EA035147B1 - Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток - Google Patents

Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток Download PDF

Info

Publication number
EA035147B1
EA035147B1 EA201792340A EA201792340A EA035147B1 EA 035147 B1 EA035147 B1 EA 035147B1 EA 201792340 A EA201792340 A EA 201792340A EA 201792340 A EA201792340 A EA 201792340A EA 035147 B1 EA035147 B1 EA 035147B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
var
cell culture
copper
concentration
cells
Prior art date
Application number
EA201792340A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201792340A2 (ru
EA201792340A3 (ru
Inventor
Леопольд Грилльбергер
Манфред Райтер
Даниель Фляйшандерль
Грегор Брамбергер
Original Assignee
Баксалта Инкорпорейтид
Баксалта Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44514323&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA035147(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Баксалта Инкорпорейтид, Баксалта Гмбх filed Critical Баксалта Инкорпорейтид
Publication of EA201792340A2 publication Critical patent/EA201792340A2/ru
Publication of EA201792340A3 publication Critical patent/EA201792340A3/ru
Publication of EA035147B1 publication Critical patent/EA035147B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24087—ADAMTS13 endopeptidase (3.4.24.87)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится, среди прочих аспектов, к условиям культивирования клеток для получения высокомолекулярного vWF, в частности WF, состоящего из большого количества мультимеров, с высокой удельной активностью и ADAMTS13 с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и/или супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH). Изобретение также обеспечивает способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярных vWF и rA13, обладающих высокой удельной активностью.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 61/362635, поданной 8 июля 2010 г., описание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Область техники
Рекомбинантная экспрессия терапевтических белков в культуре клеток (в частности, крупномасштабных культурах клеток), включая культуры эукариотических клеток, и, конкретнее, культуры клеток млекопитающих, требует применения специальных культуральных сред, обеспечивающих питательные вещества для эффективного роста клеток. В составы сред для клеточных культур часто входят различные добавки, включая эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), животные белки и/или гидролизаты белков крупного рогатого скота, а также белковые гидролизаты, полученные из растений или дрожжей. Одна из проблем, связанных с такими культурами, состоит в том, что количество получаемого белка, а также общая и удельная активность указанного белка, часто варьируют в разных культурах клеток, даже в случае, когда состав среды для культуры клеток неизменен. Эта вариабельность особенно очевидна в случае крупномасштабных производственных процессов с применением объемов клеточных культур от 10 до более чем 20000 л. Вариабельность для разных культур клеток особенно часто наблюдают для сред для клеточных культур, содержащих гидролизаты, что приводит к уменьшению продукции общего продуцируемого количества белка, а также уменьшению общей и удельной активности.
Одной из возможных причин вариабельности, наблюдаемой в разных культурах клеток, является то, что загрязняющие примеси в добавках, таких как гидролизаты, варьируют от партии к партии. Как правило, сыворотка или полученные из сыворотки вещества, такие как, например, альбумин, трансферрин или инсулин, могут содержать нежелательные агенты, которые могут загрязнять культуры клеток и получаемые из них биологические продукты. Кроме того, получаемые из сыворотки крови человека добавки должны быть проверены на все известные вирусы, включая вирусы гепатита и ВИЧ, которые могут передаваться через сыворотку крови. Более того, бычья сыворотка и получаемые из нее продукты несут риск заражения КГЭ. Помимо этого, все полученные из сыворотки продукты могут быть загрязнены неизвестными веществами. При применении для культуры клеток сыворотки или белковых добавок, полученных от человека или животных, возникают многочисленные проблемы (например, варьирующие качество и свойства составов из разных партий и риск загрязнения микоплазмой, вирусами или КГЭ), в частности, если указанные клетки применяют для производства лекарственных средств или вакцин для введения человеку. Поэтому было предпринято множество попыток получения эффективной системы хозяина и условий культивирования, для которых не требуется сыворотка или другие белковые вещества животного происхождения.
Такие бессывороточные среды разрабатывались на основе белковых экстрактов, получаемых из растений или дрожжей. Например, известно, что гидролизаты сои подходят для процессов ферментации и могут усиливать рост многих микроорганизмов со сложными питательными потребностями, дрожжей и грибов. В WO 96/26266 указано, что папаиновые гидролизаты соевой муки являются источником углеводов и азота, и многие ее компоненты могут применяться для тканевых культур. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) описывают эффекты стимуляции роста и продуктивности определенных пептидных фракций гидролизатов сои и пшеницы.
В WO 96/15231 описана бессывороточная среда, состоящая из синтетической минимальной питательной среды и дрожжевого экстракта, для размножения клеток позвоночных животных и процесса воспроизводства вирусов. Состав среды, состоящей из основной среды для культур клеток, содержащей пептид риса, экстракт дрожжей и их ферментативный гидролизат, и/или растительные липиды для роста животных клеток, описан в WO 98/15614. Содержащая очищенный соевый гидролизат среда для культивирования рекомбинантных клеток описана в WO 01/23527. В WO 00/03000 описана среда, которая содержит соевый гидролизат и дрожжевой экстракт, но также требует и присутствия рекомбинантных форм животных белков, таких как факторы роста.
В EP-А-0481791 описана культуральная среда с заданным биохимическим составом для культивирования сконструированных клеток CHO, не содержащая белков, липидов и углеводов, выделенных из животных источников, содержащая также рекомбинантный инсулин или аналог инсулина, 1 к 0,025% (мас./об.) пептона расщепленной папаином сои, и путресцин. В WO 98/08934 описана бессывороточная культура эукариотических клеток, содержащая гидролизованные соевые пептиды (1-1000 мг/л), от 0,01 до 1 мг/л путресцина и разнообразные компоненты животного происхождения, включая альбумин, фетуин, различные гормоны и другие белки. В этом контексте следует отметить, что, как известно, путресцин входит также в стандартные среды, например в среду DMEM/Хэма F12 в концентрации 0,08 мг/л.
Растительные и/или дрожжевые гидролизаты, однако, представляют собой неопределенные смеси олигопептидов и других неизвестных компонентов и загрязнителей. При этом свойства коммерчески доступных партий гидролизатов существенно варьируют. В результате выход рекомбинантных белков или вирусных продуктов значительно различается (разница составляет до троекратной) в зависимости от партии используемого гидролизата (разброс от партии к партии). Этот недостаток влияет на пролиферацию клеток, а также экспрессию белков в каждой клетке. В US 2007/0212770 описаны различные не
- 1 035147 содержащие животных белков и олигопептидов культуральные среды с заданным химическим составом, подходящие для крупномасштабного производства рекомбинантных белковых биофармацевтических средств.
Г емостаз включает взаимодействие различных путей гемостатических реакций, в итоге приводящих к образованию тромба. Тромбы представляют собой отложения компонентов крови на поверхности стенок сосудов, состоящие в основном из агрегированных тромбоцитов крови и нерастворимого перекрестно сшитого фибрина. Образование фибрина происходит в результате сдерживания протеолиза фибриногена под действием тромбина, фермента свертывания. Тромбин представляет собой конечный продукт каскада свертывания, последовательной активации зимогена на поверхности активированных тромбоцитов и лейкоцитов, и различных клеток сосудов (для ознакомления см. K.G. Mann et al., Blood, 1990, Vol. 76, p. 1-16).
Важной функцией каскада свертывания является активация фактора X комплексом активированного фактора IX (фактора IXa) и активированного фактора VIII (фактора VIIIa). Дефицит или дисфункция компонентов этого комплекса связаны с заболеванием крови, известным как гемофилия (J.E. Sadler & E.W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B, and von Willebrand's Disease (Гемофилия A, гемофилия B и болезнь Виллебранда), в G.
Stamatoyannopoulos et al., (Eds.): The molecular basis of blood diseases (Молекулярные основы заболеваний крови), W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, p. 576-602). Гемофилия A связана с дефицитом активности фактора VIII, в то время как гемофилия B связана с дефицитом фактора IX. Современное лечение представляет собой заместительную терапию с применением фармацевтических препаратов, содержащих нормальный фактор свертывания. Из указанных тромбопатий гемофилия A встречается чаще, поражая примерно одного человека из 10 000. Заместительная терапия у пациентов с гемофилией A включает повторяющееся введение препаратов, содержащих нормальный фактор VIII, путем внутривенной инфузии. Интервал между инфузиями представляет собой функцию от снижения активности фактора VIII в кровотоке. Полупериод активности фактора VIII после инфузии различен у разных индивидуумов, варьируя от 10 до 30 ч. Таким образом, профилактическая терапия требует инфузии каждые 2-3 дня. Это является тяжелым бременем для пациентов с гемофилией, в частности, в случаях, когда венозный доступ затруднен в результате местной карбонизации после частых проколов иглой для внутривенных инфузий.
Снижение частоты инфузии за счет применения фактора VIII с продленным периодом полужизни было бы очень благоприятно. В данной области техники хорошо известно, что время полураспада неактивированного гетеродимера фактора VIII сильно зависит от присутствия фактора фон Виллебранда, проявляющего высокое сродство к фактору VIII (но не к фактору VIIIa) и служащего белкомпереносчиком (J.E. Sadler and E.W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebrand's disease, в G. Stamatoynnopoulos et al. (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, p. 576-602). Известно, что пациенты, страдающие от болезни Виллебранда типа 3, не имеющие детектируемого уровня фактора фон Виллебранда в кровотоке, страдают также от вторичного дефицита фактора
VIII. Кроме того, период полураспада введенного внутривенно фактора VIII у таких пациентов составляет от 2 до 4 ч, что заметно меньше 10-30 ч, наблюдаемых у пациентов с гемофилией A. Из полученных результатов следует, что фактору VIII свойственна тенденция к быстрому выведению из кровотока и что этот процесс до некоторой степени подавляется комплексообразованием с его естественным переносчиком - фактором фон Виллебранда.
Фактор фон Виллебранда (vWF) представляет собой гликопротеин, циркулирующий в плазме в виде ряда мультимеров, размер которых варьирует, как правило, от приблизительно 500 до 20000 кДа (или 2-40 димеров vWF). Димерные и мультимерные формы vWF составлены 250 кДа полипептидными субъединицами, связанными друг с другом дисульфидными связями. vWF опосредует первичную адгезию тромбоцитов к субэндотелию поврежденной стенки сосуда; только мультимеры большего размера проявляют также гемостатическую активность. Мультимеризованный vWF связывается с поверхностным гликопротеином тромбоцитов Gp1ba посредством взаимодействия в домене Al vWF, содействуя адгезии тромбоцитов. Предполагается, что эндотелиальные клетки секретируют крупные полимерные формы vWF, а те формы vWF, которые имеют низкие молекулярные массы (низкомолекулярный vWF), возникают за счет протеолитического расщепления. Мультимеры с большими молекулярными массами накапливаются в тельцах Вейбеля-Палада эндотелиальных клеток и высвобождаются при стимуляции.
Снижение связывающей активности FVIII благодаря сниженным уровням белка vWF или уменьшению связывающей способности FVIII приводит к одному из трех типов болезни Виллебранда. Дополнительно или альтернативно, определенные типы болезни Виллебранда характеризуются повышением или снижением уровня Gp1bα-опосредованного связывания тромбоцитов, а именно типы 2A, 2B и 2M (обобщенные данные см. у Castaman et al., Disorders of Hemostasis 88(1):94-108 (2003)). Соответственно модулирование взаимодействия vWF как с FVIII, так и с Gp1ba представляет собой целесообразную стратегию для лечения как гемофилии, так и болезни Виллебранда.
Учитывая биологическую важность vWF, существует постоянная необходимость в совершенство
- 2 035147 вании техники способов получения vWF для терапевтического применения. Общеизвестно, что vWF может быть выделен из эндогенных источников, таких как плазма крови человека. Выделенный vWF обладает таким преимуществом, как высокая удельная активность в отношении выполнения его биологической функции и может, таким образом, эффективно применяться в качестве терапевтического белка для лечения соответствующих заболеваний, таких как болезнь Виллебранда. Как правило, vWF плазмы обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей приблизительно 100 мЕ/мкг, однако выделение из плазмы крови человека имеет недостатки, так как, например, такая плазма может содержать различные вирусы, такие как ВИЧ и/или вирусы гепатита, которые могут переноситься пациенту. Кроме того, плазма представляет собой ограниченный ресурс и, таким образом, дефицит плазмы может приводить к проблематичности получения достаточного количества vWF для лечения. Соответственно рекомбинантные способы получения vWF обладают преимуществами, разрешая некоторые проблемы, связанные с зависимостью от плазмы в качестве источника vWF. Для рекомбинантного получения была клонирована полноразмерная кДНК vWF; указанный прополипептид соответствует аминокислотным остаткам 23-764 полноразмерного препро-vWF (Eikenboom et al (1995) Haemophilia 1, 77 90).
К сожалению, vWF представляет собой молекулу, подвергающуюся сложным посттрансляционным модификациям. Кроме того, мультимеризация димеров vWF в большие и ультрабольшие мультимеры в аппарате Гольджи представляет собой сложную задачу при экспрессии в клетках млекопитающих. Так, экспрессия высокомолекулярного vWF в культуре клеток, например эндотелиальных клетках человека (первичных), зависит от специфического накопления ультрабольших молекул vWF в тельцах ВейбеляПалада. Такие культуры клеток не подходят для получения терапевтических белков. Описаны и другие способы культивирования клеток; известно, что условия культивирования клеток могут влиять на продуцирование vWF различным образом. Например, показано, что высокие концентрации аммония (NH4 +) нарушают посттрансляционную модификацию. Mayadas et al. (J. Biol. Chem., 264(23):13498-13503, 1989) показали, что уровень аммония 25 мМ приводили к снижению мультимеризации vWF в эндотелиальных клетках, что также негативно влияет на удельную ристоцетиновую активность рекомбинантного vWF. Снижение мультимеризации, как правило, связано со снижением активности, в частности удельной ристоцетиновой активности, рекомбинантного vWF.
До сих пор трудно предсказать, какие параметры могут положительно или отрицательно влиять на продуцирование того или иного белка, в особенности - сложных гликопротеинов, таких как фактор VIII и vWF. Например, показано, что определенные компоненты среды для клеточной культуры влияют на продуцирование фактора VIII. Согласно описанию в патенте США № 5804420 добавление полиола, меди и других следовых металлов может положительно влиять на выход фактора VIII. Также, согласно описанию в WO 2009/086309, показано, что применение меди в процессе культивирования клеток повышает выработку фактора VIII. У Mignot et al. (1989) описано также осуществление экспрессии vWF в рекомбинантных клетках CHO. Однако ни в одном из указанных примеров не содержится информации относительно удельной активности vWF или уровня его мультимеризации.
Белки ADAMTS (дезинтегрин и металлопротеиназа с мотивами тромбоспондина I типа) представляют собой семейство металлопротеиназ, содержащих ряд консервативных доменов, включая цинкзависимый каталитический домен, цистеин-богатый домен, дезинтегрин-подобный домен и по меньшей мере один, а в большинстве случаев множество повторов тромбоспондина типа I (для ознакомления см. Nicholson et al., ВМС Evol Biol. 2005 Feb 4; 5(1):11). Указанные белки, эволюционно родственные семействам металлопротеиназ ADAM и MMP (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb;7(1):25-31), являются секретируемыми ферментами, для которых установлена связь с рядом заболеваний и состояний, включая тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП) (Моаке J.L., Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):414), соединительнотканные расстройства, раковые заболевания, воспаление (Nicholson et al.) и тяжелую плазмодийную тропическую малярию (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar; 5(3):e1000349). Из-за этих связей ферменты ADAMTS были признаны потенциальными мишенями для терапии ряда патологий (Jones G.C., Curr Pharm Biotechnol. 2006 Feb; 7(1):25-31). Соответственно существует потребность в способах получения больших количеств белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью, не содержащих загрязнителей, таких как вирусы, КГЭ и патогены типа бактерий Mycoplasma.
Один из представителей семейства ADAMTS, ADAMTS13, расщепляет фактор фон Виллебранда (vWF) между остатками Tyr1605 и Met 1606; эта функция отвечает за разложение больших мультимеров vWF in vivo. Установлена связь потери активности ADAMTS13 с некоторыми состояниями, такими как ТТП (Moake J.L., Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):4-14), острое и хроническое воспаление (Chauhan et al., J Exp Med. 2008 Sep 1; 205 (9):2065-74), и, совсем недавно, с тяжелой плазмодийной тропической малярией (Larkin et al., PLoS Pathog. 2009 Mar; 5(3):e1000349).
Протеаза ADAMTS13 представляет собой гликозилированный белок массой 190 кДа, синтезируемый преимущественно в печени (Levy et al., Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa et al., Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng et al., J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima et al., J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480 и Gerritsen et al., Blood. 2001; 98:1654-1661). В значительной степени кА и в случае с мультимерами rvWF высшего порядка, рекомбинантная экспрессия больших ADAMTS13 в культурах клеток млекопитающих сопряжена с множеством трудностей.
- 3 035147
Таким образом, существует необходимость в условиях культивирования клеток, в частности условиях культивирования при крупномасштабном производстве, обеспечивающих стабильный общий выход белка и/или стабильную общую и удельную активность продуцируемых белков в различных культурах клеток. Стабильность в культурах при крупномасштабных производственных процессах важна для производства терапевтических белков. Существует также необходимость в условиях культивирования клеток для крупномасштабного производства rvWF с уровнями мультимеризации и удельной ристоцетиновой активностью, сравнимыми или превышающими таковые vWF, присутствующего в нормальной плазме человека. Сходным образом, так как белки ADAMTS вовлечены в ряд заболеваний и состояний, в данной области техники существует потребность в способах крупномасштабного производства рекомбинантных белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью, которые подходят для получения фармацевтических средств и для фармацевтического введения. Настоящее изобретение удовлетворяет указанные и другие потребности данной области техники в получении рекомбинантного фактора фон Виллебранда и рекомбинантного ADAMTS13.
Краткое описание изобретения
Согласно определенным аспектам настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, заключающемся в том, что введение добавок в среды для клеточных культур, применяемые для экспрессии рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rvWF) и рекомбинантного ADAMTS13 (rA13), приводит к значительному повышению экспрессии белков и ферментативной активности.
Согласно своему первому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rvWF); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rvWF; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rvWF из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап добавления в указанную основную среду для клеточных культур гидролизата перед культивированием указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный гидролизат представляет собой растительный гидролизат. Согласно конкретному варианту реализации указанный гидролизат представляет собой соевый гидролизат.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основная среда для клеточных культур представляют собой не содержащую животных белков культуральную среду.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие белков культуральные среды.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанные основные среды для клеточных культур представляет собой культуральные среды с заданным химическим составом.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в основной среде для клеточных культур с добавлением меди составляет от 2,4 до 20 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинации.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная одна или более клетка представляет собой клетку млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанную одну или более клетку культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток под
- 4 035147 держивают на уровне менее чем 2,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из части культурального супернатанта.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг rvWF. Согласно конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг rvWF. Согласно более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов по меньшей мере 10% rvWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный супернатант содержит высокомолекулярные мультимеры vWF из 14-22 димеров.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 10 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов rvWF коэкспрессируется с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации указанный способ дополнительно включает этап очистки rvWF от по меньшей мере 50% rFVIII, присутствующего в отделенном супернатанте. Согласно одному из вариантов реализации отношение rvWF к rFVIII после этапа очистки составляет по меньшей мере 10:1.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения rvWF.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение обеспечивает композицию рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rvWF), полученную описанным в настоящей заявке способом.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанная композиция также содержит рекомбинантный фактор VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации отношение rvWF к rFVIII составляет по меньшей мере 10:1.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rvWF), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящей заявке способом.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rvWF), при этом по меньшей мере 10% rvWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного vWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rvWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного vWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rvWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного vWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно другому
- 5 035147 конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rvWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного vWF мультимера из более чем 10 димеров.
Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rvWF в указанном супернатанте присутствует в виде высокомолекулярного vWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов указанный супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно пятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rvWF), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,4 ME ристоцетин-кофакторной активности на 1 мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,5 ME ристоцетинкофакторной активности на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,6 ME ристоцетин-кофакторной активности на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 0,7 ME ристоцетин-кофакторной активности на 1 мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно шестому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 1,0 мкг/л; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие животных белков культуральные среды.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой не содержащие белков культуральные среды.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов основные среды для клеточных культур представляют собой культуральные среды с заданным химическим составом.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 1 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 2 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет по меньшей мере 4 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 1 до 6 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов конечная концентрация меди в дополненных основной среде для клеточных культур составляет от 2 до 4 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов медь добавляют в основные среды для клеточных культур в виде соли меди, хелата меди или их комбинаций. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанная одна или более клетка представляет собой клетку млекопитающего. Согласно конкретному варианту реализации указанные клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает периодическое культивирование указанных клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов культивирование указанной одной или более клеток включает непрерывное культивирование указанных клеток. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование клеток производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанную одну или более клетку культивируют по меньшей мере в 100 л дополненной основной среды для клеточных культур.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 4,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток под
- 6 035147 держивают на уровне менее чем 3,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 3,0 х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл на протяжении этапа культивирования указанной одной или более клеток.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов этап отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта включает фильтрацию или центрифугирование для удаления клеток из указанной части культурального супернатанта.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-vWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.
Согласно предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-vWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 1200 мЕ/мкг.
Согласно более предпочтительному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант обладает удельной FRETS-vWF73 активностью rA13, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 10 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне ниже 5 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов содержание NH4 + в указанном культуральном супернатанте поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации предложенных выше способов указанный способ дополнительно включает этап обогащения rA13.
Согласно седьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный ADAMTS13 (rA13), отличающийся тем, что указанный супернатант получают описанным в настоящей заявке способом.
Согласно восьмому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный ADAMTS13 (rA13), отличающийся тем, что указанный супернатант содержит по меньшей мере 5 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл. Согласно конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 7 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 9 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл. Согласно еще одному конкретному варианту реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно девятому аспекту настоящее изобретение обеспечивает супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный ADAMTS13 (rA13), при этом указанный супернатант содержит по меньшей мере 2 мкг rA13 на 1 мл. Согласно конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг rA13 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг rA13 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг rA13 на 1 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг rA13 на 1 мл. Согласно еще одному конкретному варианту
- 7 035147 реализации вышеописанных супернатантов супернатант получают согласно описанному в настоящей заявке способу.
Согласно десятому аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция рекомбинантного ADAMTS13 (rA13), полученная согласно любому из вышеописанных способов.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного введения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет: фиг. 1A - электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1%) rvWF, экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди, согласно описанию в примере 2. Отметим, что день культивирования 3 эквивалентен дню периодической культуры 1 из табл. 7 и 8; фиг. 1B - относительное содержание мультимеров vWF, содержащих от 1 до 10 димеров (зона № 1) и более чем 10 димеров (зона № 2) согласно оценке зон, приведенных на фиг. 1A, количественно определяли денситометрическим анализом.
Фиг. 2 представляет: фиг. 2A - интервальный график средней удельной активности rvWF в супернатантах клеточных культур rvWF, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди; 2B - интервальный график средней концентрации NH4 +, обнаруживаемой в супернатантах клеточных культур rvWF, выращенных при высокой и низкой плотности клеток в присутствии высоких или низких уровней меди.
Фиг. 3 - супернатанты культур клеток, экспрессирующих рекомбинантный ADAMTS13 в присутствии возрастающих уровней меди, исследовали с применением анализа ДСН-ПААГ. После ДСН-ПААГ rA13 визуализировали с помощью фиг. 3A - окрашивания серебром и фиг. 3B - анти-А13 вестернблоттинга.
Фиг. 4 - график зависимости объемной продуктивности (P Frets) от концентрации меди, показывающий экстраполированный (сплошная линия) эффект оптимальной концентрации меди на выработку rA13.
Фиг. 5A-K - ступенчатые диаграммы при непрерывном суспензионном (хемостатическом) культивировании клеток, экспрессирующих rA13 на протяжении времени культивирования 8 недель, сравнивающие эффекты основных уровней меди (0,66 мкг/л) с таковыми в культурах, дополненных до конечной концентрации меди 2 мкг/л. Каждый столбец представляет среднее значение за неделю хемостатической культуры. Легенда относится к конкретным неделям, для которых представлены данные.
Фиг. 6 представляет: фиг. 6A - электрофорез в агарозном геле низкого разрешения (1%) rvWF, экспрессируемого в культурах клеток млекопитающих в присутствии низкой (1,0 мкг/л) и высокой (4,3 мкг/л) концентраций меди при высокой и низкой плотности клеток согласно описанию в примере 3. Следует отметить, что дни культивирования 8 и 17 (CST8 и CST17) эквивалентны дню 8 и дню 17 в табл. 10-13; фиг. 6B - относительное содержание мультимеров vWF, содержащих от 1 до 10 димеров и более чем 10 димеров согласно оценке зон, приведенных на фиг. 6A, количественно определяли денситометрическим анализом.
Подробное описание изобретения
I. Введение.
Рекомбинантный vWF (rvWF) и рекомбинантный ADAMTS13 (rA13) могут быть получены посредством экспрессии в крупномасштабных культурах клеток млекопитающих. Однако активность указанных белков при получении с применением стандартных условий культивирования клеток часто варьирует от культуры к культуре клетокдаже в тех случаях, когда общий состав сред неизменен; удельная активность рекомбинантных белков часто отличается от таковой vWF и rA13, полученных из плазмы крови. Кроме того, rvWF, экспрессируемый в культурах клеток млекопитающих, склонен образовывать белковые составы с низким (менее 10%) процентным содержанием мультимеров высшего порядка (мультимеры высшего порядка включают молекулы, содержащие более чем 10 димеров vWF). Эти недостатки стандартных способов получения rvWF и rA13 представляют особенные сложности при создании культур для крупномасштабного производства (т.е. от 10 до более чем 20000-литровых культур).
