용이하게 하기 위해, VWF의 A1 도메인 내의 상호작용을 통해 혈소판 표면 당단백질 Gp1bα에 결합한다. 내피 세포는 큰 중합체 형태의 vWF를 분비하며, 낮은 분자량을 갖는 상기 형태의 vWF (저분자량 vWF)는 단백질 분해 절단으로부터 발생하는 것으로 추정된다. 큰 분자량을 갖는 멀티머들은 내피 세포의 바이벨-펠라드 소체 (Weibel-Palade body) 내에 저장되어 자극에 의해 유리된다.
감소된 vWF 단백질 수준 또는 낮아진 FⅧ 결합 친화도로 인한 FⅧ 결합 활성의 감소는 세 가지 유형의 폰 빌레브란트병 중 하나를 야기한다. 그 외에 또는 대안적으로, 특정 유형의 폰 빌레브란트병은, 즉, 유형 2A, 2B, 및 2M에서, Gp1bα-매개 혈소판 회합 수준의 증가 또는 감소를 특징으로 한다 (문헌 [Castaman 등, Disorders of Hemostasis 88 (1):94-108 (2003)]에 요약됨). 이와 같이, FⅧ 및 Gp1bα 모두와의 vWF 상호작용의 조절은 혈우병 및 폰 빌레브란트병 모두를 치료하기 위한 실행가능한 전략이다.
vWF의 생물학적 중요성을 고려할 때, 치료적 응용을 위해 vWF를 생산하는 방법을 개선할 계속적인 필요가 본 기술분야에 있다. vWF가 인간 혈장과 같은 내생적 공급원으로부터 분리될 수 있음이 잘 알려져 있다. 상기 분리된 vWF는 그 생물학적 기능을 수행하기 위한 높은 비활성을 가지므로, 폰 빌레브란트병과 같은 관련 질병을 치료하기 위한 치료 단백질로서 효과적으로 사용될 수 있다는 점에서 유리하다. 통상적으로, 혈장 vWF는 약 100 mU/㎍의 높은 특이적인 리스토세틴 (Ristocetin) 활성을 갖지만, 인간 혈장으로부터의 분리는, 예를 들어 혈장이 환자에게 전염될 수 있는 HIV 및/또는 간염 바이러스와 같은 다양한 바이러스를 함유할 수 있기 때문에 불리하다. 나아가, 혈장은 제한된 자원이어서, 혈장 부족은 치료를 위해 충분한 vWF를 공급하는데 문제가 될 수 있다. 이와 같이, vWF를 생산하기 위한 재조합 방법은 vWF를 위한 공급원으로서 혈장에 의존하는 것과 관련된 일부 문제를 처리한다는 점에서 유리하다. 재조합 생산을 위해, vWF의 전장 (full length) cDNA가 클로닝되었고, 상기 전구 폴리펩타이드는 상기 전장 프리프로-vWF의 아미노산 잔기 23 내지 764에 해당한다 (Eikenboom 등, (1995) Haemophilia 1, 77 90).
불행하게도, vWF는 복잡한 번역 후 수식을 갖는 분자이다. 또한, 골지체에서 vWF 다이머의 크고 거대한 멀티머로의 멀티머화는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 도전이다. 예를 들어, 예컨대, 인간 (일차) 내피 세포의 세포 배양에서 발현된 고분자량 vWF는 바이벨-펠라드 소체 내의 거대한 vWF 분자의 특이적 저장에 의존한다. 그러한 세포 배양은 치료 단백질의 생산에 적합하지 않다. 다른 세포 배양 방법들이 보고되어 왔으며, 세포 배양 조건이 다양한 방식으로 vWF의 생산에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 고농도의 암모늄 (NH4 +)은 번역 후 수식을 방해하는 것으로 나타났다. Mayadas 등 (J. Biol. Chem., 264 (23):13497-13503, 1989)은 25 mM 암모늄의 수준이 내피 세포 내 vWF 멀티머화의 감소를 야기하였고, 이는 또한 재조합 vWF의 특이적 리스토세틴 활성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 입증하였다. 멀티머화의 감소는 일반적으로 재조합 vWF의 활성 감소, 특히 특이적 리스토세틴 활성 감소와 관련이 있다.
어떠한 매개변수들이 특정 단백질, 특히 인자 Ⅷ 및 vWF와 같은 복합 당단백질의 생산에 긍정적 또는 부정적으로 영향을 미칠 수 있는지 예측하는 것은 여전히 어렵다. 예를 들어, 세포 배양 배지의 특정 성분들이 인자 Ⅷ의 생산에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 미국 특허 제5,804,420호에 개시된 바와 같이, 폴리올, 구리, 및 다른 미량 금속의 첨가는 인자 Ⅷ의 생산 수율에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 또한 WO 2009/086309호에 기술된 바와 같이, 구리를 이용한 세포 배양 공정은 인자 Ⅷ의 생산을 증가시키는 것으로 나타났다. 재조합 CHO 세포에서의 vWF의 발현이 또한 Mignot 등 (1989)에 의해 보고되었다. 하지만, 이들 예들은 vWF의 비활성 또는 그 멀티머 분포와 관련된 정보를 제공하지 못한다.
ADAMTS (트롬보스폰딘 유형 I 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로티나아제 (metalloproteinase)) 단백질은 아연-의존성 촉매 도메인, 시스테인-풍부 도메인, 디스인테그린-유사 도메인, 및 적어도 하나, 및 대부분의 경우 다중, 트롬보스폰딘 유형 I 반복을 포함하는, 수많은 보존된 도메인들을 함유하는 메탈로프로티나아제의 패밀리이다 (검토를 위해, 문헌 [Nicholson 등, BMC Evol Biol. 2005 Feb 4;5 (1):11]을 참조). 메탈로프로티나아제의 ADAM 및 MMP 패밀리와 진화적으로 관련된 이들 단백질 (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7 (1):25-31)은 분비된 효소로서, 혈전성 혈소판감소성 자색반증 (thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP) (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41 (1):4-14), 결합 조직 장애 (connective tissue disorder), 암, 염증 (Nicholson 등), 및 중증 열대열 말라리아 (severe plasmodium falciparum malaria) (Larkin 등, PLoS Pathog. 2009 Mar;5 (3):e1000349)를 포함하는 수많은 질병 및 질환과 연계된다. 이들 연계로 인해, ADAMTS 효소가 수많은 병리학을 위한 잠재적인 치료 표적으로 인식되어 왔다 (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7 (1):25-31). 따라서, 오염물, 예컨대, 바이러스, BSE, 및 마이코플라스마 균과 같은 병원균이 없는, 높은 비활성을 갖는 ADAMTS 단백질을 고수율로 생산하는 방법이 요구된다.
한 가지 ADAMTS 패밀리 구성원인 ADAMTS13은, 생체내 큰 vWF 멀티머의 분해를 담당하는 기능인, 폰 빌레브란트 인자 (vWF)의 잔기 Tyr 1605 및 Met 1606 사이를 절단한다. ADAMTS13 활성의 손실은 수많은 질환, 예컨대 TTP (Moake JL, Semin Hematol. 2004 Jan;41 (1):4-14), 급성 및 만성 염증 (Chauhan 등, J Exp Med. 2008 Sep 1;205 (9):2065-74), 및 가장 최근에는, 중증 열대열 말라리아 (severe plasmodium falciparum malaria) (Larkin 등, PLoS Pathog. 2009 Mar;5 (3):e1000349)와 연계되어 왔다.
ADAMTS13 프로테아제는 대부분 간에 의해 생산되는 190 kDa 당화된 단백질이다 (Levy 등, Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa 등, Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng 등, J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima 등, J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; 및 Gerritsen 등, Blood. 2001; 98:1654-1661). 고차 rVWF 멀티머와 마찬가지로, 포유동물 세포 배양에서 큰 ADAMTS13의 재조합 발현은 많은 도전을 제시한다.
그러므로, 일관된 총 단백질 수율 및/또는 상이한 세포 배양 사이에 생산된 단백질들의 일관된 총 활성 및 비활성을 제공하는 세포 배양 조건, 특히 대규모 제조 배양 조건을 제공할 필요가 있다. 대규모 제조 공정에서 배양물 간의 일관성은 치료 단백질의 제조에 중요하다. 또한 멀티머 분포 및 정상 인간 혈장 내에 존재하는 VWF와 대등하거나 더 높은 특이적 리스토세틴 활성을 갖는 rVWF의 대규모 생산을 위한 세포 배양 조건이 요구된다. 유사하게, ADAMTS 단백질이 수많은 질병 및 질환과 관련되기 때문에, 약제학적 제형 및 투여에 적합한, 높은 비활성을 갖는 재조합 ADAMTS 단백질의 대규모 생산 방법이 본 기술분야에 요구된다. 본 발명은 재조합 폰 빌레브란트 인자 및 재조합 ADAMTS13의 생산을 위해 이들 요구 및 본 기술분야의 다른 요구를 만족시킨다.
발명의 간단한 요약
어떤 측면들에서, 본 발명은, 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF) 및 재조합 ADAMTS13 (rA13)를 발현시키기 위해 사용된 세포 배양 배지의 보충으로 단백질 발현 및 효소 활성이 상당히 개선된다는 놀라운 발견을 기반으로 한다.
제1 측면에서, 본 발명은 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF) 조성물을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리를 보충하여 2.4 ㎍/L 이상의 최종 구리 농도를 제공하는 단계; (c) rVWF 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rVWF가 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 상기 회수된 상청액은 30 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, 1 이상의 세포를 배양하기 전에 상기 기저 세포 배양 배지에 가수분해물을 보충하는 단계를 포함한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 가수분해물은 식물 가수분해물이다. 구체적인 구현예에서, 상기 가수분해물은 콩 가수분해물이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지는 동물 단백질이 비포함된 배양 배지이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지는 단백질이 비포함된 배양 배지이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지는 화학적으로 규명된 (chemically defined) 배양 배지이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 구리가 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도는 적어도 4 ㎍/L 구리이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 구리가 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도는 2.4 ㎍/L 내지 20 ㎍/L 구리이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지에 보충되는 구리는 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합으로서 제공된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 구리 염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 및 구리 옥사이드로 이루어진 군에서 선택된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포는 포유류 세포이다. 구체적인 구현예에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포의 배양은 세포의 회분 배양 (batch culture)을 포함한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포의 배양은 세포의 연속 배양을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 세포의 연속 배양은 케모스태틱 (chemostatic) 방식으로 수행된다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 세포의 연속 배양은 관류 방식 (perfusion mode)으로 수행된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포는 적어도 100 L의 보충된 기저 세포 배양 배지에서 배양된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안에 상기 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안에 상기 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안에 상기 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계는, 상기 배양 상청액의 일부로부터 세포를 제거하기 위한 여과 또는 원심분리를 포함한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 40 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 구체적인 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 구체적인 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 적어도 60 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 구체적인 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 구체적인 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 적어도 80 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 상청액 중 상기 rVWF의 10% 이상은 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 구체적인 구현예에서, 상기 rVWF의 15% 이상은 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 rVWF의 20% 이상은 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 rVWF의 25% 이상은 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 rVWF의 적어도 30%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 상청액은 14 내지 22 다이머의 고분자량 VWF 멀티머를 함유한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 배양 상청액의 NH4+ 함량은 10 mM 미만의 농도로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 배양 상청액의 NH4+ 함량은 4 mM 미만의 농도로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 rVWF는 재조합 인자 Ⅷ (rFⅧ)와 공동 발현된다. 구체적인 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 회수된 상청액에 존재하는 rFⅧ의 50% 이상으로부터 rVWF를 정제하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 정제 단계 후의 rVWF 대 rFⅧ의 비는 10:1 이상이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, rVWF 농축 단계를 포함한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF) 조성물을 제공한다.
상기에서 제공된 조성물의 일 구현예에서, 조성물은 추가로, 재조합 인자 Ⅷ (rFⅧ)을 포함한다. 구체적인 구현예에서, rVWF 대 rFⅧ의 비는 10:1 이상이다.
상기에서 제공된 조성물의 일 구현예에서, 조성물은 약제학적 투여를 위해 제형된다. 구체적인 구현예에서, 조성물은 정맥 내 투여를 위해 제형된다.
제3 측면에서, 본 발명은 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 세포 배양 상청액을 제공하고, 상기 상청액은 본원에 제공된 방법에 의해 제조된다.
제4 측면에서, 본 발명은 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 세포 배양 상청액을 제공하고, 여기서 상기 상청액 중 rVWF의 10% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 구체적인 구현예에서, 상기 상청액 중 rVWF의 15% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 상청액 중 rVWF의 20% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 상청액 중 rVWF의 25% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 상청액 중 rVWF의 30% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재한다. 상기에서 제공된 상기 상청액의 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 상청액은 본원에 제공된 방법에 따라 제조된다.
제5 측면에서, 본 발명은 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF)을 포함하는 세포 배양 상청액을 제공하고, 상기 상청액은 1 mL 당 적어도 0.4 IU 리스토세틴 보조 인자 활성을 함유한다. 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 0.5 IU 리스토세틴 보조 인자 활성을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 0.6 IU 리스토세틴 보조 인자 활성을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 0.7 IU 리스토세틴 보조 인자 활성을 함유한다. 상기에서 제공된 상청액의 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 본원에 제공된 방법에 따라 제조된다.
제6 측면에서, 본 발명은 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리를 보충하여 1.0 ㎍/L 이상의 최종 구리 농도를 제공하는 단계; (c) rA13 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rA13이 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충되는 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 1500 유닛 (Units) 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지는 동물 단백질이 비포함된 배양 배지이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지는 단백질이 비포함된 배양 배지이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지는 화학적으로 규명된 배양 배지이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도는 1 ㎍/L 구리 이상이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도는 2 ㎍/L 구리 이상이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도는 4 ㎍/L 구리 이상이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도는 1 ㎍/L 내지 6 ㎍/L 구리이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도는 2 ㎍/L 내지 4 ㎍/L 구리이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 기저 세포 배양 배지에 보충되는 구리는 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합으로서 제공된다. 구체적인 구현예에서, 구리 염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 및 구리 옥사이드로 이루어진 군에서 선택된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포는 포유류 세포이다. 구체적인 구현예에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포이다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 것은 상기 세포의 회분 배양을 포함한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 것은 상기 세포의 연속 배양을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 세포의 연속 배양은 케모스태틱 방식으로 수행된다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 세포의 연속 배양은 관류 방식으로 수행된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 1 이상의 세포는 적어도 100 L의 보충된 기저 세포 배양 배지에서 배양된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안, 상기 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안, 상기 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안, 상기 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안, 상기 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안, 상기 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안, 상기 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계는 상기 배양 상청액의 일부로부터 세포를 제거하기 위해 여과 또는 원심분리를 포함한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일마다 보충되는 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 2000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일마다 보충되는 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 2500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 적어도 800 mU/㎍의 rA13 특이적 FRETS-VWF73 활성을 갖는다.
상기에서 제공된 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 1200 mU/㎍ 이상의 rA13 특이적 FRETS-VWF73 활성을 갖는다.
상기에서 제공된 방법의 더 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 상청액은 1600 mU/㎍ 이상의 rA13 특이적 FRETS-VWF73 활성을 갖는다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 배양 상청액의 NH4+ 함량은 10 mM 미만의 농도로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 배양 상청액의 NH4+ 함량은 5 mM 미만의 농도로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 상기 배양 상청액의 NH4+ 함량은 4 mM 미만의 농도로 유지된다.
상기에서 제공된 방법의 일 구현예에서, 본 방법은 추가로, rA13 농축 단계를 포함한다.
제7 측면에서, 본 발명은 재조합 ADAMTS13 (rA13)을 포함하는 세포 배양 상청액을 제공하고, 상기 상청액은 본원에 제공된 방법에 의해 제조된다.
제8 측면에서, 본 발명은 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF)을 포함하는 세포 배양 상청액을 제공하고, 상기 상청액은 1 mL 당 적어도 5 U FRETS-VWF73 활성을 함유한다. 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 6 U FRETS-VWF73 활성을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 7 U FRETS-VWF73 활성을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 8 U FRETS-VWF73 활성을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 9 U FRETS-VWF73 활성을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 10 U FRETS-VWF73 활성을 함유한다. 상기에서 제공된 상청액의 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 본원에 제공된 방법에 따라 제조된다.
제9 측면에서, 본 발명은 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF)을 포함하는 세포 배양 상청액을 제공하고, 상기 상청액은 1 mL 당 적어도 2 ㎍ rA13을 함유한다. 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 3 ㎍ rA13을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 4 ㎍ rA13을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 5 ㎍ rA13을 함유한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 1 mL 당 적어도 6 ㎍ rA13을 함유한다. 상기에서 제공된 상청액의 또 하나의 구체적인 구현예에서, 상청액은 본원에 제공된 방법에 따라 제조된다.
제10 측면에서, 본 발명은 상기에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 제공한다.
상기에서 제공된 조성물의 일 구현예에서, 조성물은 약제학적 투여를 위해 제형된다. 구체적인 구현예에서, 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형된다.
도 1. (1a) 실시예 2에 기술된 바와 같이, 낮은 (1.0 ㎍/L) 그리고 높은 (4.3 ㎍/L) 구리 농도의 존재하에 포유동물 세포 배양에서 발현된 rVWF의 저해상도 (1 %) 아가로스 겔 전기 영동. 배양 3일은 표 7 및 표 8의 회분 (batch) 1일에 해당함에 유의한다. ( 1b) 도 1a에서 정의된 밴드에 의해 표시된 바와 같이, 1 내지 10 다이머 (밴드 번호 1) 및 10을 초과하는 다이머 (밴드 번호 2)를 갖는 VWF 멀티머의 상대적 양을 농도계 분석에 의해 정량화하였다.
도 2. (2a) 높은 또는 낮은 수준의 구리의 존재하에 높은 그리고 낮은 세포 밀도로 성장한 rVWF 세포 배양 상등액 내에 존재하는 평균 rVWF 비활성의 간격 그래프 (interval plot). ( 2b) 높은 또는 낮은 수준의 구리의 존재하에 높은 그리고 낮은 세포 밀도로 성장한 rVWF 세포 배양 상등액 내에서 발견되는 평균 NH4 + 농도의 구간 그래프.
도 3. 증가하는 수준의 구리의 존재하에 재조합 ADAMTS13을 발현하는 세포 배양물에서 얻은 상등액을 SDS-PAGE 분석에 의해 조사하였다. SDS-PAGE 이후 (3a) 은 염색 및 (3b) 항-A13 웨스턴 블롯팅에 의해 rA13을 시각화하였다.
도 4. rA13 생산성에 대한 최적 구리 농도 효과의 외삽법 (extrapolation; 실선)을 보여주는 부피 생산성 (P Frets) 데이터 대 구리 농도의 그래프.
도 5a-k. 기저 수준의 구리 (0.66 ㎍/L)의 효과를 2 ㎍/L 구리의 최종 농도로 보충된 배양물의 효과와 비교한, 8주 배양 시간 동안 rA13을 발현하는 연속 현탁 세포 배양물로부터 얻은 막대 그래프. 각각의 막대는 1주일의 케모스탯 (chemostat) 배양의 평균 데이터를 나타낸다. 범례는 상기 데이터에 나타낸 특정 주를 지칭한다.
도 6. (6a) 실시예 3에 기술된 바와 같이 높은 그리고 낮은 세포 밀도 하에서 낮은 (1.0 ㎍/L) 그리고 높은 (4.3 ㎍/L) 구리 농도의 존재하에 포유동물 세포 배양에서 발현된 rVWF의 저해상도 (1 %) 아가로스 겔 전기 영동. 배양 8일 및 17일 ("CST8" 및 "CST17")이 표 10 내지 표 13의 8일 및 17일에 해당함에 유의한다. ( 6b) 도 6a에 정의된 밴드에 의해 표시된 바와 같이, 1 내지 10 다이머 및 10을 초과하는 다이머를 갖는 VWF 멀티머의 상대적인 양을 농도계 분석에 의해 정량화하였다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
재조합 vWF (rVWF) 및 재조합 ADAMTS13 (rA13)은 대규모 포유동물 세포 배양에서 발현에 의해 생산될 수 있다. 하지만, 표준 세포 배양 조건을 이용하여 생산될 때, 배지의 일반적인 배합이 바뀌지 않은 경우에도, 이들 단백질의 활성은 보통 세포 배양마다 다르며, 상기 재조합 단백질의 비활성은 혈장으로부터 유래된 vWF 및 rA13와 흔히 동일하지 않다. 또한, 포유동물 세포 배양에서 발현된 rVWF는 낮은 (10% 미만) 백분율의 고차 멀티머 (고차 멀티머는 10을 초과하는 VWF 다이머를 함유하는 분자를 포함한다)를 갖는 단백질 조성을 생산하는 경향이 있다. rVWF 및 rA13의 표준 생산 방법에서 이들 단점은 대규모 생산 (즉, 10 리터 내지 20,000 리터 이상의 배양)을 위한 배양을 개발할 때 특히 문제가 된다.