Одним из потенциальных источников вариабельности, часто наблюдаемой в разных партиях клеточной культур, является присутствие загрязнителей в компонентах сред для клеточных культур. Указанные загрязнители могут присутствовать в различном количестве в разных партиях, что приводит к варьирующим результатам при получении rvWF и rA13. После изучения различных загрязнителей, обнаруживаемых в различных добавках для клеточных культуральных сред, авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие гидролизатов приводит к варьированию концентраций меди в таких культуральных средах. Дальнейшие исследования дали неожиданный результат: добавление меди в культуральные среды до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 до приблизительно 20 мкг/л, стабильно увеличивало общую и удельную активность rvWF и rA13 и/или также могло приводить к увеличению общего выхода белка. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложены способы и композиции для высокопродуктивного получения rvWF и белков rA13 с высокой удельной активностью.
- 8 035147
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток и композиции для получения больших количеств rvWF и rA13, обладающих активностью, сравнимой или превышающей активность, проявляемую происходящим из плазмы vWF (pdvWF) или происходящим из плазмы ADAMTS13 (pdA13). Согласно дальнейшим аспектам белки rvWF и rA13, получаемые согласно настоящему изобретению, демонстрируют стабильно более высокую активность по сравнению с белками, получаемыми с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящей заявке. Удачным образом, согласно определенным вариантам реализации описанных в настоящей заявке способов и композиций, белки rvWF и rA13, полученные согласно настоящему изобретению, проявляют стабильно более высокую удельную активность (т.е. Е/мг белка) по сравнению с белками, полученными с применением стандартных способов культивирования клеток в средах без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящей заявке. Сходным образом, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы получения rvWF и rA13 дают больший выход активности на объем культуры (т.е. Е/л/день), по сравнению со стандартными способами культивирования клеток с применением сред без добавления меди или других добавок, подробно описываемых в настоящей заявке.
Согласно еще одному аспекту в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 2 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют медь до получения общей концентрации, составляющей по меньшей мере от приблизительно 1 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации общая концентрация меди составляет приблизительно 1,5-4,5 мкг/л. Согласно определенным вариантам реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь до получения приблизительно 1; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8; 3; 3,2; 3,4; 3,6; 3,8; 4; 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20 мкг/л меди или более. Основные среды для клеточных культур как правило, содержат следовые концентрации меди менее 1 мкг/л.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л меди для продуцирования rvWF. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,5-15; 2,0-10; 2,58; 3,0-6; 4,0-5,0 мкг/л меди для продуцирования rvWF. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат.
Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы культивирования клеток, согласно которым в основную среду для клеточной культуры добавляют от приблизительно 1,5 до приблизительно 4 мкг/л меди для продуцирования rA13. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основную среду для клеточной культуры добавляют приблизительно 1,6-3,8; 1,7-3,6; 1,8-3,4; 1,9-3,2; 2,0-3,0; 2,1-2,8; 2,2-2,6; 2,3-2,4 мкг/л меди для продуцирования rA13. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры может, помимо добавленной меди, также содержать один или более гидролизат. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры включает, помимо меди и/или одного или более гидролизата, от приблизительно 1,0 до приблизительно 30 мкМ цинка. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанная основная среда для клеточной культуры также содержит, помимо меди и/или одного или более гидролизата и/или цинка, приблизительно от 0,5 до приблизительно 5,0 мМ кальция.
Согласно дальнейшему аспекту и в соответствии со всеми вышеизложенными в соответствии с настоящим изобретением предложены способы культивирования клеток, согласно которым уровни аммония в растворе культуры клеток являются низкими (менее 10 мМ). Согласно определенным вариантам реализации в способах культивирования клеток согласно настоящему изобретению применяют среды для клеточных культур, содержащие более 1, 2, 3, 4 или 5 мкг/л меди в комбинации с низкими уровнями аммония.
Одним из преимуществ способов и композиций согласно настоящему изобретению является то, что они подходят для крупномасштабного культивирования клеток. Объем указанных крупномасштабных культур клеток составляет по меньшей мере 10, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 5000, 10000 или 20000 л.
Согласно определенным аспектам способы согласно настоящему изобретению не обязательно приводят к получению большего суммарного количества рекомбинантного белка, однако получаемый рекомбинантный белок (rvWF или rA13) демонстрирует более высокую общую и удельную активность, чем обнаруживаемая у белков, полученных с применением стандартных клеточных культур, в частности, по сравнению с белками, полученными в таких культурах клеток, где среда для клеточной культуры не содержит дополнительных добавок меди. Согласно дальнейшим аспектам белки rvWF и rA13, полученные из клеток, культивируемых в средах с добавлением меди, демонстрируют стабильно повышенную
- 9 035147 активность на 1 л культуры клеток по сравнению с клетками, культивируемыми в основных средах для клеточных культур без добавления меди. Согласно дальнейшим аспектам добавление в среды меди согласно настоящему изобретению приводит к повышению выхода белка, увеличению числа клеток в культуре и/или повышению общей активности на 1 л культуры по сравнению со средами без добавления меди.
Дальнейшие преимущества способов и композиций согласно настоящему изобретению заключаются в получении популяции белков с высоким процентным содержанием (более 10%) высокомультимеризованного rvWF.
Хотя значительная часть обсуждения белков ADAMTS в настоящей заявке относится к ADAMTS13 (А13), необходимо понимать, что, так как все белки ADAMTS имеют общую структуру центрального домена и общие структурно-функциональные связи, способы и композиции, описанные в настоящей заявке, применимы для получения любых белков ADAMTS, не ограничиваясь rA13.
I. Определения.
Используемый в настоящей заявке термин рекомбинантный vWF включает vWF, полученный с применением технологии рекомбинантной ДНК. Согласно определенным вариантам реализации белки vWF согласно настоящему изобретению могут содержать конструкцию, полученную, например, согласно WO 1986/06096, опубликованной 23 октября 1986 г., и заявке на патент США сер. № 07/559509, поданной 23 июля 1990 г. от имени Ginsburg et al., включенных в настоящую заявку посредством ссылки в отношении способов получения рекомбинантного vWF. vWF согласно настоящему изобретению может включать все потенциальные формы, в том числе мономерные и мультимерные формы. Необходимо также понимать, что настоящее изобретение охватывает применение комбинаций разных формы vWF. Например, vWF согласно настоящему изобретению может включать разные мультимеры, разные производные; как активные биологически производные, так и не активные биологические производные.
Термин рекомбинантный при использовании, например, в отношении клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора означает, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы введением гетерологичной(ного) нуклеиновой кислоты или белка, либо изменением нативной(ного) нуклеиновой кислоты или белка, или что указанная клетка получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не обнаруживаемые в нативных (не-рекомбинантных) формах указанных клеток или экспрессируют нативные гены, которые в противном случае экспрессируются аномально, экспрессируются недостаточно или не экспрессируются вообще.
В контексте настоящего изобретения рекомбинантный vWF охватывает любые члены семейства vWF, например, от млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи; и их биологически активные производные. Согласно предпочтительному варианту реализации рекомбинантный vWF представляет собой vWF человека. Мутантные и вариантные белки vWF, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков vWF. Кроме того, vWF согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. vWF, описанные в настоящей заявке, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.
Термины высокомультимерный vWF, высокомолекулярный vWF и HMW vWF могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к ковалентно связанным мультимерам vWF, содержащим более чем 10 димеров vWF. Согласно определенным вариантам реализации HMW vWF содержит по меньшей мере 11 димеров vWF или по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или более димеров vWF.
Используемый в настоящей заявке термин белок ADAMTS относится к полипептиду - дезинтегрину и металлопротеиназе из семейства металлопротеиназ с мотивами тромбоспондина I типа. Члены указанного семейства включают белки человека ADAMTS1 (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS12 (NM_030955), ADAMTS13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722),
ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS16 (NM_139056), ADAMTS17 (NM_139057), ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19 (NM_133638) и ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). Белки ADAMTS включают и полноразмерные белки, и неполные полипептиды, которые проявляют, по меньшей мере, частичную биологическую активность, например по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или более, от активности, демонстрируемой полноразмерным белком, в частности протеазной активности, демонстрируемой полноразмерным белком. В определенных случаях белок ADAMTS подвергается посттрансляционной модификации in vivo или in vitro, например, ферментативным или химическим путем. Понятно, что белки ADAMTS согласно настоящему изобретению включают изоформы альтернативного сплайсинга, консервативно модифицированные белки, идентичные, по существу, белки, гомологи и т.п.
- 10 035147
В контексте настоящего изобретения термин белок ADAMTS охватывает любые члены семейства ADAMTS, происходящие, например, из млекопитающих, таких как приматы, человек, обезьяна, кролик, свинья, грызуны, мышь, крыса, хомяк, песчанка, собачьи, кошачьи, и их биологически активные производные. Мутантные и вариантные белки ADAMTS, обладающие активностью, также включены, как и функциональные фрагменты и гибриды белков ADAMTS. Кроме того, белки ADAMTS согласно настоящему изобретению могут также содержать метки, облегчающие очистку или определение, или и то, и другое. Белки ADAMTS, описанные в настоящей заявке, могут также быть модифицированы терапевтическим агентом или агентом, подходящим для визуализации in vitro или in vivo.
Используемый в настоящей заявке термин белок ADAMTS13 относится к любому белку или полипептиду, обладающему активностью ADAMTS13, в частности способностью расщеплять пептидную связь между остатками Tyr-842 и Met-843 в vWF. Согласно типовому варианту реализации белок ADAMTS13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620594 (изоформа 1 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75-1427 NP_620594 (изоформа 1 ADAMTS13, зрелый полипептид). Согласно другому варианту реализации белок ADAMTS13 относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620596 (изоформа 2 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75-1371 NP_620594 (изоформа 2 ADAMTS13, зрелый полипептид). Согласно еще одному из вариантов реализации ADAMTS13 белки включают полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в значительной степени сходную с таковой NP_620595 (изоформа 3 ADAMTS13, препробелок) или аминокислотами 75-1340 NP_620595 (изоформа 1 ADAMTS13, зрелый полипептид). Используемый в настоящей заявке термин белок ADAMTS13 включает природные варианты, обладающие vWF-расщепляющей активностью, и искусственные конструкции, обладающие vWFрасщепляющей активностью. Согласно применению в настоящем описании ADAMTS13 охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, сохраняющие некоторую степень основной активности. Примеры мутаций ADAMTS13, обнаруживаемые в популяциях человека, включают без ограничений R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, А1033Т, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, для многих из которых показана связь с тромботической тромбоцитопенической пурпурой (ТТП). Белки ADAMTS13 также включают полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации. Например, показано, что ADAMTS13 модифицируется N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) по остаткам 614, 667 и 1354, и предсказано, что остатки 142, 146, 552, 579, 707, 828 и 1235 могут также модифицироваться таким образом.
Протеолитически активный рекомбинантный ADAMTS13 может быть получен посредством осуществления экспрессии в культурах клеток млекопитающих согласно описанию у Plaimauer et al., (2002, Blood. 15; 100(10):3626-32) и в US 2005/0266528, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Способы экспрессии рекомбинантного ADAMTS13 в культуре клеток описаны у Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol. 2004 Jan; 41(1):24-33 и в US 2011/008 6413, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин биологически активное производное при использовании в контексте белка ADAMTS охватывает также полипептиды, полученные с применением технологии рекомбинантной ДНК, что может включать любые известные в данной области техники способы: (i) получения рекомбинантной ДНК посредством методов генной инженерии, например посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК, (ii) введения рекомбинантной ДНК в прокариотические или эукариотические клетки путем трансфекции, т.е. электропорацией или микроинъекцией, (iii) культивирования указанных трансформированных клеток, например, в непрерывном или периодическом режиме, (iv) экспрессии белка ADAMTS, например конститутивного или индуцируемого, и (v) выделения указанного белка ADAMTS, например, из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток, (vi) получения существенно очищенного рекомбинантного белка ADAMTS, например, с помощью ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием и т.п. Термин биологически активное производное включает также гибридные молекулы, такие как, например, белок ADAMTS или его функциональный фрагмент, скомбинированный с вторым полипептидом, например доменом Fc иммуноглобулина или альбуминовым доменом, для улучшения биологических/фармакологических параметров, таких как, например, период полужизни белка ADAMTS в кровотоке млекопитающего, в частности человека.
Термины выделенный, очищенный или биологически чистый относятся к веществу, практически или по существу не содержащему компонентов, обычно сопутствующих ему в естественном состоянии. Чистоту и гомогенность, как правило, определяют с применением техник аналитической химии, таких как электрофорез в полиакриламидном геле или жидкостная хроматография высокого разрешения. Согласно одному из вариантов реализации rvWF представляет собой преобладающий компонент в существенно очищенном составе. Согласно другому варианту реализации rA13 представляет собой преобла
- 11 035147 дающий компонент в существенно очищенном составе. Термин очищенный согласно некоторым вариантам реализации означает, что нуклеиновая кислота или белок дают, по существу, одну полосу в электрофоретическом геле. Согласно другим вариантам реализации это означает, что чистота указанной(ого) нуклеиновой кислоты или белка составляет по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или более. Чистота или очистка согласно другим вариантам реализации означает удаление по меньшей мере одного загрязнителя из подвергаемой очищению композиции. В этом смысле очистка не подразумевает, что очищенное соединение будет гомогенным, например чистым на 100%.
Биологическая активность vWF может быть измерена посредством известных методов анализа in vitro. Например, ристоцетин-кофакторный анализ основан на агглютинации свежих или фиксированных формалином тромбоцитов, индуцированной антибиотиком ристоцетином в присутствии vWF. Степень агглютинации тромбоцитов зависит от концентрации vWF и может быть измерена турбодиметрическим методом, например, с применением агрегометра (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). В настоящей заявке удельную ристоцетинкофакторную активность vWF согласно настоящему изобретению выражают в мЕ/мкг vWF согласно оценке с применением методов анализа in vitro.
Используемый в настоящей заявке термин одна единица активности ADAMTS означает уровень активности в 1 мл смешанной нормальной плазмы человека, независимо от того, какой метод анализа применяют. Например, в том случае, если белок ADAMTS представляет собой ADAMTS13, одна единица активности ADAMTS13 FRETS-vWF73 представляет собой уровень активности, необходимый для расщепления такого же количества субстрата FRETS-vWF73 (Kokame et al., Br J Haematol. 2005 Apr; 129(1):93-100), которое расщепляется одним мл смешанной нормальной плазмы человека. Удобно, что активность ADAMTS13 может быть определена методами функционального анализа, такими как функциональный анализ с применением модифицированных пептидов фактора фон Виллебранда в качестве субстрата ADAMTS13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. 2008 Sep; 6(9): 1534-41). Предпочтительный способ определения активности рекомбинантного ADAMTS13 человека описан у Gerritsen et al. (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) (Анализ протеазы, расщепляющей фактор фон Виллебранда (vWF), основанный на понижении коллаген-связывающей способности деградированного vWF: инструмент для диагностики тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТП)), Thromb Haemost 1999; 82: 1386-1389). Согласно одному из вариантов реализации, чтобы считаться белком ADAMTS13 согласно приведенному выше определению, полипептид или белок должен обладать по меньшей мере 1% vWF-расщепляющей активности нативного ADAMTS13. Согласно другим вариантам реализации белок ADAMTS13 обладает по меньшей мере 10% активности нативного ADAMTS13. Согласно другим вариантам реализации белок ADAMTS13 обладает по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100% активности нативного ADAMTS13. Количество белка ADAMTS13 также может быть определено измерением антигена ADAMTS13, например, с применением метода ИФА (ELISA), описанного у Rieger et al., (2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20). В данной области техники общепризнано, что 1 мл смешанной нормальной плазмы человека содержит 1 мкг ADAMTS13. Таким образом, согласно общепринятому в данной области техники правилу 1 мкг полученного из плазмы ADAMTS13 обладает одной единицей активности ADAMTS13.
Термины раствор культуры клеток, среда или среды для клеточной культуры и супернатант культуры клеток относятся к аспектам процессов культивирования клеток, как правило, общеизвестным в данной области техники. В контексте настоящего изобретения раствор культуры клеток может включать среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток. Указанные среды для клеточных культур вводят в раствор культуры клеток извне, необязательно вместе с добавками, для обеспечения питательных веществ и других компонентов для культивирования клеток, экспрессирующих rvWF или rA13. Термин супернатант культуры клеток относится к раствору культуры клеток, содержащему питательные вещества и другие компоненты из среды для клеточной культуры, а также продукты, высвобождаемые, метаболизируемые и/или экскретируемые клетками во время культивирования, но не сами клетки. Таким образом, согласно одному контексту супернатант культуры клеток может относиться к жидкой фазе раствора культуры клеток (т.е. к раствору культуры клеток, исключая клетки). Например, концентрация аммония культурального супернатанта, как правило, относится к концентрации аммония в растворе культуры клеток. Согласно другим контекстам супернатант культуры клеток относится к раствору культуры клеток, из которого указанные клетки были извлечены (т.е. отделенному супернатанту культуры клеток).
Используемые в настоящей заявке термины витамин B3, никотинамид, ниацинамид, ниацин и никотиновая кислота могут использоваться взаимозаменяемо, относясь к любому члену семейства витаминов B3. Соответственно любой член указанного семейства может быть использован для добавления в среду, применяемую в способах согласно настоящему изобретению.
Используемый в настоящей заявке термин среда с заданным химическим составом или среды с заданным химическим составом относится к синтетической ростовой среде, все компоненты которой
- 12 035147 идентифицированы и их концентрации известны. Среды с заданным химическим составом не содержат бактериальных, дрожжевых, животных или растительных экстрактов, хотя они могут включать или не включать отдельные компоненты растительного или животного происхождения (например, белки, полипептиды и т.п.). Неограничивающие примеры коммерчески доступных сред с заданным химическим составом включают различные модифицированные по Дульбекко среды Игла (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), питательную смесь Хэма (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), их комбинации и т.п. Способы получения культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например в патентах США №№ 6171825 и 6936441, WO 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США №№ 2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин не содержащая олигопептидов культуральная среда или не содержащие олигопептидов культуральные среды относится к не содержащей белков среде, которая не содержит олигопептиды, такие как, например, олигопептиды, полученные из белкового гидролизата. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда не содержит олигопептиды, состоящие из двадцати или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пятнадцать или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие десять или более аминокислот. Согласно одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие семь или более аминокислот. Согласно другому варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие пять или более аминокислот. Согласно еще одному варианту реализации указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие три или более аминокислоты. Согласно дальнейшему варианту реализации настоящего изобретения указанная среда не содержит олигопептиды, содержащие две или более аминокислоты. Способы получения не содержащих олигопептидов культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США №№ 6171825 и 6936441, WO 2007/077217, и опубликованных заявках на патент США № 2008/0009040 и № 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин бессывороточная культуральная среда или бессывороточная культуральные среды относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки. Несмотря на то что зачастую бессывороточные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, в бессывороточные среды могут быть добавлены отдельные животные или растительные белки или белковые фракции. Способы получения бессывороточных культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США №№ 6171825 и 6936441, WO 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США №№ 2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термин не содержащая животных белков культуральная среда или не содержащие животных белков культуральные среды относится к культуральной среде без добавления животной сыворотки, белка или фракции белка. Хотя зачастую не содержащие животных белков культуральные среды представляют собой среды с заданным химическим составом, не содержащие животных белков культуральные среды могут содержать растительные или дрожжевые гидролизаты. Способы получения не содержащих животных белков культуральных сред известны в данной области техники, например в патентах США №№ 6171825 и 6936441, WO 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США №№ 2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Используемый в настоящей заявке термины основная (базовая)среда для клеточной культуры или основные (базовые) среды для клеточных культур относятся к культуральной среде с заданным химическим составом, не содержащей олигопептидов культуральной среде, бессывороточной культуральной среде или не содержащей животных белков культуральной среде, в которую не был добавлен гидролизат, например растительный или дрожжевой гидролизат. Основные среды общеизвестны в данной области техники, например DMEM, Хэма F12, DMEM/Хэма F12, среда 199, McCoy или RPMI. Указанная основная среда может включать ряд ингредиентов, в том числе аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, обеспечивающем культивирование клетки; такие количества общеизвестны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому напряжению или ингибиторы протеазы. При необходимости, могут быть добавлены неионогенные ПАВ, такие как сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.
II. Среды для клеточных культур и супернатант культуры клеток.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения rvWF и/или rA13, обладающих повышенной активностью по сравнению с rvWF и rA13, полученных с применением основных сред для клеточных культур. Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к средам для клеточных культур для получения rvWF и/или rA13, в которых в основ
- 13 035147 ные среды для клеточных культур добавляют одно или более дополнительное вещество. Согласно конкретным вариантам реализации и приведенному ниже более подробному описанию условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению включают основные среды для клеточных культур, в которые добавлена медь до концентрации по меньшей мере 1,0 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации применяемые среды для клеточных культур и супернатанты, полученные с помощью процессов согласно настоящему изобретению, также содержат низкие уровни (менее 10 мМ) аммония. Согласно конкретному варианту реализации условиями культивирования клеток, применяемыми для экспрессии rvWF и/или rA13, управляют таким образом, чтобы поддерживать в супернатанте культуры клеток низкий уровень аммония, т.е. менее чем 10 мМ и предпочтительно менее чем 5 мМ.
Культуральная среда согласно настоящему изобретению могут быть основаны на подходящих основных средах, общеизвестных в данной области техники, таких как DMEM, Хэма F12, DMEM/Хэма F12, среда 199, McCoy или RPMI. Основная среда может включать ряд ингредиентов, включая аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли и источники углеводов. Каждый ингредиент может присутствовать в количестве, содействующем культивированию клетки; такие количества, как правило, известны специалистам в данной области техники. Указанная среда может включать вспомогательные вещества, такие как буферные вещества, например бикарбонат натрия, антиоксиданты, стабилизаторы для противодействия механическому стрессу, или ингибиторы протеазы. При необходимости может быть добавлено неионогенное ПАВ, например сополимеры и/или смеси полиэтиленгликолей и полипропиленгликолей.
Как правило, основные среды содержат менее чем 1 мкг/л меди, например среда DMEM/Хэма F12 содержит медь в концентрации приблизительно 0,3 мкг/л. Такие концентрации меди не обеспечивают достаточного количества ионов меди для поддержания продуцирования белков rvWF и rA13 согласно настоящему изобретению, которые проявляют высокую удельную активность.
Медь может быть введена в среды для клеточных культур согласно настоящему изобретению с помощью различных способов, например введением добавки в среду. Согласно некоторым вариантам реализации указанная добавка в культуральную среду может содержать гидролизат, который можно применять для повышения концентрации меди в указанной среде. Гидролизаты могут включать любой гидролизат из общеизвестных в данной области техники, таких как растительные гидролизаты, соевые гидролизаты и гидролизат пшеничной клейковины. Согласно определенным вариантам реализации добавление гидролизата может способствовать повышенной концентрации меди от приблизительно 0,2 до приблизительно 10 мкг/л Cu2+. Согласно некоторым вариантам реализации количество меди, обеспеченное гидролизатом, может зависеть от количества меди в указанном гидролизате, а также количества добавленного гидролизата. Содержание меди в гидролизате может быть определено элементным анализом, например адсорбционной атомной спектроскопией (GFAA: атомной абсорбцией в графитовой печи), или массспектрометрическими методами (например, ИСП-МС).
Согласно определенным вариантам реализации медь может вводиться в культуральные среды, сама по себе или вместе с гидролизатом, путем введения средовой добавки, включая подходящую соль меди или хелат меди. Подходящая медь соли может включать, не ограничиваясь перечисленными, сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди и оксид меди. Подходящие хелаторы меди могут включать, не ограничиваясь перечисленными, альбумин, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), полиаминовые хелатирующие агенты, этилендиамин, диэтилентриамин, триэтилентетрамин, триэтилендиамин, тетраэтиленпентамин, аминоэтилэтаноламин, аминоэтилпиперазин, пентаэтиленгексамин, триэтилентетрамин-гидрохлорид, тетраэтиленпентамин-гидрохлорид, пентаэтиленгексамин-гидрохлорид, тетраэтилпентамин, каптоприл, пеницилламин, Х,Х'-бис-(3-аминопропил)-1,3пропандиамин, N,N, бис-(2-аминоэтил)-1,3-пропандиамин, 1,7-диокса-4,10-диазациклододекан, 1,4,8,11тетраазациклотетрадекан-5,7-дион, 1,4,7-триазациклононана тригидрохлорид, 1-окса-4,7,10триазациклододекан, 1,4,8,12-тетраазациклопентадекан и 1,4,7,10-тетраазациклододекан.
Согласно определенным вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди от приблизительно 1,0 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно конкретному варианту реализации в основные клеточные среды добавляют медь до конечной концентрации от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения конечной концентрации приблизительно 1,0-5,0; 1,2-4,0; 1,3-3,0; 1,4-2,9; 1,5-2,8; 1,6-2,7; 1,7-2,6; 1,8-2,5; 1,9-2,4; 2,0-2,3; 2,1-2,2 мкг/л меди. Согласно дальнейшим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 1,2-9,5; 1,4-9; 1,6-8,5; 1,8-8; 2,0-7,5; 2,2-7; 2,4-6,5; 2,6-6,0; 2,8-5,5; 3,0-5,0; 3,2-4,5; 3,4-4 и 2-4 мкг/л. Согласно другим вариантам реализации основные среды для клеточных культур, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, дополняют до получения концентраций меди приблизительно 1-6, 2-5, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2 мкг/л. Согласно еще одному
- 14 035147 из вариантов реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно определенным вариантам реализации в основные среды для клеточных культур добавляют медь до получения общей концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1 мкг/л или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 мкг/л меди или более. Согласно определенным вариантам реализации и более подробному описанию ниже в настоящей заявке культуры для получения rA13 могут содержать приблизительно 2-4 мкг/л меди, тогда как культуры для получения rvWF могут содержать по меньшей мере 2 мкг/л меди.
Вышеуказанные концентрации представляют собой относительные концентрации чистой меди в форме двухвалентного иона меди (Cu2+). Если используется производное меди, например гидратированная соль, или соединение, содержащее медь, например хелатор меди, указанное количество производного или хелатора добавляют таким образом, что конечная концентрация меди попадает в указанные в настоящей заявке диапазоны. Например, 2 мкг/л CuSO4-5H2O эквивалентны концентрации меди, составляющей приблизительно 0,51 мкг/л (без сульфата и 5H2O).