상이한 세포 배양 회분에서 흔히 관찰되는 가변성의 한 가지 잠재적 공급원은 세포 배양 배지의 성분 내의 오염물의 존재이다. 이들 오염물은 상이한 회분에서 상이한 양으로 존재하여, rVWF 및 rA13의 생산에서 가변적인 결과를 야기할 수 있다. 다양한 세포 배양 배지 첨가물에서 발견되는 상이한 오염물들을 조사한 후, 본 발명자들은 가수분해물의 존재가 세포 배지 내 구리 농도를 변화시킨다는 것을 발견하였다. 추가 조사는 세포 배지에 구리 농도를 보충하여 적어도 약 1 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L의 총 구리 농도를 생성하는 것이 rVWF 및 rA13의 총 활성 및 비활성을 일관되게 증가시켰고/거나 총 단백질 수율 역시 증가시킬 수 있다는 놀라운 결과를 제공하였다. 따라서, 본 발명은 높은 비활성을 갖는 rVWF 및 rA13 단백질의 고수율 생산을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
한 가지 측면에서, 본 발명은 혈장 유래 vWF (pdVWF) 또는 혈장 유래 ADAMTS13 (pdA13)을 이용하여 관찰된 것과 대등하거나 더 높은 활성을 갖는 rVWF 및 rA13을 다량으로 생산하기 위한 세포 배양 방법 및 조성물을 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명에 따라 생산된 rVWF 및 rA13 단백질은 구리 또는 본원에 더 상세하게 기술된 기타 보충물로 보충되지 않은 배지에서 표준 세포 배양 방법을 이용하여 생산된 단백질보다 일관되게 더 높은 활성을 나타낸다. 유리하게도, 본원에 제공된 방법 및 조성물의 어떤 구체예에서, 본 발명에 따라 생산된 rVWF 및 rA13 단백질은 구리 또는 본원에 더 상세하게 기술된 기타 첨가물로 보충되지 않은 배지에서 표준 세포 배양 방법을 이용하여 생산된 단백질보다 일관되게 더 높은 비활성 (즉, U/mg 단백질)을 나타낸다. 마찬가지로, rVWF 및 rA13의 생산을 위해 본원에 제공된 방법은, 구리 또는 본원에 더 상세하게 기술된 기타 첨가물로 보충되지 않은 배지를 이용한 표준 세포 배양 방법과 비교할 때, 부피 배양 당 더 높은 수율의 활성 (즉, U/L/D)을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포 배양 방법을 제공하고 여기서 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 약 1 ㎍/L의 총 농도를 얻는다. 다른 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 약 2 ㎍/L의 총 농도를 얻는다. 또 다른 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 약 1 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L의 총 농도를 얻는다. 일부 구현예들에서, 구리의 총 농도는 약 1.5 - 4.5 ㎍/L이다. 어떤 구현예들에서, 세포 배양 배지는 보충되어 약 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ㎍/L 구리, 또는 그 초과를 얻는다. 기저 세포 배양 배지는 일반적으로 1 ㎍/L 미만의 소량 구리 농도를 갖는다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 세포 배양 방법을 제공하고 여기서 기저 세포 배양 배지에는 rVWF의 생산을 위해 약 1.0 내지 약 20 ㎍/L 구리가 보충된다. 추가 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지에는 rVWF의 생산을 위해 약 1.5 - 15, 2.0 - 10, 2.5 - 8, 3.0 - 6, 4.0 - 5.0 ㎍/L 구리가 보충된다. 또 추가의 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지는, 보충된 구리 외에, 하나 이상의 가수분해물을 또한 포함할 수 있다.
다른 구현예들에서, 본 발명은 세포 배양 방법을 제공하고 여기서 기저 세포 배양 배지에는 rA13의 생산을 위해 약 1.5 내지 약 4 ㎍/L 구리가 보충된다. 추가 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지에는 rA13의 생산을 위해 약 1.6 - 3.8, 1.7 - 3.6, 1.8 - 3.4, 1.9 - 3.2, 2.0 - 3.0, 2.1 - 2.8, 2.2 - 2.6, 2.3 - 2.4 ㎍/L 구리가 보충된다. 또 추가의 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지는, 보충된 구리 외에, 하나 이상의 가수분해물을 또한 포함할 수 있다. 또 추가의 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지는, 구리 및/또는 하나 이상의 가수분해물 외에, 약 1.0 내지 약 30 μM 아연을 포함한다. 또 추가의 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지는 추가로, 구리 및/또는 하나 이상의 가수분해물 및/또는 아연 외에, 약 0.5 내지 약 5.0 mM 칼슘을 포함한다.
추가적인 측면에서 그리고 임의의 상기에 따라, 본 발명은 세포 배양 방법을 제공하고 여기서 세포 배양 용액의 암모늄 수준은 낮다 (10 mM 미만). 어떤 구현예들에서, 본 발명의 세포 배양 방법은 저수준의 암모늄과 조합하여 1, 2, 3, 4, 또는 5 ㎍/L 초과의 구리를 갖는 세포 배양 배지를 이용한다.
본 발명의 방법 및 조성물의 이점들 중의 하나는, 대규모 세포 배양 생산에 적합하다는 것이다. 이들 대규모 세포 배양물은 적어도 10 L, 50 L, 100 L, 150 L, 200 L, 250 L, 500 L, 750 L, 1,000 L, 1,500 L, 2,000 L, 5,000 L, 10,000 L, 또는 20,000 리터의 배양물이다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 전체적으로 더 높은 양의 재조합 단백질을 반드시 생성하는 것은 아니지만, 생산되는 재조합 단백질 (rVWF 또는 rA13)은 특히 세포 배양 배지가 부가적인 구리로 보충되지 않은 세포 배양에서 생산된 단백질과 비교할 때, 표준 세포 배양을 이용하여 생산된 단백질에서 관찰되는 더 높은 총 활성 및 비활성을 나타낸다. 추가적인 측면에서, 구리로 보충된 배지에서 배양된 세포에서 생산된 rVWF 및 rA13 단백질은 구리로 보충되지 않은 기저 세포 배양 배지에서 배양된 세포와 비교할 때 세포 배양물 L 당 일관되게 증가된 활성을 나타낸다. 추가의 측면에서, 본 발명의 구리로 보충된 배지는 구리로 보충되지 않은 배지와 비교할 때 증가된 단백질 수율, 배양물 내 증가된 세포수, 및/또는 배양물 L 당 증가된 총 활성을 야기한다.
본 발명의 방법 및 조성물의 추가적인 장점은 이들이 고도로 멀티머화된 높은 백분율 (10% 초과)의 rVWF를 함유하는 단백질 집단을 야기한다는 점이다.
ADAMTS 단백질과 관련된 본원에서의 많은 논의가 ADAMTS13 (A13)의 측면에서 이뤄졌음에도 불구하고, 모든 ADAMTS 단백질이 공통된 코어 도메인 구성 및 공통된 구조-기능 관련성을 갖고 있기 때문에, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 rA13 뿐만 아니라 임의의 ADAMTS 단백질의 생산에 적용될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
Ⅱ. 정의
본원에 사용된 바와 같이, "재조합 vWF"는 재조합 DNA 기술을 통해 얻어진 vWF를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 vWF 단백질은, 예를 들어, 재조합 vWF를 생산하는 방법과 관련하여 참조로써 본원에 통합된, Ginsburg 등의 이름으로 1986년 10월 23일에 공개된 WO 1986/06096호 및 1990년 7월 23일에 출원된 미국 특허출원 제07/559,509호에서 제조된 컨스트럭트 (construct)를 포함할 수 있다. 본 발명에서 vWF는 모노머 및 멀티머 형태를 포함하는 모든 잠재적인 형태를 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 조합으로 사용되는 상이한 형태의 vWF를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 vWF는 상이한 멀티머, 상이한 유도체 및 생물학적으로 활성인 유도체 및 생물학적으로 비활성인 유도체 모두를 포함할 수 있다.
용어 "재조합"은, 예컨대, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터와 관련하여 사용되는 경우, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산이나 단백질의 도입 또는 천연 핵산이나 단백질의 변화에 의해 변형되었거나, 상기 세포가 그와 같이 변형된 세포로부터 유래되었음을 가리킨다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연 (비-재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 그렇지 않은 경우 비정상적으로 발현되거나, 발현 중이거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
본 발명의 문맥에서, 재조합 vWF는, 예를 들어, 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이와 같은 포유동물로부터 얻은 vWF 패밀리의 임의의 구성원, 및 이의 생물학적으로 활성인 유도체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 VWF는 인간 VWF이다. 또한, 활성을 갖는 돌연변이 및 변이형 vWF 단백질들이 vWF 단백질의 기능적 단편 및 융합 단백질과 마찬가지로 포함된다. 더욱이, 본 발명의 vWF는 정제, 검출, 또는 이 둘을 용이하게 하는 태그 (tag)를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 vWF는 치료적 부분 (moiety) 또는 실험관내 또는 생체내 영상에 적합한 부분을 이용하여 추가로 변형될 수 있다.
용어 "고도의 멀티머 vWF (highly multimeric vWF)", "고분자량 vWF", 및 "HMW VWF"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 10개를 초과하는 VWF 다이머를 함유하는 공유결합으로 부착된 vWF 멀티머를 지칭한다. 어떤 구체예에서, HMW VWF는 적어도 11개의 VWF 다이머, 또는 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 그 이상의 VWF 다이머를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, "ADAMTS 단백질"는 메탈로프로티나아제의 트롬보스폰딘 유형 I 모티프 패밀리를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로티아제의 폴리펩타이드를 지칭한다. 이 패밀리의 구성원들은 인간 단백질 ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS12 (NM_030955), ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (NM_139057), ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638), 및 ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851)을 포함한다. ADAMTS 단백질은 전장 단백질 및 적어도 부분적인 생물학적 활성, 예를 들어, 전장 단백질에 의해 입증된 활성, 특히 전장 단백질에 의해 입증된 프로테아제 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상을 나타내는 부분적인 폴리펩타이드 모두를 지칭한다. 특정 경우에, ADAMTS 단백질은, 예를 들어, 효소적 또는 화학적 수단에 의해, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 번역 후 수식될 것이다. 본 발명의 ADAMTS 단백질은 선택적으로 스플라이싱된 아형, 보존적으로 변형된 단백질, 실질적으로 동일한 단백질, 동종체 등을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 문맥에서, ADAMTS 단백질은, 예를 들어, 영장류, 인간, 원숭이, 토끼, 돼지, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 개, 고양이와 같은 포유동물로부터 얻은 ADAMTS 패밀리의 임의의 구성원, 및 이의 생물학적으로 활성인 유도체를 포함한다. 또한, 활성을 갖는 돌연변이 및 변이형 ADAMTS 단백질들이 ADAMTS 단백질의 기능적 단편 및 융합 단백질과 마찬가지로 포함된다. 더욱이, 본 발명의 ADAMTS 단백질은 정제, 검출, 또는 이 둘을 용이하게 하는 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 ADAMTS 단백질은 치료적 부분 (moiety) 또는 실험관 내 또는 생체 내 영상에 적합한 부분을 이용하여 추가로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "ADAMTS13 단백질"은 ADAMTS13 활성, 특히 VWF의 잔기 Tyr-842 및 Met-843 사이의 펩타이드 결합을 절단하는 능력을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예시적인 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 NP_620594 (ADAMTS13 (isoform) 아형 1, 프리프로단백질)의 아미노산 서열 또는 NP_620594 (ADAMTS13 아형 1, 성숙한 폴리펩타이드)의 아미노산 75 내지 1427와 매우 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 NP_620596 (ADAMTS13 아형 2, 프리프로단백질)의 아미노산 서열 또는 NP_620594 (ADAMTS13 아형 2, 성숙한 폴리펩타이드)의 아미노산 75 내지 1371과 매우 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 NP_620595 (ADAMTS13 아형 3, 프리프로단백질)의 아미노산 서열 또는 NP_620595 (ADAMTS13 아형 1, 성숙한 폴리펩타이드)의 아미노산 75 내지 1340과 매우 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, ADAMTS13 단백질은 vWF 절단 활성을 갖는 천연 변이형 및 vWF 절단 활성을 갖는 인공 컨스트럭트를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, ADAMTS13은 일부 기본 활성을 보유하는 임의의 천연 변이형, 대안적인 서열, 아형 또는 돌연변이 단백질을 포함한다. 인간 집단에서 발견되는 ADAMTS13 돌연변이의 예는, 비제한적으로, R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W를 포함하며, 이들 중 많은 부분은 혈전성 혈소판감소성 자색반증 (TTP)와 관련된 것으로 확인되었다. ADAMTS13 단백질은 또한 번역후 수식을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, ADAMTS13은 잔기 614, 667, 및 1354에서 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)에 의해 변형되는 것으로 나타났으며, 잔기 142, 146, 552, 579, 707, 828, 및 1235는 또한 이러한 방식으로 변형될 수 있는 것으로 예측되었다.
단백질 분해적으로 활성인 재조합 ADAMTS13은, 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는 문헌 [Plaimauer 등 (2002, Blood. 15;100 (10):3626-32) 및 US 2005/0266528호]에 기술된 바와 같이, 포유동물 세포 배양에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 세포 배양에서 재조합 ADAMTS13을 발현시키는 방법은, 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는 문헌 [Plaimauer B, Scheiflinger F. Semin Hematol. 2004 Jan;41 (1):24-33 및 US 2011/0086413호]에 개시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적으로 활성인 유도체"는, ADAMTS 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 또한 재조합 DNA 기술을 통해 얻어지는 폴리펩타이드를 포함한다. 이는 (i) 예컨대, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭을 통해, 유전공학에 의하여 재조합 DNA의 생산하고, (ii) 형질감염에 의해, 즉, 전기천공법 또는 미세주입을 통해 재조합 DNA를 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입하고, (iii) 예컨대, 연속 또는 회분 방식으로 상기 형질전환된 세포를 배양하고, (iv) ADAMTS 단백질을, 예컨대, 항시적으로 또는 유도로 발현시키고, (v) 예컨대, 배양 배지로부터 또는 형질전환된 세포를 회수함으로써 상기 ADAMTS 단백질을 분리하고, (vi) 예컨대, 이온교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등을 통해, 실질적으로 정제된 재조합 ADAMTS 단백질을 얻는, 본 기술분야에 알려진 임의의 방법을 포함할 수 있다. 용어 "생물학적으로 활성인 유도체"는, 예컨대, 포유동물, 특히 인간의 순환계에서 ADAMTS 단백질의 생물학적/약리학적 특성, 예컨대 반감기를 개선하기 위하여, 제2 폴리펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 Fc 도메인 또는 알부민 도메인와 조합된, 예컨대 ADAMTS 단백질, 또는 이의 기능적 단편과 같은 키메라 분자를 또한 포함한다.
용어 "분리된", "정제된", 또는 "생물학적으로 순수한"은 천연 상태로 발견될 때 정상적으로 수반되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 존재하지 않는 물질을 지칭한다. 순도 및 균일성은 통상적으로 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기법을 이용하여 결정된다. 하나의 구체예에서, rVWF는 실질적으로 정제된 제제 내에 존재하는 주된 종이다. 또 다른 구체예에서, rA13은 실질적으로 정제된 제제 내에 존재하는 주된 종이다. 일부 구체예에서, 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기 영동 겔에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성하는 것을 의미한다. 다른 구체예에서, 이는 핵산 또는 단백질이 적어도 50% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 순수하다는 것을 의미한다. 다른 구체예에서, "정제하다" 또는 "정제"는 정제될 조성물로부터 적어도 하나의 오염물을 제거하는 것을 의미한다. 이런 의미에서, 정제는 정제된 화합물이 균일, 예컨대, 100% 순수할 것을 요하지 않는다.
vWF의 생물학적 활성은 공지된 시험관 내 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 리스토세틴 보조 인자 분석은 vWF의 존재 하에 항생제 리스토세틴에 의해 유도된 신선한 또는 포르말린-고정된 혈소판의 응집을 기반으로 한다. 혈소판 응집 정도는 vWF 농도에 좌우되며, 이는 탁도계 방법, 예컨대, 응집 검출계 (aggregometer)를 사용하여 측정될 수 있다 (Weiss 등, J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane 등, Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). 본원에 제공된 바와 같이, 본 발명의 vWF의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성은, 시험관 내 분석을 이용하여 측정되는 바와 같이, vWF의 mU/㎍으로 기술된다.
본원에 사용된 바와 같이, "1 유닛 (unit)의 ADAMTS 활성"은, 사용된 분석에 관계없이, 모아진 정상 인간 혈장 1 mL에서의 활성의 양으로 정의된다. 예를 들어, ADAMTS 단백질이 ADAMTS13인 경우, ADAMTS13 FRETS-VWF73 활성 1 유닛은, 모아진 정상 인간 혈장 1 mL에 의해 절단되는 바와 같이, 동일한 양의 FRETS-VWF73 기질을 절단하는데 필요한 활성의 양이다 (Kokame 등, Br J Haematol. 2005 Apr; 129 (1):93-100). 간편하게, ADAMTS13 활성은 기능적 분석, 예컨대, ADAMTS13에 대한 기질로서 변형된 폰 빌레브란트 인자 펩타이드를 이용하는 기능적 분석에 의해 결정될 수 있다 (Tripodi 등, J Thromb Haemost. 2008 Sep;6 (9): 1534-41). 재조합 인간 ADAMTS13 활성을 결정하는 바람직한 방법은 문헌 [Gerritsen 등, (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82: 1386- 1389)]에 개시되어 있다. 하나의 구체예에서, 상기 정의된 ADAMTS13 단백질로서 고려되기 위하여, 폴리펩타이드 또는 단백질은 천연 ADAMTS13의 vWF 절단 활성의 적어도 1%를 가지고 있어야 한다. 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 천연 ADAMTS13의 활성의 적어도 10%를 함유할 것이다. 또 다른 구체예에서, ADAMTS13 단백질은 천연 ADAMTS13의 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 함유할 것이다. ADAMTS13 단백질의 양은 또한 ADAMTS13 항원의 측정에 의해, 예를 들어 문헌 [Rieger 등, (2006, Thromb Haemost. 2006 95 (2):212-20)]에 개시된 엘리자 (ELISA) 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 본 기술분야에서 잘 확립된 관례는 모아진 정상 인간 혈장 1 mL이 1 ㎍의 ADAMTS13을 함유한다는 것이다. 따라서, 본 기술분야의 관례는 1 ㎍의 혈장 유래 ADAMTS13이 1 유닛의 ADAMTS13 활성을 갖는다는 것이다.
용어 "세포 배양액", "세포 배양 배지", 및 "세포 배양 상등액"은 본 기술분야에 일반적으로 널리 알려진 세포 배양 공정의 측면을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 세포 배양액은 세포 배양 배지 및 세포 배양 상등액을 포함할 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 rVWF 또는 rA13을 발현하는 세포를 배양하기 위한 영양소 및 기타 성분을 제공하기 위해, 선택적으로 보충물과 함께, 상기 세포 배양액에 외부에서 첨가된다. 상기 세포 배양 상등액은 세포 배양 배지 유래의 영양소 및 기타 성분들 뿐만 아니라 배양 중 세포로부터 방출, 대사 및/또는 분비된 산물을 포함하는 세포 배양액을 지칭하나, 세포 자체는 아니다. 따라서, 하나의 문맥에서, 세포 배양 상등액은 세포 배양액 중 액상 (즉, 세포를 제외한 세포 배양액)을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 배양 상등액의 암모늄 농도는 일반적으로 세포 배양액에 존재하는 암모늄 농도를 지칭한다. 다른 문맥에서, 세포 배양 상등액은 세포가 제거된 세포 배양액 (즉, 재생된 세포 배양 상등액)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비타민 B3", "니코틴아미드", "니아신아미드", "니아신", 및 "니코틴산"은 비타민의 B3 패밀리 중 임의의 구성원을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, 이 패밀리의 임의의 구성원은 본 발명의 방법에 사용된 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화학적으로 규명된 배지"는 모든 성분들의 정체성 및 농도가 공지된 합성 성장 배지를 지칭한다. 화학적으로 정의된 배지는 개별적인 식물 또는 동물 유래 성분들 (예컨대, 단백질, 폴리펩타이드 등)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있지만, 세균, 효모, 동물, 또는 식물 추출물을 함유하지 않는다. 상업적으로 이용 가능한 화학적으로 정의된 배지의 비제한적인 예는 다양한 둘베코 변형 이글스 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's (DME) mediums) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), 햄스 영양 혼합물 (Ham's Nutrient Mixture) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), 이의 조합 등을 포함한다. 화학적으로 규명된 배양 배지를 제조하는 방법은 본 기술분야, 예를 들어 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217호, 및 미국 출원공개 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고펩타이드가 비포함된 배양 배지"는 올리고펩타이드, 예컨대, 단백질 가수분해물로부터 유래된 올리고펩타이드를 포함하지 않는 단백질이 없는 배지를 지칭한다. 하나의 구체예에서, 상기 배지는 20개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드를 포함하지 않는다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 배지는 15개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드를 포함하지 않는다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 배지는 10개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드를 포함하지 않는다. 하나의 구체예에서, 상기 배지는 7개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 상기 배지는 5개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 상기 배지는 3개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드를 포함하지 않는다. 본 발명의 추가의 구체예에 따르면, 상기 배지는 2개 이상의 아미노산을 갖는 올리고펩타이드를 포함하지 않는다. 올리고펩타이드가 없는 배양 배지를 제조하는 방법은 본 기술분야, 예를 들어, 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217호, 및 미국 출원공개 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "무혈청 배양 배지"는 동물 혈청으로 보충되지 않는 배양 배지를 지칭한다. 종종 무혈청 배지가 화학적으로 정의된 배지임에도 불구하고, 무혈청 배지는 별개의 동물 또는 식물 단백질 또는 단백질 분획으로 보충될 수 있다. 무혈청 배양 배지를 제조하는 방법은 본 기술분야, 예를 들어, 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217호, 및 미국 출원공개 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동물 단백질이 비포함된 배양 배지"는 동물 혈청, 단백질, 또는 단백질 분획으로 보충되지 않은 배양 배지를 지칭한다. 종종 동물 단백질이 비포함된 배양 배지는 화학적으로 규명된 배지임에도 불구하고, 동물 단백질이 비포함된 배양 배지는 식물 또는 효모 가수분해물을 함유할 수 있다. 동물 단백질이 비포함된 배양 배지를 제조하는 방법은 본 기술분야, 예를 들어, 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217호, 및 미국 출원공개 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기저 세포 배양 배지"는 화학적으로 규명된 배양 배지, 올리고펩타이드가 없는 배양 배지, 무혈청 배양 배지, 또는 가수분해물, 예컨대, 식물 또는 효모 가수분해물로 보충되지 않은 동물 단백질이 비포함된 배양 배지를 지칭한다. 기본 배지는 본 기술분야에 널리 알려져 있으며, 예컨대, DMEM, 햄스 F12, DMEM/햄스 F12, 배지 199, McCoy, 또는 RPMI이다. 상기 기본 배지는 아미노산, 비타민, 유기 및 무기염, 및 탄수화물원을 포함하는, 수많은 성분들을 포함할 수 있다. 각 성분은 세포의 배양을 지지하는 양으로 존재할 수 있으며, 상기 양은 일반적으로 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 상기 배지는 완충 성분, 예컨대, 중탄산나트륨, 항산화제, 기계적 스트레스에 대응하는 안정화제, 또는 프로테아제 억제제와 같은, 보조 성분을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 공중합체 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 혼합물과 같은 비이온성 계면활성제가 첨가될 수 있다.