Удачным образом, было обнаружено, что применение в процессе культивирования клеток среды для клеточной культуры, обеспечивающей низкие концентрации (NH4 +) в растворе культуры клеток (т.е. в культуральном супернатанте), приводит к экспрессии рекомбинантного vWF и/или rA13 с более высокой удельной активностью. Соответственно согласно определенным вариантам реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 5 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 4 мМ. Согласно другим вариантам реализации концентрация NH4+ в указанном супернатанте составляет не более чем 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее.
Соответственно согласно определенным вариантам реализации способы и композиции, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, основаны на применении основных сред для клеточных культур с добавлением меди (например, до конечной концентрации, составляющей меньшей мере 2 мкг/л) для применения в процессе, который приводит к концентрации NH4+ в супернатанте, составляющей не более 10 мМ. Согласно другим вариантам реализации основную среду для клеточной культуры дополняют для получения конечных концентраций меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.
Таблица 1
Типовые варианты концентраций меди и аммония в культуральных средах и супернатанте, подходящих для экспрессии рекомбинантных белков согласно настоящему описанию
III. IV. Концентрация аммония
но. НБЧ Юм М НБЧ 9мМ НБЧ 8мМ НБЧ 7мМ НБЧ 6мМ НБЧ 5мМ НБЧ 4мМ НБЧ ЗмМ НБЧ 2мМ НБЧ 1мМ
Концентрация меди пмм 1 мкг/л Вар. 1 Вар. 41 Вар. 81 Вар. 121 Вар. 161 Вар. 201 Вар. 241 Вар. 281 Вар. 321 Вар. 361 Вар. 401
ПММ 2 мкг/л Вар. 2 Вар. 42 Вар. 82 Вар. 122 Вар. 162 Вар. 202 Вар. 242 Вар. 282 Вар. 322 Вар. 362 Вар. 402
ПММ 3 мкг/л Вар. 3 Вар. 43 Вар. 83 Вар. 123 Вар. 163 Вар. 203 Вар. 243 Вар. 283 Вар. 323 Вар. 363 Вар. 403
ПММ 4 мкг/л Вар. 4 Вар. 44 Вар. 84 Вар. 124 Вар. 164 Вар. 204 Вар. 244 Вар. 284 Вар. 324 Вар. 364 Вар. 404
ПММ 5 мкг/л Вар. 5 Вар. 45 Вар. 85 Вар. 125 Вар. 165 Вар. 205 Вар. 245 Вар. 285 Вар. 325 Вар. 365 Вар. 405
ПММ 6 мкг/л Вар. 6 Вар. 46 Вар. 86 Вар. 126 Вар. 166 Вар. 206 Вар. 246 Вар. 286 Вар. 326 Вар. 366 Вар. 406
ПММ 7 мкг/л Вар. 7 Вар. 47 Вар. 87 Вар. 127 Вар. 167 Вар. 207 Вар. 247 Вар. 287 Вар. 327 Вар. 367 Вар. 407
- 15 035147
пмм 8 мкг/л Вар. 8 Вар. 48 Вар. 88 Вар. 128 Вар. 168 Вар. 208 Вар. 248 Вар. 288 Вар. 328 Вар. 368 Вар. 408
ПММ 9 мкг/л Вар. 9 Вар. 49 Вар. 89 Вар. 129 Вар. 169 Вар. 209 Вар. 249 Вар. 289 Вар. 329 Вар. 369 Вар. 409
ПММ 10 мкг/л Вар. 10 Вар. 50 Вар. 90 Вар. 130 Вар. 170 Вар. 210 Вар. 250 Вар. 290 Вар. 330 Вар. 370 Вар. 410
Приблизительно 1 мкг/л Вар. 11 Вар. 51 Вар. 91 Вар. 131 Вар. 171 Вар. 211 Вар. 251 Вар. 291 Вар. 331 Вар. 371 Вар. 411
Приблизительно 1,5 мкг/л Вар. 12 Вар. 52 Вар. 92 Вар. 132 Вар. 172 Вар. 212 Вар. 252 Вар. 292 Вар. 332 Вар. 372 Вар. 412
Приблизительно 2 мкг/л Вар. 13 Вар. 53 Вар. 93 Вар. 133 Вар. 173 Вар. 213 Вар. 253 Вар. 293 Вар. 333 Вар. Вар. 413
Приблизительно 2,5 мкг/л Вар. 14 Вар. 54 Вар. 94 Вар. 134 Вар. 174 Вар. 214 Вар. 254 Вар. 294 Вар. 334 Вар. 374 Вар. 414
Приблизительно 3 мкг/л Вар. 15 Вар. 55 Вар. 95 Вар. 135 Вар. 175 Вар. 215 Вар. 255 Вар. 295 Вар. 335 Вар. 375 Вар. 415
Приблизительно 3,5 мкг/л Вар. 16 Вар. 56 Вар. 96 Вар. 136 Вар. 176 Вар. 216 Вар. 256 Вар. 296 Вар. 336 Вар. 376 Вар. 416
Приблизительно 4 мкг/л Вар. 17 Вар. 57 Вар. 97 Вар. 137 Вар. 177 Вар. 217 Вар. 257 Вар. 297 Вар. 337 Вар. 377 Вар. 417
Приблизительно 4,5 мкг/л Вар. 18 Вар. 58 Вар. 98 Вар. 138 Вар. 178 Вар. 218 Вар. 258 Вар. 298 Вар. 338 Вар. 378 Вар. 418
Приблизительно 5 мкг/л Вар. 19 Вар. 59 Вар. 99 Вар. 139 Вар. 179 Вар. 219 Вар. 259 Вар. 299 Вар. 339 Вар. 379 Вар. 419
Приблизительно 5,5 мкг/л Вар. 20 Вар. 60 Вар. 100 Вар. 140 Вар. 180 Вар. 220 Вар. 260 Вар. 300 Вар. 340 Вар. 380 Вар. 420
Приблизительно 6 мкг/л Вар. 21 Вар. 61 Вар. 101 Вар. 141 Вар. 181 Вар. 221 Вар. 261 Вар. 301 Вар. 341 Вар. 381 Вар. 421
Приблизительно 7 мкг/л Вар. 22 Вар. 62 Вар. 102 Вар. 142 Вар. 182 Вар. 222 Вар. 262 Вар. 302 Вар. 342 Вар. 382 Вар. 422
Приблизительно 8 мкг/л Вар. 23 Вар. 63 Вар. 103 Вар. 143 Вар. 183 Вар. 223 Вар. 263 Вар. 303 Вар. 343 Вар. 383 Вар. 423
Приблизительно 9 мкг/л Вар. 24 Вар. 64 Вар. 104 Вар. 144 Вар. 184 Вар. 224 Вар. 264 Вар. 304 Вар. 344 Вар. 384 Вар. 424
Приблизительно 10 мкг/л Вар. 25 Вар. 65 Вар. 105 Вар. 145 Вар. 185 Вар. 225 Вар. 265 Вар. 305 Вар. 345 Вар. 385 Вар. 425
1-20 мкг/л Вар. 26 Вар. 66 Вар. 106 Вар. 146 Вар. 186 Вар. 226 Вар. 266 Вар. 306 Вар. 346 Вар. 386 Вар. 426
2-20 мкг/л Вар. 27 Вар. 67 Вар. 107 Вар. 147 Вар. 187 Вар. 227 Вар. 267 Вар. 307 Вар. 347 Вар. 387 Вар. 427
1-10 мкг/л Вар. 28 Вар. 68 Вар. 108 Вар. 148 Вар. 188 Вар. 228 Вар. 268 Вар. 308 Вар. 348 Вар. 388 Вар. 428
2-10 мкг/л Вар. 29 Вар. 69 Вар. 109 Вар. 149 Вар. 189 Вар. 229 Вар. 269 Вар. 309 Вар. 349 Вар. 389 Вар. 429
1-6 мкг/л Вар. 30 Вар. 70 Вар. НО Вар. 150 Вар. 190 Вар. 230 Вар. 270 Вар. 310 Вар. 350 Вар. 390 Вар. 430
2-6 мкг/л Вар. 31 Вар. 71 Вар. 111 Вар. 151 Вар. 191 Вар. 231 Вар. 271 Вар. 311 Вар. 351 Вар. 391 Вар. 431
3-6 мкг/л Вар. 32 Вар. 72 Вар. 112 Вар. 152 Вар. 192 Вар. 232 Вар. 272 Вар. 312 Вар. 352 Вар. 392 Вар. 432
4-6 мкг/л Вар. 33 Вар. 73 Вар. 113 Вар. 153 Вар. 193 Вар. 233 Вар. 273 Вар. 313 Вар. 353 Вар. 393 Вар. 433
1-5 мкг/л Вар. 34 Вар. 74 Вар. 114 Вар. 154 Вар. 194 Вар. 234 Вар. 274 Вар. 314 Вар. 354 Вар. 394 Вар. 434
2-5 мкг/л Вар. 35 Вар. 75 Вар. 115 Вар. 155 Вар. 195 Вар. 235 Вар. 275 Вар. 315 Вар. 355 Вар. 395 Вар. 435
3-5 мкг/л Вар. 36 Вар. 76 Вар. 116 Вар. 156 Вар. 196 Вар. 236 Вар. 276 Вар. 316 Вар. 356 Вар. 396 Вар. 436
4-5 мкг/л Вар. 37 Вар. 77 Вар. 117 Вар. 157 Вар. 197 Вар. 237 Вар. 277 Вар. 317 Вар. 357 Вар. 397 Вар. 437
1-4 мкг/л Вар. 38 Вар. 78 Вар. 118 Вар. 158 Вар. 198 Вар. 238 Вар. 278 Вар. 318 Вар. 358 Вар. 398 Вар. 438
2-4 мкг/л Вар. 39 Вар. 79 Вар. 119 Вар. 159 Вар. 199 Вар. 239 Вар. 279 Вар. 319 Вар. 359 Вар. 399 Вар. 439
3-4 мкг/л Вар. 40 Вар. 80 Вар. 120 Вар. 160 Вар. 200 Вар. 240 Вар. 280 Вар. 320 Вар. 360 Вар. 400 Вар. 440
*Н.О.=не определено, *НБЧ=не более чем, *ПММ=по меньшей мере.
Согласно некоторым вариантам реализации добавление в среды меди согласно настоящему изобретению производится путем дополнения основных сред, не содержащих животных белков и/или сред с заданным химическим составом. Способы получения не содержащих животных белков и культуральных сред с заданным химическим составом известны в данной области техники, например в патентах США №№ 6171825 и 6936441, WO 2007/077217 и в опубликованных заявках на патент США №№ 2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Согласно одному из вариантов реализации основная культуральная среда, применяемая в способах, описанных в настоящей заявке, представляет собой не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду. Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда может быть средой с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанные культуральные среды могут содержать по меньшей мере один полиамин в концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мг/л.
- 16 035147
Согласно дальнейшим вариантам реализации и в дополнение к любым описанным выше согласно настоящему изобретению предложены культуральные среды, для получения которых в основную среду добавляют медь и по меньшей мере что-либо одно из кальция, цинка и/или витамина B3. Согласно определенным вариантам реализации указанная среда может не содержать животных белков, не содержать олигопептидов или представлять собой среду с заданным химическим составом. Согласно определенным вариантам реализации указанную не содержащую животных белков или не содержащую олигопептидов среду получают согласно описанию в патентах США №№ 6171825 и 6936441, WO 2007/077217 и опубликованных заявках на патент США №№ 2008/0009040 и 2007/0212770, раскрытия которых включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей; оба источника включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей; и добавлением дополнительной меди и необязательно одного или более из кальция, цинка и витамина B3. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда с заданным химическим составом может быть сходной со смесью (1:1), модифицированной по Дульбекко среды Игла и среды Хэма F12 (DMEM/Хэма F12), куда добавлена дополнительная медь и необязательно кальций, цинк и/или витамин B3 для увеличения удельной активности rvWF или rA13, экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной среде. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда не содержит животных компонентов. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит белок, например животный белок из сыворотки, такой как эмбриональная телячья сыворотка. Согласно другому варианту реализации указанная культура содержит добавленные экзогенные рекомбинантные белки. Согласно другому варианту реализации указанные белки получены от сертифицированного свободного от патогенов животного.
Согласно определенным вариантам реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 0,5 до 10 мг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин принадлежит группе из орнитина, путресцина, спермина или спермидина или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина.
Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 30 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 0,5 до 10 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере один полиамин в концентрации, составляющей точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л, и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации указанный полиамин входит в группу из орнитина, путресцина, спермина или спермидина, или т.п. Согласно предпочтительному варианту реализации указанный полиамин представляет собой путресцин. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 8 мг/л путресцина и комбинацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.
Согласно дальнейшим аспектам помимо меди применяемые согласно настоящему изобретению среды для клеточных культур также могут содержать что-либо одно или более из: дополнительного кальция, цинка, одного или более витамина и любых их комбинаций.
Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль кальция; неограничивающие примеры приемлемых солей включают CaCl2, CaCl2, CaFPO3-2H2O, CaI2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3-2H2O и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль кальция.
Как правило, для добавления в среды согласно настоящему изобретению может применяться любая соль цинка; неограничивающие примеры приемлемых солей включают ZnSO4-7H2O, ZnSO3-2H2O, (C6H5O7)2Zn3-2H2O, ZnBr2, ZnBr2-2H2O, ZnCl2, Zn (NO3)2-6H2O, Zn (H2PO4)2-H2O, (C2H3O2)2Zn-2H2O и т.п. Согласно определенным вариантам реализации для добавления в культуральные среды согласно настоящему изобретению применяют фармацевтически приемлемую соль цинка. Согласно другим вариантам реализации цинксодержащий пептидный или белковый препарат, например инсулин, может применяться для добавления в описываемую в настоящей заявке культуру.
Согласно дальнейшим аспектам основные клеточные среды с добавлением меди и одного или более из описанных выше дополнительных веществ можно также применять в культурах с низкими уровнями
- 17 035147 аммония в супернатанте. Согласно определенным вариантам реализации дополненные среды для клеточных культур для применения согласно настоящему изобретения дают уровни аммония в растворе культуры клеток менее 10 мМ. Согласно дальнейшим вариантам реализации дополненную среду для клеточных культур согласно настоящему изобретению применяют при уровнях аммония в культуре клеток, составляющих приблизительно 0,5-9,5; 1,0-9,0; 1,5-8,5; 2,0-8,0; 2,5-7,5; 3,0-7,0; 3,5-6,5; 4,0-6,0; 4,5-5,5 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации указанные концентрации меди и аммония в среде для клеточных культур и супернатанте культуры клеток поддерживают на протяжении длительного периода времени в течение процесса производства. Согласно конкретному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония в культуре клеток поддерживают на протяжении процесса производства, т.е. в течение времени, пока rvWF или rA13 экспрессируют и выделяют из крупномасштабной культуры клеток. Согласно определенным вариантам реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в культуральном растворе на уровне согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные концентрации меди и аммония поддерживают в течение всего периода такого производственного процесса.
Согласно некоторым вариантам реализации культуральная среда, предложенная согласно настоящему изобретению, может быть представлена жидкой, сухой или порошковой формой. Указанная среда может быть предварительно разделена на аликвоты, содержащие количества, подходящие для однократного применения, либо большие количества, подходящие для более чем одной клеточной культуры. Как правило, среда согласно настоящему изобретению представлена в стерильном виде.
Ниже обсуждаются характерные особенности сред для клеточных культур, подходящих для получения rvWF или rA13. Несмотря на то что они описаны применительно либо к rvWF, либо к RA13, необходимо понимать, что любые приведенные ниже описания, относящиеся к rvWF, подходят и для RA13, и наоборот.
A. Среды для клеточных культур для получения рекомбинантного vWF.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к раствору культуры клеток для получения рекомбинантных vWF, более конкретно - высокомолекулярных vWF, обладающих высокой удельной активностью, которые описаны ниже в настоящей заявке. Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение предлагает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, содержащий среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные vWF, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающие удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации указанная культура клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно описанию выше. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF).
Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения среды для клеточных культур могут содержать медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, согласно другому варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 3 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 15 мкг/л, и согласно дальнейшему варианту реализации - по меньшей мере приблизительно 20 мкг/л.
Согласно другим вариантам реализации концентрация меди в среде для клеточных культур согласно настоящему изобретению может варьировать от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг г/л,
- 18 035147 согласно другому варианту реализации - от приблизительно 2,4 до приблизительно 15 мкг г/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 до приблизительно 10 мкг г/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 до приблизительно 8 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 2,4 до приблизительно 6 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 2,4 до приблизительно 4 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 до приблизительно 20 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 до приблизительно 15 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации - от приблизительно 4 до приблизительно 10 мкг/л, согласно еще одному варианту реализации от приблизительно 4 до приблизительно 8 мкг/л и согласно дальнейшему варианту реализации - от приблизительно 4 до приблизительно 6 мкг г/л.
Согласно настоящему изобретению также предложены наборы для экспрессии или получения rvWF; указанные наборы содержат культуральную среду, подходящую для экспрессии rvWF, обладающего высокой удельной активностью.
B. Среды для клеточных культур для получения ADAMTS13 (А13).
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает культуральные среды, подходящие для экспрессии белков ADAMTS, обладающих высокой удельной активностью. Удачным образом, было обнаружено, что добавление в культуральную среду меди значительно повышает активность рекомбинантных ферментов ADAMTS (например, rADAMTS13), экспрессируемых в клетках, культивируемых в указанной дополненной среде, в то время как указанные ферменты экспрессируются на уровнях, равных или превышающих таковые для клеток, культивируемых в среде без добавок.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение предлагает среды для клеточных культур с добавлением меди для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13 с высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди, составляющей от приблизительно 2 до приблизительно 4 мкг/л. Согласно дальнейшим вариантам реализации указанные среды дополняют до получения общей концентрации меди приблизительно 13, 2-3, 3-4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации указанные среды содержат медь в концентрации по меньшей мере 1 мкг/л. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит от 2 до 20 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 1 до 6 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 2 до 5 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации указанная среда содержит от 3 до 4 мкг/л меди. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди или по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 мкг/л либо более высокие концентрации меди.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит концентрацию меди и аммония согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно определенным вариантам реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают в течение длительного периода на уровне концентрации согласно приведенному выше описанию. Например, согласно одному из вариантов реализации концентрацию аммония поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 3 дней или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. Согласно
- 19 035147 другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или более цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.
Таблица 2
Типовые варианты реализации концентраций меди и цинка в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13
V. VI. Концентрация цинка
ПММ 2 мкМ ПМ М 3 мкМ ПМ М 4 мкМ ПМ м 5 мкМ ПМ м 6 мкМ ПМ М 7 мкМ ПМ М 8 мкМ ПМ М 9 мкМ ПМ м 10 мкМ 2- 12 мк М 5- 12 мк М
Концентрация меди пмм 1 мкг/л Вар. 441 Вар. 481 Вар. 521 Вар. 561 Вар. 601 Вар. 641 Вар. 681 Вар. 721 Вар. 761 Вар 801 Вар 841
ПММ 2 мкг/л Вар. 442 Вар. 482 Вар. 522 Вар. 562 Вар. 602 Вар. 642 Вар. 682 Вар. 722 Вар. 762 Вар 802 Вар 842
ПММ 3 мкг/л Вар. 443 Вар. 483 Вар. 523 Вар. 563 Вар. 603 Вар. 643 Вар. 683 Вар. 723 Вар. 763 Вар 803 Вар 843
ПММ 4 мкг/л Вар. 444 Вар. 484 Вар. 524 Вар. 564 Вар. 604 Вар. 644 Вар. 684 Вар. 724 Вар. 764 Вар 804 Вар 844
ПММ 5 мкг/л Вар. 445 Вар. 485 Вар. 525 Вар. 565 Вар. 605 Вар. 645 Вар. 685 Вар. 725 Вар. 765 Вар 805 Вар 845
ПММ 6 мкг/л Вар. 446 Вар. 486 Вар. 526 Вар. 566 Вар. 606 Вар. 646 Вар. 686 Вар. 726 Вар. 766 Вар 806 Вар 846
ПММ 7 мкг/л Вар. 447 Вар. 487 Вар. 527 Вар. 567 Вар. 607 Вар. 647 Вар. 687 Вар. 727 Вар. 767 Вар 807 Вар 847
ПММ 8 мкг/л Вар. 448 Вар. 488 Вар. 528 Вар. 568 Вар. 608 Вар. 648 Вар. 688 Вар. 728 Вар. 768 Вар 808 Вар 848
ПММ 9 мкг/л Вар. 449 Вар. 489 Вар. 529 Вар. 569 Вар. 609 Вар. 649 Вар. 689 Вар. 729 Вар. 769 Вар 809 Вар 849
ПММ 10 мкг/л Вар. 450 Вар. 490 Вар. 530 Вар. 570 Вар. 610 Вар. 650 Вар. 690 Вар. 730 Вар. 770 Вар 810 Вар 850
Приблизительно 1 мкг/л Вар. 451 Вар. 491 Вар. 531 Вар. 571 Вар. 611 Вар. 651 Вар. 691 Вар. 731 Вар. 771 Вар 811 Вар 851
Приблизительно 1.5 мкг/л Вар. 452 Вар. 492 Вар. 532 Вар. 572 Вар. 612 Вар. 652 Вар. 692 Вар. 732 Вар. 772 Вар 812 Вар 852
- 20 035147
Приблизительно 2 мкг/л Вар. 453 Вар. 493 Вар. 533 Вар. 573 Вар. 613 Вар. 653 Вар. 693 Вар. 733 Вар. 773 Вар 813 Вар 853
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
2.5 мкг/л 454 494 534 574 614 654 694 734 774 814 854
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
3 мкг/л 455 495 535 575 615 655 695 735 775 815 855
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
3,5 мкг/л 456 496 536 576 616 656 696 736 776 816 856
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
4 мкг/л 457 497 537 577 617 657 697 737 777 817 857
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
4.5 мкг/л 458 498 538 578 618 658 698 738 778 818 858
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
5 мкг/л 459 499 539 579 619 659 699 739 779 819 859
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
5.5 мкг/л 460 500 540 580 620 660 700 740 780 820 860
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
6 мкг/л 461 501 541 581 621 661 701 741 781 821 861
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
7 мкг/л 462 502 542 582 622 662 702 742 782 822 862
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
8 мкг/л 463 503 543 583 623 663 703 743 783 823 863
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
9 мкг/л 464 504 544 584 624 664 704 744 784 824 864
Приблизительно Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
10 мкг/л 465 505 545 585 625 665 705 745 785 825 865
1-20 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
466 506 546 586 626 666 706 746 786 826 866
2-20 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
467 507 547 587 627 667 707 747 787 827 867
1-10 мкг/ тт Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
1 IV IVllxl/Jl 468 508 548 588 628 668 708 748 788 828 868
2-10 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
469 509 549 589 629 669 709 749 789 829 869
1-6 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
470 510 550 590 630 670 710 750 790 830 870
2-6 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
471 511 551 591 631 671 711 751 791 831 871
3-6 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
472 512 552 592 632 672 712 752 792 832 872
4-6 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
473 513 553 593 633 673 713 753 793 833 873
1-5 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
474 514 554 594 634 674 714 754 794 834 874
2-5 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
475 515 555 595 635 675 715 755 795 835 875
3-5 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
476 516 556 596 636 676 716 756 796 836 876
4-5 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
477 517 557 597 637 677 717 757 797 837 877
1-4 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
478 518 558 598 638 678 718 758 798 838 878
2-4 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
479 519 559 599 639 679 719 759 799 839 879
3-4 мкг/л Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар. Вар Вар
480 520 560 600 640 680 720 760 800 840 880
*ПММ=по меньшей мере.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую кон
- 21 035147 центрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ, или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3.
- 22 035147
Таблица 3
Типовые варианты реализации концентраций меди и кальция в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13
VII. VIII. Концент рация кальция
ПМ м 0,5 мМ ПМ М 0,75 мМ ПМ М 1,0 мМ ПМ м 1,25 мМ ПМ М 1,5 мМ ПМ м 2,0 мМ ПМ М 2,5 мМ ПМ М 3,0 мМ ПМ М 4 мМ ПМ М 5 мМ 0,5- 1,5 мМ
Концентрация меди пмм 1 мкг/л Вар. 881 Вар. 921 Вар. 961 Вар. 1001 Вар. 1041 Вар. 1081 Вар. 1121 Вар. 1161 Вар. 1201 Вар. 1241 Вар 128 1
ПММ 2 мкг/л Вар. 882 Вар. 922 Вар. 962 Вар. 1002 Вар. 1042 Вар. 1082 Вар. 1122 Вар. 1162 Вар. 1202 Вар. 1242 Вар 128 2
ПММ 3 мкг/л Вар. 883 Вар. 923 Вар. 963 Вар. 1003 Вар. 1043 Вар. 1083 Вар. 1123 Вар. 1163 Вар. 1203 Вар. 1243 Вар 128 3
ПММ 4 мкг/л Вар. 884 Вар. 924 Вар. 964 Вар. 1004 Вар. 1044 Вар. 1084 Вар. 1124 Вар. 1164 Вар. 1204 Вар. 1244 Вар 128 4
ПММ 5 мкг/л Вар. 885 Вар. 925 Вар. 965 Вар. 1005 Вар. 1045 Вар. 1085 Вар. 1125 Вар. 1165 Вар. 1205 Вар. 1245 Вар 128 5
ПММ 6 мкг/л Вар. 886 Вар. 926 Вар. 966 Вар. 1006 Вар. 1046 Вар. 1086 Вар. 1126 Вар. 1166 Вар. 1206 Вар. 1246 Вар 128 6
ПММ 7 мкг/л Вар. 887 Вар. 927 Вар. 967 Вар. 1007 Вар. 1047 Вар. 1087 Вар. 1127 Вар. 1167 Вар. 1207 Вар. 1247 Вар 128 7
ПММ 8 мкг/л Вар. 888 Вар. 928 Вар. 968 Вар. 1008 Вар. 1048 Вар. 1088 Вар. 1128 Вар. 1168 Вар. 1208 Вар. 1248 Вар 128 8
ПММ 9 мкг/л Вар. 889 Вар. 929 Вар. 969 Вар. 1009 Вар. 1049 Вар. 1089 Вар. 1129 Вар. 1169 Вар. 1209 Вар. 1249 Вар 128 9
ПММ 10 мкг/л Вар. 890 Вар. 930 Вар. 970 Вар. 1010 Вар. 1050 Вар. 1090 Вар. ИЗО Вар. 1170 Вар. 1210 Вар. 1250 Вар 129 0
Приблизительно 1 мкг/л Вар. 891 Вар. 931 Вар. 971 Вар. 1011 Вар. 1051 Вар. 1091 Вар. 1131 Вар. 1171 Вар. 1211 Вар. 1251 Вар 129 1
Приблизительно 1,5 мкг/л Вар. 892 Вар. 932 Вар. 972 Вар. 1012 Вар. 1052 Вар. 1092 Вар. 1132 Вар. 1172 Вар. 1212 Вар. 1252 Вар 129 2
Приблизительно 2 мкг/л Вар. 893 Вар. 933 Вар. 973 Вар. 1013 Вар. 1053 Вар. 1093 Вар. 1133 Вар. 1173 Вар. 1213 Вар. 1253 Вар 129 3
- 23 035147
Приблизительно 2,5 мкг/л Вар. 894 Вар. 934 Вар. 974 Вар. 1014 Вар. 1054 Вар. 1094 Вар. 1134 Вар. 1174 Вар. 1214 Вар. 1254 Вар 129 4
Приблизительно 3 мкг/л Вар. 895 Вар. 935 Вар. 975 Вар. 1015 Вар. 1055 Вар. 1095 Вар. 1135 Вар. 1175 Вар. 1215 Вар. 1255 Вар 129 5
Приблизительно 3,5 мкг/л Вар. 896 Вар. 936 Вар. 976 Вар. 1016 Вар. 1056 Вар. 1096 Вар. 1136 Вар. 1176 Вар. 1216 Вар. 1256 Вар 129 6
Приблизительно 4 мкг/л Вар. 897 Вар. 937 Вар. 977 Вар. 1017 Вар. 1057 Вар. 1097 Вар. 1137 Вар. 1177 Вар. 1217 Вар. 1257 Вар 129 7
Приблизительно 4,5 мкг/л Вар. 898 Вар. 938 Вар. 978 Вар. 1018 Вар. 1058 Вар. 1098 Вар. 1138 Вар. 1178 Вар. 1218 Вар. 1258 Вар 129 8
Приблизительно 5 мкг/л Вар. 899 Вар. 939 Вар. 979 Вар. 1019 Вар. 1059 Вар. 1099 Вар. 1139 Вар. 1179 Вар. 1219 Вар. 1259 Вар 129 9
Приблизительно 5,5 мкг/л Вар. 900 Вар. 940 Вар. 980 Вар. 1020 Вар. 1060 Вар. 1100 Вар. 1140 Вар. 1180 Вар. 1220 Вар. 1260 Вар 130 0
Приблизительно 6 мкг/л Вар. 901 Вар. 941 Вар. 981 Вар. 1021 Вар. 1061 Вар. 1101 Вар. 1141 Вар. 1181 Вар. 1221 Вар. 1261 Вар 130 1
Приблизительно 7 мкг/л Вар. 902 Вар. 942 Вар. 982 Вар. 1022 Вар. 1062 Вар. 1102 Вар. 1142 Вар. 1182 Вар. 1222 Вар. 1262 Вар 130 2
Приблизительно 8 мкг/л Вар. 903 Вар. 943 Вар. 983 Вар. 1023 Вар. 1063 Вар. 1103 Вар. 1143 Вар. 1183 Вар. 1223 Вар. 1263 Вар 130 3
Приблизительно 9 мкг/л Вар. 904 Вар. 944 Вар. 984 Вар. 1024 Вар. 1064 Вар. 1104 Вар. 1144 Вар. 1184 Вар. 1224 Вар. 1264 Вар 130 4
Приблизительно 10 мкг/л Вар. 905 Вар. 945 Вар. 985 Вар. 1025 Вар. 1065 Вар. 1105 Вар. 1145 Вар. 1185 Вар. 1225 Вар. 1265 Вар 130 5
1-20 мкг/л Вар. 906 Вар. 946 Вар. 986 Вар. 1026 Вар. 1066 Вар. 1106 Вар. 1146 Вар. 1186 Вар. 1226 Вар. 1266 Вар 130 6
2-20 мкг/л Вар. 907 Вар. 947 Вар. 987 Вар. 1027 Вар. 1067 Вар. 1107 Вар. 1147 Вар. 1187 Вар. 1227 Вар. 1267 Вар 130 7
1-10 мкг/л Вар. 908 Вар. 948 Вар. 988 Вар. 1028 Вар. 1068 Вар. 1108 Вар. 1148 Вар. 1188 Вар. 1228 Вар. 1268 Вар 130 8
- 24 035147
2-10 мкг/л Вар. 909 Вар. 949 Вар. 989 Вар. 1029 Вар. 1069 Вар. 1109 Вар. 1149 Вар. 1189 Вар. 1229 Вар. 1269 Вар 130 9
1-6 мкг/л Вар. 910 Вар. 950 Вар. 990 Вар. 1030 Вар. 1070 Вар. 1110 Вар. 1150 Вар. 1190 Вар. 1230 Вар. 1270 Вар 131 0
2-6 мкг/л Вар. 911 Вар. 951 Вар. 991 Вар. 1031 Вар. 1071 Вар. 1111 Вар. 1151 Вар. 1191 Вар. 1231 Вар. 1271 Вар 131 1
3-6 мкг/л Вар. 912 Вар. 952 Вар. 992 Вар. 1032 Вар. 1072 Вар. 1112 Вар. 1152 Вар. 1192 Вар. 1232 Вар. 1272 Вар 131 2
4-6 мкг/л Вар. 913 Вар. 953 Вар. 993 Вар. 1033 Вар. 1073 Вар. 1113 Вар. 1153 Вар. 1193 Вар. 1233 Вар. 1273 Вар 131 3
1-5 мкг/л Вар. 914 Вар. 954 Вар. 994 Вар. 1034 Вар. 1074 Вар. 1114 Вар. 1154 Вар. 1194 Вар. 1234 Вар. 1274 Вар 131 4
2-5 мкг/л Вар. 915 Вар. 955 Вар. 995 Вар. 1035 Вар. 1075 Вар. 1115 Вар. 1155 Вар. 1195 Вар. 1235 Вар. 1275 Вар 131 5
3-5 мкг/л Вар. 916 Вар. 956 Вар. 996 Вар. 1036 Вар. 1076 Вар. 1116 Вар. 1156 Вар. 1196 Вар. 1236 Вар. 1276 Вар 131 6
4-5 мкг/л Вар. 917 Вар. 957 Вар. 997 Вар. 1037 Вар. 1077 Вар. 1117 Вар. 1157 Вар. 1197 Вар. 1237 Вар. 1277 Вар 131 7
1-4 мкг/л Вар. 918 Вар. 958 Вар. 998 Вар. 1038 Вар. 1078 Вар. 1118 Вар. 1158 Вар. 1198 Вар. 1238 Вар. 1278 Вар 131 8
2-4 мкг/л Вар. 919 Вар. 959 Вар. 999 Вар. 1039 Вар. 1079 Вар. 1119 Вар. 1159 Вар. 1199 Вар. 1239 Вар. 1279 Вар 131 9
3-4 мкг/л Вар. 920 Вар. 960 Вар. 1000 Вар. 1040 Вар. 1080 Вар. 1120 Вар. 1160 Вар. 1200 Вар. 1240 Вар. 1280 Вар 132 0
*ПММ=по меньшей мере.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне, не превышающем 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации указанная среда для клеточной культуры содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и кальций. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому
- 25 035147 из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 и 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.
Согласно одному из вариантов реализации получают культуральную среду для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS (например, rADAMTS13), содержащую по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамин B3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина B3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина B3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина B3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4.
Таблица 4
Типовые варианты реализации концентраций меди и никотинамида в культуральных средах, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка ADAMTS13
IX. X. Концент] рация кальция
ПММ 2 мг/мл ПМ м 3 мг/м л ПМ М 4 мг/м л ПМ М 5 мг/м л ПМ М 6 мг/м л ПМ м 7 мг/м л ПМ м 8 мг/м л ПМ М 9 мг/м л ПМ М 10 мг/м л ПМ М 15 мг/м л 2-10 мг/м л
Концентрация меди ПММ 1 мкг/л Вар. 1321 Вар. 1361 Вар. 1401 Вар. 1441 Вар. 1481 Вар. 1521 Вар. 1561 Вар. 1601 Вар. 1641 Вар. 1681 Вар. 1721
ПММ 2 мкг/л Вар. 1322 Вар. 1362 Вар. 1402 Вар. 1442 Вар. 1482 Вар. 1522 Вар. 1562 Вар. 1602 Вар. 1642 Вар. 1682 Вар. 1722
ПММ 3 мкг/л Вар. 1323 Вар. 1363 Вар. 1403 Вар. 1443 Вар. 1483 Вар. 1523 Вар. 1563 Вар. 1603 Вар. 1643 Вар. 1683 Вар. 1723
ПММ 4 мкг/л Вар. 1324 Вар. 1364 Вар. 1404 Вар. 1444 Вар. 1484 Вар. 1524 Вар. 1564 Вар. 1604 Вар. 1644 Вар. 1684 Вар. 1724
ПММ 5 мкг/л Вар. 1325 Вар. 1365 Вар. 1405 Вар. 1445 Вар. 1485 Вар. 1525 Вар. 1565 Вар. 1605 Вар. 1645 Вар. 1685 Вар. 1725
ПММ 6 мкг/л Вар. 1326 Вар. 1366 Вар. 1406 Вар. 1446 Вар. 1486 Вар. 1526 Вар. 1566 Вар. 1606 Вар. 1646 Вар. 1686 Вар. 1726
ПММ 7 мкг/л Вар. 1327 Вар. 1367 Вар. 1407 Вар. 1447 Вар. 1487 Вар. 1527 Вар. 1567 Вар. 1607 Вар. 1647 Вар. 1687 Вар. 1727
- 26 035147
пмм 8 мкг/л Вар. 1328 Вар. 1368 Вар. 1408 Вар. 1448 Вар. 1488 Вар. 1528 Вар. 1568 Вар. 1608 Вар. 1648 Вар. 1688 Вар. 1728
ПММ 9 мкг/л Вар. 1329 Вар. 1369 Вар. 1409 Вар. 1449 Вар. 1489 Вар. 1529 Вар. 1569 Вар. 1609 Вар. 1649 Вар. 1689 Вар. 1729
ПММ 10 мкг/л Вар. 1330 Вар. 1370 Вар. 1410 Вар. 1450 Вар. 1490 Вар. 1530 Вар. 1570 Вар. 1610 Вар. 1650 Вар. 1690 Вар. 1730
Приблизительно 1 мкг/л Вар. 1331 Вар. 1371 Вар. 1411 Вар. 1451 Вар. 1491 Вар. 1531 Вар. 1571 Вар. 1611 Вар. 1651 Вар. 1691 Вар. 1731
Приблизительно 1,5 мкг/л Вар. 1332 Вар. 1372 Вар. 1412 Вар. 1452 Вар. 1492 Вар. 1532 Вар. 1572 Вар. 1612 Вар. 1652 Вар. 1692 Вар. 1732
Приблизительно 2 мкг/л Вар. 1333 Вар. 1373 Вар. 1413 Вар. 1453 Вар. 1493 Вар. 1533 Вар. 1573 Вар. 1613 Вар. 1653 Вар. 1693 Вар. 1733
Приблизительно 2,5 мкг/л Вар. 1334 Вар. 1374 Вар. 1414 Вар. 1454 Вар. 1494 Вар. 1534 Вар. 1574 Вар. 1614 Вар. 1654 Вар. 1694 Вар. 1734
Приблизительно 3 мкг/л Вар. 1335 Вар. 1375 Вар. 1415 Вар. 1455 Вар. 1495 Вар. 1535 Вар. 1575 Вар. 1615 Вар. 1655 Вар. 1695 Вар. 1735
Приблизительно 3,5 мкг/л Вар. 1336 Вар. 1376 Вар. 1416 Вар. 1456 Вар. 1496 Вар. 1536 Вар. 1576 Вар. 1616 Вар. 1656 Вар. 1696 Вар. 1736
Приблизительно 4 мкг/л Вар. 1337 Вар. 1377 Вар. 1417 Вар. 1457 Вар. 1497 Вар. 1537 Вар. 1577 Вар. 1617 Вар. 1657 Вар. 1697 Вар. 1737
Приблизительно 4,5 мкг/л Вар. 1338 Вар. 1378 Вар. 1418 Вар. 1458 Вар. 1498 Вар. 1538 Вар. 1578 Вар. 1618 Вар. 1658 Вар. 1698 Вар. 1738
Приблизительно 5 мкг/л Вар. 1339 Вар. 1379 Вар. 1419 Вар. 1459 Вар. 1499 Вар. 1539 Вар. 1579 Вар. 1619 Вар. 1659 Вар. 1699 Вар. 1739
Приблизительно 5,5 мкг/л Вар. 1340 Вар. 1380 Вар. 1420 Вар. 1460 Вар. 1500 Вар. 1540 Вар. 1580 Вар. 1620 Вар. 1660 Вар. 1700 Вар. 1740
Приблизительно 6 мкг/л Вар. 1341 Вар. 1381 Вар. 1421 Вар. 1461 Вар. 1501 Вар. 1541 Вар. 1581 Вар. 1621 Вар. 1661 Вар. 1701 Вар. 1741
Приблизительно 7 мкг/л Вар. 1342 Вар. 1382 Вар. 1422 Вар. 1462 Вар. 1502 Вар. 1542 Вар. 1582 Вар. 1622 Вар. 1662 Вар. 1702 Вар. 1742
Приблизительно 8 мкг/л Вар. 1343 Вар. 1383 Вар. 1423 Вар. 1463 Вар. 1503 Вар. 1543 Вар. 1583 Вар. 1623 Вар. 1663 Вар. 1703 Вар. 1743
Приблизительно 9 мкг/л Вар. 1344 Вар. 1384 Вар. 1424 Вар. 1464 Вар. 1504 Вар. 1544 Вар. 1584 Вар. 1624 Вар. 1664 Вар. 1704 Вар. 1744
Приблизительно 10 мкг/л Вар. 1345 Вар. 1385 Вар. 1425 Вар. 1465 Вар. 1505 Вар. 1545 Вар. 1585 Вар. 1625 Вар. 1665 Вар. 1705 Вар. 1745
1-20 мкг/л Вар. 1346 Вар. 1386 Вар. 1426 Вар. 1466 Вар. 1506 Вар. 1546 Вар. 1586 Вар. 1626 Вар. 1666 Вар. 1706 Вар. 1746
2-20 мкг/л Вар. 1347 Вар. 1387 Вар. 1427 Вар. 1467 Вар. 1507 Вар. 1547 Вар. 1587 Вар. 1627 Вар. 1667 Вар. 1707 Вар. 1747
1-10 мкг/л Вар. 1348 Вар. 1388 Вар. 1428 Вар. 1468 Вар. 1508 Вар. 1548 Вар. 1588 Вар. 1628 Вар. 1668 Вар. 1708 Вар. 1748
2-10 мкг/л Вар. 1349 Вар. 1389 Вар. 1429 Вар. 1469 Вар. 1509 Вар. 1549 Вар. 1589 Вар. 1629 Вар. 1669 Вар. 1709 Вар. 1749
1-6 мкг/л Вар. 1350 Вар. 1390 Вар. 1430 Вар. 1470 Вар. 1510 Вар. 1550 Вар. 1590 Вар. 1630 Вар. 1670 Вар. 1710 Вар. 1750
2-6 мкг/л Вар. 1351 Вар. 1391 Вар. 1431 Вар. 1471 Вар. 1511 Вар. 1551 Вар. 1591 Вар. 1631 Вар. 1671 Вар. 1711 Вар. 1751
3-6 мкг/л Вар. 1352 Вар. 1392 Вар. 1432 Вар. 1472 Вар. 1512 Вар. 1552 Вар. 1592 Вар. 1632 Вар. 1672 Вар. 1712 Вар. 1752
4-6 мкг/л Вар. 1353 Вар. 1393 Вар. 1433 Вар. 1473 Вар. 1513 Вар. 1553 Вар. 1593 Вар. 1633 Вар. 1673 Вар. 1713 Вар. 1753
1-5 мкг/л Вар. 1354 Вар. 1394 Вар. 1434 Вар. 1474 Вар. 1514 Вар. 1554 Вар. 1594 Вар. 1634 Вар. 1674 Вар. 1714 Вар. 1754
2-5 мкг/л Вар. 1355 Вар. 1395 Вар. 1435 Вар. 1475 Вар. 1515 Вар. 1555 Вар. 1595 Вар. 1635 Вар. 1675 Вар. 1715 Вар. 1755
3-5 мкг/л Вар. 1356 Вар. 1396 Вар. 1436 Вар. 1476 Вар. 1516 Вар. 1556 Вар. 1596 Вар. 1636 Вар. 1676 Вар. 1716 Вар. 1756
4-5 мкг/л Вар. 1357 Вар. 1397 Вар. 1437 Вар. 1477 Вар. 1517 Вар. 1557 Вар. 1597 Вар. 1637 Вар. 1677 Вар. 1717 Вар. 1757
1-4 мкг/л Вар. 1358 Вар. 1398 Вар. 1438 Вар. 1478 Вар. 1518 Вар. 1558 Вар. 1598 Вар. 1638 Вар. 1678 Вар. 1718 Вар. 1758
2-4 мкг/л Вар. 1359 Вар. 1399 Вар. 1439 Вар. 1479 Вар. 1519 Вар. 1559 Вар. 1599 Вар. 1639 Вар. 1679 Вар. 1719 Вар. 1759
3-4 мкг/л Вар. 1360 Вар. 1400 Вар. 1440 Вар. 1480 Вар. 1520 Вар. 1560 Вар. 1600 Вар. 1640 Вар. 1680 Вар. 1720 Вар. 1760
*ПММ=по меньшей мере.
Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 6 мМ и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 6 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другому предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ и медь и никотинамид в концентра- 27 035147 циях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию аммония поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее и медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно еще одному конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13).
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, цинк и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 и 10 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2.
Согласно одному из вариантов реализации в среду для клеточной культуры добавляют медь, кальций и никотинамид. Согласно конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 до 10 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3.
XI. Способы получения факторов крови с высокой удельной активностью.
A. Способы культивирования клеток.
Настоящее изобретение обеспечивает способы крупномасштабного производства рекомбинантных белков (таких как rvWF и rA13). Согласно определенным вариантам реализации в таких способах крупномасштабного производства применяют реакторы с мешалкой/перемешиванием для получения указанных терапевтических рекомбинантных белков.
Согласно определенным вариантам реализации способы согласно настоящему изобретению могут включать применение систем культивирования клеток в периодическом или непрерывном режиме. Например, в случае использования периодических культур клеток к ним может применяться режим однократного периодического культивирования, подпитываемого культивирования или повторного периодического культивирования. Сходным образом, к непрерывным культурам клеток могут применяться, например, перфузионный, турбидостатический или хемостатический режимы. Периодическое и непрерывное культивирование клеток может проводиться в условиях суспензионной или адгезионной культуры. В условиях суспензионного культивирования клетки свободно суспендированы и распределены в культуральной среде. Альтернативно, в условиях адгезионного культивирования, клетки связаны с твердой фазой, например микроносителем, пористым микроносителем, дисковым носителем, керамическим картриджем, полым волокном, плоской пластиной, гель-матрицей и т.п.
Периодическая культура представляет собой, как правило, крупномасштабную культуру клеток, в которой клеточный инокулят культивируют до максимальной плотности в реакторе или ферментере, и собирают и обрабатывают, как при однократном периодическом культивировании. Подпитываемая культура представляет собой, как правило, периодическую культуру, получающую либо свежие питательные вещества (например, ограничивающие рост субстраты), либо добавки (например, предшественники продуктов). Питательный раствор, как правило, является высококонцентрированным, чтобы избежать разбавления в биореакторе. В повторно-периодической культуре клетки помещают в культуральную среду и выращивают до требуемой плотности клеток. Затем, чтобы избежать наступления фазы спада и гибели клеток, культуру разбавляют полной ростовой средой до того, как клетки достигают максимальной концентрации. Количество и частота разведений широко варьирует и зависит от характеристик роста клеточной линии и удобства процесса культивирования. Указанный процесс может повторяться столько раз, сколько потребуется и, если клетки и среда не отбрасываются при пересеве, объем культуры будет увеличиваться ступенчато, по мере каждого следующего разведения. Вопрос увеличивающегося объема может быть решен использованием реактора, имеющего достаточный размер для разбавлений внутри указанного сосуда, либо распределением разбавленной культуры по нескольким сосудам. Принцип ука
- 28 035147 занного типа культивирования состоит в поддержании клеток в экспоненциальной фазе роста. Серийно пересеваемая культура характеризуется тем, что объем указанной культуры всегда постепенно возрастает, может быть несколько сборов, клетки продолжают расти и указанный процесс может продолжаться так долго, как это необходимо. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный белок ADAMTS (например, rADAMTS13) может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры. Согласно другим вариантам реализации рекомбинантный vWF может быть выделен после сбора супернатанта периодической культуры.
Непрерывная культура может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, где, как правило, поддерживается постоянный объем культуры за счет сопутствующего удаления отработанной среды. Согласно хемостатическому и турбидостатическому методам извлеченная среда содержит клетки. Таким образом, клетки, остающиеся в сосуде для культивирования клеток, должны расти для поддержания стационарного состояния. Согласно хемостатическому способу скоростью роста, как правило, управляют посредством контроля степени разбавления, т.е. скорости добавления свежей среды. Скорость роста клеток в культуре может поддерживаться, например, на субмаксимальном уровне, изменением степени разбавления. Напротив, при турбидостатическом способе степень разбавления устанавливают таким образом, чтобы обеспечить максимальную скорость роста, которой могут достигнуть клетки при заданных технологических условиях, таких как рН и температура. Согласно определенным вариантам реализации rvWF или rA13 выделяют после сбора супернатанта непрерывной культуры. Типовой способ непрерывного культивирования клеток описан в WO/2011/012725 (Grillberger et al.), содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
При перфузионном культивировании извлеченная среда бедна клетками, которые остаются в культуральном сосуде, например, за счет применения способов фильтрации или центрифугирования, приводящих к повторному внесению клеток в культуру. Однако, как правило, используемые для фильтрации задерживают не 100% клеток, и таким образом часть их удаляется при извлечении среды. Очень высокие скорости роста для культивирования в режиме перфузии не критичны, так как большая часть клеток остается в культуральном сосуде. Согласно определенным вариантам реализации rvWF или rA13 выделяют после сбора супернатанта перфузионной культуры.
Реакционная система с баком-мешалкой может применяться для периодического и непрерывного культивирования клеток в суспензионном или адгезионном режимах. Как правило, указанная реакционная система с баком-мешалкой может эксплуатироваться так, как любой стандартный реактор с мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например Rushton, гидравлический, с наклонными лопастями, или типа гребного винта.
Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высоких удельных значений площадей поверхности относительно объема культуры для достижения высоких плотностей клеток и экспрессии белка. Один из способов обеспечения таких условий роста заключается в применении микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Принцип роста клеток на микроносителях впервые был описан у van Wezel (van Wezel, A.L., Nature 216:64-5 (1967)); он обеспечивает прикрепление клеток к поверхности небольших твердых частиц, взвешенных в ростовой среде. Указанные способы обеспечивают высокое соотношение поверхность-объем и таким образом обеспечивают эффективную утилизацию питательных веществ. Кроме того, при экспрессии секретируемых белков в эукариотических клеточных линиях повышение соотношения поверхность-объем обеспечивает более высокие уровни секреции и таким образом более высокий выход белка в супернатанте культуры. Наконец, указанные способы позволяют легко увеличивать масштаб эукариотических экспрессионных культур.
Клетки, экспрессирующие vWF и/или rA13, могут быть связаны со сферическим или пористым микроносителем во время роста культуры клеток. Указанный микроноситель может представлять собой микроноситель, выбранный из группы микроносителей на основе декстрана, коллагена, пластика, желатина, целлюлозы и других, согласно описанию у Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Также возможно доращивать клетки до некоторой биомассы на сферических микроносителях, и пересевать указанные клетки при достижении ими конечной для ферментера биомассы, перед получением экспрессированного белка, на пористый микроноситель, или наоборот. Подходящие сферические микроносители могут включать микроносители с гладкой поверхностью, такие как Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 и Cytodex™ 3 (GE Healthcare), и крупнопористые микроносители, такие как Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 и Cytoline™ 2 (GE Healthcare).
Согласно приведенному выше описанию настоящее изобретение включает среды для клеточных культур, содержащие повышенную концентрацию меди. Понятно, что все варианты реализации изобретения и концентрации, описанные выше в разделе Среды для клеточных культур, применимы к способам согласно настоящему изобретению, описываемым в настоящей заявке.
- 29 035147
Согласно определенным вариантам реализации указанная культура может поддерживаться в течение по меньшей мере приблизительно 7 дней, или по меньшей мере приблизительно 14, 21, 28 дней, или по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9 недель, или по меньшей мере приблизительно 2 месяцев, или 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 месяцев, или дольше. Плотность клеток, которая поддерживается в культуре клеток для получения рекомбинантного белка vWF или рекомбинантного белка rA13, зависит от условий культивирования и среды, применяемых для экспрессии белка. Специалист в данной области техники легко сможет определить оптимальную плотность клеток для культивирования клеток с получением rvWF или rA13. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток в указанной культуре поддерживают на уровне от приблизительно 0,5 х106 до 4х107 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0х106 до приблизительно 1х107 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне концентрации от приблизительно 1,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл в течение длительного периода времени. Согласно другим вариантам реализации плотность клеток может поддерживаться на уровне концентрации от приблизительно 2,0х106 до приблизительно 4,0х106 клеток/мл, или от приблизительно 1,0х106 до приблизительно 2,5х106 клеток/мл, или от приблизительно 1,5х106 до приблизительно 3,5х 106 клеток/мл, или в любом сходном диапазоне в течение длительного периода времени.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящем изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной согласно настоящему изобретению, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5 х106
- 30 035147 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 леток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 3,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно другому варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, пред
- 31 035147 ложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,0х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5 х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х 106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно еще одному более конкретному варианту реализации плотность клеток непрерывной клеточной культуры, предложенной в соответствии с настоящим изобретением, поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 1,5х106 клеток/мл, в течение по меньшей мере 9 недель.
Ниже приведены характерные детали способов получения rvWF и rA13. Следует понимать, что, хотя условия представлены конкретно для rvWF или rA13, указанные условия для rvWF могут применяться для получения rA13, и наоборот.
B. Способы получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения vWF в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония. Используемый в настоящей заявке термины культура клеток (клеточная культура) и раствор культуры клеток применяют взаимозаменяемо.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, включающий: a) обеспечение культуры клеток; b) введе
- 32 035147 ние последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; c) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно дальнейшим вариантам реализации мультимерные rvWF, получаемый с применением способов согласно настоящему изобретению, содержат приблизительно 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 димеров. Согласно дальнейшим вариантам реализации rvWF, получаемый согласно настоящему изобретению, обладает удельной активностью по меньшей мере приблизительно 20; 22,5; 25; 27,5; 30; 32,5; 35; 37,5; 40; 42,5; 45; 47,5; 50; 52,5; 55; 57,5; 60; 62,5; 65; 67,5; 70; 72,5; 75; 77,5; 80 или более мЕ/мкг. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для получения rvWF поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 2,5х106 клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 2,0х106, 1,5х106, 1,0х106, 0,5х106 клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают в диапазоне от 1,5х106 и 2,5х106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rvWF); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,0 мкг/л; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rvWF; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rvWF из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rvWF. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрация аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 10 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 5 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации, не превышающей 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации аммония, не превышающей 4 мМ, в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди по меньшей мере 2,4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочти
- 33 035147 тельному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 4 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации среды для клеточных культур содержат аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди, составляющей приблизительно 4,3 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более пред
- 34 035147 почтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 2 до 20 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 3 до 10 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентрации аммония не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее.
Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в растворе культуры клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа в основные среды для клеточных культур добавляют медь до конечной концентрации меди от 4 до 7,5 мкг/л. Согласно одному из вариантов реализации раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rvWF). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rvWF); указанный способ включает этапы: (a)
- 35 035147 обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rvWF; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rvWF из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем концентрацию NH4 + в указанном супернатанте поддерживают на низком уровне в течение по меньшей мере 7 дней, и при этом указанный отделенный супернатант также обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rvWF. Согласно конкретному варианту реализации концентрацию меди и концентрацию NH4 + в растворе культуры клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 14 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 21 дня. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 28 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 5 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 6 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 7 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 8 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF,
- 36 035147 составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа концентрацию меди и концентрацию NH4 + в культуре клеток поддерживают на уровне концентраций согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1, в течение по меньшей мере 9 недель. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного фактора фон Виллебранда (rvWF); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 2,0 мкг/л; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rvWF; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rvWF из клеток в культуральный супернатант; (e) мониторинга концентрации аммония в указанном культуральном супернатанте; и (f) отделения по меньшей мере части культурального супернатанта, причем указанный культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 10 мМ, не используют для получения композиции rvWF, и при этом указанный отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rvWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетинкофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 6 мМ, не используют для получения композиции rvWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 5 мМ, не используют для получения композиции rvWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Согласно одному из вариантов реализации описанного выше способа культуральный супернатант, содержащий аммоний в концентрации более чем 4 мМ, не используют для получения композиции rvWF. Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2,4, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мкг/л или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 2-20, 2-10, 3-8 или 4-6 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг rvWF. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью rvWF, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг rvWF.
Рекомбинантный vWF может быть получен посредством осуществления экспрессии в подходящей эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep и HepG2; клетки насекомых, например клетки SF9, клетки SF21, клетки S2 и клетки High Five; и дрожжевые клетки, например клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. Согласно одному из вариантов реализации можно осуществлять экс
- 37 035147 прессию указанного vWF в дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию CHO, BHK или HEK. Как правило, для экспрессии vWF согласно настоящему изобретению применяют клетки млекопитающих, например клетки CHO из непрерывной клеточной линии.
Согласно определенным вариантам реализации последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, кодирующую vWF, может представлять собой вектор. Указанный вектор может доставляться вирусом или может представлять собой плазмиду. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный белок, может представлять собой конкретный ген или его биологически функциональную часть. Согласно одному из вариантов реализации указанный белок представляет собой по меньшей мере биологически активную часть vWF.
Для экспрессии указанного vWF могут применяться разнообразные векторы; они могут быть выбраны из эукариотических экспрессионных векторов. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с применением таких промоторов, как AOX1, GAP, GAL1, AUG1, и т.п.; (ii) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC и т.п., с применением таких промоторов, как PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh и т.п., и (iii) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, ркДНК3, pBPV и т.п., и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п., с применением таких промоторов, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин. Типовой вектор для экспрессии rvWF описан у Kaufman et al. (Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3):1233-42); содержание указанного источника включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, указанная последовательность нуклеиновой кислоты также содержит другие последовательности, подходящие для контролируемой экспрессии белка, такие как промоторные последовательности, энхансеры, TATA-боксы, сайты инициации транскрипции, полилинкеры, сайты рестрикции, поли-A-последовательности, последовательности процессинга белков, маркеры отбора и т.п., которые общеизвестны специалистам в данной области техники.
Помимо сред для клеточных культур, содержащих повышенную концентрацию меди, условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ на протяжении всего подготовительного процесса (upstream''-процесса) в системах культивирования. Согласно одному из вариантов реализации условия культивирования клеток включают концентрацию аммония менее чем приблизительно 25 мМ, согласно другому варианту реализации менее чем приблизительно 20 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 15 мМ, согласно еще одному варианту реализации менее чем приблизительно 10 мМ и согласно дальнейшему варианту реализации менее чем приблизительно 5 мМ.
Согласно некоторым вариантам реализации концентрации аммония согласно настоящему изобретению поддерживают на постоянном уровне на протяжении всего подготовительного процесса в системе культивирования клеток. Клетки, применяемые согласно настоящему изобретению, могут культивироваться, например, способами, модифицированными относительно стандартных периодического культивирования и непрерывного культивирования, общеизвестных в данной области техники. При этом такие стандартные техники могут приводить к образованию высоких концентраций аммония в конце культивирования. В способах согласно настоящему изобретению эта проблема преодолена за счет применения систем производства, которые могут обеспечить постоянное поступление культуральной среды с помощью таких техник, как, например, перфузионное или хемостатическое культивирование. После культивирования клеток-хозяев vWF может быть выделен из отработанной среды с применением стандартных методик, таких как ультрафильтрация или центрифугирование. При необходимости vWF может быть очищен, например, ионообменной и/или эксклюзионной хроматографией и т.п.
Непрерывная культура (например, перфузионная или хемостатическая культура) может представлять собой суспензионную культуру, непрерывно получающую питательные вещества за счет притока свежей среды, при этом объем культуры, как правило, неизменен. Сходным образом, непрерывная ферментация может подразумевать процесс, при котором клетки или микроорганизмы в культуре поддерживают в экспоненциальной фазе роста за счет постоянного добавления свежей среды, точно компенсируемом удалением суспензии клеток из биореактора. Кроме того, реакционная система с баком-мешалкой может применяться для суспензионного, перфузионного, хемостатического культивирования и/или культивирования на микроносителях. Как правило, в качестве указанной реакционной системы с бакоммешалкой может работать любой стандартный реактор с баком-мешалкой с любым типом перемешивающего устройства, например, типа Rushton, гидравлическим, с наклонными лопастями, или типа гребного винта.
C. Способы получения рекомбинантного ADAMTS13 (А13).
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится также к способам получения rA13 в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую повышенную
- 38 035147 концентрацию меди. Согласно определенным вариантам реализации указанная культура также содержит низкую концентрацию аммония. Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди до конечной концентрации меди, составляющей по меньшей мере 1,0 мкг/л;
(c) обеспечения одной или более клеток, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13;
(d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETSvWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день (т.е. 1500 единиц FRETSvWF73 активности в день на 1 л культуры клеток; Р FRETS). Согласно определенным вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или более. Согласно другим вариантам реализации конечная концентрация меди в дополненных основных культуральных средах составляет 1-6, 2-5, 2-4 или 3-4 мкг/л. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение объемной продуктивности FRETS-vWF73 (P FRETS). Например, согласно определенным вариантам реализации выделяют по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в непрерывной клеточной культуре для продуцирования rA13 поддерживают на уровне концентрации, не превышающей 4,0х106 клеток/мл в течение длительного периода. Согласно другим конкретным вариантам реализации плотность клеток поддерживают на уровне не выше 3,5х106, 3,0х106, 2,5х106, 2,0х106, 1,5х106, 1,0х106 клеток/мл или менее. Согласно одному из вариантов реализации плотность клеток поддерживают на уровне от 3,0х106 до 4,0х106 клеток/мл.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 единицы активности FRETS-vWF73 на 1 мл супернатанта (FRETS). Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 8 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 10 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение продуктивности FRETS. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 4 единицами активности FRETS-vWF73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 единицами активности FRETS-vWF73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 8 единицами активности FRETS-vWF73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 10 единицами активности FRETS-vWF73 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позво
- 39 035147 ляет получить по меньшей мере 800 мЕ FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры в день (т.е. q Frets). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 E FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 E FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 E FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение удельной продуктивности FRETS-vWF73 на клетку (q Frets). Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 800 мЕ FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 E FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,2 E FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,4 E FRETS-vWF73 активности на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры в день (P ELISA). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,5 мг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки rA13. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1 мг rA13 согласно ИФАанализу на 1 л культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 1,5 мг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 2 мг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 л культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры в день (т.е. q ELISA). Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры в день. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки согласно q ELISA. Например, согласно определенным вариантам реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,5 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,7 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации культивирование клеток позволяет получить по меньшей мере 0,9 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 106 клеток культуры ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов отделенный супернатант содержит по меньшей мере 3 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 4 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно более предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 5 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации отделенный супернатант содержит по меньшей мере 6 мкг rA13 согласно ИФА-анализу на 1 мл супернатанта. Согласно определенным вариантам реализации указанные способы обеспечивают устойчивое увеличение выработки rA13. Например, согласно определенным вариантам реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 3 мкг rA13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий
- 40 035147 по меньшей мере 4 мкг rA13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно более предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 5 мкг rA13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации супернатант, обладающий по меньшей мере 6 мкг rA13 на 1 мл, выделяют ежедневно в течение по меньшей мере 7 дней или по меньшей мере 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 или более дней.
Согласно одному варианту реализации описанных выше способов раствор культуры клеток также содержит аммоний в концентрации менее чем 10 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 10 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 5 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 5 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно предпочтительному варианту реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 4 мМ. Согласно другому конкретному варианту реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на уровне не выше 4 мМ в течение по меньшей мере 7 дней. Согласно другим вариантам реализации раствор культуры клеток содержит аммоний в концентрации не выше 10 мМ или не выше 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 мМ или менее. Согласно еще одному из вариантов реализации концентрацию аммония в культуре клеток поддерживают на низком уровне на протяжении процесса (т.е. в течение всего времени, на протяжении которого указанная культура используется для получения rA13). Согласно конкретному варианту реализации культуральный раствор содержит медь и аммоний в концентрации согласно любому из вариантов 1-440, приведенных в табл. 1.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и цинка; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно одному варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере точно или приблизительно 5 мкМ цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 2 до 12 мкМ цинка. Согласно другому варианту реализации указанная культуральная среда также содержит точно или приблизительно от 5 до 12 мкМ цинка. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда также может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2 мкМ или по меньшей мере точно или приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 мкМ или более цинка. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и кальция; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 0,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации,