Ⅲ. 세포 배양 배지 및 세포 배양 상등액
본 발명의 하나의 측면은 기저 세포 배양 배지를 이용하여 생산된 rVWF 및 rA13과 비교하여 증가된 활성을 갖는 rVWF 및/또는 rA13을 생산하기 위한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 하나의 측면에서, 본 발명은 기저 세포 배양 배지가 하나 이상의 부가 성분으로 보충된 rVWF 및/또는 rA13을 생산하기 위한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 어떤 구체예에서 그리고 하기에 더 상세하게 논의된 바와 같이, 본 발명의 세포 배양 조건은 적어도 1.0 ㎍/L 구리를 갖도록 보충된 기저 세포 배양 배지를 포함한다. 추가의 구체예에서, 유용한 세포 배양 배지 및 본 발명에서 공정으로부터 유래된 상등액은 또한 낮은 수준 (10 mM 미만)의 암모늄을 포함한다. 어떤 구체예에서, rVWF 및/또는 rA13을 발현하기 위해 사용된 세포 배양 조건은 세포 배양 상등액이 낮은 수준의 암모늄, 즉, 10 mM 미만 및 바람직하게는 5 mM 미만을 유지하도록 제어된다.
본 발명의 배양 배지는 본 기술 분야에 널리 알려진 적합한 기저 배지, 예컨대, DMEM, 햄스 F12, DMEM/햄스 F12, 배지 199, McCoy, 또는 RPMI에 기초할 수 있다. 상기 기저 배지는 아미노산, 비타민, 유기 및 무기염, 및 탄수화물원을 포함하는, 수많은 성분들을 포함할 수 있다. 각 성분은 세포의 배양을 지지하는 양으로 존재할 수 있으며, 상기 양은 일반적으로 본 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 상기 배지는 완충 성분, 예컨대, 중탄산나트륨, 항산화제, 기계적 스트레스에 대응하는 안정화제, 또는 프로테아제 억제제와 같은, 보조 성분을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 공중합체 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 혼합물과 같은 비이온성 계면활성제가 첨가될 수 있다.
일반적으로, 기저 배지는 1 ㎍/L 미만의 구리를 함유하며, 예를 들어, DMEM/햄스 F12는 약 0.3 ㎍/L의 구리 농도를 갖는다. 이러한 구리 농도는 높은 비활성을 나타내는 본 발명의 rVWF 및 rA13 단백질의 생산을 지지하는데 충분한 구리 이온을 제공하지 않는다.
구리는 다양한 방법을 통해, 예컨대 배지 보충물의 첨가를 통해, 본 발명의 세포 배양 배지에 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 배지 보충물은 가수분해물을 함유할 수 있으며, 이는 배지에서 구리 농도를 증가시키기 위해 제공될 수 있다. 가수분해물은 식물 가수분해물, 대두 가수분해물, 및 밀 글루텐 가수분해물과 같이, 본 기술분야에 널리 알려진 임의의 가수분해물을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 가수분해물의 첨가는 약 0.2 내지 약 10 ㎍/L의 Cu2 +의 구리 농도의 증가에 기여할 수 있다. 일부 구체예에서, 가수분해물에 의해 제공되는 구리의 양은 가수분해물 내의 구리의 양 뿐만 아니라 첨가된 가수분해물의 양에 좌우될 수 있다. 가수분해물의 구리 함량은 원소 분석, 예컨대, 원자 흡수 분광법 (GFAA: graphite furnace atomic adsorption), 또는 질량 분광법 (예컨대, ICP-MS)에 의해 결정될 수 있다.
어떤 구현예들에서, 구리는 적당한 구리 염 또는 구리 킬레이트를 포함하는 배지 보충물을 제공하여 단독으로 또는 가수분해물에 부가하여 배양 배지에 단독으로 또는 가수분해물에 부가하여 제공될 수 있다. 적당한 구리 염은 비제한적으로 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 및 구리 옥사이드를 포함할 수 있다. 적당한 구리 킬레이터는 비제한적으로 알부민, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 폴리아민 킬레이트제, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민, 트리에틸렌디아민, 테트라에틸렌펜타민, 아미노에틸에탄올아민, 아미노에틸피페라진, 펜타에틸렌헥사민, 트리에틸렌테트라민-하이드로클로라이드, 테트라에틸렌펜타민-하이드로클로라이드, 펜타에틸렌헥사민-하이드로클로라이드, 테트라에틸펜타민, 카프토프릴, 페니실아민, N,N'-비스 (3-아미노프로필)-1,3-프로판디아민, N,N'-비스 (2-아미노에틸)-1,3-프로판 디아민, 1,7-디옥사-4,10-디아자사이클로도데칸, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-5,7-디온, 1,4,7-트리아자사이클로노난 트리하이드로클로라이드, 1-옥사-4,7,10-트리아자사이클로도데칸, 1,4,8,12-테트라아자사이클로펜타데칸, 및 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸을 포함할 수 있다.
어떤 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 약 1.0 내지 약 20 ㎍/L의 총 구리 농도로 된다. 구체적인 구현예에서, 기저 세포 배지에는 구리가 보충되어 약 1.0 내지 약 10 ㎍/L의 최종 농도로 된다. 추가 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지는 보충되어 약 1.0 - 5.0, 1.2 - 4.0, 1.3 - 3.0, 1.4 - 2.9, 1.5 - 2.8, 1.6 - 2.7, 1.7 - 2.6, 1.8 - 2.5, 1.9 - 2.4, 2.0 - 2.3, 2.1 - 2.2 ㎍/L 구리의 최종 구리 농도가 된다. 추가 구현예들에서, 본 발명의 방법에 사용된 기저 세포 배양 배지는 보충되어 약 1.2 - 9.5, 1.4 - 9, 1.6 - 8.5, 1.8 - 8, 2.0 - 7.5, 2.2 - 7, 2.4 - 6.5, 2.6 - 6.0, 2.8 - 5.5, 3.0 - 5.0, 3.2 - 4.5, 3.4 - 4, 및 2 - 4 ㎍/L 구리가 된다. 또 다른 구현예들에서, 본 발명의 방법에 사용된 기저 세포 배양 배지는 보충되어 약 1 - 6, 2 - 5, 3 - 4 ㎍/L 구리로 된다. 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 1 ㎍/L의 구리 농도로 된다. 또 하나의 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 2 ㎍/L의 총 구리 농도가 된다. 또 하나의 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 4 ㎍/L의 총 구리 농도로 된다. 어떤 구현예들에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 1 ㎍/L, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ㎍/L 구리, 또는 그 초과의 총 구리 농도로 된다. 어떤 구현예에서 및 본원에서 추가 상세히 논의된 바와 같이, rA13를 생산하기 위한 배양은 약 2 - 4 ㎍/L의 구리를 함유할 수 있고, 반면에 rVWF를 생산하기 위한 배양은 적어도 2 ㎍/L의 구리를 함유할 수 있다.
상기에서 나타낸 농도는 제2 구리 형태 (Cu2 +)로 순수한 구리의 각 농도이다. 구리 유도체, 예들 들면, 구리를 포함하는 수화 염, 또는 화합물, 예들 들면, 구리 킬레이터가 사용되면, 유도체 또는 킬레이터의 양은, 구리의 최종 농도가 본원에 기재된 범위로 되도록 첨가된다. 예를 들면, 2 ㎍/L의 CuSO4·5H2O은 약 0.51 ㎍/L의 구리 농도와 같다 (설페이트 및 5H2O 없음).
유익하게는, 세포 배양 용액 (즉, 배양 상청액 중) 낮은 암모늄 (NH4 +) 농도로 되는 세포 배양 과정 중 세포 배양 배지의 사용으로 높은 특이적 활성을 갖는 재조합 VWF 및/또는 rA13가 발현된다는 것이 발견되었다. 따라서, 어떤 구현예들에서, 상청액의 NH4 + 농도는 10 mM 이하이다. 바람직한 구현예에서, 상청액의 NH4 + 농도는 5 mM 이하이다. 바람직한 구현예에서, 상청액의 NH4 + 농도는 4 mM 이하이다. 또 다른 구현예들에서, 상청액의 NH4 + 농도는 10 mM, 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만이다.
따라서, 어떤 구체예에서, 본원에 제공된 방법 및 조성물은 상등액에 10 mM 이하의 NH4 + 농도를 야기하는 공정에 사용된 구리된 (예컨대, 적어도 2 μg/L의 최종 농도로)로 보충된 기저 세포 배양 배지의 사용에 의존한다. 또 다른 구체예에서, 상기 기저 세포 배양 배지는 표 1에 제공된 바와 같이 변형 (variation) 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 최종 구리 및 암모늄 농도를 제공하도록 보충된다.
표 1은 본원에 제공된 바와 같은 재조합 단백질의 발현에 유용한 배양 배지 및 상등액 내에 존재하는 구리 및 암모늄 농도의 예시적인 구체예이다.
Figure pat00001
Figure pat00002
*ND = 정의되지 않음
*NMT = 이하
*AL = 적어도
일부 구체예에서, 본 발명의 구리가 보충된 배지는 동물 단백질이 없고/없거나 화학적으로 정의된 기본 배지를 보충함으로써 생산된다. 동물 단백질이 없고 화학적으로 규명된 배양 배지를 제조하는 방법은 본 기술분야, 예를 들어, 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217호, 및 미국 출원공개 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 공지되어 있다. 하나의 구체예에서, 본원에 기술된 방법에 사용되는 기본 배양 배지는 동물 단백질이 없거나 올리고펩타이드가 없는 배지이다. 어떤 구체예에서, 상기 배양 배지는 화학적으로 정의될 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 배양 배지는 약 0.5 mg/L 내지 약 10 mg/L의 농도의 적어도 하나의 폴리아민을 함유할 수 있다.
추가의 구체예에서 그리고 상기에 제공된 임의의 설명에 덧붙여, 기본 배지가 구리, 및 칼슘, 아연, 및/또는 비타민 B3 중 적어도 하나로 보충된 본 발명의 배양 배지가 제공된다. 어떤 구체예에서, 상기 배지는 동물 단백질이 없거나, 올리고펩타이드가 없거나, 화학적으로 정의된 배지일 수 있다. 어떤 구체예에서, 동물 단백질이 없거나 올리고펩타이드가 없는 배지는, 모든 목적을 위해 전문이 참조로써 본원에 통합되어 있는, 미국 특허 제6,171,825호 및 제6,936,441호, WO 2007/077217호, 및 미국 출원공개 제2008/0009040호 및 제2007/0212770호에 교시되어 있는 바와 같이 제조되며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있으며, 부가적인 구리 및 선택적으로 칼슘, 아연, 및 비타민 B3 중 하나 이상으로 보충된다. 어떤 구체예에서, 상기 화학적으로 규명된 배양 배지는 배지에서 배양된 세포에서 발현되는 rVWF 또는 rA13의 비활성을 증가시키기 위해, 부가적인 구리 및 선택적으로 칼슘, 아연, 및/또는 비타민 B3으로 보충된, 둘베코 변형 이글스 배지 / 햄스 F12 1:1 혼합물 (DMEM/햄스 F12)과 유사할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 동물 성분이 없다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 단백질, 예컨대, 우태아혈청과 같은 혈청으로부터 유래된 동물 단백질을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양물은 외래에서 첨가된 재조합 단백질을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 단백질은 보증된 병원균이 없는 동물로부터 유래된다.
어떤 구체예에서, 상기 배양 배지는 적어도 하나의 폴리아민을 0.5 mg/L 내지 30 mg/L 또는 약 0.5 mg/L 내지 30 mg/L의 농도로 함유한다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 적어도 하나의 폴리아민을 0.5 mg/L 내지 10 mg/L 또는 약 0.5 mg/L 내지 10 mg/L의 농도로 함유한다. 하나의 구체예에서, 상기 배양 배지는 적어도 하나의 폴리아민을 2 mg/L 내지 8 mg/L 또는 약 2 mg/L 내지 8 mg/L의 농도로 함유한다. 어떤 구체예에서, 상기 폴리아민은 오르니틴, 푸트레신, 스퍼민 또는 스퍼미딘 등의 군으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리아민은 푸트레신이다. 어떤 구체예에서, 상기 배양 배지는 2 mg/L 내지 8 mg/L 또는 약 2 mg/L 내지 8 mg/mL의 푸트레신을 함유한다.
하나의 구체예에서, 상기 배양 배지는 0.5 mg/L 내지 30 mg/L 또는 약 0.5 mg/L 내지 30 mg/L의 농도의 적어도 하나의 폴리아민 및 표 1에 기재된 바와 같이, 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 구리 및 암모늄 조합을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 0.5 mg/L 내지 10 mg/L 또는 약 0.5 mg/L 내지 10 mg/L의 농도의 적어도 하나의 폴리아민 및 표 1에 기재된 바와 같이, 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 구리 및 암모늄 조합을 함유한다. 하나의 구체예에서, 상기 배양 배지는 2 mg/L 내지 8 mg/L 또는 약 2 mg/L 내지 8 mg/L의 농도의 적어도 하나의 폴리아민 및 표 1에 기재된 바와 같이, 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 구리 및 암모늄 조합을 함유한다. 어떤 구체예에서, 상기 폴리아민은 오르니틴, 푸트레신, 스퍼민 또는 스퍼미딘 등의 군으로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 상기 폴리아민은 푸트레신이다. 어떤 구체예에서, 상기 배양 배지는 2 mg/L 내지 8 mg/L 또는 약 2 mg/L 내지 8 mg/L의 푸트레신 및 표 1에 기재된 바와 같이, 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 구리 및 암모늄 조합을 함유한다.
추가의 측면에서, 구리 외에, 본 발명에 유용한 세포 배양 배지는 부가적인 칼슘, 아연, 하나 이상의 비타민, 및 이의 임의의 조합 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 임의의 칼슘염이 본 발명의 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있으며, 허용가능한 염의 비제한적인 예는 CaCl2, CaCl2, CaFPO3ㆍ2H2O, CaI2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3ㆍ2H2O 등을 포함한다. 어떤 구체예에서, 칼슘의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위해 사용된다.
일반적으로, 임의의 아연염이 본 발명의 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있으며, 허용가능한 염의 비제한적인 예는 ZnSO4·7H2O, ZnSO3·2H2O, (C6H5O7)2Zn3·2H2O, ZnBr2, ZnBr2·2H2O, ZnCl2, Zn(NO3)2·6H2O, Zn(H2PO4)2ㆍH2O, (C2H3O2)2Znㆍ2H2O 등을 포함한다. 어떤 구체예에서, 아연의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 발명의 배양 배지를 보충하기 위해 사용된다. 다른 구체예에서, 아연을 함유하는 펩타이드 또는 단백질 제제, 예를 들어 인슐린이 본원에 제공된 배양을 보충하기 위해 사용될 수 있다.
추가 측면에서, 구리 및 상기 논의된 부가적인 물질 중 하나 이상으로 보충된 기본 세포 배지는 상등액에 낮은 암모늄 수준을 갖는 배양에 추가로 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명에 유용한 보충된 세포 배양 배지는 10 mM 미만의 세포 배양 용액에서의 암모늄 수준을 야기한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 보충된 세포 배양 배지는 약 0.5 - 9.5, 1.0 - 9.0, 1.5 - 8.5, 2.0 - 8.0, 2.5 - 7.5, 3.0 - 7.0, 3.5 - 6.5, 4.0 - 6.0, 4.5 - 5.5 mM의 세포 배양 암모늄 수준으로 사용된다.
하나의 구체예에서, 세포 배양 배지 및 세포 배양 상등액의 구리 및 암모늄 농도는 제조 공정 중 연장된 기간 동안 유지된다. 어떤 구체예에서, 세포 배양물의 구리 및 암모늄 농도는 제조 공정이 지속되는 동안, 즉 rVWF 또는 rA13이 발현되어 대규모 세포 배양으로부터 재생되는 시간 동안 유지된다. 어떤 구체예에서, 상기 구리 및 암모늄 농도는 표 1에 개시된 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 수준으로 배양액 내에 유지된다. 바람직한 구체예에서, 상기 구리 및 암모늄 농도는 이러한 생산 공정의 전체 시간 동안 유지된다.
일부 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 배양 배지는 액체 또는 건조 또는 분말 형태로 제공될 수 있다. 상기 배지는 단독 사용에 적합한 양으로 미리 분취되거나 둘 이상의 세포 배양에 사용될 수 있는 더 큰 양으로 제공될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 배지는 멸균 방식으로 제공될 것이다.
rVWF 또는 rA13을 생산하기 위해 사용되는 세포 배양 배지의 구체적인 세부사항이 하기에 논의되어 있다. 하기가 rVWF 또는 rA13과 관련하여 논의되고 있지만, rVWF와 관련하여 아래에 제공되는 임의의 논의는 rA13에 적용할 수 있고, 반대의 경우도 마찬가지인 것으로 이해될 것이다.
A. 재조합 VWF 세포 배양 배지
본 발명의 하나의 측면은 재조합 vWF, 더욱 구체적으로, 본원에 추가로 설명되어 있는, 높은 비활성을 갖는 고분자량 vWF를 생산하기 위한 세포 배양액에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 고분자량의 재조합 vWF를 생산하기 위한 세포 배양액을 제공하며, 이는 적어도 약 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 및 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 포함하는 고도의 멀티머 vWF를 발현하는 다수의 세포를 포함한다.
일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양은 표 1에 나타난 바와 같이 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 구리 및 암모늄 농도를 갖는다. 어떤 구현예들에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 상기에서 제공된 농도에서 장기간에 걸쳐 유지된다. 예를 들면, 일 구현예에서, 암모늄 농도는 저농도에서 적어도 3일 동안, 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 유지된다. 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다).
본 발명의 일 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 약 2.4 ㎍/L, 또 하나의 구현예에서 적어도 약 3 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 적어도 약 4 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 적어도 약 8 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 적어도 약 10 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 적어도 약 15 ㎍/L, 및 추가 구현예에서 적어도 약 20 ㎍/L의 구리 농도를 포함할 수 있다.
다른 구현예들에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 구리 농도는 약 2.4 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L, 또 하나의 구현예에서 약 2.4 ㎍/L 내지 약 15 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 2.4 ㎍/L 내지 약 10 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 2.4 ㎍/L 내지 약 8 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 2.4 ㎍/L 내지 약 6 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 2.4 ㎍/L 내지 약 4 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 4 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 4 ㎍/L 내지 약 15 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 4 ㎍/L 내지 약 10 ㎍/L, 여전히 또 하나의 구현예 약 4 ㎍/L 내지 약 8 ㎍/L, 및 추가 구현예에서 약 4 ㎍/L 내지 약 6 ㎍/L 범위일 수 있다.
본 발명은 또한 rVWF의 발현 또는 생산을 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 높은 비활성을 갖는 rVWF의 발현에 적합한 배양 배지를 포함한다.
B. ADAMTS13 (A13) 세포 배양 배지
하나의 측면에서, 본 발명은 높은 비활성을 갖는 ADAMTS 단백질의 발현에 유용한 배양 배지를 제공한다. 유리하게도, 배양 배지를 구리로 보충함으로써, 상기 보충된 배지에서 배양된 세포에서 발현된 재조합 ADAMTS (예컨대, rADAMTS13) 효소의 활성은 크게 향상된 한편, 상기 효소는 보충되지 않은 배지에서 배양된 세포보다 높지는 않지만 높은 수준으로 발현된다는 것이 밝혀졌다.
일 측면에서, 본 발명은 높은 특이적 활성을 갖는 재조합 ADAMTS13 단백질의 발현을 위해 구리가 보충된 세포 배양 배지를 제공한다. 일 구현예에서, 배지는 보충되어 약 2 내지 약 4 ㎍/L의 총 구리 농도가 된다. 추가 구현예들에서, 배지는 보충되어 약 1 - 3, 2 - 3, 3 - 4 ㎍/L의 총 구리 농도가 된다. 일 구현예에서, 배지는 적어도 1 ㎍/L의 구리 농도를 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 배지는 적어도 2 ㎍/L를 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 배지는 적어도 4 ㎍/L를 함유한다. 다른 구현예들에서, 배지는 2 ㎍/L 내지 20 ㎍/L를 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 배지는 1 ㎍/L 내지 6 ㎍/L를 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 배지는 2 ㎍/L 내지 5 ㎍/L를 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 배지는 3 ㎍/L 내지 4 ㎍/L를 함유한다. 또 다른 구현예들에서, 배지는 적어도 1 ㎍/L 구리, 또는 적어도 2 ㎍/L, 3 ㎍/L, 4 ㎍/L, 5 ㎍/L, 6 ㎍/L, 7 ㎍/L, 8 ㎍/L, 9 ㎍/L, 10 ㎍/L, 11 ㎍/L, 12 ㎍/L, 13 ㎍/L, 14 ㎍/L, 15 ㎍/L, 16 ㎍/L, 17 ㎍/L, 18 ㎍/L, 19 ㎍/L, 20 ㎍/L, 또는 그 초과의 구리 농도를 함유한다.
일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 표 1에서 나타난 바와 같이 변형 1 내지 440중 어느 하나에 따른 구리 및 암모늄 농도를 갖는다. 어떤 구현예들에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 장기간에 걸쳐 상기에서 제공된 농도에서 유지된다. 예를 들면, 일 구현예에서, 암모늄 농도는 저농도에서 적어도 3 일 동안, 또는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rA13를 생산하기 위해 사용된다).
일 구현예에서, 배양 배지는 적어도 1 ㎍/L 구리 및 적어도 2 μM 아연을 함유하는 재조합 ADAMTS 단백질 (예를 들면, rADAMTS13)의 발현을 위해 제공된다. 다른 구현예들에서, 배지는 적어도 2 ㎍/L 구리 또는 적어도 4 ㎍/L 구리를 함유한다. 배지에 구리가 보충된 또 하나의 구현예에서, 배양 배지는 또한, 적어도 약 5 μM 아연 또는 대략을 함유한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 또한, 약 2 μM 내지 12 μM 아연 또는 대략을 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 배양 배지는 또한, 약 5 μM 내지 12 μM 아연 또는 대략을 함유한다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 또한, 약 2 μM, 또는 적어도 약 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 또는 그 초과 아연 또는 대략을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 배양 배지는 표 2에 나타난 바와 같이 변형 441 내지 880의 구리 및 아연 농도를 함유한다.
표 2는 재조합 ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한 배양 배지 내에 존재하는 구리 및 아연 농도의 예시적인 구체예이다.
Figure pat00003
Figure pat00004
*AL = 적어도
하나의 구체예에서, 상기 세포 배양액은 낮은 암모늄 농도를 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 세포 배양액은 10 mM 미만의 암모늄 농도 및 표 2에 기재된 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 10 mM 이하의 농도로 유지된다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양액은 6 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 2에 기재된 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 6 mM 이하의 농도로 유지된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양액은 5 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 2에 기재된 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 5 mM 이하의 농도로 유지된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양액은 4 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 2에 기재된 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 4 mM 이하의 농도로 유지된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도 및 표 2에 기재된 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 포함한다. 또 다른 어떤 구체예에서, 상기 세포 배양물의 암모늄 농도는 공정이 지속되는 동안 (즉, 상기 배양물이 rA13을 생산하기 위해 사용되는 전체 시간 동안) 낮은 수준으로 유지된다.
하나의 구체예에서, 재조합 ADAMTS 단백질 (예컨대, rADAMTS13)의 발현을 위해 적어도 1 ㎍/L 구리 및 적어도 0.5 mM 또는 약 0.5 mM의 칼슘을 함유하는 배양 배지가 제공된다. 다른 구체예에서, 상기 배지는 적어도 2 ㎍/L의 구리 또는 적어도 4 ㎍/L의 구리를 함유한다. 배지가 구리로 보충된 또 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 또한 적어도 1.5 mM의 칼슘을 함유한다. 하나의 구체예에서, 상기 배양 배지는 0.5 mM 내지 1.5 mM의 칼슘 또는 약 0.5 mM 내지 1.5 mM의 칼슘을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 적어도 정확히 또는 약 0.5 mM, 또는 적어도 정확히 또는 약 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM, 또는 그 이상의 칼슘을 함유할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 배양 배지는 표 3에 기재된 바와 같은 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 함유한다.
표 3은 재조합 ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한 배양 배지 내에 존재하는 구리 및 칼슘 농도의 예시적인 구체예이다.
Figure pat00005
Figure pat00006
*AL = 적어도
하나의 구체예에서, 상기 세포 배양액은 낮은 암모늄 농도를 추가로 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 세포 배양액은 10 mM 미만의 암모늄 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 10 mM 이하의 농도로 유지된다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양액은 6 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 6 mM 이하의 농도로 유지된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양액은 5 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 5 mM 이하의 농도로 유지된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포 배양액은 4 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 암모늄은 적어도 7일간 4 mM 이하의 농도로 유지된다. 또 다른 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 포함한다. 또 다른 어떤 구체예에서, 상기 세포 배양물의 암모늄 농도는 공정이 지속되는 동안 (즉, 상기 배양물이 rA13을 생산하기 위해 사용되는 전체 시간 동안) 낮은 수준으로 유지된다.
일 구현예에서, 세포 배양 배지에는 구리, 아연 및 칼슘이 보충된다. 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 적어도 0.5 mM의 칼슘 농도 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 적어도 1.5 mM의 칼슘 농도 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 0.5 mM 내지 1.5 mM의 칼슘 농도 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM 이상 또는 그 초과의 칼슘 농도, 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다.
일 구현예에서, 배양 배지는 적어도 1 ㎍/L 구리 및 적어도 2 mg/L 니코틴아마이드 (비타민 B3)를 함유하는 재조합 ADAMTS 단백질 (예들 들면, rADAMTS13)을 위해 제공된다. 다른 구현예들에서, 배지는 적어도 2 ㎍/L 구리 또는 적어도 4 ㎍/L 구리를 함유한다. 배지에 구리가 보충된 또 하나의 구현예에서, 배양 배지는 또한, 적어도 7 mg/L 니코틴아마이드 (비타민 B3) 를 함유한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 약 2 mg/L 내지 10 mg/L 또는 대략의 니코틴아마이드 (비타민 B3)를 함유한다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 약 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 또는 더 높은 농도 또는 대략의 니코틴아마이드 (비타민 B3)를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 배양 배지는 표 4에서 나타낸 변형 1321 내지 1760 중 어느 하나에 따른 구리 및 니코틴아마이드 농도를 함유한다.
표 4는 재조합 ADAMTS13 단백질의 발현에 유용한 배양 배지 내에 존재하는구리 및 니코틴아미드 농도의 예시적인 구체예이다.
Figure pat00007
Figure pat00008
*AL = 적어도
일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 낮은 암모늄 농도를 포함한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 10 mM 미만의 암모늄 농도 및 표 4에 나타낸 변형 1321 내지 1760 중 어느 하나에 따른 구리 및 니코틴아마이드 농도를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 암모늄은 10 mM 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 6 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 4에서 나타낸 변형 1321 내지 1760 중 어느 하나에 따른 구리 및 니코틴아마이드 농도를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 암모늄은 6 mM 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 4에서 나타낸 변형 1321 내지 1760 중 어느 하나에 따른 구리 및 니코틴아마이드 농도를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 암모늄은 5 mM 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 하나의 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도 및 표 4에서 나타낸 변형 1321 내지 1760 중 어느 하나에 따른 구리 및 니코틴아마이드 농도를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 암모늄은 4 mM 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하의 암모늄 농도, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만 및 표 4에서 나타낸 변형 1321 내지 1760 중 어느 하나에 따른 구리 및 니코틴아마이드 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rA13를 생산하기 위해 사용된다).
일 구현예에서, 세포 배양 배지에는 구리, 아연 및 니코틴아마이드가 보충된다. 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 적어도 2 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 적어도 7 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 2 mg/mL 내지 10 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL 이상, 또는 그 초과의 니코틴아마이드 농도, 및 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다.
일 구현예에서, 세포 배양 배지에는 구리, 칼슘 및 니코틴아마이드가 보충된다. 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 표 3에서 나타낸 적어도 2 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 적어도 7 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 3에서 나타낸 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 2 mg/mL 내지 10 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 3에서 나타낸 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL 이상, 또는 그 초과의 니코틴아마이드 농도, 및 표 3에서 나타낸 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다.
IV. 높은 비활성을 갖는 혈액 인자의 생산 방법
A. 세포 배양 방법
본 발명은 재조합 단백질 (예컨대, rVWF 및 rA13)의 대규모 생산 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 이러한 대규모 생산 방법은 이들 치료 재조합 단백질의 제조를 위해 교반 탱크를 이용한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 방법은 회분식 또는 연속식 작동 하에서 작동되는 세포 배양 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 회분 세포 배양을 이용하는 경우, 이들은 단일 회분, 유가 회분, 또는 반복-회분 방식 하에서 작동될 수 있다. 마찬가지로, 연속 세포 배양은, 예를 들어, 관류, 터비도스탯 (turbidostat) 또는 케모스탯 (chemostat) 방식 하에서 작동될 수 있다. 회분 및 연속 세포 배양은 현탁 또는 부착 조건 하에서 수행될 수 있다. 현탁 조건 하에서 작동되는 경우, 세포는 자유롭게 현탁되어 배양 배지 내에 혼합될 것이다. 대안적으로, 부착 조건 하에서, 세포는 고체상, 예를 들어, 미세 담체 (microcarrier), 다공성 미세 담체, 디스크 담체, 세라믹 카트리지, 중공 섬유, 평시트, 겔 매트릭스 등에 결합할 것이다.
회분 배양 (batch culture)은 통상적으로 세포 접종물이 탱크 또는 발효기에서 최대 농도로 배양되고, 회수되어 단일 회분으로 처리되는 대규모 세포 배양이다. 유가 배양은 통상적으로 신선한 영양소 (예컨대, 성장-제한 기질) 또는 첨가물 (예컨대, 산물에 대한 전구물질)이 공급되는 유가 배양이다. 공급액은 일반적으로 생물반응기의 희석을 피하기 위해 고도로 농축된다. 반복된 회분 배양에서, 세포는 배양 배지에 놓여져 목적하는 세포 밀도까지 성장된다. 쇠퇴기 및 세포 사멸의 개시를 피하기 위해, 이후 상기 배양물은 세포가 이들의 최대 농도에 도달하기 전에 완전 성장 배지로 희석된다. 희석량 및 빈도는 다양하게 달라지며 세포주의 성장 특성 및 배양 공정의 편의성에 좌우된다. 상기 공정은 필요한 만큼 수차례 반복될 수 있으며, 세포와 배지가 계대 배양에서 폐기되지 않는 한, 배양 부피는 각각의 희석이 이뤄짐에 따라 순차적으로 증가할 것이다. 상기 증가하는 부피는 반응기가 용기 내에서 희석을 가능하게 하는 충분한 크기가 되게 하거나, 희석된 배양을 몇 개의 용기로 나눔으로써 취급될 수 있다. 이러한 유형의 배양의 원리는 세포를 대수기로 증식하는 상태로 유지시키는 것이다. 연속 계대 배양은 배양 부피가 항상 순차적으로 증가하고, 다수의 회수가 존재할 수 있으며, 세포가 계속 성장하고, 상기 공정이 원하는 한 계속될 수 있다는 데 특징이 있다. 어떤 구체예에서, 재조합 ADAMTS 단백질 (예컨대, rADAMTS13)은 회분 배양의 상등액을 회수한 후 재생될 수 있다. 다른 구체예에서, 재조합 VWF는 회분 배양의 상등액을 회수한 후 재생될 수 있다.
연속 배양은 신선한 배지의 유입에 의해 영양소를 연속적으로 공급하는 현탁 배양일 수 있으며, 여기에서 상기 배양 부피는 사용된 배지를 동시에 제거함으로써 통상적으로 일정하게 유지된다. 케모스탯 및 터비도스탯 방법에서, 추출된 배지는 세포를 함유한다. 따라서, 세포 배양 용기에 남아있는 세포는 성장하여 정상 상태를 유지할 것이다. 케모스탯 방법에서, 성장 속도는 일반적으로 희석 속도, 즉 신선한 배지가 첨가되는 속도를 제어함으로써 제어된다. 상기 배양에서 세포의 성장 속도는, 예를 들어, 희석 속도의 변화에 의해 준최대 (sub-maximal) 성장 속도로 제어될 수 있다. 이와 반대로, 터비도스탯 방법에서, 희석 속도는 pH 및 온도와 같은 주어진 작동 조건에서 세포가 달성할 수 있는 최대 성장 속도를 허용하도록 설정된다. 어떤 구체예에서, rVWF 또는 rA13은 연속 배양의 상등액을 회수한 후 재생된다. 연속 세포 배양을 위한 예시적인 방법은, 모든 목적을 위해 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있는 WO/2011/012725호 (Grillberger 등)에 기술되어 있다.
관류 배양에서, 추출된 배지는 세포가 고갈되며, 세포는 예를 들어, 배양 내로 세포를 재도입하는 여과 또는 원심분리 방법에 의해 배양 용기에 유지된다. 하지만, 통상적으로 여과에 사용되는 멤브레인은 세포를 100% 보유하지 않으며, 따라서 배지가 추출될 때 일부가 제거된다. 세포의 대다수가 배양 용기 내에 보유되기 때문에, 매우 높은 성장 속도로 관류 배양을 작동하는 것이 중대하지 않을 수 있다. 어떤 구체예에서, rVWF 또는 rA13은 관류 배양의 상등액을 회수한 후 재생된다.
교반 탱크 반응기 시스템이 현탁 또는 부착 방식 하에서 작동되는 회분 및 연속 세포 배양에 사용될 수 있다. 일반적으로, 교반 탱크 반응기 시스템은 러시턴 (Rushton), 하이드로 호일 (hydrofoil), 피치드 블레이드 (pitched blade), 또는 선박 (marine)과 같은 임의의 유형의 교반기를 갖는 임의의 통상적인 교반 탱크 반응기로서 작동될 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-배양 방법은 미세 담체의 사용을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 구체예의 세포-배양은 높은 부피-특이적 배양 표면적을 제공하여 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 달성하는데 적합한 조건하에서 큰 생물반응기 내에서 수행될 수 있다. 이러한 성장 조건을 제공하는 한 가지 수단은 교반 탱크 생물반응기에서 세포 배양용 미세 담체를 사용하는 것이다. 미세 담체 상에서의 세포 성장의 개념은 van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967))에 의해 최초로 기술되었으며, 이는 성장 배지에 현탁된 작은 고체 입자의 표면상에 세포 부착을 가능하게 한다. 이들 방법은 높은 표면-대-부피 비율을 제공하므로, 효율적인 영양소 이용을 가능하게 한다. 더욱이, 진핵 세포주에서 분비된 단백질의 발현을 위해, 상기 증가된 표면-대-부피 비율이 더 높은 수준의 분비를 가능하게 하며, 따라서 배양 상등액에서 더 높은 단백질 수율을 가능하게 한다. 마지막으로, 이들 방법은 진핵 발현 배양의 손쉬운 규모확장을 가능하게 한다.
vWF 및/또는 rA13을 발현하는 세포는 세포 배양 성장 동안에 구형 또는 다공성 미세 담체에 결합할 수 있다. 상기 미세 담체는 덱스트란, 콜라겐, 플라스틱, 젤라틴 및 셀룰로오스 및 문헌 [Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303)]에 기술된 기타 물질에 기초한 미세 담체의 군으로부터 선택된 미세 담체일 수 있다. 또한 세포를 구형 미세 담체 상에서 바이오매스로 성장시키고 이들이 최종 발효기 바이오매스에 도달할 때 그리고 다공성 미세 담체 상에서 발현된 단백질을 생산하기에 앞서 세포를 계대 배양하는 것이 가능하며, 그 반대도 가능하다. 적합한 구형 미세 담체는 사이토덱스 (CytodexTM) 1, 사이토덱스TM 2, 및 사이토덱스TM 3 (GE Healthcare)과 같은 매끄러운 표면 미세 담체 및 사이토포어 (CytoporeTM) 1, 사이토포어TM 2, 사이토라인 (CytolineTM) 1, 및 사이토라인TM 2 (GE Healthcare)와 같은 미세다공성 미세 담체를 포함할 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 발명은 구리 농도가 증가된 세포 배양 배지를 포함한다. 상기 "세포 배양 배지" 부분에 기술된 모든 구체예 및 농도는 본원에 기술된 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
어떤 구현예들에서, 배양은 적어도 약 7일, 또는 적어도 약 14일, 21일, 28일, 또는 적어도 약 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 또는 적어도 약 2 개월, 또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 개월 또는 더 길게 유지될 수 있다. 세포-배양이 재조합 vWF 또는 재조합 rA13 단백질의 생산을 위해 유지되는 세포 밀도는 단백질 발현을 위한 배양-조건 및 배지에 의존할 것이다. 당해 분야에서 숙련된 자는 rVWF 또는 rA13를 생산하는 세포-배양을 위해 최적의 세포 밀도를 쉽게 결정할 것이다. 일 구현예에서, 배양은 약 0.5×106 내지 4×107 세포/mL의 세포 밀도에서 장기간에 걸쳐 유지된다. 다른 구현예들에서, 세포 밀도는 약 1.0×106 내지 약 1.0×107 세포/mL의 농도에서 장기간에 걸쳐 다른 구현예들에서, 세포 밀도는 약 1.0×106 내지 약 4.0×106 세포/mL의 농도에서 장기간에 걸쳐 유지된다. 다른 구현예들에서, 세포 밀도는 약 1.0×106 내지 약 4.0×106 세포/mL의 농도에서 장기간에 걸쳐 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 밀도는 약 2.0×106 내지 약 4.0×106 세포/mL, 또는 약 1.0×106 내지 약 2.5×106 세포/mL, 또는 약 1.5×106 내지 약 3.5×106 세포/mL, 또는 임의의 다른 유사한 범위의 농도에서, 장기간에 걸쳐 유지될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 21일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 28 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 5 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 6 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 8 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 4.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 9 주 동안 유지된다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 21일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 28일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 5 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 6 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 8 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 9 주 동안 유지된다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 21 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 28 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 5 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 6 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 8 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 9 주 동안 유지된다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 21 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 28 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 5 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 6 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 8 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 9 주 동안 유지된다.
또 하나의 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 21 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 28 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 5 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 6 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 8 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 9 주 동안 유지된다.
일 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 21 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 28 일 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 5 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 6 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 7 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 8 주 동안 유지된다. 더 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공된 연속 세포 배양물의 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 이하의 농도에서 적어도 9 주 동안 유지된다.
하기는 rVWF 및 rA13를 생산하기 위한 방법에 데산 구체적인 세부사항을 제공한다. 이해되는 바와 같이, 조건이 rVWF 또는 rA13에 대해 구체적으로 제공될지라도, rVWF에 대한 조건은 rA13를 생산하기 위해 사용될 수 있고 그 반대도 가능하다.
B. 고분자량 재조합 vWF를 생산하는 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 구리 농도가 증가된 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 조건 하에서 vWF를 생산하는 방법에 관한 것이다. 어떤 구체예에서, 상기 배양물은 또한 낮은 암모늄 농도를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양물" 및 "세포 배양액"은 상호교환적으로 사용된다.
일 구현예에서, 본 발명은, a) 세포의 배양을 제공하는 단계; b) vWF에 대한 핵산 서열 코딩을 도입하는 단계; c) 핵산 서열을 보유한 세포를 선택하는 단계; 및, d) 적어도 약 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 및 약 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함하는 세포 배양 상청액을 포함하는 세포 배양 조건 하에서 세포에서 vWF를 발현시키는 단계를 포함하는 고분자량의, 재조합 vWF의 생산 방법을 제공하고, 상기 vWF는 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함하는 고 멀티머 vWF이다. 추가 구현예들에서, 본 발명의 방법을 사용하여 생산된 멀티머 rVWF는 약 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 다이머를 포함한다. 또 추가의 구현예들에서, 본 발명에 따라 생산된 Rvwf는 약 20, 22.5, 25, 27.5, 30, 32.5, 35, 37.5, 40, 42.5, 45, 47.5, 50, 52.5, 55, 57.5, 60, 62.5, 65, 67.5, 70, 72.5, 75, 77.5, 80 이상, 또는 그 초과 mU/㎍의 특이적 활성을 갖는다. 구체적인 구현예에서, rVWF의 생산을 위한 연속 세포 배양의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 미만의 농도에서 장기간에 걸쳐 유지된다. 다른 구체적인 구현예들에서, 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL, 0.5×106 세포/mL 이하, 또는 그 미만에서 유지된다. 일 구현예에서, 세포 밀도는 1.5×106 세포/mL 내지 2.5×106 세포/mL에서 유지된다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF) 조성물의 생산 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리를 보충하여 2.0 ㎍/L 이상의 최종 구리 농도를 제공하는 단계; (c) rVWF 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rVWF가 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 회수된 상청액은 30 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 10 mM 이하의 암모늄 농도 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 2.4 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공한다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 3 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공한다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 4 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공한다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 배지는 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 적어도 4.3 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공한다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 2 ㎍/L 내지 20 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공한다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 3 ㎍/L 내지 10 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공한다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도 용액은 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 기저 세포 배양 배지에는 구리가 보충되어 4 ㎍/L 내지 7.5 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공한다. 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rVWF를 생산하기 위해 사용된다). 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF) 조성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리를 보충하는 단계; (c) rVWF 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rVWF가 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계에 있어서, 상기 상청액의 NH4 + 농도는 저수준에서 적어도 7일 동안 유지되고, 또한 여기서 상기 회수된 상청액은 적어도 30 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 구체적인 구현예에서, 세포 배양 용액의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 14일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 21 일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 28 일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 5 주 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 6 주 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 7 주 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 8 주 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양의 구리 농도 및 NH4 + 농도는 표 1에서 나타낸 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 농도에서 적어도 9 주 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF) 조성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리를 보충하여 2.0 ㎍/L 이상의 최종 구리 농도를 제공하는 단계; (c) rVWF 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rVWF가 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; (e) 상기 배양 상청액의 암모늄 농도를 모니터링하는 단계; 및 (f) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 10 mM 초과의 암모늄 농도를 포함하는 배양 상청액은 rVWF 조성물을 생산하기 위해 사용되지 않고, 또한 여기서 상기 회수된 상청액은 적어도 30 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 어떤 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2.4 ㎍/L, 3 ㎍/L, 4 ㎍/L, 5 ㎍/L, 6 ㎍/L, 7 ㎍/L, 8 ㎍/L, 9 ㎍/L, 10 ㎍/L, 15 ㎍/L, 20 ㎍/L 이상, 또는 그 초과이다. 다른 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2-20 ㎍/L, 2-10 ㎍/L, 3-8 ㎍/L, 또는 4-6 ㎍/L이다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 6 mM 초과의 암모늄 농도를 포함하는 배양 상청액은 rVWF 조성물을 생산하는데 사용되지 않는다. 어떤 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2.4 ㎍/L, 3 ㎍/L, 4 ㎍/L, 5 ㎍/L, 6 ㎍/L, 7 ㎍/L, 8 ㎍/L, 9 ㎍/L, 10 ㎍/L, 15 ㎍/L, 20 ㎍/L 이상, 또는 그 초과이다. 다른 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2-20 ㎍/L, 2-10 ㎍/L, 3-8 ㎍/L, 또는 4-6 ㎍/L이다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 5 mM 초과의 암모늄 농도를 포함하는 배양 상청액은 rVWF 조성물을 생산하는데 사용되지 않는다. 어떤 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2.4 ㎍/L, 3 ㎍/L, 4 ㎍/L, 5 ㎍/L, 6 ㎍/L, 7 ㎍/L, 8 ㎍/L, 9 ㎍/L, 10 ㎍/L, 15 ㎍/L, 20 ㎍/L 이상, 또는 그 초과이다. 다른 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2-20 ㎍/L, 2-10 ㎍/L, 3-8 ㎍/L, 또는 4-6 ㎍/L이다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 4 mM 초과의 암모늄 농도를 포함하는 배양 상청액은 rVWF 조성물을 생산하는데 사용되지 않는다. 어떤 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2.4 ㎍/L, 3 ㎍/L, 4 ㎍/L, 5 ㎍/L, 6 ㎍/L, 7 ㎍/L, 8 ㎍/L, 9 ㎍/L, 10 ㎍/L, 15 ㎍/L, 20 ㎍/L 이상, 또는 그 초과이다. 다른 구현예들에서, 보충된 기저 배양 배지의 최종 구리 농도는 2-20 ㎍/L, 2-10 ㎍/L, 3-8 ㎍/L, 또는 4-6 ㎍/L이다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 50 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 70 mU/㎍ rVWF의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
재조합 vWF는 적합한 진핵 숙주 시스템에서의 발현에 의해 생산될 수 있다. 진핵 세포의 예는, 비제한적으로, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 및 HepG2와 같은 포유동물 세포; 곤충 세포, 예컨대, SF9 세포, SF21 세포, S2 세포, 및 하이 파이브 세포 (High Five cell); 및 효모 세포, 예컨대, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 또는 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 세포를 포함한다. 하나의 구체예에서, vWF는 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유동물 세포 등, 예를 들어, 인간 세포주, 햄스터 세포주, 또는 쥣과 세포주에서 발현될 수 있다. 하나의 어떤 구체예에서, 상기 세포주는 CHO, BHK, 또는 HEK 세포주이다. 통상적으로, 포유동물 세포, 예컨대, 연속 세포주로부터 얻은 CHO 세포가 본 발명의 vWF를 발현하는데 사용될 수 있다.