- 41 035147 когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 1,5 мМ кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ кальция. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 0,5 мМ или по меньшей мере точно или приблизительно 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более кальция. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и кальция в концентрации согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и кальция; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит кальций в концентрации от 0,5 и 1,5 мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации культуральная среда содержит кальций в концентрации по меньшей мере 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,25; 2,5; 2,75; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мМ или более и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди и никотинамида; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит по меньшей мере 1 мкг/л меди и по меньшей мере 2 мг/л никотинамида (витамина B3). Согласно другим вариантам реализации указанная среда содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди или по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно другому варианту реализации, когда в среды добавляют медь, указанная культуральная среда также содержит по меньшей мере 7 мг/л никотинамида (витамина B3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит точно или приблизительно от 2 до 10 мг/л никотинамида (витамина B3). Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда может содержать по меньшей мере точно или приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 мг/л или более высокие концентрации никотинамида (витамина B3). Согласно одному из вариантов реализации указанная культуральная среда содержит медь и никотинамид в концентрациях согласно любому из вариантов 1321-1760, приведенных в табл. 4. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных
- 42 035147 сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, цинка и никотинамида; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, при этом в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации указанная среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 и 10 мг/мл и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и цинк в концентрациях согласно любому из вариантов 441-880, приведенных в табл. 2. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETSvWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение обеспечивает способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13); указанный способ включает этапы: (a) обеспечения основных сред для культуры клеток; (b) добавления в основные среды для клеточных культур меди, кальция и никотинамида; (c) обеспечения одной или более клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13; (d) культивирования указанной одной или более клеток в среде для клеточных культур с добавлением меди таким образом, что происходит экспрессия и экскреция rA13 из клеток в культуральный супернатант; и (e) отделения по меньшей мере части указанного культурального супернатанта, причем в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно одному из вариантов реализации среда для клеточной культуры содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2 мг/мл и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 7 мг/мл мМ и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другому конкретному варианту реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации от 2 и 10 мг/мл, и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно другим вариантам реализации указанная культуральная среда содержит никотинамид в концентрации по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 мг/мл или более и медь и кальций в концентрациях согласно любому из вариантов 881-1320, приведенных в табл. 3. Согласно предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2000 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно более предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 2500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации в отделенном культуральном супернатанте присутствует по меньшей мере 3000 единиц активности FRETSvWF73 на 1 л дополненных основных сред для клеточных культур в день.
Рекомбинантные белки ADAMTS могут быть получены посредством осуществления экспрессии в любой подходящей прокариотической или эукариотической системе-хозяине. Примеры эукариотических клеток включают, без ограничения, клетки млекопитающих, такие как CHO, COS, HEK 293, BHK, SKHep и HepG2; клетки насекомых, например SF9 клетки, SF21 клетки, S2 клетки и High Five клетки; и дрожжевые клетки, например клетки Saccharomyces или Schizosaccharomyces. Согласно одному из вари
- 43 035147 антов реализации указанные белки ADAMTS можно экспрессировать в бактериальных клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках птиц, клетках млекопитающих и т.п. Например, в линии клеток человека, линии клеток хомяка или линии клеток мыши. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанная клеточная линия представляет собой клеточную линию CHO, BHK или HEK. Согласно предпочтительному варианту реализации клеточная линия представляет собой клеточную линию CHO. Согласно конкретному варианту реализации клоны CHO, способные к стабильной экспрессии rA13, получают ко-трансфекцией клетки CHO кодирующими последовательностями rA13 и дигидрофолатредуктазы (например, мышиного гена dhfr) и отбором при росте в присутствии возрастающих уровней метотрексата.
Согласно одному из вариантов реализации указанные клетки могут представлять собой любые клетки млекопитающих, пригодные для культивирования, предпочтительно в ходе производственного процесса (т.е. по меньшей мере в 10 л, предпочтительно по меньшей мере в 100 л) для получения требуемого белка ADAMTS, такого как ADAMTS13. Примеры включают линию клеток почки обезьяны CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 165); линию эмбриональных клеток почек человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячкаХ-DHFR, такие как субклон DUKX-B11 (CHO, Uriaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL1587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крыс Буффало (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); опухоли молочной железы мышей (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линию гепатомы человека (Hep G2). Предпочтительно клеточная линия представляет собой линию клеток грызунов, в частности линию клеток хомяка, такую как CHO или BHK.
Значительное число векторов может применяться для экспрессии белка ADAMTS (например, ADAMTS13) и может быть выбрано из эукариотических и прокариотических экспрессионных векторов. Согласно определенным вариантам реализации плазмидный вектор предназначен для применения в экспрессии белка ADAMTS (например, ADAMTS13). Как правило, плазмидные векторы, содержащие репликон и управляющие последовательности, полученные из видов, совместимых с клеткой-хозяином, применяют в соединении с указанными хозяевами. Указанный вектор может нести сайт репликации, а также маркерные последовательности, способные обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Плазмида содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например, промотором.
Предпочтительный способ получения стабильных клонов клеток CHO, экспрессирующих рекомбинантный белок ADAMTS, следующий. Дефицитную по DHFR клеточную линию CHO DUKX-B11 трансфицируют DHFR-экспрессионным вектором, чтобы обеспечить экспрессию соответствующего рекомбинантного белка. Типовой способ описан у Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15; 100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12), содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей. Отбор проводят культивированием в не содержащих гипоксантин/тимидин (HT) средах; амплификации соответствующей области, кодирующей экспрессию рекомбинантного белка ADAMTS и DHFR гена, достигают размножением клеток в возрастающих концентрациях метотрексата. При необходимости клеточные линии CHO могут быть адаптированы для роста в не содержащей сыворотки и/или белков среде, по существу, согласно описанию в US 6100061 (Reiter et al., Immuno Aktiengesellschaft).
Согласно другому предпочтительному варианту реализации стабильные HEK293 клетки получают, трансфицируя их конструкцией, содержащей селектируемый маркер устойчивости к гигромицину, и отбирая трансформанты по устойчивости к антибиотику.
Способность определенных вирусов инфицировать клетки или проникать в клетки посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза, встраиваться в геном клетки-хозяина и стабильно и эффективно экспрессировать вирусные гены, делает их привлекательными кандидатами для переноса чужеродных нуклеиновых кислот в клетки (например, клетки млекопитающих).
Соответственно согласно определенным вариантам реализации вирусный вектор применяют для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS13) в клетку-хозяина для экспрессии. Указанный вирусный вектор должен содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ADAMTS (например, ADAMTS13), функционально связанную с одной или более контрольной последовательностью, например промотором. Как вариант, указанный вирусный вектор может не содержать контрольную последовательность, вместо этого используя контрольную последовательность клетки-хозяина для управления экспрессией белка ADAMTS. Неограничивающие примеры вирусных векторов, которые могут применяться для доставки нуклеиновой кислоты, включают аденовирусные векторы, AAV-векторы и ретровирусные векторы.
- 44 035147
Согласно одному из вариантов реализации аденовирусный экспрессионный вектор включают конструкции, содержащие аденовирусные последовательности, достаточные для осуществления упаковки указанной конструкции и гарантированной экспрессии клонированной в нее конструкции ADAMTS. Аденовирусные векторы позволяют вводить чужеродные последовательности размером до 7 т.п.н. (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).
Согласно другому варианту реализации аденоассоциированный вирус (AAV) может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS13), в клетку-хозяина для экспрессии. AAV-системы описывались ранее и, как правило, общеизвестны в данной области техники (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). Детали получения и применения rAAV-векторов описаны, например, в патентах США №№ 5139941 и 4797368, включенных в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте и для любых целей.
Согласно одному из вариантов реализации ретровирусный экспрессионный вектор может применяться для введения нуклеотидной последовательности, кодирующей белок ADAMTS (например, ADAMTS13), в клетку-хозяина для экспрессии. Указанные системы были описаны ранее и в целом общеизвестны в данной области техники (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, в Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, p. 494-513, 1988; Temin, в: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, p. 149-188, 1986). Согласно конкретному варианту реализации ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор (см., например, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; патенты США №№ 6013516 и 5994136).
Неограничивающие примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как pRSET, pET, pBAD и т.п., при этом промоторы, применяемые в прокариотических экспрессионных векторах, включают lac, trc, trp, recA, araBAD и т.п. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) векторы для экспрессии в дрожжах, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с применением таких промоторов, как AOX1, GAP, GAL1, AUG1 и т.п.; (ii) векторы для экспрессии в клетках насекомых, такие как pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC и т.п., с применением таких промоторов, как PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh и т.п., и (iii) векторы для экспрессии в клетках млекопитающих, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, ркДНК3, pBPV и т.п., и векторы, происходящие из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, герпесвирусы, ретровирусы и т.п., с применением таких промоторов, как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актина. Типовой вектор для экспрессии rA13 описан у Plaimauer et al. (Blood. 2002 Nov 15; 100(10):3626-32. Epub 2002 Jul 12); содержание указанного источника включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Согласно определенным вариантам реализации способы культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать применение микроносителя. Настоящее изобретение обеспечивает, наряду с прочими аспектами, способы крупномасштабной экспрессии белка ADAMTS. Согласно некоторым вариантам реализации культивирование клеток согласно вариантам реализации изобретения может проводиться в больших биореакторах в условиях, подходящих для получения высокого отношения поверхности к объему в культуре для достижения высокой плотности клеток и экспрессии белка. Одним из способов обеспечения таких условий роста является применение микроносителей для культивирования клеток в биореакторах с мешалкой. Согласно другому варианту реализации указанные ростовые потребности удовлетворяются посредством применения суспензионной культуры клеток.
XII. Конкретные варианты реализации.
Рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rvWF).
Рекомбинантный vWF можно экспрессировать в клетках млекопитающих, но удельная активность vWF может широко варьировать в зависимости от условий культивирования клеток; не было показано, что она сравнима или равна таковой vWF, выделенного из плазмы крови. Настоящее изобретение основано частично на неожиданном открытии, что среды для клеточных культур, содержащие по меньшей мере 2,4 мкг/л меди, обеспечивают благоприятный эффект, способствую экспрессии высокомолекулярного vWF, имеющего высокую удельную активность. В частности, высокомолекулярный рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению может включать высокомультимерную форму, содержащую от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающую удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Процессы культивирования клеток согласно настоящему изобретению также позволяют поддерживать низкие уровни NH4 + (например, менее чем 10 мМ) во время подготовительного процесса в системах культивирования клеток, уменьшая таким образом пагубные эффекты на посттрансляционные модификации. Предполагается, что согласно настоящему изобретению впервые предложены условия клеточных культур, включающие среду с подходящей концентрацией меди в комбинации с подходящими уровнями аммония в супернатанте, для экспрессии высокомультимерных vWF с высокой удельной активностью.
- 45 035147
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и/или супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH4 +). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF; указанный раствор культуры клеток содержит: среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок vWF, причем указанный белок vWF обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток раствор культуры клеток содержит средовую добавку, содержащую медь.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит гидролизат, необязательно - соевый гидролизат.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная средовая добавка содержит соль меди, хелат меди или их комбинации.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток концентрация меди составляет от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше культур клеток белок vWF содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF; указанный способ включает этапы: a) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок vWF; b) экспрессии белка vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный белок vWF представляет собой высокомультимерный белок vWF и имеет удельную ристоцетиновую активность, составляющую по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки взяты из непрерывной клеточной линии.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов указанные клетки представляют собой клетки CHO.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов концентрация меди составляет от приблизительно от 2,4 до приблизительно 20 мкг/л.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации описанных выше способов рекомбинантный белок vWF содержит приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает высокомолекулярный рекомбинантный белок vWF, получаемый при помощи процесса, включающего этапы: a) обеспечения культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок vWF; и b) экспрессии белка vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный белок vWF представляет собой высокомультимерный белок vWF и обладает удельной ристоцетиновой активностью, составляющей
- 46 035147 по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rvWF рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rvWF рекомбинантный белок vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно одному из конкретных вариантов реализации вышеописанных композиций rvWF рекомбинантный белок vWF содержит приблизительно от 14 до приблизительно 22 димеров.
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение обеспечивает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного белка vWF, при этом указанный раствор культуры клеток включает: среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерный белок vWF, причем указанный белок vWF содержит от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладает удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к условиям культивирования клеток для получения рекомбинантного высокомолекулярного vWF, находящегося в высокомультимерной форме с высокой удельной активностью. Условия культивирования клеток согласно настоящему изобретению могут включать, например, среду для клеточной культуры с повышенной концентрацией меди и супернатант культуры клеток с низкой концентрацией аммония (NH4 +). Согласно настоящему изобретению также предложены способы культивирования клеток в условиях клеточной культуры для экспрессии высокомолекулярного vWF с высокой удельной активностью.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение включает раствор культуры клеток для получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, содержащего среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л; супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ; и множество клеток, экспрессирующих высокомультимерные vWF, содержащие от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров, и обладающие удельной ристоцетиновой активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному из вариантов реализации описанных выше растворов культур клеток по меньшей мере 10% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного vWF мультимера из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно определенным вариантам реализации клетки могут быть взяты из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки CHO. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение включает способ получения высокомолекулярного рекомбинантного vWF, включающий a) обеспечение культуры клеток; b) введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; c) отбор клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и, d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере приблизительно 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем приблизительно 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительной до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации супернатанта культуры клеток, описанной выше, по меньшей мере 10% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rvWF
- 47 035147 присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки, которые могут быть взяты из непрерывной клеточной линии, могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки CHO. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 мкг/л до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение охватывает высокомолекулярный рекомбинантный vWF, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: a) обеспечения культуры клеток; b) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; c) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Согласно одному варианту реализации описанного выше супернатанта культуры клеток по меньшей мере 10% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 20% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно некоторым вариантам реализации клетки могут быть из непрерывной клеточной линии и могут включать клетки млекопитающих, такие как клетки CHO. Согласно определенным вариантам реализации концентрация меди может составлять по меньшей мере приблизительно 4 мкг/л, либо концентрация меди может варьировать от приблизительно 2,4 до приблизительно 20 мкг/л. Согласно некоторым вариантам реализации среды для клеточных культур содержат средовую добавку, содержащую медь. Согласно определенным вариантам реализации указанная средовая добавка может содержать гидролизат или соль меди, хелат меди или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная соль меди может включать сульфат меди, ацетат меди, карбонат меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрат меди или оксид меди. Согласно некоторым вариантам реализации указанный рекомбинантный vWF обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 50 мЕ/мкг, либо указанная удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rvWF), обладающий удельной ристоцетинкофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг. Согласно предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 40 мЕ/мкг.
Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 60 мЕ/мкг. Согласно более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 70 мЕ/мкг. Согласно еще более предпочтительному варианту реализации указанная композиция обладает удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 80 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций по меньшей мере 10% rvWF в указанной композиции присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере 15% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному
- 48 035147 варианту реализации по меньшей мере 20% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 25% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров. Согласно другому конкретному варианту реализации по меньшей мере 30% rvWF присутствует в виде высокомолекулярного мультимера vWF из более чем 10 димеров.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно одному из конкретных вариантов реализации указанный культуральный супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток CHO.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций, rvWF экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 2,4 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 4 мкг/л меди. Согласно более конкретному варианту реализации указанная культура содержит от 2,4 до 20 мкг/л меди. Согласно одному из вариантов реализации медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой периодическую культуру.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации указанное непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH4 + в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,5 х 106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х 106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную культуру поддерживают на уровне менее чем 1,5х 106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций, rvWF коэкспрессируется с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII). Согласно конкретному варианту реализации большую часть коэкспрессируемого rFVIII удаляют. Согласно более конкретному варианту реализации отношение rvWF к rFVIII в указанной композиции составляет по меньшей мере 10:1.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию лиофилизируют.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение включает высокомолекулярный рекомбинантный vWF, получаемый с помощью процесса, включающего этапы: a) обеспечения культуры клеток; b) введения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей vWF; c) отбора клеток, несущих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и d) осуществление экспрессии vWF в указанных клетках в условиях клеточной культуры, включающих среду для клеточной культуры, содержащую медь в концентрации по меньшей мере 2,4 мкг/л, и супернатант культуры клеток, содержащий аммоний в концентрации менее чем 10 мМ, причем указанный vWF представляет собой высокомультимерный vWF, содержащий от приблизительно 14 до приблизительно 22 димеров и обладающий удельной ристоцетиновой активностью по меньшей мере приблизительно 30 мЕ/мкг. Очевидно, что здесь могут применяться все варианты реализации и концентрации, описанные в разделах Среды для клеточных культур и Способы получения рекомбинантного vWF выше.
Рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению может включать высокомолекулярный рекомбинантный белок vWF, обладающий высокой удельной активностью. Согласно одному из вариантов реализации vWF согласно настоящему изобретению представляет собой высокомультимерную форму vWF. Согласно некоторым вариантам реализации указанная высокомультимерная форма vWF содержит по меньшей мере до приблизительно 14 димеров, а согласно другим вариантам реализации - по меньшей мере до приблизительно 22 димера. Согласно другим вариантам реализации высокомультимерная форма vWF может варьировать от приблизительно 10 до приблизительно 20 димеров, или от приблизительно 15 до приблизительно 25 димеров, или от приблизительно 20 до приблизительно 40 димеров. Согласно определенным вариантам реализации рекомбинантный vWF сопоставим с vWF плазмы.
Согласно приведенному в настоящей заявке описанию в соответствии с настоящим изобретением
- 49 035147 получен неожиданный результат, состоящий в том, что повышенная концентрация меди в культуре клеток среды позволяет получать высокомолекулярный vWF с высокой удельной активностью. Среды для клеточных культур, содержащие медь в концентрации, например, выше чем приблизительно 2,4 мкг/л, могут повышать выход рекомбинантного мультимерного vWF по сравнению с не содержащими медь средами. Согласно определенным вариантам реализации процент мультимерного vWF (т.е. rvWF, содержащего по меньшей мере 2 димера) может быть выше, чем приблизительно 50%, или выше, чем приблизительно 75%, или выше, чем приблизительно 90%. Уровень мультимеризации vWF может быть проанализирован с применением стандартных техник, таких как, например, электрофорез в агарозе в невосстанавливающих условиях.
Согласно настоящей заявке рекомбинантный vWF, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать высокой удельной активностью, например высокой удельной ристоцетин-кофакторной активностью. Согласно одному из вариантов реализации рекомбинантный vWF, полученный при помощи способов согласно настоящему изобретению, может обладать удельной ристоцетин-кофакторной активностью, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг, а согласно другому варианту реализации - по меньшей мере 50 мЕ/мкг. Согласно другим вариантам реализации удельная ристоцетин-кофакторная активность может варьировать от приблизительно 30 до приблизительно 100 мЕ/мкг или от приблизительно 50 до приблизительно 100 мЕ/мкг.
B. Рекомбинантный ADAMTS13 (rA13).
Белки ADAMTS (т.е. ADAMTS-1-ADAMTS-20) представляют собой семейство секретируемых цинковых металлопротеиназ, имеющих общую модулярную доменную организацию (для ознакомления см. Flannery C.R., Front Biosci. 2006 Jan 1; 11:544-69). Все белки ADAMTS имеют общее строение центрального домена, состоящего из сигнального пептида, за которым следует продомен, цинк-зависимый металлопротеиназный каталитический домен, дезинтегрин-подобный домен, повтор тромбоспондина типа I, цистеин-богатый домен и спейсерный домен (Apte S.S., J Biol Chem. 2009 Nov 13; 284(46):314937). Помимо этого, все они, кроме ADAMTS-4, содержат по меньшей мере еще один домен повтора тромбоспондина типа I, и многие из белков ADAMTS содержат один или более дополнительный вспомогательный домен. В частности, сообщалось, что все белки ADAMTS, по всей видимости, содержат по меньшей мере один кальций-связывающий сайт и по меньшей мере один цинк-связывающий сайт, расположенные внутри металлопротеиназного каталитического домена (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), p. 881-888).
Описана биологическая роль белков ADAMTS при различных заболеваниях и состояниях, включая антиангиогенез, интерстициальный фиброз почек, перестройку костной ткани, фолликулогенез в яичниках, атеросклероз, развитие мочеполовой системы и рост/ремоделирование опухолей (ADAMTS-1); синдром Элерса-Данлоса типа 7C и бычий дерматоспараксис (ADAMTS-2); артрит, атеросклероз и тендинопатию (ADAMTS-4); артрит и глиобластому (ADAMTS-5); артрит (ADAMTS-7); антиангиогенез, злокачественные новообразования мозга, артрит и атеросклероз (ADAMTS-8); артрит (ADAMTS-9, -12); тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ADAMTS-13) и антитромбоз/инсульт (ADAMTS18) (для ознакомления см. Lin and Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1, 121-131).
Рекомбинантный ADAMTS13 (A13) экспрессировали в клетках млекопитающих и прежде, однако удельная активность широко варьирует в зависимости от условий культивирования клеток. Было обнаружено, что многие коммерчески доступные культуральные среды непригодны для экспрессии rA13 с высокой удельной активностью, выражаемой как отношение активности, измеренной посредством анализа FRETS-vWF73, к содержанию антигена, согласно оценке с применением ELISA. Согласно одному аспекту способы, предложенные согласно настоящему изобретению, основаны на нескольких полезных открытиях, позволяющих осуществлять экспрессию в культуре клеток белка rA13, обладающего повышенными уровнями общей и удельной активности.
Соответственно благодаря общим структурно-функциональным связям семейства ADAMTS секретируемых металлопротеиназ, предлагаемые согласно настоящему изобретению способы позволяют экспрессировать в культуре клеток и выделять из клеточной среды все белки ADAMTS.
Согласно одному из аспектов в соответствии с настоящим изобретением предложена композиция, содержащая рекомбинантный ADAMTS13 (rA13), обладающий удельной FRETS-vWF активностью, составляющей по меньшей мере 1600 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанный rA13 обладает удельной FRETS-vWF активностью, составляющей по меньшей мере 800 мЕ/мкг.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная композиция содержит культуральный супернатант. Согласно конкретному варианту реализации указанный культуральныи супернатант представляет собой супернатант культуры клеток млекопитающих. Согласно более конкретному варианту реализации указанный супернатант культуры клеток млекопитающих представляет собой супернатант клеток CHO.
Согласно одному варианту реализации вышеописанных композиций указанный rA13 экспрессируется в культуре клеток, содержащей по меньшей мере 1 мкг/л меди. Согласно конкретному варианту реализации указанная культура клеток содержит по меньшей мере 2 мкг/л меди. Согласно более конкретно
- 50 035147 му варианту реализации указанная культура содержит от 2 до 20 мкг/л меди.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций медь представлена в виде соли меди, хелата меди или их комбинации. Согласно конкретному варианту реализации указанная соль меди выбрана из группы, состоящей из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорид меди, гидроксид меди, нитрата меди и оксида меди.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой периодическую культуру.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанная культура клеток представляет собой непрерывную культуру. Согласно конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в хемостатическом режиме. Согласно другому конкретному варианту реализации непрерывное культивирование производится в режиме перфузии.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH4 + в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 5 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций уровень NH4 + в указанной культуре поддерживают на уровне концентрации ниже 4 мМ.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 4,0х106 клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 3,0х106 клеток/мл. Согласно конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 2,0х106 клеток/мл. Согласно более конкретному варианту реализации плотность клеток в культуре поддерживают на уровне менее чем 1,5х106 клеток/мл.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию получают в форме для фармацевтического введения. Согласно конкретному варианту реализации указанную композицию получают в форме для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения.
Согласно одному из вариантов реализации вышеописанных композиций указанную композицию лиофилизируют.
XIII. Составы.
Согласно одному аспекту составы, содержащие рекомбинантные терапевтические белки rvWF или rA13 согласно настоящему изобретению, лиофилизируют перед введением.
Лиофилизация проводится с применением общеизвестных в данной области техники методик и должна быть оптимизирована для разрабатываемой композиции [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) и Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].
Способы получения фармацевтических составов могут включать один или более следующих этапов: добавление стабилизирующего агента согласно описанию в настоящей заявке к указанной смеси перед лиофилизацией, добавление по меньшей мере одного агента, выбранного из объемообразующего агента, регулирующего осмолярность агента и ПАВ, каждый из которых соответствует приведенному в настоящей заявке описанию, к указанной смеси перед лиофилизацией. Лиофилизированный состав состоит согласно одному аспекту по меньшей мере из чего-либо одного или более из: буфера, объемообразующего агента и стабилизатора. Согласно этому аспекту оценивают полезность поверхностноактивного вещества и используют его в случаях, когда слипание на этапе процесса лиофилизации или восстановления представляет собой проблему. Для поддержания стабильности рН состава во время лиофилизации вводят подходящий буферизирующий агент.
Стандартный способ восстановления лиофилизированного материала заключается в повторном добавлении объема чистой воды или стерильной воды для инъекций (WFI) (как правило, эквивалентного объему, удаленному во время лиофилизации), хотя при получении фармацевтиков для парентерального введения иногда применяют разбавленные растворы антибактериальных агентов [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)].
Соответственно предложены способы получения восстановленных композиций рекомбинантного vWF, включающие этап добавления разбавителя к лиофилизированной композиции рекомбинантного vWF согласно настоящему изобретению.
Лиофилизированный материал может быть восстановлен в виде водного раствора. Различные водные носители, например стерильная вода для инъекций, вода с консервантами для многодозового применения или вода с подходящим количеством поверхностно-активных веществ (например, водная суспензия, которая содержит активное соединение в смеси с вспомогательными веществами, подходящими для получения водных суспензий). Согласно различным аспектам такие вспомогательные вещества представляют собой суспендирующие агенты, например, и без ограничения, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие агенты представляют собой встречающиеся в природе фосфатиды, например, и без ограничения, лецитин или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, и без ограничения, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, и без ог
- 51 035147 раничения, гептадекаэтил-еноксицетанолом, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такими как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гексита, например, и без ограничения, такими как полиэтиленсорбитанмоноолеат. Согласно различным аспектам указанные водные суспензии также содержат один или более консервант, например, и без ограничения, этил, или н-пропил, п-гидроксибензоат.
Для введения композиций человеку или экспериментальным животным согласно одному аспекту указанные композиции содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей. Выражения фармацевтически или фармакологически приемлемый относятся к молекулярным субстанциям и композициям, которые стабильны, подавляют разложение белков, например агрегацию, и продукты расщепления, и, кроме того, не вызывают аллергических или другие нежелательных реакций при введении с применением путей, общеизвестных в данной области техники, согласно приведенному ниже описанию. Фармацевтически приемлемые носители включают любые и все из клинически полезных растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических и задерживающих абсорбцию агентов и т.п., включая агенты, описанные выше.
Указанные фармацевтические составы вводят внутривенно, перорально, местно, трансдермально, парентерально, путем ингаляции, вагинально, ректально или путем внутричерепной инъекции. Используемый в настоящей заявке термин парентеральный включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрацистернальные инъекции или инфузионные техники. Также включено введение путем внутривенной, внутрикожной, внутримышечной, интрамаммарной, внутрибрюшинной, интратекальной, ретробульбарной, внутрилегочной инъекции и/или хирургической имплантации в конкретный участок. Как правило, композиции, по существу, не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для реципиента.
Однократное или многократное введение указанных композиций выполняют с применением дозировок и схем, выбранных лечащим врачом. Подходящая для предотвращения или лечения заболевания дозировка зависит от типа заболевания, лечение которого проводят, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли лекарственное средство с профилактической или терапевтической целью, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на лекарственное средство, и на основании выбора лечащего врача.
Согласно одному аспекту составы согласно настоящему изобретению вводят сначала в виде болюса, а затем следует непрерывная инфузия для поддержания терапевтических циркулирующих уровней лекарственного продукта. В другом примере соединение согласно настоящему изобретению вводят в виде однократной дозы. Специалисты в данной области техники смогут легко оптимизировать эффективные дозировки и схемы введения в соответствии с надлежащей медицинской практикой и клиническим состоянием пациента. Частота введения доз зависит от фармакокинетических параметров агентов и пути введения. Оптимальный фармацевтический состав определяет специалист в данной области техники в зависимости от пути введения и требуемой дозировки; см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042), с. 1435-1712, включенные в настоящую заявку посредством ссылки. Такие составы влияют на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo введенных агентов. В зависимости от пути введения подходящую дозу вычисляют в соответствии с массой тела, площадью поверхности тела или размером органа. Подходящие дозировки могут быть уточнены посредством стандартных способов определения уровней дозы в крови в сочетании с подходящими данными о зависимости доза-эффект. Окончательный режим дозирования определяет лечащий врач с учетом различных факторов, модифицирующих действие лекарственных средств, например удельной активности лекарственного средства, тяжести поражения и отклика пациента, возраста, состояния, массы тела, пола и рациона питания пациента, тяжести любой инфекции, времени введения и других клинических факторов. Например, типичная доза рекомбинантного vWF согласно настоящему изобретению составляет приблизительно 50 Е/кг, что равно 500 мкг/кг. По мере проведения исследований появляется дополнительная информация относительно подходящих уровней дозировок и продолжительности лечения различных заболеваний и состояний.
XIV. Способы лечения.
Настоящее изобретение также охватывает способы лечения пациента, нуждающегося в rvWF или rA13, полученных согласно способам, описанным в настоящей заявке. Такие способы лечения могут включать введение фармацевтических составов, содержащих рекомбинантный rA13 или высокомолекулярный рекомбинантный vWF согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение обеспечивает способы терапевтического или профилактического лечения, включающие введение композиции rvWF или rA13, предложенной в настоящем изобретении. Как правило, для терапевтического применения составы вводят пациенту с заболеванием или состоянием, связанным с дисфункцией ADAMTS13 или vWF, или нуждающемуся в этом по иной причинам, в терапевтически эффективной дозе. Составы и количества, эффективные для указанного применения, зависят от тяжести указанного заболевания или состояния, и от общего состояния здоровья пациента. В зависимости от дозировки и частоты, требуемых и переносимых пациентом, может
- 52 035147 осуществляться однократное или многократное введение указанных составов.
Согласно одному из вариантов реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с дисфункцией ADAMTS13 или vWF. Согласно дальнейшему варианту реализации фармацевтические составы, содержащие рекомбинантный vWF, могут вводиться для лечения заболеваний, связанных с vWF, таких как болезнь Виллебранда или гемофилия. Согласно другому варианту реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения или предотвращения заболеваний или состояний, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, включающие введение композиции rA13, предложенной в настоящей заявке. Согласно другому варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает способы разрушения одного или более тромба у нуждающегося в этом пациента. Согласно другим вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения инфаркта у нуждающегося в этом пациента. Как правило, предложенные в соответствии с настоящим изобретением способы включают введение композиции rADAMTS13 согласно настоящему изобретению нуждающемуся в этом пациенту.
Неограничивающими примерами расстройств, связанных с образованием и/или присутствием одного или более тромба, являются наследственная тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП), приобретенная ТТП, артериальный тромбоз, острый инфаркт миокарда (ОИМ), инсульт, сепсис и диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС).
Неограничивающие примеры расстройств, связанных с инфарктом, включают без ограничения инфаркт миокарда (сердечный приступ), эмболию легких, цереброваскулярные нарушения, такие как инсульт, окклюзионная болезнь периферических артерий (например, гангрена), антифосфолипидный синдром, сепсис, гигантоклеточный артериит (ГКА), грыжа и заворот кишок.
XV. Примеры.
Настоящее изобретение будет также проиллюстрировано следующими примерами, не ограничиваясь ими.
Пример 1.
Эксперименты с непрерывной культурой клеток проводили с применением культуры рекомбинантной клеточной линии CHO, экспрессирующей vWF. Основная среда представляла собой DMEM/F12, содержащую приблизительно 0,3 мкг/л Cu2+. В указанную среду был добавлен соевый гидролизат и сульфат меди (CuSO4-5H2O) с получением конечной концентрации меди в среде выше чем по меньшей мере 2,4 мкг/л.
Рекомбинантные клетки CHO, экспрессирующие vWF, культивировали в непрерывной клеточной культуре таким образом, что уровни аммония (NH4 +) находились на уровне концентрации менее чем приблизительно 10 мМ. Было обнаружено, что системы производства, обеспечивающие непрерывное поступление среды (например, перфузионные или хемостатические культуры) предпочтительны, так как стандартные техники периодических или подпитываемых культур приводят к высоким концентрациям NH4 + в конце культивирования. В конце культивирования выделяли высокомультимерный vWF и измеряли удельную ристоцетин-кофакторную активность vWF.
Пример 2.
Рекомбинантный фактор VIII (rFVIII) и фактор фон Виллебранда (rvWF) коэкспрессировали в периодических культурах клеток GD8/6 для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность vWF. Вкратце, клетки GD8/6 культивировали в непрерывном режиме в среде BAV-SP, состоящей из порошка модифицированной основной среды DMEM/F12 (табл. 5) и дополнительных добавок, также содержащих 4 г/л соевого гидролизата, см. табл. 6, с добавлением или без добавления дополнительной меди. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность rvWF использовали основные BAV-SP среды. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л меди и добавленный соевый гидролизат, что добавляло еще 0,7 мкг/л меди, как было установлено экспериментально, с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в среды BAV-SP, используемые для периодических культур, также добавляли дополнительно 3,3 мкг/л Cu2+, что давало конечную концентрацию меди 4,3 мкг/л, для определения действия высоких концентраций меди на экспрессию и активность vWF.
Таблица 5
Состав культуральных сред BAV-SP
XVI. Среда BAV-SP
Компоненты мг/л
Аминокислоты
L-Аланин 4,45
L-Аргинин НС1 147,50
- 53 035147
Ъ-Аспарагин-НгО 30,21
L-Аспарагиновая кислота 6, 65
L-Цистеин HCl-НгО 32,55
L-Цистин 2НС1 57,35
L-Глутаминовая кислота 7,35
Глицин 18,75
L-Гистидин-НгО НС1 31,48
Гидрокси-Ъ-Пролин
L-Изолейцин 54,47
L-Лейцин 59, 05
L-Лизин НС1 91,25
L-Метионин 17,24
L-Фенилаланин 35,48
L-Пролин 52,24
L-Серин 26, 25
L-Треонин 53,45
L-Триптофан 29, 01
L-Тирозин 2Na 2Н2О 55,79
L-Валин 52,85
Витамин
Аскорбиновая кислота 3,499
Биотин 0,0035
Холинхлорид 8,980
D-Са-Пантотенат 2,240
Фолиевая кислота 2, 650
1-Инозитол 12,600
Никотинамид 2,020
Пиридоксин НС1 2,031
Рибофлавин 0,219
Тиамин НС1 2,170
Витамин В12 0, 680
Неорганические соли
Кальция хлорид (СаС12) 116,600
Сульфат меди (СиВСЦ-бНгО) 0,0013
- 54 035147
Нитрат железа (Fe (NO3) 3-9Н2О) 0, 050
Сульфат железа (FeSO4-7H2O) 0,417
Хлорид магния (МдС12) 28,640
Сульфат магния (MgSO4) 48,840
Хлорид калия (КС1) 311,800
Хлорид натрия (NaCl) 6995,50 0
Фосфат натрия (Na2HPO4) 71,020
Фосфат натрия (NaH2PO4) 62,500
Гептагидрат сульфата цинка (ZnSO4- 7Н2О) 0,432
Селенит натрия 0,0131
Другие
D-Глюкоза 3151
Линолевая кислота 0, 042
Липоевая кислота 0, 105
Путресцин 2НС1 0, 081
Тимидин 0,365
Гипоксантин Na 2,390
Пируват натрия 55,000
Таблица 6
Состав добавки для BAV-SP
Компоненты конечного состава
L-Глутамин 600,00
Этаноламин 1,530
Synperonic F68 250,000
Бикарбонат натрия (NaHCO3) 2000,000
Соевый пептон 4000,00
Общий состав 18596,8
Клетки GD8/6, экспрессирующие rvWF, культивировали либо в среде с низким содержанием меди (табл. 7), либо в среде с высоким содержанием меди (табл. 8) в течение 7 дней. Через 2 дня культуры пересевали для проведения периодического культивирования на протяжении 5 дней. Образцы указанного культурального супернатанта ежедневно исследовали на содержание rvWF (vWF ELISA), общую (ристоцетин) и удельную (удельную активность) с применением ристоцетин-кофакторного анализа. Различные параметры культивирования, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрацию аммония, также отслеживали ежедневно (кроме дней периодического культивирования 3 и 4).
Неожиданно было обнаружено, что культуры клеток, росшие при высоких концентрациях меди, давали супернатанты, имеющие значительно более высокую общую и удельную rvWF-активность (ср. результаты в табл. 7 и 8). Например, на 4 день периодического культивирования культура клеток, росшая при высоких концентрациях меди, имела 1,52 ME rvWF активности/мл, по сравнению с 0,2 ME rvWF активности/мл для культуры с низким содержанием меди, несмотря на тот факт, что культура с низким содержанием меди клеток давала почти в два раза большее количество rvWF по сравнению с культурой клеток с высоким содержанием меди. Кроме того, удельная активность супернатанта, полученного из культуры с высоким содержанием меди, была более чем в 13 раз выше, чем у супернатанта культуры с низким содержанием меди (831 мЕ/10 мкг rvWF к 62 мЕ/10 мкг rvWF).
Как видно из табл. 7 и 8, общая и удельная ристоцетин-кофакторная активность культуры с высоким содержанием меди была в два раза выше таковой культуры с низким содержанием меди на 1 день периодического культивирования. Кроме того, в отличие от последующего увеличения активности, наблюдаемого в культуре с высоким содержанием меди, в культуре клеток с низким содержанием меди не было отмечено увеличения ристоцетин-кофакторной активности после 1 дня периодического культивирования. В соответствии с этим результатом анализ мультимерного статуса rvWF электрофорезом в агарозном геле показал, что в супернатанте культуры клеток с низким содержанием меди в 1-й день периодического культивирования присутствовала низкая относительно концентрации низкомолекулярных ви
- 55 035147 дов rvWF концентрация высокомолекулярного rvWF и также, что указанная относительная концентрация снижалась с течением времени (фиг. 1A и 1B). Напротив, добавление в культуральную среду Cu2+ стабильно приводило к образованию антигена с ристоцетин-кофакторной (RiCoF) активностью на протяжении четвертого дня. В соответствии с этим, уменьшения количества стабильных высокомолекулярных мультимеров rvWF в течение дня 4 периодической культуры не происходило (фиг. 1A и 1B). Результаты денситометрии агарозного электрофоретического геля, приведенные на фиг. 1B, показали, что при условии низкого уровня меди культура способна продуцировать только популяцию rvWF, более чем 10% rvWF которой (т.е. 16,3%) представлено молекулами из более чем 10 димеров, в течение одного дня периодического культивирования (т.е. образец дня 3 в 2 полосе агарозного геля на фиг. 1A); примечательно, что эта популяция опускалась до всего лишь 4% на день 5 периодического культивирования (образец дня 7 в полосе 6). Напротив, в условиях высокого содержания меди относительное количество мультимеров vWF, состоящих из более чем 10 димеров, стабильно составляет около 30% на протяжении дня 4 в периодической культуре (день 3- день 6 в полосах 7-10; 28-31,4%).
Примечательно, что начиная с 5-го дня периодического культивирования культуры с высоким содержанием меди, когда уровни NH4 + превышали 100 мг/л (выше чем приблизительно 5,0 мМ), экспрессия дополнительного антигена (18,3-35,4 мкг/л; ср. дни периодического культивирования 4 и 5 в табл. 8) не приводила к сопутствующему увеличению RiCoF-активности в супернатанте. В соответствии с этим результатом уровень высокомолекулярных мультимеров rvWF на 5 день периодического культивирования (7 день культивирования) снижался относительно концентрации низкомолекулярных мультимеров rvWF. Также только на 5 день периодического культивирования (образец дня 7 культуры в полосе 11) относительное количество vWF, состоящего из более чем 10 димеров, снижается до 21,4%.
В совокупности приведенные выше данные показывают, что дополнительная концентрация меди в культурах клеток, экспрессирующих rvWF, существенно увеличивает общую и удельную ристоцетинкофакторную активность rvWF, а также стабильную выработку высокомолекулярных мультимеров rvWF. Кроме того, эти данные выявляют корреляцию между высокими концентрациями NH4 + в культуре клеток и снижением ристоцетин-кофакторной активности rvWF и выработки высокомолекулярного мультимерного rvWF.
Таблица 7
Экспрессия rvWF в культурах клеток млекопитающих при периодическом режиме культивирования с применением сред BAV-SP с низкой концентрацией меди (1,0 мкг/л)
день периодического культивирования Количество клеток [10Е6 клеток/мл] nh4 + [мг/л] Жизнеспособность [%] vWF ELISA [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] Удельная активность мЕ/10мкг
0 0,42 21 98,8 н.о. н.о. н.о.
1 0,78 43 н.о. 6,3 0,23 365
2 1,24 64 99,1 12,8 0,23 180
3 1,86 н.о. н.о. 22,7 0,21 93
4 2,49 н.о. н.о. 32,2 0,20 62
5 з,и 106 98,3 44,4 0,20 45
Таблица 8
Экспрессия rvWF в культурах клеток млекопитающих, культивируемых в периодическом режиме с применением BAV-SP сред с высокой концентрацией меди (4,3 мкг/л)
день периодического культивирования Количество клеток [10Е6 клеток/мл] nh4 + [мг/л] Жизнеспособность [%] vWF ELISA [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] Удельная активность мЕ/10мкг
0 0,40 21 99,3 н.о. н.о. н.о.
1 0,71 42 н.о. 4,8 0,40 833
2 1,23 63 99,5 8,7 0,62 713
3 1,85 н.о. н.о. 15,0 1,07 713
4 2,54 н.о. н.о. 18,3 1,52 831
5 3,32 109 98,9 35,4 1,55 438
Пример 3.
Рекомбинантный фактор VIII (rFVIII) и фактор фон Виллебранда (rvWF) коэкспрессировали в непрерывных культурах клеток GD8/6, эксплуатируемых в хемостатических условиях, для определения эффекта состава культуральной среды на экспрессию и активность vWF. Вкратце, клетки GD8/6 культи
- 56 035147 вировали в среде BAV-SP, содержащей 4 г/л соевого гидролизата с добавлением и без добавления меди согласно описанию в примере 2. Для исследования эффекта низких концентраций меди на экспрессию и активность rvWF применяли основные среды BAV-SP. Указанные основные среды содержали 0,3 мкг/л меди и добавленный соевый гидролизат, что давало дополнительные 0,7 мкг/л меди с получением конечной концентрации меди 1,0 мкг/л. Для сравнения в периодических культурах применяли среды BAV-SP также с добавлением дополнительных 3,3 мкг/л Cu2+, с получением конечной концентрации меди 4,3 мкг/л, для определения эффекта высоких концентраций меди на экспрессию и активность vWF. Культуры, растущие в присутствии высоких и низких концентраций меди, культивировали как при высокой (2,8х 106 клеток/мл), так и при низкой (прибл. 1,4х106 клеток/мл) плотности клеток.
Как и ранее, образцы указанного культурального супернатанта исследовали на rvWF содержание (vWF ELISA), общую (ристоцетиновую) и удельную (удельную активность) активности посредством ристоцетин-кофакторного анализа. Также отслеживали различные параметры культуры, включая количество клеток, жизнеспособность клеток и концентрацию аммония. Данные получали на основании фазы стационарного состояния недель 2 и 3 хемостатической культуры (табл. 9-13).
Таблица 9
Средние данные по экспрессии rvWF в хемостатической культуре клеток на протяжении недель 2 и 3
XVII. Количество клеток XVIII. Концентрация меди XIX. Количество клеток [10Е6 клеток/мл] XX. NH4+ XXI. [мМ] XXII. Жизнеспо собность XXIII. [%] XXIV. vWF ELISA [мкг/мл] XXV. Ристоцетин [МЕ/мл] XXVI. удельная активность [мЕ/ 10мкг]
XXVII. XXVIII. XXIX. 2,88 XXX. XXXI. XXXII. XXXIII. xxxrv.
большое низкая 3,88 97,74 44,56 0,10 21,62
XXXV. XXXVI. XXXVII. XXXVI хххгх. XL. 38,38 XLI. 0,19 XLII.
большое высокая 2,79 II. 4,04 98,25 53,11
XLIII. XLIV. XLV. 1,55 XLVI. XLVII. XLVIII. XLIX. 0,10 L. 50,16
маленькое низкая 3,33 98,63 18,96
LI. LII. LIII. 1,43 I.IV. LV. 98,59 LVI. 11,76 LVII. 0,70 LVIII.
маленькое высокая 3,17 598,76
Таблица 10
Экспрессия rvWF в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3
LIX. День LX. Количество клеток [10E6 клеток/мл] LXI. NH4+ LXII. [мМ] LXIII. Жизнеспосо бность LXIV. [%] LXV. vWF ELISA [мкг/мл] LXVI. Ристоцетин [МЕ/мл] LXVII. удельная активность [μΕ/ΙΟμκγ]
LXVIII. 8 LXIX. 2,54 LXX. 3,7 LXXI. 98,20 LXXII. 39,8 LXXIII. 0,095 LXXIV. 23,86934673
LXXV. 9 LXXVI. 3,02 LXXVII. 4,2 LXXVIII. 97,40 LXXIX. LXXX. LXXXI.
LXXXII. 10 LXXXIII. 2,97 LXXXIV. 3,9 LXXXV. 97,90 LXXXVI. 41,3 LXXXVII. 0,095 LXXX VIII. 23,00242131
LXXXIX. 11 XC. 2,78 XCI. XCII. хеш. XCIV. xcv.
XCVI. 13 XCVII. 2,91 XCVIII. 3,8 XCIX. 97,60 C. 41,7 CI. 0,095 СП. 22,78177458
cm. 14 CIV. 2,90 CV. 3,8 CVI. 97,40 evil. CVIII. CIX.
CX. 15 CXI. 3,05 CXII. 3,9 CXIII. 97,70 CXIV. 44,7 CXV. 0,095 CXVI. 21,25279642
CXVII. 16 CXVIII. 2,99 CXIX. 3,8 CXX. 98,30 CXXI. CXXII. CXXIII.
CXXIV. 17 CXXV. 2,76 CXXVI. 3,9 CXXVII. 97,40 CXXVIII. 55,3 CXXIX. 0,095 CXXX. 17,17902351
CXXXI. CXXXII. 2,88 CXXXIII. 3,88 exxxrv. 97,74 CXXXV. 44,56 CXXXVI. 0,10 CXXXVII. 21,62
- 57 035147
Таблица 11
Экспрессия rvWF в хемостатической культуре клеток в условиях большого количества клеток и высоких уровней меди на протяжении недель 2 и 3
CXXXVIII. День CXXXIX. Количество клеток [10Е6 клеток/мл] CXL. NH4+ CXLI. [мМ] CXLII. Жизнеспосо бность CXLIII. [%] CXLIV. vWF ELISA [мкг/мл] CXLV. Ристоцетин [МЕ/мл] CXLVI. удельная активность [мЕ/Юмкг]
CXLVII. 8 CXLVIII. 2,52 CXLIX. 3,9 CL. 98,30 CLI. 31,8 CLII. 0,35 CLIII. 110,0628931
CLIV. 9 CLV. 2,92 CLVI. 4,3 CLVII. 98,50 CL VIII. CLIX. CLX.
10 2,80 4,2 98,60 37,4 0,32 85,56149733
11 2,57
13 2,81 3,9 98,50 37,6 0,095 25,26595745
14 2,92 3,9 97,80
15 2,77 3,9 97,80 43,0 0,095 22,09302326
16 2,72 4,0 98,30
17 3,04 4,1 98,20 42,1 0,095 22,56532067
2,79 4,04 98,25 38,38 0,19 53,11
Таблица 12
Экспрессия rvWF в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток, низкого уровня меди на протяжении недель 2 и 3
День Количество клеток [10Е6 клеток/мл] NH4 + [мМ] Жизнеспосо бность [%] vWF ELISA [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] удельная активность [мЕ/10мкг]
8 1,61 3,3 99,10 19,3 0,095 49,22279793
9 1,65 5,5 98,00
10 1,49 3,3 98,90 18,6 0,095 51,07526882
11 1,58
13 1,58 3,4 98,10 18,1 0,095 52,48618785
14 1,56 3,3 99,30
15 1,52 3,3 98,50 18,9 0,095 50,26455026
16 1,50 3,3 98,40
17 1,50 3,4 98,70 19,9 0,095 47,73869347
1,55 3,33 98,63 18,96 0,10 50,16
Таблица 13
Экспрессия rvWF в хемостатической культуре клеток в условиях маленького количества клеток, высокого уровня меди на протяжении недель 2 и 3
День Количество клеток [10Е6 клеток/мл] NH4+ [мМ] Жизнеспосо бность [%] vWF ELISA [мкг/мл] Ристоцетин [МЕ/мл] удельная активность [мЕ/10мкг]
8 1,46 3,2 98,80 11,6 0,73 629,3103448
9 1,45 3,2 98,20
10 1,37 3,1 98,90 11,0 0,7 636,3636364
11 1,43
13 1,33 3,2 98,10 Н,1 0,68 612,6126126
14 1,39 3,2 97,20
15 1,51 3,2 99,70 12,4 0,69 556,4516129
16 1,49 3,2 98,60
17 1,43 3,2 99,20 12,7 0,71 559,0551181
1,43 3,17 98,59 11,76 0,70 598,76
Как показано на фиг. 2A, супернатант, собранный из непрерывной rvWF-культуры клеток, выращенной при низкой плотности клеток и высоких концентрациях меди, имел высокую удельную активность (в среднем 600 мЕ/10 мкг), в то время как супернатанты, собранные из rvWF-культур клеток, выращенных при высокой плотности клеток в присутствии высоких или низких концентраций меди, и rvWF-культур клеток, выращенных при низкой плотности клеток в присутствии низкой концентрации меди, имели низкие удельные активности (менее чем 100 мЕ/10 мкг). В соответствии с результатами,
- 58 035147 полученными для периодических культур, как видно из фиг. 2B, непрерывные культуры клеток млекопитающих, экспрессирующие rvWF с высокой удельной активностью, содержат более низкие NH4 + концентрации, чем культуры, продуцирующие rvWF с низкой удельной активностью. Эти данные также подтверждают корреляцию между концентрацией NH4 + в культуре клеток и удельной активностью rvWF, продуцируемого указанной культурой. Примечательно, что комбинация высокой концентрации меди и низкой концентрации аммония в культуре клеток позволяла добиться значительного повышения активности rvWF.
В соответствии с этим результатом, анализ мультимерного статуса rvWF в хемостатических культурах с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг. 6) показал, что только супернатанты культур, эксплуатируемых при высоком содержании меди и низкой плотности клеток и, таким образом, низком содержании аммония, обеспечивали устойчивую экспрессию высокомультимерного vWF (приблизительно 23-27% в дни CST 8, 17 и 24, полосы 4, 8, и 12 соответственно). Все прочие условия не обеспечивали устойчивого достижения большого количества - более чем 10% vWF, содержащего более чем 10 димеров, на протяжении длительного периода культивирования.
Пример 4.
Для определения эффекта концентрации меди в культуральной среде на экспрессию и удельную активность rA13 культуры клеток млекопитающих для экспрессии rA13 культивировали в течение 4 недель в условиях хемостатической непрерывной культуры в среде ADAMTS13, включающей модифицированные основные среды DMEM/F12 BESP845 и дополнительные добавки (табл. 14), содержащие медь в диапазоне концентраций от 0,66 мкг/л (без дополнительного добавления меди) и с дополнительным добавлением меди до 4 мкг/л. Как видно из табл. 15, возрастающая концентрация меди в среде для клеточных культур приводила к значительному увеличению объемной (P) и удельной (q) продуктивности, выражаемой в виде общей активности rA13, полученного на 1 л культуры в день, и общей активности полученного rA13 на клетку в день соответственно.
- 59 035147
Таблица 14
Состав среды для получения ADAMTS13
CLXI. DMEM/F12 BESP845
Аминокислоты мг/л
L-Аланин 13,3500
L-Аргинин НС1 147,5000
L-Аспарагин-НгО 45,1600
L-Аспарагиновая кислота 19,9500
L-Цистеин НС1-Н2О 32,5500
L-Цистин 2НС1 102,3500
L-Глутаминовая кислота 22,0500
Глицин 26,2500
L-Гистидин-НгО НС1 51,4800
L-Изолейцин 74,4700
L-Лейцин 119,0500
L-Лизин НС1 146,2500
L-Метионин 100,0000
L-Фенилаланин 60,4800
L-Пролин 63,7400
L-Серин 36,7500
L-Треонин 53,4500
L-Триптофан 29,0100
L-Тирозин 2Na 2Н2О 75,7900
L-Валин 82,8500
соли мг/л
Кальция хлорид (СаС12) 116,6000
Сульфат меди (СиЗСМ-ЬНгО) 0,0026
Нитрат железа (Ге (NO3) 3-9НгО) 0,0500
Сульфат железа (ГеБСц-ЗНгО) 1,0170
Хлорид магния (МдС12) 28,6400
Сульфат магния (MgSO4) 48,8400
Хлорид калия (КС1) 311,8000
Хлорид натрия (NaCl) 5495,5000
Na2HPO4 Безводный 213,0200
NaH2PO4 Безводный 54,3500
Гептагидрат сульфата цинка (ZnSO4- 27Н2О) 0,4320
Селенит натрия, безводный 0,0087
- 60 035147
Витамин мг/л
Аскорбиновая кислота 3,4990
Биотин 0,2035
Холинхлорид 26,9800
D-Са-Пантотенат 6,2400
Фолиевая кислота 6,6500
1-Инозитол 36,6000
Никотинамид 7,0200
Пиридоксин НС1 6,0310
Рибофлавин 0,6590
Тиамин НС1 6,5100
Витамин В12 2,6800
другое мг/л
D-Глюкоза 5000,0000
Линолевая кислота 0,0420
Липоевая кислота 1,0050
Путресцин 2НС1 3,6810
Тимидин 0,3650
Гипоксантин Na 2,3900
Пируват натрия 55,0000
DMEM/F12 BESP845: всего 12738,3
ADAMTS-13 Средовые добавки мг/л
L-Глутамин 1300,0000
Pluronic F68 1000,0000
Этаноламин 1,5300
ZnSo4*7 Н2О 1,0000
Na-Гидрокарбонат 1500,0000
Всего добавок 3802,5
Общее количество ингредиентов 16540,8
Чтобы определить, влияют ли повышенные концентрации меди на сохранность экспрессируемого rA13, супернатант, собранный от ^ХЭ-культур клеток, выращенных в среде, содержащей 0,66 мкг/л, 1 и 4 мкг/л меди, исследовали с помощью анализа ДСН-ПААГ. Как видно из фиг. 3A (окрашивание серебром) и 3B (анти-А13 вестерн-блоттинг), очевидных изменений в качестве продукта при гельэлектрофорезе не наблюдается. Так, экспрессия rA13 в присутствии повышенных концентраций меди не приводит к повышению уровня усеченного 170 кДа или других низкомолекулярных вариантов rA13 и к появлению дополнительных или увеличению полос, соответствующих HCP (белкам клеток-хозяев).
При расчете оптимальной концентрации меди для активности rA13 экстраполирование данных из табл. 15 о зависимости P Frets от концентрации меди (фиг. 4) показывает, что оптимальный эффект, очевидно, достигается при приблизительно 2 мкг/л с негативным влиянием по консервативной оценке при более чем приблизительно 4 мкг/л.
- 61 035147
Таблица 15
Экспрессия rA13 в культурах клеток млекопитающих при хемостатическом режиме непрерывного культивирования с применением среды, содержащей различные концентрации меди
Объем 10 л R&D (НИР) эксперимент Среднее за 4 недели CST ZZ - NC Р Frets q Frets Уд. активность
[10Е6 клеток/мл] [Е/(л*д) ] [Е/ (10Е9 клетки* д) ] Е/мг
0,66 мкг/л Си2+ 1,35 1322 1028 1759
1 мкг/л Си2+ 1, 64 1962 1247 1690
4 мкг/л Си2+ 2,26 2960 1338 1768
На основании полученных результатов, описанных выше, был проведен дополнительный эксперимент для сравнения экспрессии rA13 в среде для клеточных культур, содержащей 0,66 мкг/л меди и содержащих 2,0 мкг/л меди. Как видно из табл. 16, добавление в основные клеточные среды меди до конечной концентрации 2,0 мкг/л меди приводило к значительному повышению объемной (P) и удельной (q) продуктивности, выраженной в виде общей активности rA13, полученного на 1 л культуры в день, и общей активности rA13, полученного на клетку в день соответственно на протяжении 8 недель. Конкретные данные для каждой недели выработки rA13 в двух указанных культурах приведены на фиг. 5. Из этих данных очевидно следует, что добавление меди оказывает измеряемый благоприятный эффект на метаболизм клеток, удельную скорость роста и выработку rA13.
Таблица 16
Экспрессия rA13 в культурах клеток млекопитающих при хемостатическом режиме непрерывного культивирования с применением среды, содержащей различные концентрации меди
Объем 10 л Среднее за 8 недель CST ZZ - NC Р Frets q Frets Уд. активность
[10Е6 кл. /мл ] [Е/ (л*д) ] [Е/ (10Е9 кл.*д)] Е/мг
0,66 мкг/л Си2+ 1,29 1049 821 1862
2 мкг/л Си2+ 2,17 2470 1146 1749
Понятно, что примеры и варианты реализации, описанные в настоящей заявке, приведены исключительно для наглядности, и что различные модификации или изменения с учетом таковых будут понятны специалистам в данной области техники, подлежат включению в суть и объем настоящей заявки и подпадают под действие прилагаемой формулы изобретения. Все упоминаемые в настоящей заявке публикации, патенты и патентные заявки включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте для любых целей.