어떤 구체예에서, vWF를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열은 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 바이러스에 의해 전달될 수 있으며, 또는 플라스미드일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 특정 유전자 또는 이의 생물학적 기능성 부분일 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 단백질은 vWF의 적어도 생물학적으로 활성인 부분이다.
다양한 벡터가 vWF의 발현을 위해 사용될 수 있으며 이는 진핵 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예는: (i) 효모에서의 발현을 위해, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 이용한, pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위해, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 이용한, pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC와 같은 벡터, 및 (iii) 포유동물 세포에서의 발현을 위해, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 β-액틴과 같은 프로모터를 이용한, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터 및 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템으로부터 유래된 벡터를 포함한다. rVWF를 발현하기 위한 예시적인 벡터는, 모든 목적을 위해 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있는, 문헌 [Kaufman 등, (Mol Cell Biol. 1989 Mar;9 (3):1233-42)]에 의해 기술되어 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 상기 핵산 서열은 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 일반적으로 알려진, 프로모터 서열, 인핸서, TATA 박스, 전사 개시 부위, 폴리링커, 제한효소 부위, 폴리-A-서열, 단백질 가공 서열, 선별 마커 등과 같이 단백질의 제어된 발현에 적합한 기타 서열을 추가로 포함한다.
증가된 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 외에도, 본 발명의 세포 배양 조건은 배양 시스템에서의 전체 상류 공정 내내 약 25 mM 미만의 암모늄 농도를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 상기 세포 배양 조건은 약 25 mM 미만, 또 다른 구체예에서 약 20 mM 미만, 또 다른 구체예에서 약 15 mM 미만, 또 다른 구체예에서 약 10 mM 미만, 및 또 다른 구체예에서 약 5 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 암모늄 농도는 세포 배양 시스템의 전체 상류 공정 내내 일정하게 유지된다. 본 발명에 따라 사용되는 세포는, 예컨대, 기술 분야에 일반적으로 알려진 종래 회분식-배양 및 유가식 배양과 비교하여 변형된 방법에 의해 배양될 수 있다. 하지만, 이러한 종래 기술들은 배양 말기에 높은 농도의 암모늄을 생성할 수 있다. 본 발명의 방법은, 예컨대, 관류 또는 케모스탯 배양과 같은 기술을 통해 배양 배지의 연속적 공급을 제공할 수 있는 생산 시스템을 이용함으로써 이 문제를 극복한다. 숙주 세포를 배양한 후, vWF는 한외 여과 또는 원심분리와 같은 표준 방법을 이용하여 사용된 배지로부터 재생될 수 있다. 원하는 경우, vWF는, 예컨대, 이온 교환 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다.
연속 배양 (예컨대, 관류 또는 케모스탯 배양)은 신선한 배지의 유입에 의해 영양소가 연속적으로 공급되는 현탁 배양일 수 있으며, 여기에서 상기 배양 부피는 일반적으로 일정하다. 유사하게, 연속 발효는 생물반응기로부터 세포 현탁액을 제거함으로써 정확히 균형을 이루는, 신선한 배지의 연속 공급에 의해 배양에서 세포나 미생물이 대수 증식기로 유지되는 공정을 지칭할 수 있다. 나아가, 교반 탱크 반응기 시스템이 현탁, 관류, 케모스탯, 및/또는 미세 담체 배양에 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 교반 탱크 반응기 시스템은 러시턴 (Rushton), 하이드로호일 (hydrofoil), 피치드 블레이드 (pitched blade), 또는 선박 (marine)과 같은 임의의 유형의 교반기를 갖는 임의의 통상적인 교반 탱크 반응기로서 작동될 수 있다.
C. 재조합 ADAMTS13 (A13)를 생산하는 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 구리 농도가 증가된 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 조건 하에서 rA13를 생산하는 방법에 관한 것이다. 어떤 구체예에서, 상기 배양은 또한 낮은 암모늄 농도를 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리를 보충하여 1.0 ㎍/L 이상의 최종 구리 농도를 제공하는 단계; (c) rA13 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에 배양함으로써, rA13이 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 회수된 배양 상청액 내에, 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 1500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성 (즉, 세포 배양물 리터 당 하루 당 1500 유닛 FRETS-VWF73 활성; P FRETS)이 존재한다. 어떤 구체예에서, 상기 보충된 기본 배양 배지의 최종 구리 농도는 2 ㎍/L, 3 ㎍/L, 4 ㎍/L, 5 ㎍/L, 6 ㎍/L 이상, 또는 그 초과이다. 다른 구체예에서, 상기 보충된 기본 배양 배지의 최종 구리 농도는 1-6 ㎍/L, 2-5 ㎍/L, 2-4 ㎍/L, 또는 3-4 ㎍/L 사이이다. 바람직한 구체예에서, 하루당 상기 보충된 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 적어도 2000 유닛 FRETS-VWF73 활성이 상기 재생된 배양 상등액 내에 존재한다. 보다 바람직한 구체예에서, 하루당 상기 보충된 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 적어도 2500 유닛 FRETS-VWF73 활성이 상기 회수된 배양 상등액 내에 존재한다. 가장 바람직한 구체예에서, 하루당 상기 보충된 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 적어도 3000 유닛 FRETS-VWF73 활성이 상기 재생된 배양 상등액 내에 존재한다. 어떤 구체예에서, 상기 방법은 지속적으로 개선된 부피 FRETS-VWF73 생산성 (P FRETS)을 제공한다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 보충된 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 적어도 1500 유닛 FRETS-VWF73 활성이 적어도 7일 동안, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70일, 또는 그 이상 동안 매일 재생된다. 바람직한 구체예에서, 보충된 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 적어도 2000 유닛 FRETS-VWF73 활성이 적어도 7일간, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70일 이상 동안 매일 재생된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 보충된 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 적어도 2500 유닛 FRETS-VWF73 활성이 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70일 이상 동안 매일 재생된다. 가장 바람직한 구체예에서, 보충된 기저 세포 배양 배지 1 리터 당 적어도 3000 유닛 FRETS-VWF73 활성이 적어도 7일간, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70일 이상 동안 매일 재생된다. 어떤 구체예에서, rA13의 생산을 위한 연속 세포 배양의 세포 밀도는 연장된 기간 동안 4.0×106 세포/mL 이하의 농도로 유지된다. 다른 어떤 구체예에서, 상기 세포 밀도는 3.5×106 세포/mL, 3.0×106 세포/mL, 2.5×106 세포/mL, 2.0×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL 이하 또는 그 미만으로 유지된다. 하나의 구체예에서, 상기 세포 밀도는 3.0×106 세포/mL 내지 4.0×106 세포/mL로 유지된다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 4 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL 상청액 (FRETS)를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 6 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL 상청액을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 8 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL 상청액을 갖는다. 가장 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 적어도 10 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL 상청액을 갖는다. 어떤 구현예들에서, 본 방법은 유지가능하게 개선된 FRETS 생산을 제공한다. 예를 들면, 어떤 구현예들에서, 적어도 4 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동알 매일 회수된다. 바람직한 구현예에서, 적어도 6 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 회수된다. 더 바람직한 구현예에서, 적어도 8 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 회수된다. 가장 바람직한 구현예에서, 적어도 10 유닛 FRETS-VWF73 활성/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 회수된다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 800 mU의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포/일일로 생산된다 (즉, q FRETS). 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 1 U의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포/일일로 생산된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 1.2 U의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포/일일로 생산된다. 가장 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 1.4 U의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포/일일로 생산된다. 어떤 구현예들에서, 본 방법은 유지가능하게 개선된 세포 특이적 FRETS-VWF73 생산성 (q FRETS)을 제공한다. 예를 들면, 어떤 구현예들에서, 세포 배양으로 적어도 800 mU의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포가 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 1 U의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포가 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 1.2 U의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포가 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다. 가장 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 1.4 U의 FRETS-VWF73 활성/배양에 존재하는 106 세포가 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양으로 적어도 1 mg rA13/ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 리터 배양/일일 (P ELISA). 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 1.5 mg rA13/리터 배양/일일로 생산된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 2 mg rA13/리터 배양/일일로 생산된다. 어떤 구현예들에서, 본 방법은 유지가능하게 개선된 rA13 생산을 제공한다. 예를 들면, 어떤 구현예들에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 1 mg rA13/리터 배양이 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 1.5 mg rA13/리터 배양이 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 2 mg rA13/리터 배양이 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 0.5 ㎍ rA13/배양에서 존재하는 106 세포/일일로 생산된다 (즉, q ELISA). 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 0.7 ㎍ rA13/배양에서 존재하는 106 세포/일일로 생산된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 0.9 ㎍ rA13/배양에 존재하는 106 세포/일일로 생산된다. 어떤 구현예들에서, 본 방법은 유지가능하게 개선된 q ELISA 생산을 제공한다. 예를 들면, 어떤 구현예들에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 0.5 ㎍ rA13/배양에서 존재하는 106 세포가 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 0.7 ㎍ rA13/배양에서 존재하는 106 세포가 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다. 더 바람직한 구현예에서, 세포 배양으로 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 0.9 ㎍ rA13/배양에서 존재하는 106 세포가 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 생산된다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 회수된 상청액은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 3 ㎍ rA13/mL 상청액을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 4 ㎍ rA13/mL 상청액을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 5 ㎍ rA13/mL 상청액을 갖는다. 가장 바람직한 구현예에서, 회수된 상청액은 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 6 ㎍ rA13/mL 상청액을 갖는다. 어떤 구현예들에서, 본 방법은 유지가능하게 개선된 rA13 생산을 제공한다. 예를 들면, 어떤 구현예들에서, 적어도 3 ㎍ rA13/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 회수된다. 바람직한 구현예에서, 적어도 4 ㎍ rA13/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 회수된다. 더 바람직한 구현예에서, 적어도 5 ㎍ rA13/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 회수된다. 가장 바람직한 구현예에서, 적어도 6 ㎍ rA13/mL를 갖는 상청액은 적어도 7일, 또는 적어도 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 또는 그 초과 일 동안 매일 회수된다.
상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 세포 배양 용액은 추가로, 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 10 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 5 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 5 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 용액은 4 mM 이하의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 4 mM 이하의 암모늄 농도에서 적어도 7일 동안 유지된다. 또 다른 구현예들에서, 세포 배양 용액은 10 mM 이하, 또는 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM 이하, 또는 그 미만의 암모늄 농도를 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 세포 배양의 암모늄 농도는 저수준에서 과정의 기간 동안 유지된다 (즉, 전체 시간 동안 배양은 rA13를 생산하기 위해 사용된다). 특별한 구현예에서, 배양 용액은 표 1에서 제공된 바와 같이 변형 1 내지 440 중 어느 하나에 따른 구리 및 암모늄 농도를 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리 및 아연을 보충하는 단계; (c) rA13 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 이상의 세포를 상기 구리 보충된 세포 배양 배지에서 배양하고, 이로써 rA13는 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 적어도 1500 유닛 FRETS-VWF73 활성/리터 보충된 기저 세포 배양 배지/일일은 회수된 배양 상청액에서 존재한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 적어도 1 ㎍/L 구리 및 적어도 2 μM 아연을 함유한다. 다른 구현예들에서, 배지는 적어도 2 ㎍/L 구리 또는 적어도 4 ㎍/L 구리를 함유한다. 배지에 구리가 보충된 일 구현예에서, 배양 배지는 또한, 적어도 약 5 μM 아연 또는 대략을 함유한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 또한, 약 2 μM 내지 12 μM 아연 또는 대략을 함유한다. 또 하나의 구현예에서, 배양 배지는 또한, 약 5 μM 내지 12 μM 아연 또는 대략을 함유한다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 또한, 약 2 μM 또는 대략, 또는 적어도 약 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 11 μM, 12 μM, 13 μM, 14 μM, 15 μM, 20 μM, 25 μM, 30 μM, 또는 그 초과 아연 또는 대략을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 배양 배지는 표 2에서 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 적어도 2000 유닛 FRETS-VWF73 활성/리터 보충된 기저 세포 배양 배지/일일은 회수된 배양 상청액에서 존재한다. 더 바람직한 구현예에서, 적어도 2500 유닛 FRETS-VWF73 활성/리터 보충된 기저 세포 배양 배지/일일은 회수된 배양 상청액에서 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, 적어도 3000 유닛 FRETS-VWF73 활성/리터 보충된 기저 세포 배양 배지/일일은 회수된 배양 상청액에서 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리 및 칼슘을 보충하는 단계; (c) rA13 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 이상의 세포를 상기 구리 보충된 세포 배양 배지에서 배양하고, 이로써 rA13는 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 적어도 1500 유닛 FRETS-VWF73 활성/리터 보충된 기저 세포 배양 배지/일일은 회수된 배양 상청액에서 존재한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 적어도 1 ㎍/L 구리 및 적어도 0.5 mM 칼슘을 함유한다. 다른 구현예들에서, 배지는 적어도 2 ㎍/L 구리 또는 적어도 4 ㎍/L 구리를 함유한다. 배지에 구리가 보충된 또 하나의 구현예에서, 배양 배지는 또한, 적어도 1.5 mM 칼슘을 함유한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 약 0.5 mM 내지 1.5 mM 칼슘 또는 대략을 함유한다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 약 0.5 mM 또는 대략, 또는 적어도 약 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM, 또는 그 초과 칼슘 또는 대략을 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 배양 배지는 표 3에서 나타낸 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 3000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리, 아연, 및 칼슘을 보충하는 단계; (c) rA13 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rA13가 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 1500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 적어도 0.5 mM의 칼슘 농도 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 적어도 1.5 mM의 칼슘 농도 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 칼슘 농도 0.5 mM 내지 1.5 mM 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 적어도 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM, 2.5 mM, 2.75 mM, 3.0 mM, 3.5 mM, 4.0 mM, 4.5 mM, 5.0 mM, 또는 그 초과의 칼슘 농도, 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 3000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리 및 니코틴아마이드를 보충하는 단계; (c) rA13 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rA13이 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 1500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 적어도 1 ㎍/L 구리 및 적어도 2 mg/L 니코틴아마이드 (비타민 B3)를 함유한다. 다른 구현예들에서, 배지는 적어도 2 ㎍/L 구리 또는 적어도 4 ㎍/L 구리를 함유한다. 배지에 구리가 보충된 또 하나의 구현예에서, 배양 배지는 또한, 적어도 7 mg/L 니코틴아마이드 (비타민 B3) 를 함유한다. 일 구현예에서, 배양 배지는 약 2 mg/L 내지 10 mg/L 니코틴아마이드 (비타민 B3) 또는 대략을 함유한다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 적어도 약 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L, 9 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L 또는 대략, 또는 그 초과 농도의 니코틴아마이드 (비타민 B3)를 함유할 수 있다. 일 구현예에서, 배양 배지는 표 4에서 나타낸 변형 1321 내지 1760 중 어느 하나에 따른 구리 및 니코틴아마이드 농도를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 3000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리, 아연, 및 니코틴아마이드를 보충하는 단계; (c) rA13 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rA13이 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기서 적어도 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 1500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 일 구현예에서, 세포 배양 배지는 적어도 2 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 적어도 7 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 배지는 2 mg/mL 내지 10 mg/mL의 니코틴아마이드 농도 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 또 다른 구현예들에서, 배양 배지는 적어도 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 또는 그 초과의 니코틴아마이드 농도, 및 표 2에 나타낸 변형 441 내지 880 중 어느 하나에 따른 구리 및 아연 농도를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 3000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 재조합 ADAMTS13 (rA13) 조성물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) 상기 기저 세포 배양 배지를 구리, 칼슘, 및 니코틴아미드로 보충하는 단계; (c) rA13 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계; (d) 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 상기 1 이상의 세포를 배양함으로써, rA13이 발현되고 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계; 및 (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계, 여기에서 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 1500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 하나의 구체예에서, 상기 세포 배양 배지는 적어도 2 mg/mL의 니코틴아미드 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다. 또 다른 어떤 구체예에서, 상기 배양 배지는 적어도 7 mg/mL의 니코틴아미드 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다. 또 다른 어떤 구체예에서, 상기 배양 배지는 2 mg/mL 내지 10 mg/mL의 니코틴아미드 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 상기 배양 배지는 적어도 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 또는 그 이상의 니코틴아미드 농도 및 표 3에 기재된 변형 881 내지 1320 중 어느 하나에 따른 구리 및 칼슘 농도를 갖는다. 바람직한 구체예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 2500 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다. 가장 바람직한 구체예에서, 상기 회수된 배양 상청액 내에는 매일 보충된 기저 세포 배양 배지의 1 리터 당 3000 유닛 이상의 FRETS-VWF73 활성이 존재한다.
재조합 ADAMTS 단백질은 임의의 적합한 원핵 또는 진핵 숙주 시스템에서의 발현에 의해 생산될 수 있다. 진핵 세포의 예는, 비제한적으로, CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, 및 HepG2와 같은 포유동물 세포; 예를 들어 SF9 세포, SF21 세포, S2 세포, 및 하이 파이브 (High Five) 세포와 같은 곤충 세포; 및 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스 또는 쉬조사카로마이세스 세포를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 ADAMTS 단백질은 진균 세포, 효소 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 포유동물 세포 등, 예를 들어, 인간 세포주, 햄스터 세포주, 또는 쥣과 세포주에서 발현될 수 있다. 하나의 어떤 구체예에서, 상기 세포주는 CHO, BHK, 또는 HEK 세포주이다. 바람직한 구체예에서, 상기 세포주는 CHO 세포주이다. 어떤 구체예에서, rA13을 안정적으로 발현할 수 있는 CHO 클론은 CHO 세포를 rA13 및 디하이드로폴레이트 리덕타아제 (예컨대, 쥣과 dhfr 유전자)에 대한 코딩 서열로 공동-형질감염시키고 증가하는 수준의 메토트렉세이트의 존재 하에 성장에 대해 선별함으로써 제조된다.
하나의 구체예에서, 상기 세포는 ADAMTS13과 같은 목적하는 ADAMTS 단백질을 생산하기 위해, 바람직하게는 제조 공정 (즉, 적어도 10 리터, 바람직하게는 적어도 100 리터)에서, 배양될 수 있는 임의의 포유동물 세포일 수 있다. 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham 등, J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); DUKX-B11 서브클론과 같은 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Uriaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 마우스 세르토리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부암 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방종양 (MMT 060562, ATCC CCL51 ); TRI 세포 (Mather 등, Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암주 (Hep G2)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포주는 설치류 세포주, 특히 CHO 또는 BHK와 같은 햄스터 세포주이다.
ADAMTS 단백질 (예컨대, ADAMTS13)의 발현을 위해 다양한 벡터들이 사용될 수 있으며, 이들은 진핵 및 원핵 발현 벡터들로부터 선택될 수 있다. 어떤 구체예에서, ADAMTS 단백질 (예컨대, ADAMTS13)을 발현시키는데 사용하기 위해 플라스미드 벡터가 고려된다. 일반적으로, 숙주 세포와 양립가능한 종으로부터 유래한 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 사용된다. 상기 벡터는 복제 부위 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 마킹 (marking) 서열을 가질 수 있다. 상기 플라스미드는 하나 이상의 제어 서열, 예를 들어 프로모터에 작동가능하게 연결된 ADAMTS 단백질 (예컨대, ADAMTS13)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다.
재조합 ADAMTS 단백질을 발현하는 안정한 CHO 세포를 제조하는 바람직한 방법은 하기와 같다. DHFR 결핍 CHO 세포주 DUKX-B11이 관련된 재조합 단백질의 발현을 가능하게 하도록 DHFR 발현 벡터로 형질감염된다. 예시적인 방법이 모든 목적을 위해 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있는 문헌 [Plaimauer 등, Blood. 2002 Nov 15;100 (10):3626-32. Epub 2002 Jul 12]에 기술되어 있다. 선별은 하이포잔틴/티미딘 (HT)이 없는 배지에서의 성장에 의해 수행되고, 재조합 ADAMTS 단백질 및 DHFR 유전자의 발현을 위해 코딩하고 있는 관련 영역의 증폭은 증가하는 농도의 메토트렉세이트에서 세포의 증식에 의해 달성된다. 적절한 경우, CHO 세포주는, 특히 제US 6,100,061호 (Reiter 등, lmmuno Aktiengesellschaft)에 기술된 바와 같은, 무혈청 및/또는 무단백질 배지에서의 성장을 위해 개조될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 안정한 HEK293 세포는 하이그로마이신 선별 마커를 함유하는 컨스트럭트로 형질감염시키고 항생체 내성에 의해 형질전환체를 선별함으로써 제조된다.
세포를 감염시키고 수용체 매개 엔도시토시스 (endocytosis)를 통하여 세포로 들어가는 특정 바이러스의 능력, 및 숙주 세포 게놈 내로 통합하여 바이러스 유전자를 안정적이고 효과적으로 특정 바이러스의 능력으로 인해, 바이러스는 외래 핵산을 세포 (예컨대, 포유동물 세포) 내로 전달하기 위한 매력적인 후보자이다. 따라서, 어떤 구체예에서, 바이러스 벡터는 ADAMTS 단백질 (예컨대, ADAMTS13)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현용 숙주 세포 내로 도입하는데 사용된다. 상기 바이러스 벡터는 하나 이상의 제어 서열, 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 ADAMTS 단백질 (예컨대, ADAMTS13)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 대안적으로, 상기 바이러스 벡터는 제어 서열을 함유하지 않을 수 있으며, 그 대신 ADAMTS 단백질의 발현을 유도하는 숙주 세포 내의 제어 서열에 의존할 것이다. 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
하나의 구체예에서, 아데노바이러스 발현 벡터는 컨스트럭트의 패키징 (packaging)을 지지하고, 궁극적으로 그 안에 클로닝된 ADAMTS 컨스트럭트를 발현하는데 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 상기 컨스트럭트를 포함한다. 아데노바이러스 벡터는 최대 7 kb의 외래 서열의 도입을 가능하게 한다 (Grunhaus 등, Seminar in Virology, 200 (2):535-546, 1992)).
또 다른 구체예에서, 아데노-연관 바이러스 (AAV)가 ADAMTS 단백질 (예컨대, ADAMTS13)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현용 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. AAV 시스템은 종래에 기술되어 왔으며, 본 기술분야에 일반적으로 널리 알려져 있다 (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17 (6):1110-7, 1994; Cotten 등, Proc Natl Acad Sci USA, 89 (13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13 (2-3):141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). rAAV 벡터의 생성 및 사용과 관련된 세부 사항은, 예를 들어, 모든 목적을 위해 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있는 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기술되어 있다.
하나의 구체예에서, 레트로바이러스 발현 벡터가 ADAMTS 단백질 (예컨대, ADAMTS13)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현용 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 이들 시스템은 종래에 기술되어 왔으며, 본 기술분야에 일반적으로 널리 알려져 있다 (Mann 등, Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez 및 Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). 어떤 구체예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다 (예를 들어, Naldini 등, Science, 272 (5259):263-267, 1996; Zufferey 등, Nat Biotechnol, 15 (9):871-875, 1997; Blomer 등, J Virol ., 71 (9):6641-6649, 1997; 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호를 참조한다).
원핵 발현을 위한 벡터의 비제한적인 예는 pRSET, pET, pBAD 등과 같은 플라스미드를 포함하며, 상기 원핵 발현 벡터에 사용되는 프로모터들은 lac, trc, trp, recA, araBAD 등을 포함한다. 진핵 발현을 위한 벡터의 예는 (i) 효모에서의 발현을 위해, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 이용한, pAO, pPIC, pYES, pMET과 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서의 발현을 위해, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 이용한, pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC 등과 같은 벡터, 및 (iii) 포유동물 세포에서의 발현을 위해, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, 및 β-액틴과 같은 프로모터를 이용한, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터, 및 백시나 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스 등과 같은 바이러스 시스템으로부터 유래된 벡터를 포함한다. rA13을 발현하기 위한 예시적인 벡터는, 모든 목적을 위해 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있는, 문헌 [Plaimauer 등, (Blood. 2002 Nov 15;100 (10):3626-32. Epub 2002 Jul 12)]에 기술되어 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 세포-배양 방법은 미세 담체의 사용을 포함한다. 본 발명은, 다른 측면 중에서도, 대규모 ADAMTS 단백질 발현의 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 구체예의 세포-배양은 높은 세포 밀도 및 단백질 발현을 달성하기 위해, 높은 부피-특이적 배양 표면적을 제공하는데 적합한 조건 하에서 큰 생물반응기 내에서 수행될 수 있다. 이러한 성장 조건을 제공하기 위한 하나의 수단은 교반 탱크 생물 반응기에서 세포-배양을 위한 미세 담체를 사용하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 이들 성장 요건은 현탁 세포 배양의 사용을 통해 충족된다.
V. 특정 구체예
A. 재조합 폰 빌레브란트 인자 ( rVWF )
재조합 vWF는 포유동물 세포에서 발현될 수 있지만, vWF의 비활성은 세포 배양 조건에 따라 광범위하게 달라질 수 있으며 혈장으로부터 분리된 vWF와 대등하거나 동일하지 않은 것으로 나타났다. 본 발명은 적어도 2.4 ㎍/L의 구리를 갖는 세포 배양 배지가 높은 비활성을 갖는 고분자량 vWF의 발현을 촉진하는 유리한 효과를 제공한다는 놀라운 결과에 일부 기반한다. 특히, 본 발명의 고분자량의 재조합 vWF는 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특정 리스토세틴 활성을 포함하는 고도의 멀티머 형태를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포 배양 공정은 또한 세포 배양에서 상류 공정 동안에 낮은 NH4 + 수준 (예컨대, 10 mM 미만)을 유지하는 것을 가능하게 하며, 이로써 번역후 수식에 대해 해로운 효과를 감소시킨다. 본 발명은 높은 비활성을 갖는 고도의 멀티머성 vWF를 발현하기 위해 상등액 내에 적합한 수준의 암모늄과 조합된 적합한 구리 농도를 갖는 배지를 포함하는 세포 배양 조건을 최초로 제공한다고 여겨진다.
하나의 측면에서, 본 발명은 높은 비활성을 갖는 재조합, 고분자량 vWF를 생산하기 위한 세포 배양 조건에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 조건은, 예를 들어, 구리 농도가 증가된 세포 배양 배지 및/또는 낮은 암모늄 (NH4 +) 농도를 갖는 세포 배양 상등액을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 높은 비활성을 갖는 고분자량 vWF를 발현하는 세포 배양 조건에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 고분자량의 재조합 vWF 단백질을 생산하기 위한 세포 배양액을 제공하며, 상기 세포 배양액은 적어도 약 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지; 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함하는 세포 배양 상등액; 및 고도의 멀티머성 vWF 단백질을 발현하는 다수의 세포를 포함하고, 여기에서 상기 vWF 단백질은 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함한다.
상기에 기재된 세포 배양물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 세포 배양 용액은 구리를 포함하는 배지 보충물을 포함한다.
상기에 기재된 세포 배양물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 배지 보충물은 가수분해물, 임의로 콩 가수분해물을 포함한다.
상기에 기재된 세포 배양물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 배지 보충물은 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합을 포함한다.
상기에 기재된 세포 배양물의 하나의 구체적인 구현예에서, 구리 염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 및 구리 옥사이드로 이루어진 군에서 선택된다.
상기에 기재된 세포 배양물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 구리 농도는 적어도 약 4 ㎍/L이다.
상기에 기재된 세포 배양물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 구리 농도는 약 2.4 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L이다.
상기에 기재된 세포 배양물의 하나의 구체적인 구현예에서, vWF 단백질은 약 14 내지 약 22 다이머를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 고분자량의, 재조합 vWF 단백질을 생산하는 방법을 제공한다: a) 재조합 vWF 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 배양을 제공하는 단계; b) 적어도 약 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 및 약 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함하는 세포 배양 상청액을 포함하는 세포 배양 조건 하에서 세포에서의 vWF 단백질을 발현시키는 단계, 상기 vWF 단백질은 고 멀티머 vWF 단백질이고, 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함한다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 세포는 포유류 세포이다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 세포는 연속 세포주로부터 유래한다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 세포는 CHO 세포이다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 구리 농도는 적어도 약 4 ㎍/L이다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 구리 농도는 약 2.4 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L이다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 재조합 vWF 단백질은 적어도 약 50 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 재조합 vWF 단백질은 약 30 mU/㎍ 내지 약 100 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
전술한 방법 중 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 재조합 vWF 단백질은 약 14 내지 약 22 다이머를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된 고분자량의, 재조합 vWF 단백질을 제공한다: a) 재조합 vWF 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 배양을 제공하는 단계; 및 b) 적어도 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 및 암모늄 농도 10 mM 미만을 포함하는 세포 배양 상청액을 포함하는 세포 배양 조건 하에서 세포에서의 vWF 단백질을 발현시키는 단계, 상기 vWF 단백질은 고 멀티머 vWF 단백질이고 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함한다.
상기에 기재된 rVWF 조성물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 재조합 vWF 단백질은 적어도 약 50 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 rVWF 조성물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 재조합 vWF 단백질은 약 30 mU/㎍ 내지 약 100 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 rVWF 조성물의 하나의 구체적인 구현예에서, 상기 재조합 vWF 단백질은 약 14 내지 약 22 다이머를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 고분자량의, 재조합 vWF 단백질을 생산하기 위한 세포 배양 용액을 제공하고, 이 세포 배양 용액은, 적어도 약 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지; 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함하는 세포 배양 상청액; 및 고 멀티머 vWF 단백질을 발현시키는 복수의 세포를 포함하고, 상기 vWF 단백질은 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 높은 특이적 활성을 갖는 고 멀티머 형태인 재조합 고분자량 vWF을 생산하기 위한 세포 배양 조건에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 조건은, 예를 들면, 증가된 구리 농도를 갖는 세포 배양 배지 및 낮은 암모늄 (NH4 +) 농도를 갖는 세포 배양 상청액을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 높은 특이적 활성을 갖는 고분자량 vWF를 발현시키기 위해 세포 배양 조건에서 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 고분자량의, 재조합 vWF를 생산하는 세포 배양 용액을 포함하고, 이 용액은, 적어도 약 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지; 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함하는 세포 배양 상청액; 및 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함하는 고 멀티머 vWF를 발현시키는 복수의 세포를 포함한다. 상기에 기재된 세포 배양 용액의 일 구현예에서, rVWF의 적어도 10%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 15%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 20%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 25%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 30%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 어떤 구현예들에서, 구리 농도는 적어도 약 4 ㎍/L일 수 있거나 구리 농도는 약 2.4 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L 범위일 수 있다. 일부 구현예들에서, 세포 배양 배지는 구리를 포함하는 배지 보충물을 포함한다. 어떤 구현예들에서, 배지 보충물은 가수분해물 또는 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 구리 염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 또는 구리 옥사이드를 포함할 수 있다. 어떤 구현예들에서, 연속 세포주로부터 유래될 수 있는 세포는 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 재조합 vWF는 적어도 약 50 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 가지거나, 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성은 약 30 mU/㎍ 내지 약 100 mU/㎍ 범위일 수 있다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 고분자량의, 재조합 vWF를 생산하는 방법을 포함한다: a) 세포의 배양을 제공하는 단계; b) vWF에 대한 핵산 서열 코딩을 도입하는 단계; c) 핵산 서열을 보유한 세포를 선택하는 단계; 및, d) 적어도 약 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 및 약 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함하는 세포 배양 상청액을 포함하는 세포 배양 조건 하에서 세포에서의 vWF를 발현시키는 단계, 상기 vWF는 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함하는 고 멀티머 vWF이다. 상기에 기재된 세포 배양 상청액의 일 구현예에서, rVWF의 적어도 10%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 15%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 20%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 25%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 30%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 일부 구현예들에서, 연속 세포주로부터 유래될 수 있는 세포는 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포를 포함할 수 있다. 어떤 구현예들에서, 구리 농도는 적어도 약 4 ㎍/L일 수 있거나, 구리 농도는 약 2.4 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L 범위일 수 있다. 일부 구현예들에서, 세포 배양 배지는 구리를 포함하는 배지 보충물을 포함한다. 어떤 구현예들에서, 배지 보충물은 가수분해물 또는 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 구리 염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 또는 구리 옥사이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 재조합 vWF는 적어도 약 50 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 가지거나, 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성은 약 30 mU/㎍ 내지 약 100 mU/㎍ 범위일 수 있다.
또 하나의 측면에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 공정에 의해 생산된 고분자량의, 재조합 vWF를 포함한다: a) 세포의 배양을 제공하는 단계; b) vWF에 대한 핵산 서열 코딩을 도입하는 단계; c) 핵산 서열을 보유한 세포를 선택하는 단계; 및, d) 적어도 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 및 암모늄 농도 10 mM 미만을 포함하는 세포 배양 상청액을 포함하는 세포 배양 조건 하에서 세포에서의 vWF를 발현시키는 단계, 상기 vWF는 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함하는 고 멀티머 vWF이다. 상기에 기재된 세포 배양 상청액의 일 구현예에서, rVWF의 적어도 10%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 15%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 20%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 25%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 30%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 일부 구현예들에서, 연속 세포주로부터 유래할 수 있는 세포는 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포를 포함할 수 있다. 어떤 구현예들에서, 구리 농도는 적어도 약 4 ㎍/L일 수 있거나 구리 농도는 약 2.4 ㎍/L 내지 약 20 ㎍/L 범위일 수 있다. 일부 구현예들에서, 세포 배양 배지는 구리를 포함하는 배지 보충물을 포함한다. 어떤 구현예들에서, 배지 보충물은 가수분해물 또는 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 구리 염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 또는 구리 옥사이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 재조합 vWF는 적어도 약 50 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 가지거나, 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성은 약 30 mU/㎍ 내지 약 100 mU/㎍ 범위일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 적어도 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 40 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 50 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 60 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 70 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다. 또한 더 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 80 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 조성물 중 rVWF의 적어도 10%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 15%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 20%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 25%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, rVWF의 적어도 30%는 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머에서 존재한다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 조성물은 배양 상청액을 포함한다. 하나의 구체적인 구현예에서, 배양 상청액은 포유류 세포 배양 상청액이다. 더 구체적인 구현예에서, 포유류 세포 배양 상청액은 CHO 세포 상청액이다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, rVWF는 적어도 2.4 ㎍/L 구리를 포함하는 세포 배양에서 발현된다. 구체적인 구현예에서, 세포 배양은 적어도 4 ㎍/L 구리를 포함한다. 더 구체적인 구현예에서, 배양은 2.4 ㎍/L 내지 20 ㎍/L 구리를 포함한다. 일 구현예에서, 구리는 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합으로서 제공된다. 구체적인 구현예에서, 구리 염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 및 구리 옥사이드로 이루어진 군에서 선택된다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 세포 배양은 회분 배양이다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 세포 배양은 연속 배양이다. 구체적인 구현예에서, 연속 배양은 케모스태틱 방식으로 수행된다. 또 하나의 구체적인 구현예에서, 연속 배양은 관류 방식으로 수행된다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 배양 중 NH4+의 수준은 4 mM 미만의 농도로 유지된다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 배양물의 세포 밀도는 2.5×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 배양물의 세포 밀도는 2.0×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
상기에 기재된 조성물의 일 구현예에서, 배양은 1.5×106 세포/mL 미만으로 유지된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, rVWF는 재조합 인자 Ⅷ (rFⅧ)와 함께 공동 발현된다. 어떤 구체예에서, 상기 공동 발현된 rFⅧ의 대다수는 제거되었다. 보다 어떤 구체예에서, 조성물 내의 rVWF 대 rFⅧ의 비율은 적어도 10:1이다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 조성물은 약제학적 투여를 위해 제형화된다. 어떤 구체예에서, 상기 조성물은 정맥 내, 피하, 또는 근육 내 투여를 위해 제형화된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 조성물은 동결건조된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 공정에 의해 생산된 고분자량의 재조합 vWF를 포함한다: a) 세포의 배양물을 제공하는 단계; b) vWF를 코딩하는 핵산 서열을 도입하는 단계; c) 상기 핵산 서열을 갖는 세포를 선별하는 단계; 및, d) 적어도 2.4 ㎍/L의 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지 및 10 mM 미만의 암모늄 농도를 포함하는 세포 배양 상등액을 포함하는 세포 배양 조건 하에서 상기 세포 내에서 vWF를 발현시키는 단계, 여기에서 상기 vWF는 약 14 내지 약 22 다이머 및 적어도 약 30 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 활성을 포함한다. 전술한 "세포 배양 배지" 및 "재조합 vWF를 생산하는 방법"에 기술된 모든 구체예 및 농도들은 본원에 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 재조합 vWF는 높은 비활성을 갖는 고분자량 재조합 vWF 단백질을 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 vWF는 vWF의 고도의 멀티머성 형태이다. 일부 구체예에서, 상기 vWF의 고도의 멀티머성 형태는 적어도 최대 약 14 다이머를 포함하며 다른 구체예에서는 적어도 최대 약 22 다이머를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 vWF의 고도의 멀티머성 형태는 약 10 내지 약 20 다이머, 또는 약 15 내지 약 25 다이머, 또는 약 20 내지 약 40 다이머의 범위일 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 재조합 vWF는 혈장 vWF와 대등하다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 세포 배양 배지에서의 증가된 구리 농도가 높은 비활성을 갖는 고분자량 vWF를 생산할 수 있다는 놀라운 결과를 제공한다. 구리 농도, 예컨대, 약 2.4 ㎍/L를 초과하는 구리 농도를 포함하는 세포 배양 배지는 구리가 없는 배지와 비교하여 재조합 멀티머성 vWF의 수율을 증가시킬 수 있다. 어떤 구체예에서, 멀티머성 vWF (즉, 적어도 2개의 다이머를 포함하는 rVWF)의 백분율은 약 50%보다 크거나, 약 75%보다 크거나, 약 90%보다 클 수 있다. 상기 vWF의 멀티머성 분포는, 예컨대, 비환원 조건 하에서 아가로스 전기 영동에서와 같은 표준 기술을 이용하여 분석될 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 vWF는 높은 비활성, 예컨대 높은 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 가질 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 vWF는 적어도 30 mU/㎍ 및 또 다른 구체예에서 적어도 50 mU/㎍의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성은 약 30 mU/㎍ 내지 약 100 mU/㎍ 또는 약 50 mU/㎍ 내지 약 100 mU/㎍의 범위일 수 있다.
B. 재조합 ADAMTS13 ( rA13 )
ADAMTS 단백질 (즉, ADAMTS-1 내지 ADAMTS-20)은 공통된 모듈식 도메인 조직을 공유하는 분비된 아연 메탈로프로티나아제의 패밀리이다 (검토를 위해, 문헌 [Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan 1;11:544-69]을 참조한다). 모든 ADAMTS 단백질은 신호 펩타이드 다음으로 전구도메인, 아연-의존성 메탈로프로티나아제 촉매 도메인, 디스인테그린-유사 도메인, 트롬보스폰딘 유형 I 반복, 시스테인-풍부 도메인, 및 스페이서 도메인으로 구성된, 공통된 코어 도메인 구성을 공유한다 (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13;284 (46):31493-7). 또한, ADAMTS-4 외에 모두는 적어도 하나 이상의 트롬보스폰딘 유형 I 반복 도메인을 함유하며, 많은 ADAMTS 단백질은 하나 이상의 부가적인 보조 도메인을 함유한다. 특히, 모든 ADAMTS 단백질은 메탈로프로티나아제 촉매 도메인 사이에 위치한 적어도 하나의 칼슘 결합 부위 및 적어도 하나의 아연 결합 부위를 함유하는 것으로 보인다고 보고되었다 (Andreini 등, J. Proteome Res., 2005, 4 (3), pp 881-888).
ADAMTS 단백질의 생물학적 역할이 항혈관형성 (Antiangiogenesis), 신장 간세포 섬유증 (Renal interstitial fibrosis), 골 재형성 (Bone remodeling), 난소의 난포 발생 (Ovarian folliculogenesis), 아테롬성 동맥경화증, 비뇨생식기 발달 (Urogenital development), 및 종양 성장/재형성 (ADAMTS-1); 엘러-단로스 증후군 (Ehler-Danlos syndrome) 유형 7C 및 소 피부파열증 (dermatospraxis) (ADAMTS-2); 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 및 건병증 (Tendinopathy) (ADAMTS-4); 관절염 및 교아종 (Glioblastoma) (ADAMTS-5); 관절염 (ADAMTS-7); 항혈관형성, 뇌 악성 종양, 관절염, 및 아테롬성 동맥경화증 (ADAMTS-8); 관절염 (ADAMTS-9, -12); 혈전성 혈소판감소성 자색반증 (thrombotic thrombocytopenic purpura) (ADAMTS-13); 및 항혈전/뇌졸중 (ADAMTS18) (검토를 위해, 문헌 [Lin and Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131]을 참조한다)을 포함하는, 다양한 질병 및 질환에 대해 보고되었다.
재조합 ADAMTS13 (A13)은 이전에 포유동물 세포에서 발현되었지만, 비활성은 세포 배양 조건에 따라 광범위하게 달라진다. 많은 상업적으로 이용 가능한 배양 배지는, ELISA에 의해 결정된 항원 함량에 대한 FRETS-VWF73 분석에 의해 측정된 활성의 비율로서 표현되는, 높은 비활성을 갖는 rA13의 발현에 충분치 않다. 하나의 측면에서, 본원에 제공된 방법은 증가된 수준의 총 활성 및 비활성을 갖는 rA13의 세포-배양 발현을 가능하게 하는 몇 가지 유리한 발견에 기초한다.