Claims (21)

1. Способ получения композиции рекомбинантного ADAMTS13 (rA13), включающий стадии культивирования клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок rA13 в среде культуры клеток, содержащей от 1 до 6 мкг/л меди таким образом, что rA13 экспрессировался и выделялся из клеток млекопитающего в культуральный супернатант; и отделения по меньшей мере части культурального супернатанта, где плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 4,0х106 клеток на 1 мл на протяжении этапа культивирования клеток млекопитающего;
причем в указанном отделенном супернатанте присутствует по меньшей мере 1500 единиц активности FRETS-vWF73 на 1 л среды культуры клеток в день.
2. Способ по п.1, где среда культуры клеток не содержит белков.
3. Способ по п.1 или 2, где среда культуры клеток представляет собой культуральную среду с заданным химическим составом.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где среда культуры клеток содержит от 2,0 до 4,0 мкг/л меди.
5. Способ по любому из пп. 1-3, где среда культуры клеток содержит 4 мкг/л меди.
6. Способ по любому из пп. 1-3, где среда культуры клеток содержит 2 мкг/л меди.
- 62 035147
7. Способ по любому из пп.1-6, где клетки млекопитающего представляют собой CHO клетки.
8. Способ по любому из пп.1-7, где культивирование клеток млекопитающего проводится непрерывно.
9. Способ по п.8, где культивирование клеток млекопитающего осуществляют в хемостатическом режиме.
10. Способ по п.8, где культивирование клеток млекопитающего осуществляют в режиме перфузии.
11. Способ по любому из пп.1-10, где клетки млекопитающего культивируют по меньшей мере в 100 л среды культуры клеток.
12. Способ по любому из пп.1-11, где плотность клеток поддерживают на уровне от 2,0х106 до 4,0х106 клеток на 1 мл.
13. Способ по любому из пп.1-12, где среда культуры клеток содержит от 5 до 10 мг/л никотинамида.
14. Способ по любому из пп.1-13, где среда культуры клеток содержит примерно 7 мг/л никотинамида.
15. Способ по любому из пп.1-14, дополнительно включающий этап обогащения rA13.
16. Супернатант культуры клеток, содержащий рекомбинантный ADAMTS13 (rA13), полученный способом по любому из пп.1-15.
17. Композиция рекомбинантного ADAMTS13 (rA13) для введения субъекту, нуждающемуся в ней, полученная способом по любому из пп.1-15.
18. Композиция по п.17, где нарушением является тромботическая тромбоцитопеническая пурпура.
19. Композиция по п.17, где нарушением является инфаркт.
20. Композиция по п.17, где нарушением является инсульт.
21. Композиция по любому из пп.17-20, где композиция пригодна для внутривенного введения.
EA201792340A 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток EA035147B1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36263510P 2010-07-08 2010-07-08