따라서, 분비된 메탈로프로티나아제의 ADAMTS 패밀리 사이의 공유된 구조-기능 관련성으로 인해, 본 발명에 의해 제공된 방법은 세포 배양에서의 모든 ADAMTS 단백질의 발현 및 세포 배지로부터의 회수를 가능하게 한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 적어도 1600 mU/㎍의 특이적 FRETS-VWF 활성을 갖는 재조합 ADAMTS13 (rA13)을 포함하는 조성물을 제공한다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, rA13은 적어도 800 mU/㎍의 특이적 FRETS-VWF 활성을 갖는다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 조성물은 배양 상등액을 포함한다. 어떤 구체예에서, 상기 배양 상등액은 포유동물 세포 배양 상등액이다. 보다 어떤 구체예에서, 상기 포유동물 세포 배양 상등액은 CHO 세포 상등액이다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, rA13은 적어도 1 ㎍/L의 구리를 포함하는 세포 배양물에서 발현된다. 어떤 구체예에서, 상기 세포 배양물은 적어도 2 ㎍/L의 구리를 포함한다. 보다 어떤 구체예에서, 상기 배양물은 2 ㎍/L 내지 20 ㎍/L 구리를 포함한다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 구리는 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이의 조합으로서 제공된다. 어떤 구체예에서, 상기 구리염은 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 및 구리 옥사이드로 이루어진 군에서 선택된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 세포 배양은 회분 배양이다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 세포 배양은 연속 배양이다. 어떤 구체예에서, 상기 연속 배양은 케모스탯 방식으로 수행된다. 또 다른 구체예에서, 상기 연속 배양은 관류 방식으로 수행된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 배양물 내의 NH4+의 수준은 5 mM 미만의 농도로 유지된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 배양물 내의 NH4+의 수준은 4 mM 미만의 농도로 유지된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 배양물의 세포 밀도는 mL 당 4.0×106 세포 미만으로 유지된다. 어떤 구체예에서, 상기 배양물의 세포 밀도는 mL 당 3.0×106 세포 미만으로 유지된다. 어떤 구체예에서, 상기 배양물의 세포 밀도는 mL 당 2.0×106 세포 미만으로 유지된다. 보다 어떤 구체예에서, 상기 배양물의 세포 밀도는 mL 당 1.5×106 세포 미만으로 유지된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 조성물은 약제학적 투여를 위해 제형화된다. 어떤 구체예에서, 상기 조성물은 정맥내, 피하, 또는 근육내 투여를 위해 제형화된다.
전술한 조성물의 하나의 구체예에서, 상기 조성물은 동결건조된다.
VI. 제형
하나의 측면에서, 본 발명의 재조합 치료 단백질 rVWF 또는 rA13을 포함하는 제형은 투여에 앞서 동결건조된다. 동결건조는 본 기술분야에 일반적인 기술을 이용하여 수행되며 개발될 조성물을 위해 최적화되어야 한다 [Tang 등, Pharm Res. 21:191-200, (2004) and Chang 등, Pharm Res. 13:243-9 (1996)].
약제학적 제형을 제조하는 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 동결건조하기 이전에 상기 혼합물에 본원에 기술된 안정화제를 첨가하는 단계, 동결건조 이전에 상기 혼합물에 본원에 기술된 증량제, 삼투압 조절제, 및 계면활성제로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 첨가하는 단계. 동결건조된 제형은, 하나의 측면에서, 완충제, 증량제, 및 안정화제 중 하나 이상으로 적어도 구성된다. 이 측면에서, 동결 단계 동안 또는 재구축 동안 응집이 문제가 되는 경우, 계면활성제의 유용성이 평가되고 선별된다. 동결건조 동안 상기 제형을 안정한 pH 영역 내에 유지하기 위해 적절한 완충제가 포함된다.
동결된 물질에 대한 표준 재구축 실행은, 항생제의 희석액이 비경구 투여를 위한 약제의 생산에 종종 사용됨에도 불구하고, 다량의 주입용 순수한 물 또는 멸균수 (WFI) (통상적으로 동결건조 동안에 제거된 부피와 동량임)을 다시 첨가하는 것이다 [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. 따라서, 본 발명의 동결건조된 재조합 VWF 조성물에 희석제를 투여하는 단계를 포함하는 재구축된 재조합 VWF 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
상기 동결건조된 물질은 수용액으로서 재구축될 수 있다. 다양한 수성 담체, 예컨대, 주사용 멸균수, 다회 복용 용도를 위한 보존제를 갖는 물, 또는 적절한 양의 계면활성제를 갖는 물 (예를 들어, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 함께 혼합된 활성 화합물을 함유하는 수성 현탁액)이 사용될 수 있다. 다양한 측면에서, 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 나트륨 카르복실메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아이며; 분산제 또는 습윤제는 자연적으로 발생하는 포스파티드, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 중합 산물, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올과의 중합 산물, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 헵타데카에틸-엔옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산으로부터 유래된 부분적인 에스테르와의 중합 산물 및 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레에이트와 같은 헥시톨, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산으로부터 유래된 부분적인 에스테르와의 중합 산물 및 헥시톨 무수물, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 다양한 측면에서, 상기 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시 벤조에이트를 함유한다.
조성물을 인간이나 시험 동물에서 투여하기 위해, 하나의 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 문구 "약제학적으로" 또는 "약리학적으로" 허용 가능한은 안정하며, 응집 및 분해 산물과 같은 단백질 분해를 억제하고, 또한 전술한 바와 같이, 본 기술분야에 널리 알려진 경로를 이용하여 투여될 때 알레르기, 또는 기타 역 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는, 상기 개시된 제제를 포함하는 임의의 그리고 모든 임상학적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항생제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
상기 약제학적 제형은 정맥 내로, 경구로, 국소로, 경피로, 비경구로, 흡입 분무에 의해, 질로, 직장으로, 또는 두개 내 주사에 의해 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 비경구는 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 대조 내 (intracisternal) 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥 내, 피 내, 근육 내, 유방 내, 복강 내, 척추강 내, 안구 뒤쪽, 폐 내 주사 및/또는 특정 부위에서의 수술적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로 조성물은 발열물질 (pyrogen) 뿐만 아니라, 수용자에게 해로울 수 있는 기타 불순물이 본질적으로 존재하지 않는다.
조성물의 단회 또는 다회 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴을 이용하여 수행된다. 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 약물이 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 종래 치료요법, 환자의 임상학적 병력 및 약물에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 좌우된다.
하나의 측면에서, 본 발명의 제형은 초기 볼루스 (bolus) 이후 약물 제품의 치료적 순환 수준을 유지하는 연속 주입에 의해 투여된다. 또 다른 예로서, 본 발명의 화합물은 일회 용량으로서 투여된다. 본 기술분야의 숙련자들은 우수한 의학적 실행 및 개별적인 환자의 임상학적 상태에 의해 결정된 바와 같이 유효 투여량 및 투여 계획을 손쉽게 최적화할 것이다. 투여 빈도는 제제의 약동학적 파라미터 및 투여 경로에 좌우된다. 최적 약제학적 제형은 투여 경로 및 목적하는 투여량에 따라 본 기술분야의 숙련자에 의해 결정된다. 예를 들어, 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pages 1435-1712]를 참조한다. 이러한 제형은 신체 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 투여된 제제의 생체 내 제거 속도에 영향을 미친다. 투여 경로에 따라, 적합한 용량은 체중, 체표면적 또는 장기 크기에 따라 계산된다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 투여량을 결정하기 위한 확립된 분석을 사용함으로써 확인될 수 있다. 최종 투여량 계획은 약물의 작용을 변형시키는 여러 가지 인자, 예컨대 약물의 비활성, 환자의 손상의 중증도 및 반응성, 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 기타 임상학적 인자를 고려하여, 주치의에 의해 결정된다. 예로써, 본 발명의 재조합 vWF의 통상적인 용량은 대략 50 U/kg로서 500 ㎍/kg이다. 연구가 수행됨에 따라, 다양한 질병 및 상태에 대한 적절한 투여량 수준 및 치료 지속시간과 관련된 추가 정보가 알려질 것이다.
Ⅶ. 치료 방법
본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 따라 생산된 rVWF 또는 rA13을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법을 고려한다. 이러한 치료 방법은 본 발명의 재조합 rA13 또는 고분자량의 재조합 vWF를 포함하는 약제학적 제형의 투여를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 rVWF 또는 rA13 조성물의 투여를 포함하는 치료적 또는 예방적 치료 방법을 제공한다. 일반적으로, 치료적 응용을 위해, 제형은 "치료적 유효량"으로, ADAMTS13 또는 VWF 기능 장애와 관련된 질병 또는 질환을 갖는 환자 또는 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 이러한 사용에 효과적인 제형 및 함량은 질병 또는 질환의 중증도 및 환자의 건강의 일반적인 상태에 따라 달라질 것이다. 제형의 단회 또는 다회 투여는 환자에 의해 요구되고 허용되는 투여량 및 빈도에 좌우되어 투여될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 ADAMTS13 또는 VWF 기능장애와 관련된 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 추가의 구체예에서, 재조합 vWF를 포함하는 약제학적 제형은 폰 빌레브란트병 또는 혈우병과 같은, vWF와 관련된 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 제공된 rA13 조성물의 투여를 포함하는, 하나 이상의 혈전의 형성 및/또는 존재와 관련된 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에게서 하나 이상의 혈전을 분해하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에게서 경색을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공된 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 본원에 제공된 바와 같은 rADAMTS13 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
하나 이상의 혈전의 형성 및/또는 존재와 관련된 장애의 비제한적인 예는 유전성 혈전성 혈소판감소성 자색반증 (TTP), 후천성 TTP, 동맥혈전, 급성 심근경색 (AMI), 뇌졸중, 패혈증, 및 파종성 혈관내응고 (DIC)이다.
경색과 관련된 장애의 비제한적인 예는, 비제한적으로, 심근경색 (심장병), 폐색전, 뇌졸중과 같은 뇌혈관 사건, 말초 동맥 폐쇄성 질환 (예컨대, 괴저), 항인지질 증후군, ?혈증, 거대-세포 동맥염, 헤르니아, 및 장염전 (volvulus)을 포함한다.
Ⅷ. 실시예
본 발명은 하기 실시예에서 더 예시될 것이나, 이에 제한되지 않는다.
실시예 1
vWF를 발현하는 재조합 CHO 세포주의 배양을 이용하여 연속 세포 배양 실험을 수행하였다. 기본 배지는 약 0.3 ㎍/L의 Cu2 +를 함유하는 DMEM/F12였다. 상기 배지를 대두 가수분해물 및 황산구리 (CuSO4·5H2O)로 보충하여 배지 내 최종 구리 농도가 적어도 2.4 ㎍/L를 초과하도록 하였다.
vWF를 발현하는 재조합 CHO 세포를 암모늄 수준 (NH4 +)이 약 10 mM 미만의 농도로 유지되도록 연속 세포 배양에 의해 배양하였다. 종래 회분 또는 유가 기술이 배양 말기에 높은 NH4 + 농도를 생성하였기 때문에, 배지의 연속 공급을 제공하는 생산 시스템 (예컨대, 관류 또는 케모스탯 배양)이 바람직한 것으로 확인되었다. 배양 말기에, 고도의 멀티머성 vWF를 분리하였고, vWF의 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 측정하였다.
실시예 2
재조합 인자 Ⅷ (rFVIII) 및 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 GD8/6 세포의 회분 배양에서 공동발현시켜 VWF 발현 및 활성에 대한 배양 배지의 조성물의 영향을 결정하였다. 요약하면, GD8/6 세포를 변형된 DMEM/F12 기본 분말 (표 5) 및 부가적인 구리 보충물을 갖는 그리고 갖지 않는, 또한 4 g/L의 대두 가수분해물을 함유하는 부가적인 보충물 (표 6 참조)로 구성된 BAV-SP 배지에서 회분 배양하였다. rVWF 발현 및 활성에 대한 낮은 구리 농도의 영향을 시험하기 위하여, 기본 BAV-SP 배지를 사용하였다. 상기 기본 배지는 0.3 ㎍/L 구리를 함유하였고 대두 가수분해물로 보충되었으며, 상기 대두 가수분해물은 실험적으로 정의된 바와 같이 부가적인 0.7 ㎍/L의 구리에 기여하여, 1.0 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공하였다. 비교로서, VWF 발현 및 활성에 대한 높은 구리 농도의 효과를 결정하기 위해, 회분 배양을 위해 사용된 BAV-SP 배지를 부가적인 3.3 ㎍/L의 Cu2 +로 보충하여, 4.3 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공하였다.
하기 표 5는 BAV-SP 배양 배지의 조성을 나타낸 것이다.
BAV-SP-배지
성분 mg/L
아미노산
L-알라닌 4.45
L-아르기닌 HCl 147.50
L-아스파라긴-H2O 30.21
L-아스파트산 6.65
L-시스테인 HCl-H2O 32.55
L-시스틴 2HCl 57.35
L-글루탐산 7.35
글리신 18.75
L-히스티딘-H2O HCl 31.48
하이드록시-L-프롤린
L-이소류신 54.47
L-류신 59.05
L-라이신 HCl 91.25
L-메티오닌 17.24
L-페닐알라닌 35.48
L-프롤린 52.24
L-세린 26.25
L-트레오닌 53.45
L-트립토판 29.01
L-타이로신 2Na 2H2O 55.79
L-발린 52.85
비타민
아스코브산 3.499
바이오틴 0.0035
콜린 클로라이드 8.980
D-Ca-판토테네이트 2.240
엽산 2.650
I-이노시톨 12.600
니코틴아미드 2.020
피리독신 HCl 2.031
리보플라빈 0.219
티아민 HCl 2.170
비타민 B12 0.680
무기염
염화칼슘 (CaCl2) 116.600
황산구리 (CuSO4-5H2O) 0.0013
질산제이철 (Fe(NO3)3-9H2O) 0.050
황산제일철 (FeSO4-7H2O) 0.417
염화마그네슘 (MgCl2) 28.640
황산마그네슘 (MgSO4) 48.840
염화칼륨 (KCl) 311.800
염화나트륨 (NaCl) 6995.500
인산나트륨 (Na2HPO4) 71.020
인산나트륨 (NaH2PO4) 62.500
황산아연 7 수화물 (ZnSO4-7H2O) 0.432
아세렌산 나트륨 0.0131
기타
D-글루코스 3151
리놀레산 0.042
리포산 0.105
푸트레신 2HCl 0.081
티미딘 0.365
하이포잔틴 Na 2.390
피르브산 나트륨 55.000
하기 표 6은 BAV-SP 보충물의 조성을 나타낸 것이다.
최종 제형에 대한 성분 　
L-글루타민 600.00
에탄올아민 1.530
신페로닉 (Synperonic) F68 250.000
중탄산나트륨 (NaHCO3) 2000.000
대두 펩톤 4000.00
　 　
총 제형 18596.8
rVWF를 발현하는 GD8/6 세포를 낮은 구리 배지 (표 7) 또는 높은 구리 배지 (표 8)에서 7일간 배양시켰다. 2일 후, 상기 배양물을 계대 배양하여 5일간 회분 배양을 수행하였다. 배양 상등액 시료를 리스토세틴 보조 인자 분석을 통해 매일 rVWF 함량 (vWF ELISA), 총 (리스토세틴) 및 특이적 (비활성)을 시험하였다. 또한, 세포 계수, 세포 생존율, 및 암모늄 농도를 포함하는, 여러 가지 배양 매개변수를 매일 관찰하였다 (회분 3일 및 4일 제외).예상외로, 높은 구리 농도 하에서 성장한 세포 배양물은 현저하게 높은 총 rVWF 활성 및 특이적 rVWF 활성 (표 7 및 표 8에서의 결과를 비교)을 함유하는 상등액을 생성하였다. 예를 들어, 회분 4일에, 높은 구리 농도 하에서 성장한 세포 배양물은 낮은 구리 배양물의 0.2 IU rVWF 활성/mL과 비교하여 1.52 IU rVWF 활성/mL을 함유하였다. 이는 낮은 구리 세포 배양물이 높은 구리 세포 배양물에 비해 거의 두 배 함량의 rVWF를 생산하였다는 사실에도 불구하고 그러하다. 나아가, 높은 구리 배양물로부터 얻은 상등액의 비활성은 낮은 구리 배양 상등액보다 13배가 넘게 더 높았다 (831 mU/10㎍ rVWF 대 62 mU/10㎍ rVWF).
표 7 및 표 8에서 보는 바와 같이, 높은 구리 배양물의 총 리스토세틴 보조 인자 활성 및 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성은 회분 1일에 낮은 구리 배양물의 2배였다. 나아가, 높은 구리 배양물에서 관찰된 이후의 활성 증가와는 달리, 낮은 구리 세포 배양물의 경우 회분 1일 후 리스토세틴 보조 인자 활성의 양의 증가가 관찰되지 않았다. 이 결과와 일치하게도, rVWF 멀티머 상태의 아가로스 겔 전기 영동 분석은 낮은 농도의 고분자량 rVWF가 저분자량 rVWF 종의 농도에 비해 회분 1일에 낮은 구리 세포 배양물의 상등액에 존재하였다는 것과, 상대적 농도가 시간이 흐르면서 더 감소하였다는 것을 밝혀내었다 (도 1a 및 1B). 그에 반해, 배양 배지를 Cu2 +로 보충하는 것은 4일 내내 리스토세틴 보조 인자 (RiCoF) 활성 항원을 일관되게 형성시켰다. 일관되게도, 안정한 고분자량 rVWF 멀티머의 양의 감소는 회분 배양 4일 내내 일어나지 않았다 (도 1a 및 1B). 도 1b에 나타난 아가로스 전기 영동 겔의 농도계 결과는 낮은 구리 조건 하에서 상기 배양이 10%를 넘는 (즉, 16.3%) rVWF가 회분 배양의 1일 동안 10개를 초과하는 다이머를 갖는 분자로 존재하는 rVWF 집단을 단지 생성할 수 있었음을 밝혀내었고 (즉, 도 1a의 아가로스 겔의 레인 2에서의 "3일" 시료), 주목할만게도, 이 집단은 회분 배양의 5일에 단지 4%로 떨어졌다 (레인 6에서의 "7일" 시료). 그와 반대로, 높은 구리 조건 하에서 10개를 초과하는 다이머를 갖는 vWF 멀티머의 상대적 양은 유가 배양 4일 내내 일관되게 약 30%이다 (레인 7-10에서의 "3일" 내지 "6일"; 28% 내지 31.4%).
주목할만하게도, 높은 구리 회분 배양의 회분 5일에 시작하여, NH4 + 수준이 100 mg/L을 초과할 때 (약 5.0 mM을 초과), 부가적인 항원의 발현 (18.3 내지 35.4 ㎍/L; 표 8의 회분 4일과 5일을 비교)은 상등액 내에 존재하는 RiCoF 활성의 동시 증가를 야기하지 않았다. 이 결과와 일치하게도, 회분 5일 (배양 7일)에 고분자량 rVWF 멀티머의 수준은 저분자량 rVWF 멀티머의 농도에 비해 감소하였다. 또한, 단지 회분 5일째에 (레인 11에서의 배양의 "7일" 시료), 10개를 초과하는 다이머를 갖는 vWF의 상대적 양이 21.4%로 감소된다.
종합하면, 상기 제공된 데이터는 rVWF를 발현하는 세포 배양물에서의 구리 농도의 보충이 총 rVWF 리스토세틴 보조 인자 활성 및 특이적 rVWF 리스토세틴 보조 인자 활성뿐만 아니라 고분자량 rVWF 멀티머의 안정적 생산을 급격하게 증가시킨다는 것을 입증하였다. 더욱이, 상기 데이터는 세포 배양물에서의 높은 NH4 + 농도의 존재와 rVWF 리스토세틴 보조 인자 활성 및 고분자량 rVWF 멀티머 생산의 손실 사이의 상관관계를 보여준다.
하기 표 7은 낮은 구리 농도 (1.0 ㎍/L)를 갖는 BAV-SP 배지를 이용하여 회분 방식으로 수행된 포유동물 세포 배양에서의 rVWF의 발현을 나타낸 것이다.
회분 일 세포수
[10E6 세포/mL]		 NH4 +
[mg/l]		 생존율
[%]		 vWF ELISA
[㎍/ml]		 리스토세틴
[IU/mL]		 비활성
mU/10㎍
0 0.42 21 98.8 n.d. n.d. n.d.
1 0.78 43 n.d. 6.3 0.23 365
2 1.24 64 99.1 12.8 0.23 180
3 1.86 n.d. n.d. 22.7 0.21 93
4 2.49 n.d. n.d. 32.2 0.20 62
5 3.11 106 98.3 44.4 0.20 45
하기 표 8은 높은 구리 농도 (4.3 ㎍/L)를 갖는 BAV-SP 배지를 이용하여 회분 방식으로 수행된 포유동물 세포 배양에서의 rVWF의 발현을 나타낸 것이다.
회분 일 세포수
[10E6 세포/mL]		 NH4 +
[mg/l]		 생존율
[%]		 vWF ELISA
[㎍/ml]		 리스토세틴
[IU/mL]		 비활성
mU/10㎍
0 0.40 21 99.3 n.d. n.d. n.d.
1 0.71 42 n.d. 4.8 0.40 833
2 1.23 63 99.5 8.7 0.62 713
3 1.85 n.d. n.d. 15.0 1.07 713
4 2.54 n.d. n.d. 18.3 1.52 831
5 3.32 109 98.9 35.4 1.55 438
실시예 3
재조합 인자 Ⅷ (rFVIII) 및 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 케모스탯 조건 하에서 작동되는 GD8/6 세포의 연속 배양에서 공동 발현시켜 VWF 발현 및 활성에 대한 배양 배지 조성물의 영향을 결정하였다. 요약하면, GD8/6 세포를 실시예 2에서 기술된 구리 보충물을 갖는 그리고 갖지 않는 4 g/L의 대두 가수분해물을 함유하는 BAV-SP 배지에서 배양하였다. rVWF 발현 및 활성에 대한 낮은 구리 농도의 영향을 시험하기 위해, 기본 BAV-SP 배지를 사용하였다. 상기 기본 배지는 0.3 ㎍/L의 구리를 함유하였고, 대두 가수분해물로 보충되었으며, 이는 부가적인 0.7 ㎍/L 구리에 기여하여, 1.0 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공하였다. 비교로서, VWF 발현 및 활성에 대한 높은 구리 농도의 효과를 결정하기 위하여, 회분 배양을 위해 사용된 BAV-SP 배지를 추가로 부가적인 3.3 ㎍/L의 Cu2 +로 보충하여, 4.3 ㎍/L의 최종 구리 농도를 제공하였다. 높은 그리고 낮은 구리 농도의 존재하에 성장한 배양물을 높은 (2.8x106 세포/mL) 그리고 낮은 (대략 1.4x10E06 세포/mL) 세포 밀도 하에서 배양하였다.
이전과 같이, 배양 상등액 시료를 리스토세틴 보조 인자 분석을 통해 rVWF 함량 (vWF ELISA), 총 (리스토세틴) 및 특이적 (비활성) 활성을 시험하였다. 또한, 세포 수, 세포 생존율, 및 암모늄 농도를 포함하는, 다양한 배양 매개변수도 관찰하였다. 2주 및 3주의 케모스탯 배양의 정상 상태기 (steady state phase)로부터 데이터를 생성하였다 (표 9 내지 표 13).
하기 표 9는 2주 및 3주 동안 케모스탯 세포 배양에서의 rVWF 발현에 대한 평균 데이터를 나타낸 것이다.
세포수 구리 농도 세포수
[10E6 세포/mL]		 NH4+
[mM]		 생존율
[%]		 vWF ELISA
[㎍/ml]		 리스토세틴
[IU/mL]		 비활성
[mU/10㎍]
높음 낮음 2.88 3.88 97.74 44.56 0.10 21.62
높음 높음 2.79 4.04 98.25 38.38 0.19 53.11
낮음 낮음 1.55 3.33 98.63 18.96 0.10 50.16
낮음 높음 1.43 3.17 98.59 11.76 0.70 598.76
하기 표 10은 2주 및 3주 동안 높은 세포수, 낮은 구리 조건 하에서 케모스탯 세포 배양에서의 rVWF 발현을 나타낸 것이다.
일 세포수
[10E6 세포/mL]		 NH4+
[mM]		 생존율
[%]		 vWF ELISA
[㎍/ml]		 리스토세틴
[IU/mL]		 비활성
[mU/10㎍]
8 2.54 3.7 98.20 39.8 0.095 23.86934673
9 3.02 4.2 97.40 　 　 　
10 2.97 3.9 97.90 41.3 0.095 23.00242131
11 2.78 　 　 　 　 　
13 2.91 3.8 97.60 41.7 0.095 22.78177458
14 2.90 3.8 97.40 　 　 　
15 3.05 3.9 97.70 44.7 0.095 21.25279642
16 2.99 3.8 98.30 　 　 　
17 2.76 3.9 97.40 55.3 0.095 17.17902351
　 2.88 3.88 97.74 44.56 0.10 21.62
하기 표 11은 2주 및 3주 동안 높은 세포수, 높은 구리 조건 하에서 케모스탯 세포 배양에서의 rVWF 발현을 나타낸 것이다.
일 세포수
[10E6 세포/mL]		 NH4+
[mM]		 생존율
[%]		 vWF ELISA
[㎍/ml]		 리스토세틴
[IU/mL]		 비활성
[mU/10㎍]
8 2.52 3.9 98.30 31.8 0.35 110.0628931
9 2.92 4.3 98.50 　 　 　
10 2.80 4.2 98.60 37.4 0.32 85.56149733
11 2.57 　 　 　 　 　
13 2.81 3.9 98.50 37.6 0.095 25.26595745
14 2.92 3.9 97.80 　 　 　
15 2.77 3.9 97.80 43.0 0.095 22.09302326
16 2.72 4.0 98.30 　 　 　
17 3.04 4.1 98.20 42.1 0.095 22.56532067
　 2.79 4.04 98.25 38.38 0.19 53.11
하기 표 12는 2주 및 3주 동안 낮은 세포수, 낮은 구리 조건 하에서 케모스탯 세포 배양에서의 rVWF 발현을 나타낸 것이다.
일 세포수
[10E6 세포/mL]		 NH4+
[mM]		 생존율
[%]		 vWF ELISA [㎍/ml] 리스토세틴 [IU/mL] 비활성 [mU/10㎍]
8 1.61 3.3 99.10 19.3 0.095 49.22279793
9 1.65 3.3 98.00 　 　 　
10 1.49 3.3 98.90 18.6 0.095 51.07526882
11 1.58 　 　 　 　 　
13 1.58 3.4 98.10 18.1 0.095 52.48618785
14 1.56 3.3 99.30 　 　 　
15 1.52 3.3 98.50 18.9 0.095 50.26455026
16 1.50 3.3 98.40 　 　 　
17 1.50 3.4 98.70 19.9 0.095 47.73869347
　 1.55 3.33 98.63 18.96 0.10 50.16
하기 표 13은 2주 및 3주 동안 낮은 세포 수, 높은 구리 조건 하에서 케모스탯 세포 배양에서의 rVWF 발현을 나타낸 것이다.
일 세포수 [10E6 세포/mL] NH4+
[mM]		 생존율
[%]		 vWF ELISA [㎍/ml] 리스토세틴 [IU/mL] 비활성 [mU/10㎍]
8 1.46 3.2 98.80 11.6 0.73 629.3103448
9 1.45 3.2 98.20 　 　 　
10 1.37 3.1 98.90 11.0 0.7 636.3636364
11 1.43 　 　 　 　 　
13 1.33 3.2 98.10 11.1 0.68 612.6126126
14 1.39 3.2 97.20 　 　 　
15 1.51 3.2 99.70 12.4 0.69 556.4516129
16 1.49 3.2 98.60 　 　 　
17 1.43 3.2 99.20 12.7 0.71 559.0551181
1.43 3.17 98.59 11.76 0.70 598.76
도 2a에서 보는 바와 같이, 낮은 세포 밀도 및 높은 구리 농도에서 성장한 연속 rVWF 세포 배양물로부터 회수된 상등액은 높은 비활성 (평균 600 mU/10㎍)을 함유한 반면, 높은 또는 낮은 구리 농도의 존재하에 높은 세포 밀도에서 성장한 rVWF 세포 배양물 및 낮은 구리 농도의 존재하에 낮은 세포 밀도에서 성장한 rVWF 세포 배양물로부터 회수된 상등액은 낮은 비활성 (100 mU/10㎍ 미만)을 함유하였다. 회분 배양에 대해 관찰된 결과와 일치하게도, 도 2b는 높은 비활성을 갖는 VWF를 발현하는 연속 포유동물 세포 배양물이 낮은 비활성을 갖는 rVWF를 생산하는 배양물보다 NH4 + 농도가 더 낮음을 보여준다. 이 데이터는 세포 배양에서의 NH4 + 농도와 배양에 의해 생산된 rVWF의 비활성 사이의 상관관계를 더 강화한다. 주목할 만하게도, 세포 배양에서 높은 구리 농도 및 낮은 암모늄 농도의 조합은 현저하게 개선된 rVWF 활성의 생성을 가능하게 하였다.이 결과와 일치하게도, 케모스탯 배양의 rVWF 멀티머 상태의 아가로스 겔 전기 영동 분석 (도 6)은 높은 구리 및 낮은 세포 밀도 및 따라서 낮은 암모늄에서 작동된 배양물로부터 얻은 상등액만이 높은 멀티머성 vWF의 일관된 발현을 야기하였음을 밝혀내었다 (각각 레인 4, 8, 및 12에서 CST 8일, 17일 및 24일째에 약 23% 내지 27%). 다른 모든 조건들은 연장된 배양 기간에 걸쳐 10개를 초과하는 다이머를 갖는 vWF 중 10%를 초과하는 일관되게 높은 양에 도달하지 않는다.
실시예 4
rA13의 발현 및 비활성에 대한 배양 배지 구리 농도의 효과를 결정하기 위해, 포유동물 세포 배양 발현 rA13을 변형된 DMEM/F12 기본 배지 BESP845 및 0.66 ㎍/L로부터의 범위의 구리 농도 (부가적인 구리 보충물이 없음)를 함유하며 4 ㎍/L까지의 부가적인 구리 보충물을 갖는 부가적인 보충물 (표 14)을 포함하는 ADAMTS13 배지에서 케모스탯 연속 배양 조건 하에서 4주간 성장시켰다. 표 15에 나타난 바와 같이, 세포 배양 배지에서 증가하는 구리 농도는, 각각 배양물 리터 및 일 당 생산된 총 rA13 활성 및 세포 및 일 당 생산된 총 rA13 활성으로 표현된, 부피 (P) 및 특이적 (q) 생산성의 현저한 증가를 야기하였다.
하기 표 14는 ADAMTS13 배지의 조성을 나타낸 것이다.
DMEM /F12 BESP845
아미노산 mg/L
L-알라닌 13.3500
L-아르기닌 HCl 147.5000
L-아스파라긴-H2O 45.1600
L-아스파트산 19.9500
L-시스테인 HCl-H2O 32.5500
L-시스틴 2HCl 102.3500
L-글루탐산 22.0500
글리신 26.2500
L-히스티딘-H2O HCl 51.4800
L-이소류신 74.4700
L-류신 119.0500
L-라이신 HCl 146.2500
L-메티오닌 100.0000
L-페닐알라닌 60.4800
L-프롤린 63.7400
L-세린 36.7500
L-트레오닌 53.4500
L-트립토판 29.0100
L-타이로신 2Na 2H2O 75.7900
L-발린 82.8500
염 mg/L
염화칼슘 (CaCl2) 116.6000
황산구리 (CuSO4 -5H2O) 0.0026
질산제이철 (Fe (NO3)3-9H2O) 0.0500
황산제일철 (FeSO4-7H2O) 1.0170
염화마그네슘 (MgCl2) 28.6400
황산마그네슘 (MgSO4) 48.8400
염화칼륨 (KCl) 311.8000
염화나트륨 (NaCl) 5495.5000
무수 Na2HPO4 213.0200
무수 NaH2PO4 54.3500
황산아연 7수화물 (ZnSO4-27H2O) 0.4320
무수 아세렌산 나트륨 0.0087
비타민 mg/L
아스코브산 3.4990
바이오틴 0.2035
콜린 클로라이드 26.9800
D-Ca-판토테네이트 6.2400
엽산 6.6500
I-이노시톨 36.6000
니코틴아미드 7.0200
피리독신 HCl 6.0310
리보플라빈 0.6590
티아민 HCl 6.5100
비타민 B12 2.6800
기타 mg/L
D-글루코스 5000.0000
리놀레산 0.0420
리포산 1.0050
푸트레신 2HCl 3.6810
티미딘 0.3650
하이포잔틴 Na 2.3900
피르브산 나트륨 55.0000
DMEM /F12 BESP845 : 총량 12738.3　
　 　
ADAMTS - 13 배지 보충물 mg/L
L-글루타민 1300.0000
플루로닉 (Pluronic) F68 1000.0000
에탄올아민 1.5300
ZnSo4*7 H2O 1.0000
Na-하이드로겐카보네이트 1500.0000
보충물 총량 3802.5
성분 총량 16540.8
증가된 구리 농도가 발현된 rA13의 온전함에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 0.66 ㎍/L, 1 ㎍/L, 및 4 ㎍/L 구리를 함유하는 배지에서 성장한 rA13 세포 배양으로부터 회수된 상등액을 SDS-PAGE 분석에 의해 조사하였다. 도 3a (은 염색) 및 도 3b (항-A13 웨스턴 블롯)에서 보는 바와 같이, 겔 전기 영동에 의한 산물 품질에 명백한 변화가 관찰되지 않았다. 구체적으로, 절단된 170 kD 또는 다른 낮은 MW rA13 변이체의 수준의 증가 및 다른 부가적인 또는 증가된 HCP 밴드가 증가된 구리 농도의 존재 하에 rA13 발현으로부터 야기되지 않았다. rA13의 활성에 대한 구리의 최적 농도를 평가하기 위해, P Frets 대 구리 농도의 표 15로부터 얻은 데이터의 외삽법 (도 4)은 약 4 ㎍/L 초과에서 부정적 효과의 보수적 추정과 함께, 최적 효과가 약 2 ㎍/L에서 도달하는 것으로 보임을 보여준다.
하기 표 15는 다양한 구리 농도를 함유하는 배지를 이용하여 케모스탯 연속 배양 방식에서 수행된 포유동물 세포 배양에서의 rA13의 발현을 나타낸 것이다.
10 L 규모 R&D 실험
CST 4주의 평균 		ZZ - NC P Frets q Frets 비활성
[10E6 세포/mL] [U/ (L*d)] [U/ (10E9 세포*d)] U/mg
0.66 ㎍/L Cu2+ 1.35 1322 1028 1759
1 ㎍/L Cu2+ 1.64 1962 1247 1690
4 ㎍/L Cu2+ 2.26 2960 1338 1768
상기 수득된 결과에 기초하여, 0.66 ㎍/L의 구리를 함유하는 세포 배양 배지에서의 rA13의 발현을 2.0 ㎍/L 구리와 비교하는, 부가적인 실험을 수행하였다. 표 16에 나타난 바와 같이, 기본 세포 배지를 2.0 ㎍/L의 최종 농도의 구리로 보충하는 것은 8주의 기간에 걸쳐 배양물 리터 및 일 당 생산된 총 rA13 활성 및 세포 및 일 당 생산된 총 rA13 활성으로 각각 표현된 부피 (P) 및 특이적 (q) 생산성에 현저한 증가를 야기하였다. 두 가지 배양에서의 rA13 생산의 각각의 주에 대한 구체적인 데이터가 도 5에 나타나 있다. 이들 데이터로부터, 구리 보충이 세포 대사, 비성장속도 및 rA13 생산성에 주목할만한 유익한 영향을 미친다는 것이 명백하다.하기 표 16은 다양한 구리 농도를 함유하는 배지를 이용하여 케모스탯 연속 배양 방식에서 수행된 포유동물 세포 배양에서의 rA13의 발현을 나타낸 것이다.
10 L 규모
CST 8주의 평균 		ZZ - NC P Frets q Frets 비활성
[10E6 세포/mL] [U/ (L*d)] [U/ (10E9 세포*d)] U/mg
0.66 ㎍/L Cu2+ 1.29 1049 821 1862
2 ㎍/L Cu2+ 2.17 2470 1146 1749
본원에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 예시를 위한 것이고 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 본 기술분야의 숙련자에게 제시될 것이며, 이는 본원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구항의 범주에 속한다. 본원에 인용된 모든 문헌, 특허, 및 특허출원은 모든 목적을 위하여 전문이 참고로써 본원에 통합되어 있다.

Claims (51)

  1. 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 세포 배양 상청액으로서, 상기 rVWF의 20% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재하며, 상기 세포 배양 상청액은 2.4 ㎍/L 이상의 최종 구리 농도를 제공하도록 보충되고 세포 배양 상청액의 NH4 + 함량이 4 mM 미만 또는 10 mM 미만의 농도로 유지되는 것인, 세포 배양 상청액.
  2. 제1항에 있어서, mL 당 0.5 IU 이상의 리스토세틴 보조인자 활성을 함유하는 것인 세포 배양 상청액.
  3. 제1항에 있어서, 30 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조인자 활성을 갖는 것인 세포 배양 상청액.
  4. 제1항에 있어서, 40 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조인자 활성을 갖는 것인 세포 배양 상청액.
  5. 제1항에 있어서, 50 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조인자 활성을 갖는 것인 세포 배양 상청액.
  6. 제1항에 있어서, 60 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조인자 활성을 갖는 것인 세포 배양 상청액.
  7. 제1항에 있어서, 70 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조인자 활성을 갖는 것인 세포 배양 상청액.
  8. 제1항에 있어서, 80 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조인자 활성을 갖는 것인 세포 배양 상청액.
  9. 제1항에 있어서, 상청액 중 rVWF의 30% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재하는 세포 배양 상청액.
  10. 제1항에 있어서, rVWF가 14 내지 22 다이머의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재하는 세포 배양 상청액.
  11. 제1항에 있어서, 재조합 인자 VIII (rFVIII)을 추가로 포함하는 것인 세포 배양 상청액.
  12. 제11항에 있어서, rVWF 대 rFVIII의 비가 10:1 이상인 세포 배양 상청액.
  13. (a) 기저 세포 배양 배지를 제공하는 단계;
    (b) 상기 기저 세포 배양 배지에 구리를 보충하여 2.4 ㎍/L 이상의 최종 구리 농도를 제공하는 단계;
    (c) 재조합 폰빌레브란트 인자 (rVWF) 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 1 이상의 세포를 제공하는 단계;
    (d) 상기 1 이상의 세포를 상기 구리가 보충된 세포 배양 배지에서 배양함으로써, rVWF가 발현되고 상기 세포로부터 배양 상청액으로 방출되는 단계로서, 상기 세포 배양 상청액의 NH4 + 함량이 4 mM 미만 또는 10 mM 미만의 농도로 유지되는 단계; 및
    (e) 상기 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 회수된 상청액이 30 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는 것인, rVWF를 포함하는 세포 배양 상청액.
  14. 제13항에 있어서, 재조합 인자 VIII (rFVIII)을 추가로 포함하는 것인 세포 배양 상청액.
  15. 제14항에 있어서, rVWF 대 rFVIII의 비가 10:1 이상인 세포 배양 상청액.
  16. 제14항에 있어서, 약제학적 투여용으로 제제화된 것인 세포 배양 상청액.
  17. 제16항에 있어서, 정맥내 투여용으로 제제화된 것인 세포 배양 상청액.
  18. 제13항에 있어서, 상기 방법이 1 이상의 세포를 배양하는 단계 이전에 상기 기저 세포 배양 배지를 가수분해물로 보충하는 단계를 추가로 포함하는 세포 배양 상청액.
  19. 제18항에 있어서, 가수분해물이 식물 가수분해물인 세포 배양 상청액.
  20. 제19항에 있어서, 가수분해물이 대두 가수분해물인 세포 배양 상청액.
  21. 제13항에 있어서, 기저 세포 배양 배지가 동물 단백질이 없는 배양 배지인 세포 배양 상청액.
  22. 제13항에 있어서, 기저 세포 배양 배지가 단백질이 없는 배양 배지인 세포 배양 상청액.
  23. 제13항에 있어서, 기저 세포 배양 배지가 화학적으로 규명된(chemically defined) 배양 배지인 세포 배양 상청액.
  24. 제13항에 있어서, 구리 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도가 4 ㎍/L 구리 이상인 세포 배양 상청액.
  25. 제13항에 있어서, 구리 보충된 기저 세포 배양 배지의 최종 구리 농도가 2.4 ㎍/L 내지 20 ㎍/L 구리인 세포 배양 상청액.
  26. 제13항에 있어서, 기저 세포 배양 배지를 보충하는 구리가 구리 염, 구리 킬레이트, 또는 이들의 조합으로서 제공되는 세포 배양 상청액.
  27. 제26항에 있어서, 구리 염이 구리 설페이트, 구리 아세테이트, 구리 카보네이트, 구리 클로라이드, 구리 하이드록사이드, 구리 나이트레이트, 및 구리 옥사이드로 이루어진 군에서 선택되는 세포 배양 상청액.
  28. 제13항에 있어서, 상기 1 이상의 세포가 포유동물 세포인 세포 배양 상청액.
  29. 제28항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 세포 배양 상청액.
  30. 제13항에 있어서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 것이 상기 세포의 회분 배양을 포함하는 세포 배양 상청액.
  31. 제13항에 있어서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 것이 상기 세포의 연속 배양을 포함하는 세포 배양 상청액.
  32. 제31항에 있어서, 상기 세포의 연속 배양이 케모스태틱 방식으로 수행되는 세포 배양 상청액.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세포의 연속 배양이 관류 방식으로 수행되는 세포 배양 상청액.
  34. 제13항에 있어서, 상기 1 이상의 세포가 100 L 이상의 상기 보충된 기저 세포 배양 배지에서 배양되는 세포 배양 상청액.
  35. 제13항에 있어서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안 세포 밀도가 2.5×106 세포/mL 미만으로 유지되는 세포 배양 상청액.
  36. 제35항에 있어서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안 세포 밀도가 2.0×106 세포/mL 미만으로 유지되는 세포 배양 상청액.
  37. 제35항에 있어서, 상기 1 이상의 세포를 배양하는 단계 동안 세포 밀도가 1.5×106 세포/mL 미만으로 유지되는 세포 배양 상청액.
  38. 제13항에 있어서, 배양 상청액의 적어도 일부를 회수하는 단계가 배양 상청액의 일부로부터 세포를 제거하기 위한 여과 또는 원심분리를 포함하는 세포 배양 상청액.
  39. 제13항에 있어서, 상기 회수된 상청액이 40 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는 세포 배양 상청액.
  40. 제39항에 있어서, 상기 회수된 상청액이 50 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는 세포 배양 상청액.
  41. 제39항에 있어서, 상기 회수된 상청액이 60 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는 세포 배양 상청액.
  42. 제39항에 있어서, 상기 회수된 상청액이 70 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는 세포 배양 상청액.
  43. 제39항에 있어서, 상기 회수된 상청액이 80 mU/㎍ rVWF 이상의 rVWF 특이적 리스토세틴 보조 인자 활성을 갖는 세포 배양 상청액.
  44. 제13항에 있어서, 상청액 중 rVWF의 10% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재하는 세포 배양 상청액.
  45. 제13항에 있어서, 상청액 중 rVWF의 20% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재하는 세포 배양 상청액.
  46. 제13항에 있어서, 상청액 중 rVWF의 30% 이상이 10 다이머 초과의 고분자량 VWF 멀티머 내에 존재하는 세포 배양 상청액.
  47. 제13항에 있어서, 상청액이 14 내지 22 다이머의 고분자량 VWF 멀티머를 함유하는 세포 배양 상청액.
  48. 제13항에 있어서, 단계 (c) 중 상기 1 이상의 세포가 재조합 인자 VIII (rFVIII)을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하고, 상기 rFVIII는 rVWF 단백질과 공동 발현되는 세포 배양 상청액.
  49. 제48항에 있어서, 상기 방법이 상기 회수된 상청액에 존재하는 FVIII의 50% 이상으로부터 rVWF를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 세포 배양 상청액.
  50. 제49항에 있어서, 상기 정제 단계 후 rVWF 대 rFVIII의 비가 10:1 이상인 세포 배양 상청액.
  51. 제13항에 있어서, 상기 방법이 세포 배양 상청액 내에 상기 rVWF 단백질을 농축시키는 것을 추가로 포함하는 세포 배양 상청액.
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