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201792340A2 EA201792340A2 (ru) 2018-02-28
EA201792340A3 EA201792340A3 (ru) 2018-07-31
EA035147B1 true EA035147B1 (ru) 2020-05-06

Family

ID=44514323

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201792340A EA035147B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA201390082A EA029503B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA202090220A EA202090220A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток
EA202090067A EA202090067A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA201390080A EA035066B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, СОДЕРЖАЩЕЙ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР ФОН ВИЛЛЕБРАНДА (rVWF)

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390082A EA029503B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA202090220A EA202090220A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток
EA202090067A EA202090067A3 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA201390080A EA035066B1 (ru) 2010-07-08 2011-07-08 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, СОДЕРЖАЩЕЙ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР ФОН ВИЛЛЕБРАНДА (rVWF)

Country Status (25)

Country Link
US (8) US9458222B2 (ru)
EP (6) EP2590998B1 (ru)
JP (3) JP6138683B2 (ru)
KR (4) KR102027991B1 (ru)
CN (4) CN103097409A (ru)
AU (6) AU2011274467B2 (ru)
BR (2) BR112013000512A2 (ru)
CA (2) CA2804275A1 (ru)
CO (2) CO6680636A2 (ru)
DK (3) DK3064508T4 (ru)
EA (5) EA035147B1 (ru)
ES (4) ES2761692T5 (ru)
FI (1) FI3064508T4 (ru)
HR (3) HRP20192089T4 (ru)
HU (3) HUE046443T2 (ru)
IL (5) IL286298B (ru)
MX (3) MX339632B (ru)
NZ (2) NZ605403A (ru)
PL (4) PL3064508T5 (ru)
PT (3) PT2590998T (ru)
SG (3) SG10201809632XA (ru)
SI (3) SI2591094T1 (ru)
TR (1) TR201815211T4 (ru)
TW (4) TWI609890B (ru)
WO (2) WO2012006594A1 (ru)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8415114B2 (en) 2008-12-05 2013-04-09 Baxter International Inc. Methods of measuring ADAMTS13-mediated in vivo cleavage of von Willebrand factor and uses thereof
US8772462B2 (en) 2010-05-26 2014-07-08 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
IL286298B (en) 2010-07-08 2022-08-01 Baxalta Inc A method to generate high molecular weight substituted vwf in cell culture
EP3858375B1 (en) 2011-06-10 2024-03-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Treatment of coagulation disease by administration of recombinant vwf
US9030963B2 (en) * 2012-12-03 2015-05-12 Honeywell International Inc. Analyzing a network topology
UY35343A (es) * 2013-02-26 2014-09-30 Bayer Healthcare Llc Formulaciones y procedimientos para la producción de proteína recombinante aumentada
US9677105B2 (en) 2013-03-14 2017-06-13 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US8956830B2 (en) 2013-03-14 2015-02-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US20140271622A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
AU2013203062C1 (en) 2013-03-15 2018-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Subcutaneous administration of adamts13
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
EP3131929B1 (en) 2014-04-16 2022-06-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies for the prevention or the treatment of bleeding episodes
WO2015188224A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Csl Limited Improved production of recombinant von willebrand factor in a bioreactor
MA41685A (fr) * 2014-10-17 2017-08-22 Biogen Ma Inc Supplémentation en cuivre pour la régulation de la glycosylation dans un procédé de culture cellulaire de mammifère
CA2973343C (en) * 2015-02-05 2023-08-08 R.P. Scherer Technologies, Llc Activated formylglycine-generating enzymes and methods of producing and using the same
AR104050A1 (es) 2015-03-26 2017-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Proceso de producción con iones de cobre controlados
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
SG11201900853SA (en) 2016-08-04 2019-02-27 Baxalta Inc Use of adamts13 for treating, ameliorating and/or preventing vaso-occlusive crisis in sickle cell disease, acute lung injury and/or acute respiratory distress syndrome
CN106957815B (zh) * 2017-03-16 2021-05-07 杨涛 一种用于人类多潜能干细胞的无血清培养基的配方
BR112020000322A2 (pt) 2017-07-07 2020-07-14 Baxalta Incorporated uso de fator de von willebrand recombinante (rvwf)
PT3648788T (pt) 2017-07-07 2024-08-23 Takeda Pharmaceuticals Co Tratamento de hemorragia gastrointestinal em pacientes com doença de von willebrand grave por administração de fvw recombinante
AU2019240135B2 (en) 2018-03-21 2024-10-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited Separation of VWF and VWF propeptide by chromatographic methods
SG11202108325YA (en) 2019-02-01 2021-08-30 Takeda Pharmaceuticals Co Methods of prophylactic treatment using recombinant vwf (rvwf)
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10961500B1 (en) 2019-04-23 2021-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture medium for eukaryotic cells
JP2022547556A (ja) 2019-09-11 2022-11-14 武田薬品工業株式会社 フォン・ヴィレブランド因子と補体ｃ１ｑの複合体に関連する治療法
JP2023514541A (ja) 2020-02-04 2023-04-06 武田薬品工業株式会社 組換えｖｗｆの投与による重症のフォンヴィレブランド病患者における過多月経の治療
US20230201319A1 (en) 2020-05-22 2023-06-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adamts13 compositions and methods for treating and diagnosing complications of coronavirus disease

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042441A2 (en) * 2000-11-22 2002-05-30 Baxter Aktiengesellschaft VON WILLEBRAND FACTOR (vWF) CLEAVING PROTEASE POLYPEPTIDE, NUCLEIC ACID ENCODING THE POLYPEPTIDE AND USE OF POLYPEPTIDE

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4767704A (en) * 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
NL8500961A (nl) 1985-04-01 1986-11-03 Stichting Vrienden Van De Stic Cdna-codering voor de humane von willebrand-factor, plasmiden met een dergelijke cdna-codering respektievelijk fragmenten ervan, alsmede micro-organismen, welke dergelijke plasmiden bevatten.
AU591671B2 (en) 1985-04-11 1989-12-14 Children's Medical Center Corporation Von willebrand factor
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
DE69535940D1 (de) 1994-11-10 2009-06-04 Baxter Healthcare Sa Verfahren zur Herstellung von biologischen Produkten in Protein-freiem Kultur
AU703484B2 (en) 1995-02-23 1999-03-25 Quest International Services B.V. Peptides for tissue and cell culture media
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
WO1998008934A1 (en) 1996-08-30 1998-03-05 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US6458574B1 (en) * 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
AU4751697A (en) 1996-10-10 1998-05-05 Douglas Danner Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients
US6156570A (en) * 1997-03-20 2000-12-05 Regents Of The University Of Minnesota Process for the continuous culture of cells
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
AT407255B (de) 1997-06-20 2001-02-26 Immuno Ag Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6531577B1 (en) 1997-12-15 2003-03-11 Hemasure Denmark A/S von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations
US6528286B1 (en) * 1998-05-29 2003-03-04 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins
US6406909B1 (en) 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
AT409379B (de) 1999-06-02 2002-07-25 Baxter Ag Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen
JP2001120262A (ja) 1999-10-26 2001-05-08 Welfide Corp 生理活性物質の産生増強方法
WO2003045995A2 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Sandoz Gmbh Cell culture process
EP1468099A2 (en) 2002-01-17 2004-10-20 Lonza Biologics plc Glutamine-auxothrophic human cells capable of producing proteins and capable of growing in a glutamine-free medium
US20050084828A1 (en) 2003-10-21 2005-04-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Apparatus and method for braille instruction
EP1593388A1 (en) 2004-05-05 2005-11-09 ZLB Behring GmbH Therapeutic plasma protein-concentrates containing von willebrand factor as high molecular weight multimers
TWI384069B (zh) * 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
US20060094104A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
US8273553B2 (en) * 2004-11-02 2012-09-25 Ares Trading S.A. Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells
KR101196103B1 (ko) 2004-11-02 2012-11-01 아레스 트레이딩 에스.에이. 포유동물 세포용 무?혈청 세포 배양 배지
US20070049557A1 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Hashim Ahmed Solid pharmaceutical dosage forms comprising bisphosphonates and modified amino acid carriers
KR101423344B1 (ko) 2006-01-04 2014-07-30 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 올리고펩티드-무함유 세포 배양 배지를 이용하여 단백질을 발현시키는 방법
US20070190057A1 (en) * 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
CN101490239A (zh) * 2006-07-14 2009-07-22 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改进的细胞培养方法
SG10201510384UA (en) * 2006-09-13 2016-01-28 Abbvie Inc Cell culture improvements
US7960869B2 (en) 2006-09-22 2011-06-14 Siemens Industry, Inc. Internal intelligence for remote operated relay
NZ577728A (en) * 2006-12-27 2012-01-12 Baxter Int Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage
RU2009132986A (ru) * 2007-03-02 2011-04-10 Уайт (Us) Применение меди и глутамата в культуре клеток для производства полипептидов
DE102007046611A1 (de) * 2007-09-28 2009-04-02 Osram Opto Semiconductors Gmbh Lichtquelle mit Konversionselement und Lichtwellenleiter, Verfahren zur Herstellung der Lichtquelle und deren Verwendung
PT2235197T (pt) 2007-12-27 2017-10-11 Baxalta Inc Processos para cultura de células
US20090181423A1 (en) 2007-12-31 2009-07-16 Baxter International Inc. Substantially animal protein-free recombinant furin and methods for producing same
JP4458167B2 (ja) * 2008-01-11 2010-04-28 住友金属工業株式会社 熱間塑性加工用潤滑剤を用いる継目無管製造における外面潤滑方法
US20110086813A1 (en) 2008-03-19 2011-04-14 Gad Glaser Compounds for treating bacterial infections
AU2009236187B2 (en) * 2008-04-17 2012-08-02 Wyeth Llc Methods for enhanced production of bone morphogenetic proteins
US8486699B2 (en) 2008-05-23 2013-07-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Immortal unipotent porcine PICM-19H and PICM-19B stem cell lines
US8580554B2 (en) * 2009-07-31 2013-11-12 Baxter International Inc. Method of producing a polypeptide or virus of interest in a continuous cell culture
BR122021005965B1 (pt) * 2009-07-31 2022-01-25 Baxalta Incorporated Método para produzir uma composição de desintegrina e metaloproteinase com motivo trombospondina (adamts)
IL286298B (en) 2010-07-08 2022-08-01 Baxalta Inc A method to generate high molecular weight substituted vwf in cell culture
TWI408228B (zh) 2010-10-29 2013-09-11 Univ Nat Chunghsing 用於生產一標的蛋白質的核酸建構物、重組型載體以及方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002042441A2 (en) * 2000-11-22 2002-05-30 Baxter Aktiengesellschaft VON WILLEBRAND FACTOR (vWF) CLEAVING PROTEASE POLYPEPTIDE, NUCLEIC ACID ENCODING THE POLYPEPTIDE AND USE OF POLYPEPTIDE

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARBARA PLAIMAUER et al. Cloning, expression, abd functional characterization of the von Willebrand factor-cleaving protease (ADAMTS13). Blood, 15 November 2002, Vol. 100, no. 10, p. 3626-3632, особенно реферат, с. 3626-3631 *
DEBRA J. BEVITT et al. Expression of ADAMTS metalloproteinases in retinal pigment epithelium derived cell line ARPE-19: transcriptional regulation by TNF. Biochimica et Biophysica Actas, 2003, Vol. 1626, p. 83-91 *
KOICHI KOKAME et al. FRETS-VWF73, a first fluorogenic substrate for ADAMTS13 assay. British Journal of Haematology, 2005, Vol. 129, p. 93-100, особенно реферат, с. 93-98 *
NEIFAR M. et al. Effect of culturing processes and copper addition on laccase production by the white-rot fingus Fomes fomentarius MUCL 35117. The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology, 2009, Vol. 49, p. 73-78, особенно реферат, с. 73-77 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016025873A (ja) 2016-02-12
AU2018200206B2 (en) 2020-05-28
KR102027991B1 (ko) 2019-10-02
CO6680636A2 (es) 2013-05-31
ES2761692T3 (es) 2020-05-20
CN107286235A (zh) 2017-10-24
BR112013000515A2 (pt) 2016-05-17
DK3064508T4 (da) 2023-04-11
US10100099B2 (en) 2018-10-16
KR101924120B1 (ko) 2018-11-30
TW201204744A (en) 2012-02-01
EP3064508B1 (en) 2019-08-28
HRP20180136T1 (hr) 2018-04-06
US10822394B2 (en) 2020-11-03
AU2011274467A1 (en) 2013-01-24
HRP20181657T1 (hr) 2019-03-08
TWI670073B (zh) 2019-09-01
EP3626736A1 (en) 2020-03-25
CN103097409A (zh) 2013-05-08
KR20180130587A (ko) 2018-12-07
DK2590998T3 (en) 2018-02-12
US9458222B2 (en) 2016-10-04
DK3064508T3 (da) 2019-11-25
DK2591094T3 (en) 2018-11-26
US20120035110A1 (en) 2012-02-09
EP3064508A1 (en) 2016-09-07
PL2590998T3 (pl) 2018-05-30
HRP20192089T4 (hr) 2023-04-28
IL286298A (en) 2021-10-31
US20180044405A1 (en) 2018-02-15
MX353409B (es) 2018-01-11
TW201900207A (zh) 2019-01-01
IL255327A0 (en) 2017-12-31
TW201637665A (zh) 2016-11-01
EA202090220A2 (ru) 2020-05-31
IL286298B (en) 2022-08-01
AU2020203565A1 (en) 2020-06-18
ES2694518T3 (es) 2018-12-21
PT2590998T (pt) 2018-02-13
KR20130091328A (ko) 2013-08-16
SG186935A1 (en) 2013-02-28
AU2018200206A1 (en) 2018-04-05
EP2590998B1 (en) 2017-11-15
PT3064508T (pt) 2019-12-05
EA201792340A2 (ru) 2018-02-28
EA202090067A2 (ru) 2020-04-30
JP2013533748A (ja) 2013-08-29
SG186936A1 (en) 2013-02-28
IL255327B (en) 2020-04-30
JP2013538046A (ja) 2013-10-10
AU2011274470A1 (en) 2013-01-24
TWI646972B (zh) 2019-01-11
US20190085052A1 (en) 2019-03-21
NZ605403A (en) 2014-10-31
EP3064508B2 (en) 2023-03-15
EP3392271A1 (en) 2018-10-24
US20120034674A1 (en) 2012-02-09
AU2015207811A1 (en) 2015-08-20
IL223930A (en) 2017-01-31
CN103097522A (zh) 2013-05-08
US20170008948A1 (en) 2017-01-12
PL3392271T3 (pl) 2021-11-15
HRP20192089T1 (hr) 2020-03-20
EP3392271B1 (en) 2021-05-05
US11780904B2 (en) 2023-10-10
BR112013000512A2 (pt) 2016-05-17
US9409971B2 (en) 2016-08-09
KR102007773B1 (ko) 2019-08-06
HUE038193T2 (hu) 2018-09-28
ES2664392T3 (es) 2018-04-19
AU2011274470B2 (en) 2015-08-13
EP2591094B1 (en) 2018-09-05
TW201206953A (en) 2012-02-16
EP3909977A1 (en) 2021-11-17
MX2013000165A (es) 2013-06-05
BR112013000515B1 (pt) 2021-11-03
AU2022200035A1 (en) 2022-01-20
JP6138683B2 (ja) 2017-05-31
KR20130091329A (ko) 2013-08-16
AU2011274467B2 (en) 2015-01-15
JP5953502B2 (ja) 2016-07-20
SI3064508T2 (sl) 2023-05-31
WO2012006594A1 (en) 2012-01-12
EA201390080A1 (ru) 2013-06-28
EP2591094A1 (en) 2013-05-15
US20210115110A1 (en) 2021-04-22
WO2012006591A1 (en) 2012-01-12
ES2761692T5 (es) 2023-07-05
ES2875772T3 (es) 2021-11-11
HUE046443T2 (hu) 2020-03-30
US8852888B2 (en) 2014-10-07
US20150018525A1 (en) 2015-01-15
EP3392271B8 (en) 2021-06-16
EA035066B1 (ru) 2020-04-23
TWI617575B (zh) 2018-03-11
TR201815211T4 (tr) 2018-11-21
EA201390082A1 (ru) 2013-06-28
PL3064508T5 (pl) 2024-04-08
KR20180099922A (ko) 2018-09-05
IL273304A (en) 2020-04-30
IL273304B (en) 2021-09-30
JP6284919B2 (ja) 2018-02-28
PT2591094T (pt) 2018-11-20
KR101894604B1 (ko) 2018-09-03
CA2805557A1 (en) 2012-01-12
PL2591094T3 (pl) 2019-02-28
SI3064508T1 (sl) 2019-12-31
MX339632B (es) 2016-06-02
EA201792340A3 (ru) 2018-07-31
SI2590998T1 (en) 2018-06-29
CA2804275A1 (en) 2012-01-12
EA202090067A3 (ru) 2020-07-31
EP2590998A1 (en) 2013-05-15
MX2013000166A (es) 2013-06-05
TWI609890B (zh) 2018-01-01
PL3064508T3 (pl) 2020-02-28
EA029503B1 (ru) 2018-04-30
JP2017217004A (ja) 2017-12-14
AU2020203565B2 (en) 2021-09-30
EA202090220A3 (ru) 2020-08-31
HUE11738351T2 (hu) 2019-03-28
NZ605404A (en) 2014-08-29
AU2015207811B2 (en) 2017-10-19
US20150056657A1 (en) 2015-02-26
CO6690745A2 (es) 2013-06-17
IL223929A (en) 2017-11-30
US9834591B2 (en) 2017-12-05
CN108060154A (zh) 2018-05-22
FI3064508T4 (fi) 2023-04-25
SG10201809632XA (en) 2018-12-28
SI2591094T1 (sl) 2018-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA035147B1 (ru) Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA043293B1 (ru) Способ получения рекомбинантного adamts13 в культуре клеток
EA041947B1 (ru) Способ получения рекомбинантного высокомолекулярного vwf в культуре клеток

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY