ES2664392T3 - Método de producción de vWF recombinante de alto peso molecular en cultivo celular - Google Patents

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Abstract

Método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rvWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre cobre 2,4 μg/l y 20 μg/l; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rvWF; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que el rvWF se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo en el que el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 30 mU/μg de rvWF.

Description

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DESCRIPCION
Método de producción de vWF recombinante de alto peso molecular en cultivo celular Antecedentes de la invención
La expresión recombinante de proteínas terapéuticas en cultivo celular (particularmente cultivos celulares a gran escala), incluyendo el cultivo celular eucariota, y más específicamente el cultivo celular de mamífero, requiere el uso de medios de cultivo especiales que proporcionen sustancias nutrientes para el crecimiento eficaz de las células. Las formulaciones de medios de cultivo celular a menudo se complementan con una variedad de aditivos, incluyendo suero bovino fetal (FCS), proteínas derivadas de animales y/o hidrolizados de proteínas de origen bovino así como hidrolizados de proteínas derivados de plantas o levaduras. Un reto con tales cultivos es que la cantidad de proteína y la actividad total y específica de la proteína producida a menudo son variables a través de diferentes cultivos celulares, incluso cuando no se cambia la formulación para los medios de cultivo celular. Esta variabilidad es especialmente evidente en el caso de los procedimientos de fabricación a gran escala que utilizan volúmenes de cultivo celular de 10 litros a más de 20 000 litros. Medios de cultivo celular que contienen hidrolizados son particularmente propensos a variabilidad de un cultivo celular al siguiente, lo que conduce a la producción disminuida de la proteína total, así como a una actividad total y específica disminuidas.
Un posible motivo para la variabilidad a través de diferentes cultivos celulares es que los contaminantes en aditivos tales como hidrolizados varían de un lote al siguiente. En general, el suero o las sustancias derivadas de suero, tales como, por ejemplo, albúmina, transferrina o insulina, pueden comprender agentes no deseados que pueden contaminar los cultivos celulares y los productos biológicos obtenidos de ellos. Además, los aditivos derivados de suero humano tienen que someterse a prueba para todos los virus conocidos, incluyendo virus de la hepatitis y VIH que pueden transmitirse a través del suero. Además, el suero bovino y productos derivados del mismo conllevan el riesgo de contaminación por BSE. Además, todos los productos derivados del suero pueden contaminarse por sustancias desconocidas. Cuando se usan aditivos de proteína o suero derivados de fuentes humanas o animales en cultivo celular, hay numerosos problemas (por ejemplo, la calidad variable en la composición de los diferentes lotes y el riesgo de contaminación con micoplasma, virus o BSE), particularmente si las células se usan en la fabricación de fármacos o vacunas para la administración humana. Por tanto, se han realizado muchos intentos para proporcionar condiciones de cultivo y sistemas huésped eficaces, que no requieren suero ni otros compuestos proteicos animales.
Tales medios libres de suero se han desarrollado basándose en extractos de proteínas derivados de plantas o levaduras. Por ejemplo, se sabe que los hidrolizados de soja son útiles para los procedimientos de fermentación y pueden potenciar el crecimiento de muchos organismos, levaduras y hongos de cultivo difícil. El documento WO 96/26266 describe que los digestos con papaína de harina de soja constituyen una fuente de hidratos de carbono y nitrógeno y muchos de los componentes pueden usarse en cultivo tisular. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688-692) describen efectos que promueven el crecimiento y la productividad de fracciones peptídicas de hidrolizado de trigo y soja definidas.
El documento WO 96/15231 divulga un medio libre de suero compuesto por un medio esencial mínimo sintético y un extracto de levadura para la propagación de células de vertebrados y un procedimiento de producción de virus. En el documento WO 98/15614 se divulga una formulación de medio compuesta por un medio de cultivo celular basal que comprende un péptido de arroz y un extracto de levadura y un digesto enzimático del mismo, y/o un lípido vegetal para el crecimiento de células animales. En el documento WO 01/23527 se divulga un medio que comprende hidrolizado de soja purificado para el cultivo de células recombinantes. El documento WO 00/03000 divulga un medio que comprende un hidrolizado de soja y un extracto de levadura, pero también requiere la presencia de formas recombinantes de proteínas animales, tales como factores de crecimiento.
El documento EP-A-0 481 791 describe un medio de cultivo definido bioquímicamente para cultivar células CHO obtenidas por ingeniería genética, que está libre de proteínas, lípidos e hidratos de carbono, aislado de una fuente animal, que comprende además una insulina recombinante o análogo de insulina, putrescina y peptona de soja digeridas por papaína a del 1 % al 0,025 % p/v. El documento WO 98/08934 describe un cultivo celular eucariota libre de suero que comprende péptidos de soja hidrolizados (1-1000 mg/l), putrescina de 0,01 a 1 mg/l y una variedad de componentes derivados de animales, incluyendo albúmina, fetuína, diversas hormonas y otras proteínas. En este contexto, debe indicarse que también se sabe que la putrescina está comprendida en medios convencionales como DMEM/F12 de Ham en una concentración de 0,08 mg/l.
Sin embargo, los hidrolizados de plantas y/o levaduras son mezclas indefinidas de oligopéptidos y otros componentes y contaminantes desconocidos. Además, la calidad de los lotes de hidrolizados disponibles comercialmente varía extremadamente. Como resultado, hay grandes variaciones en la producción de proteínas recombinantes o productos virales (una variación de hasta un factor de tres) en función de los lotes hidrolizados usados (“variación de un lote a otro”). Este inconveniente afecta a la proliferación de las células, así como a la expresión de proteínas de cada célula. El documento US 2007/0212770 describe diversos medios de cultivo definidos químicamente, libres de oligopéptidos y libres de proteínas animales que son útiles para la producción a
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gran escala de productos biofarmacéuticos proteicos recombinantes.
La hemostasia implica la interacción de diversas vías de reacción hemostáticas que conducen finalmente a la formación de un trombo. Los trombos son depósitos de hemoderivados sobre la superficie de la pared vascular que consisten principalmente en plaquetas sanguíneas agregadas y fibrina reticulada insoluble. La formación de fibrina es el resultado de la proteólisis restringida de fibrinógeno por trombina, una enzima de coagulación. La trombina es el producto final de la cascada de coagulación, una sucesión de activaciones de zimógeno que se producen sobre las superficies de plaquetas y leucocitos sanguíneos activados, y una variedad de células vasculares (para su estudio, véase K. G. Mann et al., Blood, 1990, Vol. 76, págs. 1-16).
Una función importante en la cascada de coagulación reside en la activación del factor X por el complejo de factor IX activado (factor IXa) y factor VIII activado (factor VIIIa). Una deficiencia o una disfunción de los componentes de este complejo está asociada con la enfermedad de la sangre conocida como hemofilia (J. E. Sadler & E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B, and von Willebrand's Disease, en G. Stamatoyannopoulos et al., (Eds.): The molecular basis of the blood diseases. W.B. Saunders Co., Filadelfia, 1987, págs. 576-602). La hemofilia A está relacionada con una deficiencia de la actividad del Factor VIII, mientras que la hemofilia B se refiere a una deficiencia del factor IX. El tratamiento actual consiste en una terapia de sustitución usando preparaciones farmacéuticas que comprenden el factor de coagulación normal. De estas trombopatías, la hemofilia A se produce con más frecuencia, afectando aproximadamente a uno de 10 000 hombres. La terapia de sustitución en pacientes con hemofilia A implica la administración repetida de preparaciones que contienen factor VIII normal mediante infusión intravenosa. El intervalo entre infusiones es una función de la degradación de la actividad del factor VIII en la circulación sanguínea. La semivida de la actividad del factor VIII tras una infusión difiere de un individuo a otro, oscilando entre 10 y 30 horas. Por tanto, una terapia profiláctica requiere una infusión cada de dos a tres días. Esto constituye una pesada carga en la vida de los pacientes hemofílicos, en particular, si el acceso venoso ha sido difícil debido a la cicatrización local tras pinchazos de aguja frecuentes para infusiones intravenosas.
Sería particularmente ventajoso si la frecuencia de las infusiones pudiera disminuirse usando factor VIII que tuviera semividas prolongadas. Se conoce bien en la técnica que la semivida del heterodímero de factor VIII no activado depende fuertemente de la presencia de factor de von Willebrand, que muestra una fuerte afinidad por el factor VIII (sin embargo no por el factor VIIIa) y sirve como proteína portadora (J. E. Sadler y E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebrand's disease, en G. Stamatoynnopoulos et al. (Eds.): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders Co., Filadelfia, 1987, págs. 576-602). Se sabe que los pacientes que padecen enfermedad de von Willebrand de tipo 3, que no tienen un factor de von Willebrand detectable en su circulación sanguínea, también padecen una deficiencia de factor VIII secundaria. Además, la semivida del factor VIII administrado por vía intravenosa en esos pacientes es de 2 a 4 horas, que considerablemente es más corto que de 10 a 30 horas observado en pacientes con hemofilia A. A partir de estos hallazgos resulta que el factor VIII tiende a un aclaramiento rápido de la circulación sanguínea y que este proceso se inhibe hasta cierto punto por la complejación con su portador natural, el factor de von Willebrand.
El factor de von Willebrand (vWF) es una glucoproteína que circula en plasma como una serie de multímeros que normalmente oscilan en tamaño entre aproximadamente 500 y 20 000 kD (o entre 2 y 40 dímeros de vWF). Los dímeros y formas multiméricas de vWF están compuestos por subunidades polipeptídicas de 250 kD unidas entre sí mediante puentes disulfuro. El vWF media la adhesión plaquetaria inicial al subendotelio de la pared del vaso dañado; presentando también sólo los multímeros más grandes actividad hemostática. El vWF multimerizado se une a la glucoproteína Gp1ba de la superficie de las plaquetas, a través de una interacción en el dominio A1 del vWF, con el fin de facilitar la adhesión plaquetaria. Se supone que las células endoteliales secretan formas poliméricas grandes de vWF y que estas formas de vWF que tienen un bajo peso molecular (vWF de bajo peso molecular) han surgido de la escisión proteolítica. Los multímeros que tienen grandes masas moleculares se almacenan en los cuerpos de Weibel-Palade de las células endoteliales y se liberan tras estimulación.
La reducción de la actividad de unión de FVIII, debido o bien a los niveles reducidos de proteína vWF o bien a la afinidad de unión disminuida de FVIII, da como resultado uno de tres tipos de enfermedad de von Willebrand. Además de, o alternativamente, determinados tipos de enfermedad de von Willebrand se caracterizan por un aumento o una disminución en el nivel de la asociación de plaquetas mediada por Gp1ba, concretamente en los tipos 2A, 2B y 2M (resumido en Castaman et al., Disorders of Hemostasis 88(1 ):94-108 (2003)). Como tal, la modulación de las interacciones del vWF tanto con FVIII como con Gp1ba es una estrategia viable para el tratamiento tanto de la hemofilia como de la enfermedad de von Willebrand.
Dada la importancia biológica del vWF, hay una necesidad constante en la técnica de mejorar los modos para producir vWF para aplicaciones terapéuticas. Se sabe bien que el vWF puede aislarse de fuentes endógenas, tales como plasma sanguíneo humano. El vWF aislado es ventajoso porque tiene una alta actividad específica para llevar a cabo su función biológica y, por tanto, puede usarse eficazmente como una proteína terapéutica para tratar enfermedades relacionadas, tal como la enfermedad de von Willebrand. Normalmente, el vWF plasmático tienen una actividad de ristocetina específica de aproximadamente 100 mU/pg, pero el aislamiento del plasma sanguíneo humano tiene desventajas porque, por ejemplo, el plasma puede contener una variedad de virus, tales como VIH y/o virus de hepatitis, que pueden transferirse al paciente. Además, el plasma es un recurso limitado y, por tanto, la
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escasez de plasma puede ser problemática a la hora de proporcionar suficiente vWF para el tratamiento. Como tal, los métodos recombinantes para producir vWF son ventajosos cuando se abordan algunos de los problemas asociados con basarse en plasma como fuente para el vWF. Para la producción recombinante, se clonó la longitud completa del ADNc de vWF; el propolipéptido corresponde a los residuos de aminoácido 23 a 764 del prepro-vWF de longitud completa (Eikenboom et al (1995) Haemophilia 1, 77 90).
Desgraciadamente, el vWF es una molécula con modificaciones postraducionales complejas. Además, la multimerización de los dímeros de vWF para dar multímeros grandes y ultra grandes en el aparato de Golgi supone un reto para la expresión en células de mamífero. Por ejemplo, el vWF de alto peso molecular expresado en cultivo celular de, por ejemplo, células endoteliales humanas (primarias) depende del almacenamiento específico de moléculas de vWF ultragrandes en cuerpos de Weibel-Palade. Tales cultivos celulares no son adecuados para la producción de proteínas terapéuticas. Se han notificado otros métodos de cultivo celular, y se sabe que las condiciones del cultivo celular pueden afectar a la producción del vWF de varios modos. Por ejemplo, se ha demostrado que altas concentraciones de amonio (NH4+) alteran las modificaciones postraducionales. Mayadas et al. (J. Biol. Chem., 264(23):13497-13503, 1989) demostraron que niveles de amonio 25 mM daban como resultado la multimerización de vWF reducida en células endoteliales, lo que también afecta negativamente a la actividad de ristocetina específica del vWF recombinante. La reducción de la multimerización generalmente está asociada con la reducción de la actividad, particularmente de la actividad de ristocetina específica, del vWF recombinante.
El documento WO 2009/086309 se refiere a procedimientos para cultivar células de mamífero, particularmente células de mamífero que secretan proteínas heterólogas y/o recombinantes y, más particularmente, a células de mamífero que secretan proteínas sanguíneas, tales como el factor de coagulación sanguínea VIII, ADAMTS-13, furina o el factor de coagulación VIII.
El documento WO 2008/109410 se refiere al uso de cobre y glutamato en cultivo celular para la producción de polipéptidos.
El documento EP 1096017 se refiere a un método para cultivar una célula animal que puede producir una sustancia fisiológicamente activa.
El documento US 4767704 se refiere a un medio de cultivo libre de proteínas útil para la producción a gran escala de rutina de anticuerpos monoclonales y otras sustancias producidas por células de importancia biológica y clínica.
Lao et al., 1997, se refiere a los efectos del amonio y el lactato sobre el crecimiento y el metabolismo de un cultivo de células de ovario de hámster chino recombinante.
Todavía sigue siendo difícil predecir qué parámetros pueden afectar positiva o negativamente a la producción de una proteína particular, especialmente glucoproteínas complejas como el factor VIII y vWF. Por ejemplo, se ha demostrado que determinados componentes de un medio de cultivo celular afectan a la producción de factor VIII. Tal como se divulga en la patente estadounidense n.° 5.804.420, la adición de poliol, cobre y otros metales traza puede afectar positivamente al rendimiento de producción de factor VIII. En el documento WO 2009/086309 también se describen procedimientos de cultivo celular usando cobre que se ha demostrado que mejoran la producción de factor VIII. Mignot et al. (1989) también han notificado la expresión de vWF en células CHO recombinantes. Sin embargo, ninguno de estos ejemplos proporciona información con respecto a la actividad específica de vWF o su distribución multimérica.
Las proteínas ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina de tipo I) son una familia de metaloproteinasas que contienen varios dominios conservados, incluyendo un dominio catalítico dependiente de cinc, un dominio rico en cisteína, un dominio similar a desintegrina y al menos una y en la mayoría de los casos múltiples repeticiones de trombospondina de tipo I (para una revisión, véase Nicholson et al., BMC Evol Biol. 4 de febrero de 2005;5(1):11). Estas proteínas, que están relacionadas evolutivamente con las familias ADAM y MMP de metaloproteinasas (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. Febrero de 2006;7(1):25-31), son enzimas secretadas que sean asociado con varias enfermedades y estados incluyendo la púrpura trombocitopética trombótica (TTP) (Moake JL, Semin Hematol. Enero de 2004;41(1):4-14), trastornos del tejido conjuntivo, cánceres, inflamación (Nicholson et al.) y malaria grave por Plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. Marzo de 2009;5(3):e1000349). Debido a estas asociaciones, las enzimas ADAMTS se han reconocido como posibles dianas terapéuticas para varias patologías (Jones GC, Curr Pharm Biotechnol. Febrero de 2006;7(1):25-31). Por consiguiente, se necesitan métodos de producción de grandes rendimientos de proteínas ADAMTS que tengan altas actividades específicas, que estén libres de contaminantes tales como virus, BSE y patógenos como bacterias Mycoplasma.
Un miembro de la familia ADAMTS, ADAMTS13, escinde el factor de von Willebrand (vWF) entre los residuos de Tyr 1605 y Met 1606, una función responsable de la degradación de grandes multímeros de vWF in vivo. La pérdida de actividad de ADAMTS 13 se ha asociado con varios estados, tales como TTP (Moake JL, Semin Hematol. Enero de 2004;41(1.):4-14), inflamación aguda y crónica (Chauhan et al., J Exp Med. Septiembre de 2008 1;205(9):2065-74), y más recientemente, malaria grave por Plasmodium falciparum (Larkin et al., PLoS Pathog. Marzo de
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2009;5(3):e1000349).
La proteasa ADAMTS 13 es una proteína glucosilada de 190 kDa producida predominantemente por el hígado (Levy et al., Nature. 2001; 413:488-494; Fujikawa et al., Blood. 2001; 98:1662-1666; Zheng et al., J Biol Chem. 2001; 276:41059-41063; Soejima et al., J Biochem (Tokyo). 2001; 130:475-480; y Gerritsen et al., Blood. 2001; 98:1654- 1661). De manera muy similar a los multímeros de rvWF de orden superior, la expresión recombinante de la gran ADAMTS13 en cultivo celular de mamífero presenta muchos retos.
Por tanto, existe la necesidad de proporcionar condiciones de cultivo celular, particularmente condiciones de cultivo de fabricación a gran escala, que proporcionen rendimiento de proteína total sistemático y/o actividad total y específica sistemática de las proteínas producidas entre diferentes cultivos celulares. La regularidad entre cultivos en procedimientos de fabricación a gran escala es importante en la fabricación de proteínas terapéuticas. También existe la necesidad de condiciones de cultivo celular para la producción a gran escala de rvWF con una distribución multimérica y actividad de ristocetina específica comparable o superior a la del vWF tal como está presente en el plasma humano normal. De manera similar, puesto que las proteínas ADAMTS se han implicado en varias enfermedades y estados, existe la necesidad en la técnica de métodos de producción a gran escala de proteínas ADAMTS recombinantes que tienen altas actividades específicas, que son adecuadas para la formulación y administración farmacéuticas. La presente invención satisface estas y otras necesidades en la técnica para la producción de factor de von Willebrand recombinante y ADAMTS 13 recombinante.
Breve sumario de invención
En determinados aspectos, la presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que la complementación de medios de cultivo celular usados para expresar factor de von Willebrand recombinante (rvWF) da como resultado la expresión de proteínas y la actividad enzimática significativamente mejoradas. La presente invención proporciona lo siguiente:
1. Un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rvWF), comprendiendo el método las etapas de:
(a) proporcionar medios de cultivo celular basales;
(b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre cobre 2,4 pg/l y 20 pg/l;
(c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rvWF;
(d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que el rvWF se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo en el que el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM; y
(e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 30 mU/pg de rvWF.
2. El método de 1, que comprende además la etapa de complementar los medios de cultivo celular basales con un hidrolizado antes de cultivar la una o más células.
3. El método de 2, en el que el hidrolizado es un hidrolizado de plantas o un hidrolizado de soja.
4. El método según uno cualquiera de 1 a 3, en el que los medios de cultivo celular basales son medios de cultivo libres de proteínas animales, medios de cultivo libres de proteínas o medios de cultivo definidos químicamente.
5. El método según uno cualquiera de 1 a 4, en el que la concentración de cobre final de los medios de cultivo celular basales complementados con cobre es de al menos 4 pg/l de cobre.
6. El método según uno cualquiera de 1 a 5, en el que la una o más células son células de mamífero, preferiblemente células CHO.
7. El método según uno cualquiera de 1 a 6, en el que cultivar la una o más células comprende el cultivo discontinuo de las células o comprende el cultivo continuo de las células.
8. El método de 7, en el que el cultivo continuo de células se realiza en modo quimiostático o en modo de perfusión.
9. El método según uno cualquiera de 1 a 8, en el que la una o más células se cultivan en al menos 100 l de los medios de cultivo celular basales complementados.
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10. El método según uno cualquiera de 1 a 9, en el que la densidad celular se mantiene a menos de 2,5 x 106 células por ml durante la etapa de cultivar la una o más células, menos de 2,0 * 106 células por ml durante la etapa de cultivar la una o más células, o menos de 1,5 * 106 células por ml durante la etapa de cultivar la una o más células.
11. El método según uno cualquiera de 1 a 10, en el que la etapa de recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo comprende filtración o centrifugación para retirar células de la parte del sobrenadante de cultivo.
12. El método según uno cualquiera de 1 a 11, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 40 mü/pg de rvWF.
13. El método de 12, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mü/pg de rvWF, al menos 60 mü/pg de rvWF, al menos 70 mü/pg de rvWF, o al menos 80 mü/pg de rvWF.
14. El método según uno cualquiera de 1 a 13, en el que al menos el 10 %, el 20 % o el 30 % del rvWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.
15. El método según uno cualquiera de 1 a 14, en el que el sobrenadante contiene multímeros de vWF de alto peso molecular de 14 a 22 dímeros.
16. El método según uno cualquiera de 1 a 15, en el que rvWF se coexpresa con factor VIII recombinante (rFVIII).
17. El método según uno cualquiera de 1 a 16, en el que el método comprende además una etapa de enriquecimiento de rvWF.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. (1A) Electroforesis en gel de agarosa (al 1 %) de baja resolución de rvWF expresado en cultivo celular de mamífero en presencia de concentración de cobre baja (1,0 pg/l) y alta (4,3 pg/l), tal como se describe en el ejemplo 2. Obsérvese que el día 3 de cultivo es equivalente al día 1 de lote de la tabla 7 y la tabla 8. (1B) Las cantidades relativas de multímeros de vWF que tienen de 1 a 10 dímeros (número de banda 1) y más de 10 dímeros (número de banda 2), tal como se indica por las bandas definidas en la figura 1A, se cuantificaron mediante análisis densitométrico.
Figura 2. (2A) Diagrama de intervalos de la actividad específica de rvWF promedio presente en sobrenadantes de cultivo celular de rvWF crecido a densidades celulares altas y bajas en presencia de niveles altos o bajos de cobre. (2B) Diagrama de intervalos de la concentración de NH4+ promedio encontrada en sobrenadantes de cultivo celular de rvWF crecido a densidades celulares altas y bajas en presencia de niveles altos o bajos de cobre.
Figura 3. (Referencia) Se investigaron sobrenadantes de cultivos celulares que expresan ADAMTS13 recombinante en presencia de niveles crecientes de cobre mediante análisis de SDS-PAGE. Se visualizó rA13 tras SDS-PAGE mediante (3A) tinción con plata y (3B) inmunotransferencia anti-A13.
Figura 4. (Referencia) Diagrama de datos de la productividad volumétrica (P Frets) frente a concentración de cobre que muestra una extrapolación (línea continua) del efecto de la concentración de cobre óptima sobre la productividad de rA13.
Figura 5A-K. (Referencia) Gráficos de barras de cultivos celulares de suspensión continua (quimiostato) que expresan rA13 a lo largo de un tiempo de cultivo de 8 semanas que compara los efectos de los niveles basales de cobre (0,66 pg/l) con los de cultivos complementados hasta una concentración final de 2 pg/l de cobre. Cada barra representa los datos medios de una semana de cultivo quimiostático. La leyenda se refiere a la semana particular presentada en los datos.
Figura 6. (6A) Electroforesis en gel de agarosa (al 1 %) de baja resolución de rvWF expresado en cultivo celular de mamífero en presencia de concentración de cobre baja (1,0 pg/l) y alta (4,3 pg/l) a densidades celulares altas y bajas tal como se describe en el ejemplo 3. Obsérvese que los días 8 y 17 de cultivo (“CST8” y “CST17”) son equivalentes al día 8 y el día 17 de la tabla 10 a la tabla 13. (6B) Las cantidades relativas de multímeros de vWF que tienen de 1 a 10 dímeros y más de 10 dímeros, tal como se indica por las bandas definidas en la figura 6A, se cuantificaron mediante análisis densitométrico.
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Descripción detallada de invención
I. Introducción
vWF recombinante (rvWF) y ADAMTS13 recombinante (rA13) pueden producirse mediante la expresión de cultivos celulares de mamífero a gran escala. Sin embargo, la actividad de estas proteínas cuando se producen usando condiciones de cultivo celular convencionales a menudo varía de unos cultivos celulares a otros, incluso cuando no se cambian las formulaciones generales de los medios, y a menudo las actividades específicas de las proteínas recombinantes no son iguales a las de vWF y rA13 derivadas de plasma sanguíneo. Además, rvWF expresado en cultivos celulares de mamífero tiende a producir composiciones de proteína con bajos porcentajes (inferiores al 10 %) de multímeros de orden superior (los multímeros de orden superior incluyen moléculas que contienen más de 10 dímeros de vWF). Estos inconvenientes en los métodos de producción convencionales de rvWF y rA13 son particularmente problemáticos cuando se desarrollan cultivos para la producción a gran escala (es decir, cultivos de desde 10 hasta más de 20 000 litros).
Una posible fuente de variabilidad observada a menudo en diferentes lotes de cultivo celular es la presencia de contaminantes de los medios de cultivo celular. Estos contaminantes pueden estar presentes en diferentes cantidades en diferentes lotes, lo que conduce a resultados variables en la producción de rvWF y rA13. Tras investigar los diferentes contaminantes encontrados en diversos aditivos de medios de cultivo celular, los presentes inventores encontraron que la presencia de hidrolizados conduce a variación en las concentraciones de cobre en los medios celulares. Una investigación adicional proporcionó el resultado sorprendente de que la complementación con concentraciones de cobre de los medios celulares hasta producir una concentración de cobre total de al menos aproximadamente 1 pg/l a aproximadamente 20 pg/l aumentaba de manera sistemática la actividad total y específica de rvWF y rA13 y/o también podría conducir a un rendimiento de proteína total aumentado. Por tanto, la presente invención proporciona métodos y composiciones para la producción de alto rendimiento de proteínas rvWF con alta actividad específica.
En un aspecto, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular para producir grandes cantidades de rvWF con actividad que es comparable a o mayor que la observada con vWF derivado de plasma (pdvWF). En aspectos adicionales, las proteínas rvWF producidas según la presente invención muestran sistemáticamente mayor actividad que proteínas producidas usando métodos de cultivo celular convencionales en medios que no se han complementado con cobre u otros complementos descritos en mayor detalle en el presente documento. Ventajosamente, en determinadas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, las proteínas rvWF producidas según la presente invención muestran sistemáticamente actividad específica mayor (es decir, U/mg de proteína) que proteínas producidas usando métodos de cultivo celular convencionales en medios que no se han complementado con cobre u otros complementos descritos en mayor detalle en el presente documento. Asimismo, los métodos proporcionados en el presente documento para la producción de rvWF proporcionan rendimientos de actividad mayores por volumen de cultivo (es decir, U/L/D), en comparación con métodos de cultivo celular convencionales utilizando medios que no se han complementado con cobre u otros complementos descritos en mayor detalle en el presente documento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los que un medio de cultivo celular basal se complementa con cobre para dar como resultado una concentración total de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo celular se complementa para dar como resultado aproximadamente cobre 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 1,2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 pg/l, o más. Los medios de cultivo celular basales generalmente tienen una concentración de cobre traza por debajo de 1 pg/l.
En realizaciones adicionales, el medio de cultivo celular basal se complementa con desde aproximadamente cobre 2,5-8, 3,0-6, 4,0-5,0 pg/l para la producción de rvWF. Todavía en realizaciones adicionales, el medio de cultivo celular basal puede, además de complementarse con cobre, incluir también uno o más hidrolizados.
En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos de cultivo celular en los que un medio de cultivo celular basal se complementa con cobre desde aproximadamente 1,5 hasta aproximadamente 4 pg/l para la producción de rA13. En realizaciones adicionales, el medio de cultivo celular basal se complementa con cobre desde aproximadamente 1,6-3,8, 1,7-3,6, 1,8-3,4, 1,9-3,2, 2,0-3,0, 2,1-2,8, 2,2-2,6, 2,3-2,4 pg/l para la producción de rA13. Todavía en realizaciones adicionales, el medio de cultivo celular basal puede, además de complementarse con cobre, incluir también uno o más hidrolizados. Aún en realizaciones adicionales, el medio de cultivo celular basal incluye, además de cobre y/o uno o más hidrolizados, cinc de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 30 pM. Todavía en realizaciones adicionales, el medio de cultivo celular basal incluye adicionalmente, además de cobre y/o uno o más hidrolizados y/o cinc, calcio entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5,0 mM.
Todavía en un aspecto adicional y según cualquiera de lo anterior, la presente invención proporciona métodos de cultivo celular en los que los niveles de amonio de la disolución de cultivo celular son bajos (por debajo de 4 mM). En determinadas realizaciones, los métodos de cultivo celular de la presente invención utilizan medios de cultivo celular
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que tienen más de cobre 3, 4, o 5 pg/l en combinación con bajos niveles de amonio.
Una de las ventajas de los métodos y las composiciones de la presente invención es que son susceptibles a la producción del cultivo celular a gran escala. Estos cultivos celulares a gran escala son cultivos de al menos 10 l, 50 l, 100 l, 150 l, 200 l, 250 l, 500 l, 750 l, 1000 l, 1500 l, 2000 l, 5000 l, 10 000 l o 20 000 litros.
En determinados aspectos, los métodos de la invención no dan como resultado necesariamente una cantidad mayor de proteína recombinante global, pero la proteína recombinante (cualquier rvWF) que se produce muestra mayor actividad total y específica que la observada en proteínas producidas usando cultivos celulares convencionales, particularmente en comparación con proteínas producidas en cultivos celulares en los que el medio de cultivo celular no se ha complementado con cobre adicional. En aspectos adicionales, las proteínas rvWF producidas en células cultivadas en medios complementados con cobre muestran sistemáticamente actividad aumentada por litro de cultivo celular en comparación con células cultivadas en medios de cultivo celular basales que no se han complementado con cobre. Todavía en aspectos adicionales, los medios complementados con cobre de la presente invención dan como resultado un rendimiento de proteína aumentado, un número de células aumentado en el cultivo, y/o una actividad total aumentada por litro de cultivo en comparación con medios que no se han complementado con cobre.
Ventajas todavía adicionales de los métodos de la invención son que dan como resultado una población de proteínas que contiene un alto porcentaje (más del 10 %) de rvWF altamente multimerizado.
Aunque gran parte de la descripción en el presente documento que se refiere a proteínas ADAMTS es en lo que se refiere a ADAMTS 13 (A13), se apreciará que puesto que todas las proteínas aDaMTS comparten una arquitectura de dominio central común y relaciones de estructura-función comunes, los métodos y las composiciones descritos en la presente divulgación son aplicables para la producción de cualquier proteína ADAMTS, no sólo rA13.
II. Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, “vWF recombinante” incluye vWF obtenido a través de tecnología de ADN recombinante. En determinadas realizaciones, las proteínas vWF de la invención pueden comprender un constructo, por ejemplo, preparado como en el documento WO 1986/06096 publicado el 23 de octubre de 1986 y la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 07/559.509, presentada el 23 de julio de 1990, en nombre de Ginsburg et al. El vWF en la presente invención puede incluir todas las posibles formas, incluyendo las formas monoméricas y multiméricas. También debe entenderse que la presente invención engloba diferente formas de vWF que van a usarse en combinación. Por ejemplo, el vWF de la presente invención puede incluir diferentes multímeros, diferentes derivados y tanto derivados biológicamente activos como derivados no biológicamente activos.
El término “recombinante” cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, se ha modificado mediante la introducción de una proteína o ácido nucleico heterólogo o mediante la alteración de una proteína o ácido nucleico nativo, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan de manera anómala, se expresan en menor cantidad o no se expresan en absoluto.
En el contexto de la presente invención, el vWF recombinante abarca cualquier miembro de la familia de vWF de, por ejemplo, un mamífero tal como un primate, humano, mono, conejo, cerdo, roedor, ratón, rata, hámster, jerbo, animal canino, animal felino y derivados biológicamente activos del mismo. En una realización preferida, el vWF recombinante es vWF humano. También se abarcan proteínas vWF mutantes y variantes que tienen actividad, como son fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas vWF. Además, el vWF de la invención puede comprender además etiquetas que facilitan la purificación, la detección, o ambas. El vWF descrito en el presente documento puede modificarse adicionalmente con un resto terapéutico o un resto del que se obtienen imágenes de manera adecuada in vitro o in vivo.
Los términos “vWF altamente multimérico”, “vWF de alto peso molecular” y “vWF HMW” pueden usarse de manera intercambiable y se refieren a multímeros de vWF unidos covalentemente que contienen más de 10 dímeros de vWF. En determinadas realizaciones, vWF HMW contiene al menos 11 dímeros de vWF, o al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o más dímeros de vWF.
Tal como se usa en el presente documento en la presente divulgación, una “proteína ADAMTS” se refiere a un polipéptido de la familia de metaloproteinasas de desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina de tipo I. Los miembros de esta familia incluyen las proteínas ADaMTS 1 humanas (NM_006988), ADAMTS2 (NM_014244; NM_021599), ADAMTS3 (NM_014243), ADAMTS4 (NM_005099), ADAMTS5 (NM_007038), ADAMTS6 (NM_014273), ADAMTS7 (NM_0142727), ADAMTS8 (NM_007037), ADAMTS9 (NM_182920; NM_182921; NM_020249), ADAMTS10 (NM_030957), ADAMTS 12 (NM_030955), ADAMTS 13 (NM_139025; NM_139026; NM_139027; NM_139028), ADAMTS14 (NM_139155; NM_080722), ADAMTS15 (NM_139055), ADAMTS 16 (NM_139056), ADAMTS 17 (NM_139057), ADAMTS18 (NM_199355; NM_139054), ADAMTS19
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(NM_133638), y ADAMTS20 (NM_025003, NM_175851). Las proteínas ADAMTS incluyen tanto proteínas de longitud completa como polipéptidos parciales que muestran al menos actividad biológica parcial, por ejemplo, al menos el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, o más de la actividad demostrada por la proteína de longitud completa, en particular la actividad proteasa demostrada por la proteína de longitud completa. En determinados casos, una proteína ADAMTS se modificará postraducionalmente o bien in vivo o bien in vitro, por ejemplo, mediante medios enzimáticos o químicos. Se entiende que las proteínas ADAMTS de la presente invención incluyen alternativamente isoformas sometidas a corte y empalme, proteínas modificadas de manera conservativa, proteínas sustancialmente idénticas, homólogos y similares.
En el contexto de la presente divulgación, una proteína ADAMTS abarca cualquier miembro de la familia ADAMTS de, por ejemplo, un mamífero tal como un primate, humano, mono, conejo, cerdo, roedor, ratón, rata, hámster, jerbo, animal canino, animal felino, y derivados biológicamente activos del mismo. También se abarcan proteínas ADAMTS mutantes y variantes que tienen actividad, como son fragmentos funcionales y proteínas de fusión de las proteínas ADAMTS. Además, las proteínas ADAMTS de la invención pueden comprender además etiquetas que facilitan la purificación, la detección, o ambas. Las proteínas ADAMTS descritas en el presente documento pueden modificarse adicionalmente con un resto terapéutico o un resto del que se obtienen imágenes de manera adecuada in vitro o in vivo.
Tal como se usa en el presente documento en la presente divulgación, una “Proteína ADAMTS13” se refiere a cualquier proteína o polipéptido con actividad de ADAMTS 13, particularmente la capacidad para escindir el enlace peptídico entre los residuos Tyr-842 y Met-843 de vWF. En una realización a modo de ejemplo, una proteína ADAMTS13 se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es altamente similar a la de NP_620594 (isoforma 1 de AdAmTs13, preproproteína) o los aminoácidos del 75 al 1.427 de NP_620594 (isoforma 1 de ADAMTS13, polipéptido maduro). En otra realización, una proteína ADAMTS13 se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es altamente similar a la de NP_620596 (isoforma 2 de aDaMTS13, preproproteína) o los aminoácidos del 75 al 1371 de NP_620594 (isoforma 2 de ADAMTS13, polipéptido maduro). Aún en otra realización, las proteínas ADAMTS13 incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos altamente similar a la de NP_620595 (isoforma 3 de ADAMTS 13, preproproteína) o los aminoácidos del 75 al 1340 de NP_620595 (isoforma 1 de ADAMTS 13, polipéptido maduro). Tal como se usa en el presente documento, una proteína ADAMTS13 incluye variantes naturales con actividad de escisión de vWF y constructos artificiales con actividad de escisión de vWF. Tal como se usa en la presente invención, ADAMTS13 engloba cualquier variante natural, secuencia alternativa, isoforma o proteína mutante que conserva algo de actividad basal. Los ejemplos de mutaciones de ADAMTS13 encontradas en la población humana incluyen, sin limitación, R7W, V88M, H96D, R102C, R193W, T196I, H234Q, A250V, R268P, W390C, R398H, Q448E, Q456H, P457L, C508Y, R528G, P618A, R625H, I673F, R692C, A732V, S903L, C908Y, C951G, G982R, C1024G, A1033T, R1095W, R1123C, C1213Y, T1226I, G1239V, R1336W, muchas de las cuales se han encontrado asociadas con la púrpura trombocitopénica trombótica (TTP). Las proteínas ADAMTS13 también incluyen polipéptidos que contienen modificaciones postraducionales. Por ejemplo, se ha demostrado que ADAMTS13 se modifica mediante N- acetilglucosamina (GlcNAc) en los residuos 614, 667 y 1354, y se ha predicho que los residuos 142, 146, 552, 579, 707, 828 y 1235 también pueden modificarse de este modo.
Puede prepararse ADAMTS13 recombinante proteolíticamente activa mediante la expresión en cultivos celulares de mamífero, tal como se describe en Plaimauer et al., (2002, Blood. 15;100(10):3626-32) y el documento US 2005/0266528. Se divulgan métodos para la expresión de ADAMTS13 recombinante en cultivo celular en Plaimauer B, Scheiflinger F. (Semin Hematol. Enero de 2004;41(1):24-33 y el documento US 2011/0086413.
Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado biológicamente activo”, cuando se usa en el contexto de una proteína ADAMTS para la presente divulgación, también abarca polipéptidos obtenidos a través de tecnología de ADN recombinante. Esta puede incluir cualquier método conocido en la técnica para (i) producir ADN recombinante mediante ingeniería genética, por ejemplo, a través de la transcripción inversa de ARN y/o amplificación de ADN, (ii) introducir ADN recombinante en células procariotas o eucariotas mediante transfección, es decir, a través de electroporación o microinyección, (iii) cultivar dichas células transformadas , por ejemplo, de manera continua o discontinua, (iv) expresar una proteína ADAMTS, por ejemplo, de manera constitutiva o con inducción, y (v) aislar dicha proteína ADAMTS, por ejemplo, del medio de cultivo o recoger las células transformadas, con el fin de (vi) obtener proteína ADAMTS recombinante purificada sustancialmente, por ejemplo, a través de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, y similares. El término “derivado biológicamente activo” incluye también moléculas quiméricas tales como por ejemplo una proteína ADAMTS, o fragmento funcional de la misma, en combinación con un segundo polipéptido, por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina o un dominio de albúmina, con el fin de mejorar las propiedades biológicas/farmacológicas tales como por ejemplo, la semivida de la proteína ADAMTS en el sistema circulatorio de un mamífero, particularmente un humano.
Los términos “aislado”, “purificado” o “biológicamente puro” se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad normalmente se determinan usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alto rendimiento. En una realización, rvWF es la especie predominante
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presente en una preparación que está purificada sustancialmente. En otra realización, rA13 es la especie predominante presente en una preparación que está purificada sustancialmente. El término “purificado” en algunas realizaciones indica que un ácido nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. En otras realizaciones, significa que la proteína o el ácido nucleico es puro en al menos el 50 %, más preferiblemente puro en al menos el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, e 97 %, el 98 %, el 99 % o más. “Purificar” o “purificación” en otras realizaciones significa retirar al menos un contaminante de la composición que va a purificarse. En este sentido, purificación no requiere que el compuesto purificado sea homogéneo, ejemplo, puro al 100 %.
La actividad biológica de vWF puede medirse mediante ensayos in vitro conocidos. Por ejemplo, en ensayo de cofactor de ristocetina se basa en la aglutinación de plaquetas frescas o fijadas en formalina inducidas por el antibiótico ristocetina en presencia de vWF. El grado de aglutinación de plaquetas depende de la concentración de vWF y puede medirse mediante el método turbidimétrico, por ejemplo mediante el uso de un agregómetro (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). Tal como se proporciona en el presente documento, la actividad específica del cofactor de ristocetina del vWF de la presente invención se describe en lo que se refiere a mU/pg de vWF, tal como se mide usando ensayos in vitro.
Tal como se usa en el presente documento en la presente divulgación, “una unidad de actividad de ADAMTS” se define como la cantidad de actividad en 1 ml de plasma humano normal combinado, independientemente del ensayo que esté usándose. Por ejemplo, cuando la proteína ADAMTS es ADAMTS13, una unidad de actividad mediante FRETS-vWF73 de ADAMTS13 es la cantidad de actividad necesaria para escindir la misma cantidad del sustrato FRETS-vWF73 (Kokame et al., Br J Haematol. Abril de 2005; 129(1):93-100) cuando se escinde por un ml de plasma humano normal combinado. De manera conveniente, la actividad de ADAMTS13 puede determinarse mediante ensayos funcionales, tales como ensayos funcionales que emplean péptidos de factor de von Willebrand modificados como sustrato para ADAMTS13 (Tripodi et al. J Thromb Haemost. Septiembre de 2008;6(9): 1534-41). Un método preferido de determinación de la actividad de ADAMTS 13 humana recombinante se divulga en Gerritsen et al. (Assay of von Willebrand factor (vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Thromb Haemost 1999; 82: 1386-1389). En una realización, para considerarse como una proteína ADAMTS13 tal como se definió anteriormente, un polipéptido o proteína debe tener al menos un 1 % de la actividad de escisión de vWF de ADAMTS13 nativa. En otras realizaciones, una proteína ADAMTS13 contendrá al menos el 10 % de la actividad de ADAMTS13 nativa. Aún en otras realizaciones, una proteína ADAMTS13 contendrá al menos el 5 %, el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 % de la actividad de ADAMTS13 nativa. La cantidad de una proteína ADAMTS13 también puede determinarse mediante la medición de un antígeno de ADAMTS13, por ejemplo usando el método ELISA divulgado en Rieger et al., (2006, Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20). Un convenio bien establecido en la técnica es que 1 ml de plasma humano normal combinado contiene 1 pg de ADAMTS13. Por tanto, el convenio en la técnica es que 1 pg de ADAMTS 13 derivado de plasma tiene una unidad de actividad de ADAMTS13.
Los términos “disolución de cultivo celular”, “medio o medios de cultivo celular” y “sobrenadante de cultivo celular” se refieren a aspectos de procedimientos de cultivo celular generalmente bien conocidos en la técnica. En el contexto de la presente invención, una disolución de cultivo celular puede incluir medios de cultivo celular y sobrenadante de cultivo celular. Los medios de cultivo celular se añaden externamente a la disolución de cultivo celular, opcionalmente junto con complementos, para proporcionar nutrientes y otros componentes para cultivar células que expresan rvWF o rA13. El sobrenadante de cultivo celular se refiere a una disolución de cultivo celular que comprende los nutrientes y otros componentes del medio de cultivo celular así como productos liberados, metabolizados y/o excretados de las células durante el cultivo, pero a no las propias células. Por tanto, en un contexto, un sobrenadante de cultivo celular puede referirse a la fase líquida de una disolución de cultivo celular (es decir, la disolución de cultivo celular excluyendo las células). Por ejemplo, la concentración de amonio de un sobrenadante de cultivo generalmente se refiere a la concentración de amonio presente en la disolución de cultivo celular. En otros contextos, un sobrenadante de cultivo celular se refiere a una disolución de cultivo celular de la que se han retirado las células (es decir, un sobrenadante de cultivo celular recuperado).
Tal como se usa en el presente documento, los términos “vitamina B3”, “nicotinamida”, “niacinamida”, “niacina” y “ácido nicotínico” pueden usarse de manera intercambiable para referirse a cualquier miembro de la familia B3 de vitaminas. Por consiguiente, cualquier miembro de esta familia puede usarse para complementar el medio usado en los métodos de la presente invención.
Tal como se usa en el presente documento, el término “medio definido químicamente” o “medios definidos químicamente” se refiere a un medio de crecimiento sintético en el que se conocen la identidad y la concentración de todos los componentes. Los medios definidos químicamente no contienen extractos bacterianos, de levadura, animales o vegetales, aunque pueden incluir o no componentes derivados de plantas o animales individuales (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, etc.). Los ejemplos no limitativos de medios definidos químicamente disponibles comercialmente incluyen, diversos medios de Eagle modificados por Dulbecco (DME) (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), mezcla de nutrientes de Ham (Sigma-Aldrich Co; SAFC Biosciences, Inc), combinaciones de los mismos, y similares. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medios de cultivo definidos
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químicamente, por ejemplo en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad para todos los fines.
Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo libre de oligopéptidos” o “medios de cultivo libres de oligopéptidos” se refiere a un medio libre de proteínas que no comprende oligopéptidos, tales como, por ejemplo, oligopéptidos derivados de un hidrolizado de proteínas. En una realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen veinte o más aminoácidos. En una realización de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen quince o más aminoácidos. En otra realización de la invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen diez o más aminoácidos. En una realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen siete o más aminoácidos. En otra realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen cinco o más aminoácidos. Todavía en otra realización, el medio no comprende oligopéptidos que tienen tres o más aminoácidos. Según una realización adicional de la presente invención, el medio no comprende oligopéptidos que tienen dos o más aminoácidos. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo libre de oligopéptidos, por ejemplo en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO2007/077217, y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad para todos los fines.
Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo libre de suero” o “medios de cultivo libres de suero” se refiere a un medio de cultivo que no está complementado con un suero animal. Aunque en ocasiones los medios libre de suero son medios definidos químicamente, los medios libres de suero pueden complementarse con proteínas diferenciadas de plantas o animales o fracciones de proteínas. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo libre de suero, por ejemplo en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad para todos los fines.
Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo libre de proteínas animales” o “medios de cultivo libres de proteínas animales” se refiere a un medio de cultivo que no está complementado con un suero, proteína o fracción de proteína animal. Aunque en ocasiones los medios de cultivo libres de proteínas animales son medios definidos químicamente, los medios de cultivo libres de proteínas animales pueden contener hidrolizados de pantas o levaduras. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medio de cultivo libre de proteínas animales, por ejemplo en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217 y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad para todos los fines.
Tal como se usa en el presente documento, el término “medio de cultivo celular basal” o “medios de cultivo celular basales” se refiere a un medio de cultivo definido químicamente, un medio de cultivo libre de oligopéptidos, un medio de cultivo libre de suero, o un medio de cultivo libre de proteínas animales que no se ha complementado con un hidrolizado, por ejemplo, un hidrolizado de plantas o levaduras. Se conocen bien en la técnica medios basales, por ejemplo, DMEM, F12 de Ham, DMEM/F12 de Ham, medio 199, McCoy o RPMI. El medio basal puede incluir varios componentes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, y fuentes de hidratos de carbono. Cada componente puede estar presente en una cantidad que soporta el cultivo de una célula, conociéndose tales cantidades generalmente por un experto en la técnica. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias tampón, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizantes para contrarrestar tensiones mecánicas, o inhibidores de proteasa. Si es necesario, puede añadirse un tensioactivo no iónico tal como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles o polipropilenglicoles.
III. Medios de cultivo celular y sobrenadante de cultivo celular
Un aspecto de la presente invención se refiere a medios de cultivo celular para producir rvWF y/o rA13 que tienen actividad aumentada en comparación con rvWF y rA13 producidos con medios de cultivo celular basales. En un aspecto, la presente invención se refiere a medios de cultivo celular para producir rvWF y/o rA13 en los que los medios de cultivo celular basales se complementan con una o más sustancias adicionales. En realizaciones específicas y tal como se comenta en mayor detalle a continuación, las condiciones de cultivo celular de la presente invención incluyen medios de cultivo celular basales complementados para tener al menos cobre 1,0 pg/l. En realizaciones adicionales, los medios de cultivo celular que se usan y sobrenadantes derivados de los procedimientos en la presente invención también comprenden bajos niveles (por debajo de 10 mM) de amonio. En una realización particular, las condiciones de cultivo celular usadas para expresar rvWF y/o rA13 se controlan de manera que el sobrenadante de cultivo celular mantiene un bajo nivel de amonio, es decir, menos de 10 mM y preferiblemente menos de 5 mM.
Los medios de cultivo de la presente invención pueden basarse en un medio basal adecuado bien conocido en la
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técnica, por ejemplo, DMEM, F12 de Ham, DMEM/F12 de Ham, medio 199, McCoy o RPMI. El medio basal puede incluir varios componentes, incluyendo aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, y fuentes de hidratos de carbono. Cada componente puede estar presente en una cantidad que soporta el cultivo de una célula, conociéndose generalmente tales cantidades por un experto en la técnica. El medio puede incluir sustancias auxiliares, tales como sustancias tampón, por ejemplo, bicarbonato de sodio, antioxidantes, estabilizantes para contrarrestar tensiones mecánicas, o inhibidores de proteasa. Si es necesario, puede añadirse un tensioactivo no iónico tal como copolímeros y/o mezclas de polietilenglicoles o polipropilenglicoles.
Generalmente, los medios basales contienen menos de 1 pg/l de cobre (por ejemplo, DMEM/F12 de Ham tiene una concentración de cobre de aproximadamente 0,3 pg/l). Tales concentraciones de cobre no proporcionan suficientes iones de cobre como para soportar la producción de las proteínas rvWF y rA13 de la presente invención, que muestran alta actividad específica.
El cobre puede proporcionarse a los medios de cultivo celular de la presente invención a través de una variedad de formas, tales como a través de la adición de un complemento de medio. En algunas realizaciones, el complemento de medio puede contener hidrolizado, que puede proporcionarse para aumentar la concentración de cobre en los medios. Los hidrolizados pueden incluir cualquier hidrolizado bien conocido en la técnica, tales como hidrolizados de plantas, hidrolizados de soja e hidrolizado de gluten de trigo. En determinadas realizaciones, la adición de hidrolizado puede contribuir a una concentración de cobre aumentada de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 10 pg/l de Cu2+. En algunas realizaciones, la cantidad de cobre proporcionada por el hidrolizado puede depender de la cantidad de cobre en el hidrolizado así como de la cantidad de hidrolizado añadida. El contenido en cobre de un hidrolizado puede determinarse mediante análisis elemental, por ejemplo, espectroscopía de adsorción atómica (GFAA: adsorción atómica con horno de grafito), o métodos de espectroscopía de masas (por ejemplo, ICP-EM).
En determinadas realizaciones, el cobre puede proporcionarse a los medios de cultivo solo o además del hidrolizado proporcionando un complemento de medio que incluye una sal de cobre o quelato de cobre adecuado. Las sales de cobre adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre. Los quelantes de cobre adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, albúmina, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), agentes quelantes de poliamina, etilendiamina, dietilentriamina, trietilentetramina, trietilendiamina, tetraetilenpentamina, aminoetiletanolamina, aminoetilpiperazina, pentaetilenhexamina, clorhidrato de trietilentetramina, clorhidrato de tetraetilenpentamina, clorhidrato de pentaetilenhexamina, tetraetilpentamina, captopril, penicilamina, N,N'-bis(3-aminopropil)-1,3- propanodiamina, N,N-bis(2-animoetil)-1,3-propanodiamina, 1,7-dioxa-4,10-diazaciclododecano, 1,4,8,11-tetraaza- ciclotetradecano-5,7-diona, triclorhidrato de 1,4,7-triazaciclononano, 1-oxa-4,7,10-triazaciclododecano, 1,4,8,12- tetraaza-ciclopentadecano, y 1,4,7,10-tetraaza-ciclododecano.
En determinadas realizaciones, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para dar como resultado una concentración total de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En realizaciones adicionales, los medios de cultivo celular basales usados en métodos de la presente invención se complementan para dar como resultado aproximadamente cobre 2,4-6,5, 2,6-6,0, 2,8-5,5,3,0-5,0, 3,2-4,5, 3,4-4, y 2-4 pg/l. Aún en otras realizaciones, los medios de cultivo celular basales usados en métodos de la presente invención se complementan para dar como resultado aproximadamente cobre 3-4 pg/l. Aún en otra realización, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para dar como resultado una concentración total de cobre de al menos 4 pg/l. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para dar como resultado una concentración total de cobre de al menos cobre 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 pg/l, o más.
Las concentraciones indicadas anteriormente son las concentraciones respectivas de cobre puro, en forma cúprica (Cu2+). Si se usa un derivado de cobre, por ejemplo, una sal hidratada, o un compuesto que comprende cobre, por ejemplo, un quelante de cobre, la cantidad de derivado o quelante se añade de manera que la concentración final del cobre está en los intervalos descritos en el presente documento. Por ejemplo, 2 pg/l de CuSÜ4-5H2O es equivalente a una concentración de cobre de aproximadamente 0,51 pg/l (sin sulfato y 5H2O).
Ventajosamente, se ha encontrado que el uso del medio de cultivo celular en procedimientos de cultivo celular que dan como resultado bajas concentraciones de amonio (NH4+) en la disolución de cultivo celular (es decir, en el sobrenadante de cultivo) da como resultado la expresión de vWF recombinante y/o rA13 con actividades específicas mayores. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la concentración de NH4+ del sobrenadante es menor de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la concentración de NH4+ del sobrenadante no es mayor de de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos.
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, los métodos y las composiciones proporcionados en el presente documento se basan en el uso de medios de cultivo celular basales complementados con cobre (por ejemplo, hasta una concentración final de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l usados en un procedimiento que da como resultado una concentración de NH4+ menor de 4 mM en el sobrenadante. Aún en otras realizaciones de la presente divulgación, el medio de cultivo celular basal se complementa para proporcionar una concentración de cobre y de amonio finales
según una cualquiera de las variaciones de 1 a 440, tal como se proporciona en la tabla 1.
Tabla 1. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y amonio presentes en medios de cultivo y sobrenadantes útiles para la expresión de proteínas recombinantes tal como se proporciona en la presente 5 divulgación.
J._________________________________________________________*__________________________________________________________i___________________—__*_
Concentración de amonio
N.D. NMT 10mM NMT 9mM NMT 8mM NMT 7mM NMT 6mM NMT 5mM NMT 4mM NMT 3mM NMT 2mM NMT 1mM
0 i— JD
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
1 mi L
1 41 81 121 161 201 241 281 321 361 401
O O
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
0
2 ua/L 2 42 82 122 162 202 242 282 322 362 402
c
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
'O
3 ua/L 3 43 83 123 163 203 243 283 323 363 403
03 L.
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
c
4UQ/L 4 44 84 124 164 204 244 284 324 364 404
o c
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
o o
5 ua/L 5 45 85 125 165 205 245 285 325 365 405
AL
Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
6 ua/L 6 46 86 126 166 206 246 286 326 366 406
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
7 ug/L 7 47 87 127 167 207 247 287 327 367 407
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
8 ua/L 8 48 88 128 168 208 248 288 328 368 408
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
9 ua/L 9 49 89 129 169 209 249 289 329 369 409
AL
10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 10 50 90 130 170 210 250 290 330 370 410
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
1 ug/L 11 51 91 131 171 211 251 291 331 371 411
Aprox. 1.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 12 52 92 132 172 212 252 292 332 372 412
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
2 ug/L 13 53 93 133 173 213 253 293 333 373 413
Aprox. 2.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 14 54 94 134 174 214 254 294 334 374 414
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
3 ua/L 15 55 95 135 175 215 255 295 335 375 415
Aprox. 3.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 16 56 96 136 176 216 256 296 336 376 416
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
4 ua/L 17 57 97 137 177 217 257 297 337 377 417
Aprox. 4.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 18 58 98 138 178 218 258 298 338 378 418
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
5 ug/L 19 59 99 139 179 219 259 299 339 379 419
Aprox. 5.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 20 60 100 140 180 220 260 300 340 380 420
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
6 ua/L 21 61 101 141 181 221 261 301 341 381 421
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
7 gg/L 22 62 102 142 182 222 262 302 342 382 422
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
8 ua/L 23 63 103 143 183 223 263 303 343 383 423
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
9 ua/L 24 64 104 144 184 224 264 304 344 384 424
5
10
15
20
25
30
Aprox. 10 JJS/t- Var. 25 Var. 65 Var. 105 Var. 145 Var 185 Var. 225 Var. 265 Var. 305 Var. 345 Var. 385 Var. 425
1-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
M9/L 26 66 106 146 186 226 266 306 346 386 426
2-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
27 67 107 147 187 227 267 307 347 387 427
1-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
jjs'l 28 68 108 148 188 228 268 308 348 388 428
2-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
(jg/L 29 69 109 149 189 229 269 309 349 389 429
1-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
van 30 70 110 150 190 230 270 310 350 390 430
2-6 Var. Var. Var, Var. Var. Var, Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 31 71 111 151 191 231 271 311 351 391 431
3-6 Var. Var. Var, Var. Var, Var. Var. Var. Var. Var. Var.
ms/L 32 72 112 152 192 232 272 312 352 392 432
4-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 33 73 113 153 193 233 273 313 353 393 433
1-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 34 74 114 154 194 234 274 314 354 394 434
2-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var, Var. Var. Var. Var.
35 75 115 155 195 235 275 315 355 395 435
3-5 Var. Var. Var, Var, Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var,
pgVL 36 76 116 156 196 236 276 316 356 396 436
4-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
ng'L 37 77 117 157 197 237 277 317 357 397 437
1-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
_yg'L 38 78 118 158 198 238 278 318 358 398 438
2-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
ng/L 39 79 119 159 199 239 279 319 359 399 439
3-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var, Var. Var, Var.
__ 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440
*ND = no definido *NMT= no más de *AL = al menos
En algunas realizaciones, los medios complementados con cobre de la presente invención se producen complementando medios basales que están libres de proteínas animales y/o definidos químicamente. Se conocen en la técnica métodos de preparación de medios de cultivo libres de proteínas animales y definidos químicamente, por ejemplo en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, documento WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770. En una realización, el medio de cultivo basal usado en los métodos descritos en el presente documento es un medio libre de proteínas animales o libre de oligopéptidos. En determinadas realizaciones, el medio de cultivo puede estar definido químicamente. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo pueden contener al menos una poliamina a una concentración de aproximadamente 0,5 mg/l a aproximadamente 10 mg/l.
En realizaciones adicionales y además cualquiera de las descripciones proporcionadas anteriormente, se proporcionan medios de cultivo de la invención en que un medio basal se complementa con cobre y al menos uno de calcio, cinc y/o vitamina B3. En determinadas realizaciones, el medio puede ser un medio libre de proteínas animales, libre de oligopéptidos o definido químicamente. En determinadas realizaciones, el medio libre de proteínas animales o libre de oligopéptidos se prepara tal como se enseña en las patentes estadounidenses números 6.171.825 y 6.936.441, el documento WO 2007/077217, y las publicaciones de solicitud de patente estadounidense números 2008/0009040 y 2007/0212770, y se complementa con cobre adicional y opcionalmente con uno o más de calcio, cinc y vitamina B3. En una realización específica, el medio de cultivo definido químicamente puede ser similar a una mezcla de medio de Eagle modificado por Dulbecco / F12 de Ham (DMEM/F12 de Ham) 1:1, que se ha complementado con cobre adicional y opcionalmente calcio, cinc y/o vitamina B3, con el fin de aumentar la actividad específica de rvWF o rA13 expresado en una célula cultivada en el medio. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo está libre de componentes animales. En otra realización, el medio de cultivo contiene proteínas, por ejemplo, proteínas animales de suero tal como suero bovino fetal. En otra realización, el cultivo tiene proteínas recombinantes añadidas de manera exógena. En otra realización, las proteínas proceden de un animal libre de patógenos certificado.
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En determinadas realizaciones, los medios de cultivo contienen al menos una poliamina a una concentración de o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 30 mg/l. En otra realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 10 mg/l. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l. En determinadas realizaciones la poliamina es del grupo de ornitina, putrescina, espermina o espermidina, o similares. En una realización preferida, la poliamina es putrescina. En una realización específica, el medio de cultivo contiene putrescina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l.
La divulgación anterior puede contener las siguientes realizaciones:
En una realización, los medios de cultivo contienen al menos una poliamina a una concentración de o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 30 mg/l y una combinación de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En otra realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 0,5 mg/l y 10 mg/l y una combinación de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos una poliamina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l y una combinación de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En determinadas realizaciones la poliamina es del grupo de ornitina, putrescina, espermina o espermidina, o similares. En una realización preferida, la poliamina es putrescina. En una realización específica, el medio de cultivo contiene putrescina a o aproximadamente entre 2 mg/l y 8 mg/l y una combinación de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1.
En aspectos adicionales, además de cobre, los medios de cultivo celular que se usan en la presente invención pueden incluir adicionalmente uno o más de: calcio adicional, cinc, una o más vitaminas, y cualquier combinación de los mismos.
Generalmente, puede usarse cualquier sal de calcio para complementar los medios de la invención, incluyendo los ejemplos no limitativos de sales aceptables CaCh, CaCl2, CaFPO3-2H2O, CaÍ2, CaBr2, (C2H3O2)2Ca, (CHO2)2Ca, (C6H7O6)2Ca, (C6H5O7)2Ca3'2H2O, y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de calcio farmacéuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invención.
Generalmente, puede usarse cualquier sal de cinc para complementar los medios de la invención, incluyendo los ejemplos no limitativos de sales aceptables, ZnSO4'7H2O, ZnSO3-2H2O, (C6H5O7)2'Zn3'2H2O, ZnBr2, ZnBr2'2H2O, ZnCl2, Zn (NO3)2'6H2O, Zn (H2PO4)2H2O, (C2H3O2^Zn-2H2O, y similares. En determinadas realizaciones, se usa una sal de cinc farmacéuticamente aceptable para complementar los medios de cultivo de la invención. En otras realizaciones, puede usarse una preparación de proteína o péptido que contiene cinc, por ejemplo insulina, para el complemento del cultivo proporcionado en el presente documento.
Todavía en aspectos adicionales, pueden usarse adicionalmente medios celulares basales complementados con cobre y uno o más de los materiales adicionales comentados anteriormente en cultivos con bajos niveles de amonio en el sobrenadante. En determinadas realizaciones, los medios de cultivo celular complementados que se usan en la presente invención dan como resultado niveles de amonio en la disolución de cultivo celular por debajo de 4 mM.
En una realización, las concentraciones de cobre y amonio de los medios de cultivo celular y un sobrenadante de cultivo celular se mantienen durante un periodo de tiempo prolongado durante el procedimiento de fabricación. En una realización específica, las concentraciones de cobre y amonio de un cultivo celular se mantienen durante la duración de un procedimiento de fabricación, es decir, durante el tiempo en que está expresándose rvWF y recuperándose de un cultivo celular a gran escala. En determinadas realizaciones de la presente divulgación, las concentraciones de cobre y amonio se mantienen en la disolución de cultivo a un nivel según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En una realización preferida, las concentraciones de cobre y amonio se mantienen durante todo el tiempo de tal procedimiento de producción.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo proporcionado por la invención puede proporcionarse en forma líquida o seca o de polvo. Pueden tomarse previamente alícuotas del medio en una cantidad adecuada para un solo uso o proporcionarse en mayor cantidad de la que puede usarse para más de un cultivo celular. Generalmente, el medio de la invención se proporcionará de modo estéril.
A continuación se comentan detalles específicos de medios de cultivo celular que se usan para producir rvWF o rA13. Aunque lo siguiente se comenta con respecto a o bien rvWF o bien rA13, se apreciará que cualquiera de la descripción proporcionada a continuación con respecto a rvWF puede aplicarse a rA13, y viceversa.
A. Medios de cultivo celular de vWF recombinante
Un aspecto de la presente invención se refiere a una disolución de cultivo celular para producir vWF recombinante, más específicamente, vWF de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica, que se describe adicionalmente en el presente documento. En una realización, la presente invención proporciona una disolución de cultivo celular para producir vWF recombinante, de alto peso molecular, que comprende un medio de cultivo celular
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que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l y una pluralidad de células que expresan vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad específica de cofactor de ristocetina de al menos aproximadamente 30 mU/pg.
En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, el cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otras realizaciones de la presente divulgación, el cultivo celular tiene una concentración de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En determinadas realizaciones, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene durante un periodo prolongado a una concentración tal como se proporcionó anteriormente. Por ejemplo, en una realización, la concentración de amonio se mantiene a una concentración baja durante al menos 3 días, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. Aún en otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF).
En una realización de la invención, los medios de cultivo celular pueden comprender una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l, en otra realización de al menos aproximadamente 3 pg/l, aún en otra realización de al menos aproximadamente 4 pg/l, aún en otra realización de al menos aproximadamente 8 pg/l, aún en otra realización de al menos aproximadamente 10 pg/l, aún en otra realización de al menos aproximadamente 15 pg/l.
En otras realizaciones, la concentración de cobre en los medios de cultivo celular de la presente invención puede oscilar entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 20 pg/l, en otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 15 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 10 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 8 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 6 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 4 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 20 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 15 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 10 pg/l, aún en otra realización entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 8 pg/l, y en una realización adicional entre aproximadamente 4 pg/l y aproximadamente 6 pg/l.
La presente invención también proporciona kits para la expresión o producción de rvWF, comprendiendo los kits un medio de cultivo adecuado para la expresión de rvWF que tiene alta actividad específica.
B. Medios de cultivo celular de ADAMTS13 (A13) de la presente divulgación
En un aspecto, la presente divulgación proporciona medios de cultivo que son útiles para la expresión de proteínas ADAMTS que tienen altas actividades específicas. Ventajosamente, se ha encontrado que complementando un medio de cultivo con cobre, se potencian enormemente las actividades de las enzimas ADAMTS recombinantes (por ejemplo, rADAMTS13) expresadas en células cultivadas en el medio complementado, mientras que las enzimas se expresan a niveles tan altos como, si no mayores que, los de células cultivadas en medios no complementados.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona medios de cultivo celular complementados con cobre para la expresión de la proteína ADAMTS13 recombinante con alta actividad específica. En una realización, los medios se complementan para dar como resultado una concentración total de cobre de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 pg/l. En realizaciones adicionales, los medios se complementan para dar como resultado una concentración total de cobre de desde aproximadamente 1-3, 2-3, 3-4 pg/l. En una realización, los medios contienen una concentración de cobre de al menos 1 pg/l. En otra realización, los medios contienen al menos cobre 2 pg/l. En otra realización, los medios contienen al menos cobre 4 pg/l. En otras realizaciones, los medios contienen cobre entre 2 pg/l y 20 pg/l. En otra realización, los medios contienen cobre entre 1 pg/l y 6 pg/l. En otra realización, los medios contienen cobre entre 2 pg/l y 5 pg/l. En otra realización, los medios contienen cobre entre 3 pg/l y 4 pg/l. Aún en otras realizaciones, los medios contienen al menos cobre 1 pg/l, o al menos cobre 2 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 11 mg/l, 12 mg/l, 13 pg/l, 14 pg/l, 15 mg/l, 16 mg/l, 17 mg/l, 18 mg/l, 19 mg/l, 20 mg/l, o concentraciones mayores de cobre.
En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular tiene una concentración de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En determinadas realizaciones, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene durante un periodo prolongado a una concentración tal como se proporcionó anteriormente. Por ejemplo, en una realización, la concentración de amonio se mantiene a concentración baja durante al menos 3 días, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 28, 35, 42, 49, 56,
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63, 70 o más días. En una realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. En una realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 14 días. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 14 días. Aún en otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rA13).
En una realización, se proporciona un medio de cultivo para la expresión de proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos cobre 1 pg/l y al menos cinc 2 pM. En otras realizaciones, los medios contienen al menos cobre 2 pg/l o al menos cobre 4 p/l. En otra realización en la que los medios se complementan con cobre, el medio de cultivo también contiene cinc al menos a o aproximadamente 5 pM. En una realización, el medio de cultivo también contiene cinc a o aproximadamente entre 2 pM y 12 pM. En otra realización, el medio de cultivo también contiene cinc a o aproximadamente entre 5 pM y 12 pM. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo también puede contener cinc al menos a o aproximadamente 2 pM, o al menos a o aproximadamente 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 11 pM, 12 pM, 13 pM, 14 pM, 15 pM, 20 pM, 25 pM, 30 pM o más. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2.
Tabla 2. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y cinc presentes en medios de cultivo útiles para la expresión de una proteína aDaMtS13 recombinante de la presente divulgación.
Concentración de cinc
AL 2 pM AL 3pM AL 4 pM AL 5 uM AL 6 pM AL 7 pM AL 8 pM AL 9 pM AL 10 pM 2-12 pM 5-12 pM
O
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
1 mq/l 441 481 521 561 601 641 681 721 761 801 841
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
2 gg/L 442 482 522 562 602 642 682 722 762 802 842
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
3 gg/L 443 483 523 563 603 643 683 723 763 803 843
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
4 |jq/L 444 484 524 564 604 644 684 724 764 804 844
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
5 gg/L 445 485 525 565 605 645 685 725 765 805 845
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
6 gg/L 446 486 526 566 606 646 686 726 766 806 846
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
7 gg/L 447 487 527 567 607 647 687 727 767 807 847
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
8 gq/L 448 488 528 568 608 648 688 728 768 808 848
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
9 gq/L 449 489 529 569 609 649 689 729 769 809 849
AL
10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 450 490 530 570 610 650 690 730 770 810 850
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
1 gg/L 451 491 531 571 611 651 691 731 771 811 851
Aprox. 1.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 452 492 532 572 612 652 692 732 772 812 852
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
2 gg/L 453 493 533 573 613 653 693 733 773 813 853
Aprox. 2.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 454 494 534 574 614 654 694 734 774 814 854
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
3 gg/L 455 495 535 575 615 655 695 735 775 815 855
Aprox. 3.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 456 496 536 576 616 656 696 736 776 816 856
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
4 gg/L 457 497 537 577 617 657 697 737 777 817 857
Aprox. 4.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 458 498 538 578 618 658 698 738 778 818 858
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
5 gg/L 459 499 539 579 619 659 699 739 779 819 859
Aprox. 5.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 460 500 540 580 620 660 700 740 780 820 860
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
6 gg/L 461 501 541 581 621 661 701 741 781 821 861
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
? gg/L 462 502 542 582 622 662 702 742 782 822 862
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
8 gg/L 463 503 543 583 623 663 703 743 783 823 863
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
9 gg/L 464 504 544 584 624 664 704 744 784 824 864
Aprox. 10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
_yg/L___ 465 505 545 585 625 665 705 745 785 825 865
5
10
15
20
25
30
1-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
f-g/L 466 506 546 586 626 666 706 746 786 826 866
2-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 467 507 547 587 627 667 707 747 787 827 867
1-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 468 508 548 588 628 668 708 748 788 828 868
2-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 469 509 549 589 629 669 709 749 789 829 869
1-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Mg/L 470 510 550 590 630 670 710 750 790 830 870
2-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Mg/L 471 511 551 591 631 671 711 751 791 831 871
3-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Mg/L 472 512 552 592 632 672 712 752 792 832 872
4-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 473 513 553 593 633 673 713 753 793 833 873
1-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 474 514 554 594 634 674 714 754 794 834 874
2-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 475 515 555 595 635 675 715 755 795 835 875
3-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Mg/L 476 516 556 596 636 676 716 756 796 836 876
4-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 477 517 557 597 637 677 717 757 797 837 877
1-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 478 518 558 598 638 678 718 758 798 838 878
2-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 479 519 559 599 639 679 719 759 799 839 879
3-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Mg/L 480 520 560 600 640 680 720 760 800 840 880
*AL = al menos
En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio baja. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 6 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 6 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 4 mM durante al menos 7 días. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. Aún en otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rA13).
En una realización, se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos cobre 1 pg/l y al menos calcio a o aproximadamente 0,5 mM. En otras realizaciones, los medios contienen al menos cobre 2 pg/l o al menos cobre 4 pg/l. En otra realización en la que los medios se complementan con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos calcio 1,5 mM. En una realización, el medio de cultivo contiene calcio a o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener calcio al menos a o aproximadamente 0,5 mM, o al menos a o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, o más. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las
variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3.
Tabla 3. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y calcio presentes en medios de cultivo útiles para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante de la presente divulgación.
Concentración de calcio
AL AL AL AL AL AL AL AL AL AL 0.5-
0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 2.0 2.5 3.0 4 mM 5 mM 1.5
mM mM mM mM mM mM mM mM mM
O
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
n o
1 pg/L 881 921 961 1001 1041 1081 1121 1161 1201 1241 1281
o <D ■o
AL Var. Var. Var. Var. Var, Var. Var. Var. Var. Var. Var.
2gg/L
882 922 962 1002 1042 1082 1122 1162 1202 1242 1282
c kO
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
o CTJ
3 pq/L 883 923 963 1003 1043 1083 1123 1163 1203 1243 1283
+■»
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
o o
4 pg/L 884 924 964 1004 1044 1084 1124 1164 1204 1244 1284
c o
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var, Var. Var. Var. Var. Var.
o
5 pq/L 885 925 965 1005 1045 1085 1125 1165 1205 1245 1285
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
6 yq/L 886 926 966 1006 1046 1086 1126 1166 1206 1246 1286
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
7 yq/L 887 927 967 1007 1047 1087 1127 1167 1207 1247 1287
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
8 yq/L 888 928 968 1008 1048 1088 1128 1168 1208 1248 1288
AL Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
9 yq/L 889 929 969 1009 1049 1089 1129 1169 1209 1249 1289
AL 10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
yg/L 890 930 970 1010 1050 1090 1130 1170 1210 1250 1290
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
1 yg/L 891 931 971 1011 1051 1091 1131 1171 1211 1251 1291
Aprox. 1.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Mg/L 892 932 972 1012 1052 1092 1132 1172 1212 1252 1292
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
2 yq/L 893 933 973 1013 1053 1093 1133 1173 1213 1253 1293
Aprox. 2.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
yg/L 894 934 974 1014 1054 1094 1134 1174 1214 1254 1294
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
3 yq/L 895 935 975 1015 1055 1095 1135 1175 1215 1255 1295
Aprox. 3.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
yg/L 896 936 976 1016 1056 1096 1136 1176 1216 1256 1296
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
4 yq/L 897 937 977 1017 1057 1097 1137 1177 1217 1257 1297
Aprox. 4.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
yg/L 898 938 978 1018 1058 1098 1138 1178 1218 1258 1298
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
5 yq/L 899 939 979 1019 1059 1099 1139 1179 1219 1259 1299
Aprox. 5.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 900 940 980 1020 1060 1100 1140 1180 1220 1260 1300
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
6 yq/L 901 941 981 1021 1061 1101 1141 1181 1221 1261 1301
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
7 yg/L 902 942 982 1022 1062 1102 1142 1182 1222 1262 1302
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
8 yq/L 903 943 983 1023 1063 1103 1143 1183 1223 1263 1303
Aprox. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
9 yq/L 904 944 984 1024 1064 1104 1144 1184 1224 1264 1304
Aprox. 10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
yg/L 905 945 985 1025 1065 1105 1145 1185 1225 1265 1305
1-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 906 946 986 1026 1066 1106 1146 1186 1226 1266 1306
2-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
yg/L 907 947 987 1027 1067 1107 1147 1187 1227 1267 1307
1-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
yg/L 908 948 988 1028 1068 1108 1148 1188 1228 1268 1308
2-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L__ 909 949 989 1029 1069 1109 1149 1189 1229 1269 1309
5
10
15
20
25
30
35
40
1-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Ufl/L 910 950 990 1030 1070 1110 1150 1190 1230 1270 1310
2-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
tjg/L 911 951 991 1031 1071 1111 1151 1191 1231 1271 1311
3-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 912 952 992 1032 1072 1112 1152 1192 1232 1272 1312
4-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Ufl/L 913 953 993 1033 1073 1113 1153 1193 1233 1273 1313
1-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 914 954 994 1034 1074 1114 1154 1194 1234 1274 1314
2-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
^g/L 915 955 995 1035 1075 1115 1155 1195 1235 1275 1315
3-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
[jg/L 916 956 996 1036 1076 1116 1156 1196 1236 1276 1316
4-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
Hg/L 917 957 997 1037 1077 1117 1157 1197 1237 1277 1317
1-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
ug/L 918 958 998 1038 1078 1118 1158 1198 1238 1278 1318
2-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg/L 919 959 999 1039 1079 1119 1159 1199 1239 1279 1319
3-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
gg'L__ 920 960 1000 1040 1080 1120 1160 1200 1240 1280 1320
*AL = al menos
En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio baja. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 6 mM y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 6 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 4 mM durante al menos 7 días. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. Aún en otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rA13).
En una realización, el medio de cultivo celular se complementa con cobre, cinc y calcio. En una realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,5 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 1,5 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de entre 0,5 mM y 1,5 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, o más, y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2.
En una realización, se proporciona un medio de cultivo para la expresión de una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, rADAMTS13) que contiene al menos cobre 1 pg/l y al menos nicotinamida 2 mg/l (vitamina B3). En otras realizaciones, los medios contienen al menos cobre 2 pg/l o al menos cobre 4 pg/l. En otra realización en la que los medios se complementan con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos nicotinamida 7 mg/l (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene nicotinamida (vitamina B3) a o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener nicotinamida al menos a o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, o
concentraciones mayores de nicotinamida (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y nicotinamida según una cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, tal como se expone en la tabla 4.
5 Tabla 4. Realizaciones a modo de ejemplo de concentraciones de cobre y nicotinamida presentes en medios de cultivo útiles para la expresión de una proteína ADAMTS13 recombinante de la presente divulgación.
Concentraciones de calcio
AL 2 mq/mL AL 3 mq/mL AL 4 mq/mL AL 5 mq/mL AL 6 mq/mL AL 7 mq/mL AL 8 mq/mL AL 9 mq/mL AL 10 mq/mL AL 15 mq/mL 2-10 mg/mL
0)
AL 1 gg/L Var. 1321 Var. 1361 Var. 1401 Var. 1441 Var. 1481 Var. 1521 Var. 1561 Var. 1601 Var. 1641 Var. 1681 Var. 1721
n o ü <D TJ
AL 2 Md/L Var. 1322 Var. 1362 Var. 1402 Var. 1442 Var. 1482 Var. 1522 Var. 1562 Var. 1602 Var. 1642 Var. 1682 Var. 1722
‘O ü <C k_ c Q>
AL 3 gq/L Var. 1323 Var. 1363 Var. 1403 Var. 1443 Var. 1483 Var. 1523 Var. 1563 Var. 1603 Var. 1643 Var. 1683 Var. 1723
O c o o
AL 4 gg/L Var. 1324 Var. 1364 Var. 1404 Var. 1444 Var. 1484 Var. 1524 Var, 1564 Var. 1604 Var. 1644 Var. 1684 Var. 1724
AL 5 gg/L Var. 1325 Var. 1365 Var. 1405 Var. 1445 Var. 1485 Var. 1525 Var. 1565 Var. 1605 Var. 1645 Var. 1685 Var. 1725
AL 6 gg/L Var. 1326 Var. 1366 Var. 1406 Var. 1446 Var. 1486 Var. 1526 Var. 1566 Var. 1606 Var. 1646 Var. 1686 Var. 1726
AL 7 gg/L Var. 1327 Var. 1367 Var. 1407 Var. 1447 Var. 1487 Var. 1527 Var. 1567 Var. 1607 Var. 1647 Var. 1687 Var. 1727
AL 8 gg/L Var. 1328 Var. 1368 Var. 1408 Var. 1448 Var. 1488 Var. 1528 Var. 1568 Var. 1608 Var. 1648 Var. 1688 Var. 1728
AL 9 gg/L Var. 1329 Var. 1369 Var. 1409 Var. 1449 Var. 1489 Var. 1529 Var. 1569 Var. 1609 Var. 1649 Var. 1689 Var, 1729
AL 10 gg/L Var. 1330 Var. 1370 Var. 1410 Var. 1450 Var. 1490 Var. 1530 Var. 1570 Var. 1610 Var. 1650 Var. 1690 Var. 1730
Aprox. 1 gg/L Var. 1331 Var. 1371 Var. 1411 Var. 1451 Var. 1491 Var. 1531 Var. 1571 Var. 1611 Var. 1651 Var, 1691 Var. 1731
Aprox, 1.5 gq/L Var. 1332 Var. 1372 Var. 1412 Var. 1452 Var. 1492 Var. 1532 Var. 1572 Var. 1612 Var. 1652 Var. 1692 Var. 1732
Aprox. 2 gg/L Var. 1333 Var. 1373 Var. 1413 Var. 1453 Var. 1493 Var. 1533 Var. 1573 Var. 1613 Var. 1653 Var. 1693 Var. 1733
Aprox. 2.5 gg/L Var. 1334 Var. 1374 Var. 1414 Var. 1454 Var. 1494 Var. 1534 Var. 1574 Var. 1614 Var. 1654 Var. 1694 Var. 1734
Aprox. 3 gg/L Var. 1335 Var. 1375 Var. 1415 Var. 1455 Var. 1495 Var. 1535 Var. 1575 Var. 1615 Var. 1655 Var. 1695 Var. 1735
Aprox. 3.5 gg/L Var. 1336 Var. 1376 Var. 1416 Var. 1456 Var. 1496 Var. 1536 Var. 1576 Var. 1616 Var. 1656 Var. 1696 Var. 1736
Aprox. 4 gg/L Var. 1337 Var. 1377 Var. 1417 Var. 1457 Var. 1497 Var. 1537 Var. 1577 Var. 1617 Var. 1657 Var. 1697 Var. 1737
Aprox. 4.5 gq/L Var. 1338 Var. 1378 Var. 1418 Var. 1458 Var. 1498 Var. 1538 Var. 1578 Var. 1618 Var. 1658 Var, 1698 Var. 1738
Aprox. 5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1339 1379 1419 1459 1499 1539 1579 1619 1659 1699 1739
Aprox. 5.5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1340 1380 1420 1460 1500 1540 1580 1620 1660 1700 1740
Aprox. 6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1341 1381 1421 1461 1501 1541 1581 1621 1661 1701 1741
Aprox. 7 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1342 1382 1422 1462 1502 1542 1582 1622 1662 1702 1742
Aprox. 8 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1343 1383 1423 1463 1503 1543 1583 1623 1663 1703 1743
Aprox. 9 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1344 1384 1424 1464 1504 1544 1584 1624 1664 1704 1744
Aprox. 10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1345 1385 1425 1465 1505 1545 1585 1625 1665 1705 1745
1-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1346 1386 1426 1466 1506 1546 1586 1626 1666 1706 1746
2-20 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1347 1387 1427 1467 1507 1547 1587 1627 1667 1707 1747
1-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1348 1388 1428 1468 1508 1548 1588 1628 1668 1708 1748
2-10 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1349 1389 1429 1469 1509 1549 1589 1629 1669 1709 1749
1-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1350 1390 1430 1470 1510 1550 1590 1630 1670 1710 1750
2-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1351 1391 1431 1471 1511 1551 1591 1631 1671 1711 1751
3-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1352 1392 1432 1472 1512 1552 1592 1632 1672 1712 1752
4-6 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1353 1393 1433 1473 1513 1553 1593 1633 1673 1713 1753
1-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1354 1394 1434 1474 1514 1554 1594 1634 1674 1714 1754
2-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1355 1395 1435 1475 1515 1555 1595 1635 1675 1715 1755
3-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1356 1396 1436 1476 1516 1556 1596 1636 1676 1716 1756
4-5 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1357 1397 1437 1477 1517 1557 1597 1637 1677 1717 1757
1-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1358 1398 1438 1478 1518 1558 1598 1638 1678 1718 1758
2-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1359 1399 1439 1479 1519 1559 1599 1639 1679 1719 1759
3-4 Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var. Var.
pg/L 1360 1400 1440 1480 1520 1560 1600 1640 1680 1720 1760
*AL = al menos
En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio baja. En una 5 realización, el medio de cultivo comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM y una concentración de cobre y nicotinamida según una cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, tal como se expone en la tabla 4. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 6 mM y una concentración de cobre y nicotinamida según una cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, tal 10 como se expone en la tabla 4. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 6 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM y una concentración de cobre y nicotinamida según una cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, tal como se expone en la tabla 4. En una realización específica, el amonio se mantiene
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a una concentración de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En otra realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM y una concentración de cobre y nicotinamida según una cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, tal como se expone en la tabla 4. En una realización específica, el amonio se mantiene a una concentración de no más de 4 mM durante al menos 7 días. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos y una concentración de cobre y nicotinamida según una cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, tal como se expone en la tabla 4. Aún en otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rA13).
En una realización, el medio de cultivo celular se complementa con cobre, cinc y nicotinamida. En una realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ml y 10 mg/ml y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, o más, y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2.
En una realización, el medio de cultivo celular se complementa con cobre, calcio y nicotinamida. En una realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml mM y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ml y 10 mg/ml y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, o más, y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3.
IV. Métodos para la producción de factores sanguíneos que tienen alta actividad específica
A. Métodos de cultivo celular
La presente invención proporciona métodos para la producción a gran escala de proteínas recombinantes (tal como rvWF). En determinadas realizaciones, los métodos de producción a gran escala utilizan reactores de tanque con agitación/remoción para la fabricación de estas proteínas terapéuticas recombinantes.
En determinadas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de un sistema de cultivo celular que se hace funcionar en modo de funcionamiento discontinuo o continuo. Por ejemplo, cuando se utilizan cultivos celulares discontinuos, pueden hacerse funcionar en modo de un único lote, semicontinuo o de lotes repetidos. Asimismo, los cultivos celulares continuos pueden hacerse funcionar en modo, por ejemplo, de perfusión, turbidostato o quimiostato. El cultivo celular discontinuo y continuo puede realizarse en condiciones de suspensión o adherencia. Cuando se hace funcionar en condiciones de suspensión, las células se suspenderán libremente y se mezclarán dentro del medio de cultivo. Alternativamente, en condiciones de adherencia, las células se unirán a una fase sólida, por ejemplo, un microportador, un microportador poroso, portador de disco, cartucho de cerámica, fibra hueca, lámina plana, matriz de gel, y similares.
Un cultivo discontinuo normalmente es un cultivo celular a gran escala en el que se cultiva un inóculo celular hasta una densidad máxima en un tanque o fermentador, y se recoge y se procesa como un solo lote. Un cultivo semicontinuo normalmente es un cultivo discontinuo al que se suministran nutrientes nuevos (por ejemplo, sustratos de limitación del crecimiento) o aditivos (por ejemplo, precursores para productos). La disolución de alimentación habitualmente está altamente concentrada para evitar la dilución del biorreactor. En un cultivo discontinuo repetido, las células se colocan en un medio de cultivo y se hacen crecer hasta una densidad celular deseada. Para evitar el comienzo de una fase de disminución y muerte celular, se diluye entonces el cultivo con medio de crecimiento completo antes de que las células alcancen su concentración máxima. La cantidad y la frecuencia de dilución varían ampliamente y depende de las características de crecimiento de la línea celular y de la conveniencia del procedimiento de cultivo. El procedimiento puede repetirse tantas veces como se requiera y, a menos que las células y el medio se desechen como subcultivo, el volumen del cultivo aumentará gradualmente a medida que se realiza cada dilución. El volumen creciente puede manejarse teniendo un reactor de tamaño suficiente como para permitir diluciones dentro del recipiente o dividiendo el cultivo diluido en varios recipientes. El fundamento de este tipo de cultivo es mantener las células en un estado de crecimiento exponencial. El subcultivo en serie se caracteriza
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porque el volumen del cultivo siempre está creciendo gradualmente, puede haber múltiples recogidas, las células continúan creciendo y el procedimiento puede continuar durante tanto tiempo como se desee. En determinadas realizaciones de la presente divulgación, puede recubrirse una proteína ADAMTS recombinante (por ejemplo, ADAMTS13) tras recoger el sobrenadante de un cultivo discontinuo. En otras realizaciones, puede recubrirse un vWF recombinante tras la recogida del sobrenadante de un cultivo discontinuo.
Un cultivo continuo puede ser un cultivo en suspensión al que están suministrándose continuamente nutrientes mediante el flujo de entrada de medio nuevo, en el que el volumen de cultivo habitualmente se mantiene constante mediante la retirada simultánea del medio gastado. En los métodos de quimiostato y turbidostato, el medio extraído contiene células. Por tanto, las células que permanecen en el recipiente de cultivo celular deben crecer hasta mantener un estado estacionario. En el método de quimiostato, la tasa de crecimiento se controla normalmente controlando la tasa de dilución, es decir, la tasa a la que se añade medio nuevo. La tasa de crecimiento de las células en el cultivo puede controlarse, por ejemplo, a una tasa de crecimiento submáxima, mediante la alteración de la tasa de dilución. En contraposición, en el método de turbidostato, la tasa de dilución se fija para permitir la tasa de crecimiento máxima que pueden lograr las células en las condiciones de funcionamiento dadas, tales como pH y temperatura. En determinadas realizaciones, el rvWF se recubre tras la recogida del sobrenadante de un cultivo continuo. Un método a modo de ejemplo para cultivo celular continuo se describe en el documento WO/2011/012725 (Grillberger et al.).
En un cultivo en perfusión, el medio extraído presenta reducción de células, que se retienen en el recipiente de cultivo, por ejemplo, mediante filtración o mediante métodos centrífugos que conducen a la reintroducción de las células en el cultivo. Sin embargo, normalmente las membranas usadas para la filtración no retienen el 100 % de las células, y por tanto se retira una proporción cuando se extrae el medio. Puede que no sea crucial hacer funcionar cultivos en perfusión a tasas de crecimiento muy altas, ya que la mayoría de las células quedan retenidas en el recipiente de cultivo. En determinadas realizaciones, el rvWF se recubre tras la recogida del sobrenadante de un cultivo en prefusión.
El sistema de reactor de tanque con agitación puede usarse para cultivos celulares discontinuos y continuos que se hacen funcionar en modos en suspensión o adherente. Generalmente, el sistema de reactor de tanque con agitación puede hacerse funcionar como cualquier reactor de tanque con agitación convencional con cualquier tipo de agitador tal como un dispositivo Rushton, perfil hidrodinámico, pala con ajuste de paso o hélice.
En determinadas realizaciones, los métodos de cultivo celular de la invención pueden comprender el uso de un microportador. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones pueden realizarse en grandes biorreactores en condiciones adecuadas para proporcionar áreas superficiales de cultivo específicas de alto volumen para lograr densidades celulares y expresión de proteínas altas. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microportadores para cultivo celular en biorrectores de tanque con agitación. El concepto de crecimiento celular en microportadores se describió por primera vez por van Wezel (van Wezel, A.l., Nature 216:64-5 (1967)) y permite la unión celular sobre la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio de crecimiento. Estos métodos proporcionan altas razones de superficie con respecto a volumen y por tanto permiten la utilización de nutrientes eficaz. Además, para la expresión de proteínas secretadas en líneas de células eucariotas, la razón aumentada de superficie con respecto a volumen permite mayores niveles de secreción y por tanto mayores rendimientos de proteína en el sobrenadante del cultivo. Finalmente, estos métodos permiten la fácil ampliación a escala de cultivos de expresión en eucariotas.
Las células que expresan vWF pueden unirse a un microportador esférico o poroso durante el crecimiento del cultivo celular. El microportador puede ser un microportador seleccionado del grupo de microportadores basados en dextrano, colágeno, plástico, gelatina y celulosa y otros tal como se describe en Butler (1988. En: Spier & Griffiths, Animal cell Biotechnology 3:283-303). También es posible hacer crecer las células hasta una biomasa sobre microportadores esféricos y subcultivar las células cuando han alcanzado la biomasa final del fermentador y antes de la producción de la proteína expresada sobre un microportador poroso o viceversa. Los microportadores esféricos adecuados pueden incluir microportadores de superficie lisa, tales como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2, y Cytodex™ 3 (GE Healthcare) y microportadores macroporosos tales como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1, y Cytoline™ 2 (GE Healthcare).
Tal como se describió anteriormente, la presente invención incluye medios de cultivo celular que tienen una concentración de cobre aumentada. Se entiende que pueden aplicarse todas las realizaciones y concentraciones descritas en la sección de “medios de cultivo celular” anterior a los métodos de la presente invención descritos en el presente documento.
En determinadas realizaciones, el cultivo puede mantenerse durante al menos aproximadamente 7 días, o al menos aproximadamente 14 días, 21 días, 28 días, o al menos aproximadamente 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, o al menos aproximadamente 2 meses, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses o más. La densidad celular a la que se mantiene un cultivo celular para la producción de un vWF recombinante o una proteína rA13 recombinante dependerá de las condiciones de cultivo y del medio usado para la expresión de proteínas. Un experto en la técnica podrá determinar fácilmente la densidad celular óptima para un
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cultivo celular que produce rvWF o rA13. En una realización, el cultivo se mantiene a una densidad celular de entre aproximadamente 0,5 x 106 y 4 x 107 células/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0 x 106 y aproximadamente
1.0 x 107 células/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0 x 106 y aproximadamente 4,0 x 106 células/ml durante un periodo de tiempo prolongado. En otras realizaciones, la densidad celular se mantiene a una concentración de entre aproximadamente 1,0 x 106 y aproximadamente 4,0 x 106 células/ml durante un periodo de tiempo prolongado. Aún en otras realizaciones, la densidad celular puede mantenerse a una concentración de entre aproximadamente
2.0 x 106 y aproximadamente 4,0 x 106 células/ml, o entre aproximadamente 1,0 x 106 y aproximadamente 2,5 x 106 células/ml, o entre aproximadamente 1,5 x 106 y aproximadamente 3,5 x 106 células/ml, o cualquier otro intervalo similar, durante un periodo de tiempo prolongado.
En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 4,0 x 106 células/ml durante al menos 9 semanas.
En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,5 x 106 células/ml durante al menos 9 semanas.
En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 x 106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más
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específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 3,0 * 106 células/ml durante al menos 9 semanas.
En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante al menos 9 semanas.
En otra realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 2,0 * 106 células/ml durante al menos 9 semanas.
En una realización, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 7 días. En una realización específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 14 días. En una realización más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 21 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 28 días. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 5 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 6 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 7 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 8 semanas. En una realización aún más específica, la densidad celular de un cultivo celular continuo proporcionado en el presente documento se mantiene a una concentración de no más de 1,5 * 106 células/ml durante al menos 9 semanas.
Lo siguiente proporciona detalles específicos sobre métodos para producir rvWF y rA13. Tal como se apreciará, aunque las condiciones se presentan específicamente para rvWF o rA13, las condiciones para rvWF pueden usarse para producir rA13 y viceversa.
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B. Métodos de producción de vWF recombinante de alto peso molecular
En otro aspecto, la presente invención se refiere adicionalmente a métodos para producir vWF en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que tiene una concentración de cobre aumentada. En determinadas realizaciones, el cultivo también comprende una concentración de amonio baja. Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo celular” y “disolución de cultivo celular” se usan de manera intercambiable.
En una realización, la presente invención proporciona un método de producción de un vWF recombinante, de alto peso molecular, que comprende: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica para vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de aproximadamente 4 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. En realizaciones adicionales, el rvWF multimérico producido utilizando los métodos de la presente invención comprende aproximadamente 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22, 20-21 dímeros. Todavía en realizaciones adicionales, el rvWF producido según la presente invención tiene una actividad específica de al menos aproximadamente 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80 o más mU/pg. En una realización específica, la densidad celular del cultivo celular continuo para la producción de rvWF se mantiene a una concentración de no más de 2,5 * 106 células/ml durante un periodo prolongado. En otras realizaciones específicas, la densidad celular se mantiene a no más de
2,0 * 106 células/ml, 1,5 * 106 células/ml, 1,0 * 106 células/ml, 0,5 * 106 células/ml, o menos. En una realización, la densidad celular se mantiene a entre 1,5 * 106 células/ml y 2,5 * 106 células/ml.
En una realización, la presente invención proporciona un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rvWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rvWF; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que el rvWF se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 30 mU/pg de rvWF. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 3 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 4 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo
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durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de aproximadamente 4,3 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio de la disolución de cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, los medios de cultivo celular basales se complementan con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En una realización, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 4 mM. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rvWF). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización, la presente invención proporciona un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rvWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rvWF; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que el rvWF se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que la concentración de NH4+ del sobrenadante se mantiene a un nivel bajo durante al menos 7 días, y adicionalmente en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 30 mU/pg de rvWF. En una realización específica de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ de la disolución de cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 14 días. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica
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para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 21 días. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 28 días. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 5 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 6 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 7 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 8 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente de la presente divulgación, la concentración de cobre y la concentración de NH4+ del cultivo celular se mantienen a una concentración según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se expone en la tabla 1 durante al menos 9 semanas. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización, la presente invención proporciona un método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rvWF), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rvWF; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que el rvWF se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; (e) monitorizar la concentración de amonio del sobrenadante de cultivo; y (f) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que el sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 10 mM no se usa para producir la composición de rvWF, y adicionalmente en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 30 mU/pg de rvWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de al menos 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de entre 3-8 pg/l o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para
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rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, no se usa sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 6 mM para producir la composición de rvWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de al menos 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de entre 3-8 pg/l o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, no se usa sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 5 mM para producir la composición de rvWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de al menos 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de entre 3-8 pg/l o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
En una realización del método descrito anteriormente, no se usa sobrenadante de cultivo que comprende una concentración de amonio de más de 4 mM para producir la composición de rvWF. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de al menos 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l, 7 pg/l, 8 pg/l, 9 pg/l, 10 pg/l, 15 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de entre 3-8 pg/l o 4-6 pg/l. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 70 mU/pg de rvWF.
Puede producirse vWF recombinante mediante la expresión en un sistema huésped eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep, y HepG2; células de insecto, por ejemplo, células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, por ejemplo, células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces. En una realización, el vWF puede expresarse en células de levadura, células de insecto, células de ave, células de mamífero, y similares. Por ejemplo, en una línea celular humana, una línea celular de hámster, o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK. Normalmente, pueden usarse células de mamífero, por ejemplo, células CHO de una línea celular continua, para expresar el vWF de la presente invención.
En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para vWF puede ser un vector. El vector puede administrarse mediante un virus o puede ser un plásmido. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína puede ser un gen específico o una parte biológicamente funcional de la misma. En una realización, la proteína es al menos una parte biológicamente activa de vWF.
Puede usarse una amplia variedad de vectores para la expresión del vWF y pueden seleccionarse de vectores de expresión en eucariotas. Los ejemplos de vectores para expresión en eucariotas incluyen: (i) para la expresión en levadura, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores tales como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) para la expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para la expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes, retrovirus, etc., usando promotores tales como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV, y p-actina. Un vector a modo de ejemplo para expresar rvWF lo describe Kaufman et al. (Mol. Cell Biol. Marzo de 1989;9(3):1233-42).
En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico comprende además otras secuencias adecuadas para una expresión controlada de una proteína tal como secuencias promotoras, potenciadores, cajas TATA, sitios de iniciación de la transcripción, poliligadores, sitios de restricción, secuencias de poli-A, secuencias de procesamiento de proteínas, marcadores de selección, y similares que conoce generalmente un experto habitual en la técnica.
Además de los medios de cultivo celular que comprenden una concentración de cobre aumentada, las condiciones de cultivo celular de la presente invención pueden incluir una concentración de amonio de menos de aproximadamente 4 mM por todo el procedimiento anterior en sistemas de cultivo.
En algunas realizaciones, las concentraciones de amonio de la presente invención se mantienen constantes por todo
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el procedimiento anterior del sistema de cultivo celular. Las células usadas según la presente invención pueden cultivarse, por ejemplo, mediante métodos que se modifican en comparación con el cultivo discontinuo y el cultivo semicontinuo convencionales, cada uno de los cuales se conocen generalmente en el campo. Sin embargo, tales técnicas convencionales pueden producir altas concentraciones de amonio al final del cultivo. Los métodos de la presente invención superan este problema empleando sistemas de producción que pueden proporcionar un suministro continuo de medios de cultivo a través de técnicas tales como, por ejemplo, cultivos de perfusión o quimiostato. Tras el cultivo de las células huésped, el vWF puede recuperarse del medio empleado usando metodologías convencionales, tales como ultrafiltración o centrifugación. Si se desea, el vWF puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico y/o de exclusión molecular, y similares.
Un cultivo continuo (por ejemplo, un cultivo de perfusión o quimiostato) puede ser un cultivo en suspensión al que están suministrándose continuamente nutrientes mediante el flujo de entrada de medio nuevo, en el que el volumen de cultivo habitualmente es constante. De manera similar, la fermentación continua puede referirse a un procedimiento en el que las células o los microorganismos se mantienen en cultivo en la fase de crecimiento exponencial mediante la adición continua de medio nuevo que se equilibra exactamente por la retirada de la suspensión celular del biorreactor. Además, puede usarse un sistema de reactor de tanque con agitación para cultivos en suspensión, de perfusión, quimiostáticos y/o de microportador. Generalmente, el sistema de reactor de tanque con agitación puede hacerse funcionar como cualquier reactor de tanque con agitación convencional con cualquier tipo de agitador tal como un dispositivo Rushton, perfil hidrodinámico, pala con ajuste de paso o hélice.
C. Métodos de producción de ADAMTS13 recombinante (A13) de la presente divulgación
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere además a métodos para producir rA13 en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que tiene una concentración de cobre aumentada. En determinadas realizaciones, el cultivo también comprende una concentración de amonio baja.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de al menos 1,0 pg/l; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que rA13 se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día (es decir, 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por día por litro de cultivo celular; P FRETS) en el sobrenadante de cultivo recuperado. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de al menos 2 pg/l, 3 pg/l, 4 pg/l, 5 pg/l, 6 pg/l o mayor. En otras realizaciones, la concentración de cobre final de los medios de cultivo basales complementados es de entre 1-6 pg/l, 2-5 pg/l, 2-4 pg/l o 3-4 pg/l. En una realización preferida, están presentes al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida, están presentes al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida, están presentes al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan productividad volumétrica mediante FRETS-vWF73 mejorada (P FRETS). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se recuperan diariamente al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una realización preferida, se recuperan diariamente al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una realización más preferida, se recuperan diariamente al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En la realización más preferida, se recuperan diariamente al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, o más días. En una realización específica, la densidad celular del cultivo celular continuo para la producción de rA13 se mantiene a una concentración de no más de 4,0x106 células/ml durante un periodo prolongado. En otras realizaciones específicas, la densidad celular se mantiene a no más de 3,5 * 106 células/ml, 3,0 * 106 células/ml, 2,5 * 106 células/ml, 2,0 * 106 células/ml, 1,5 * 106 células/ml, 1,0 * 106 células/ml, o menos. En una realización, la densidad celular se mantiene a entre
3,0 * 106 células/ml y 4,0 * 106 células/ml.
En una realización de los métodos descritos anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene al menos 4 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por ml de sobrenadante (FRETS). En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 6 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por ml de sobrenadante. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 8 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por ml de sobrenadante. En la realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos
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10 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por ml de sobrenadante. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan producción de FRETS mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se recupera diariamente sobrenadante que tiene al menos 4 unidades de actividad mediante FRETS- vWF73 por ml durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, se recupera diariamente sobrenadante que tiene al menos 6 unidades de actividad mediante FRETS- vWF73 por ml durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, se recupera diariamente sobrenadante que tiene al menos 8 unidades de actividad mediante FRETS- vWF73 por ml durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En la realización más preferida, se recupera diariamente sobrenadante que tiene al menos 10 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por ml durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.
En una realización de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 800 mU de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo por día (es decir, q FRETS). En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 U de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo por día. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,2 U de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo por día. En la realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,4 U de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo por día. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan productividad mediante FRETS-vWF73 específica de célula (q FRETS) mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 800 mU de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 U de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la
producción de al menos 1,2 U de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo
diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En la realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,4 U de actividad mediante FRETS-vWF73 por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.
En una realización de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 mg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por litro de cultivo por día (P ELISA). En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,5 mg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por litro de cultivo por día. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la
producción de al menos 2 mg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por litro de cultivo por día. En
determinadas realizaciones, los métodos proporcionan producción de rA13 mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1 mg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por litro de cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 1,5 mg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por litro de cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 2 mg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por litro de cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.
En una realización de los métodos descritos anteriormente, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,5 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo por día (es decir, q ELISA). En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,7 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo por día. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,9 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo por día. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionan producción mediante q ELISA mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,5 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,7 mg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, el cultivo celular da como resultado la producción de al menos 0,9 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por 106 células presentes en el cultivo diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.
En una realización de los métodos descritos anteriormente, el sobrenadante recuperado tiene al menos 3 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En una realización preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 4 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En una realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 5 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En la realización más preferida, el sobrenadante recuperado tiene al menos 6 pg de rA13, tal como se mide mediante ELISA, por ml de sobrenadante. En determinadas realizaciones, los métodos
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proporcionan producción de rA13 mejorada de manera sostenible. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se recupera sobrenadante que tiene al menos 3 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14,
21.28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización preferida, se recupera sobrenadante que tiene al menos 4 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En una realización más preferida, se recupera sobrenadante que al menos 5 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días. En la realización más preferida, se recupera sobrenadante que tiene al menos 6 pg de rA13 por ml diariamente durante al menos 7 días, o al menos 14,
21.28, 35, 42, 49, 56, 63, 70 o más días.
En una realización de los métodos descritos anteriormente, la disolución de cultivo celular comprende además una concentración de amonio de menos de 10 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 10 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 5 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 5 mM durante al menos 7 días. En una realización preferida, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 4 mM. En otra realización específica, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a una concentración de amonio de no más de 4 mM durante al menos 7 días. Aún en otras realizaciones, la disolución de cultivo celular comprende una concentración de amonio de no más de 10 mM, o no más de 9 mM, 8 mM, 7 mM, 6 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, o menos. Aún en otra realización, la concentración de amonio del cultivo celular se mantiene a un nivel bajo durante la duración del procedimiento (es decir, durante todo el tiempo en que está usándose el cultivo para producir rA13). En una realización particular, la disolución de cultivo tiene una concentración de cobre y amonio según una cualquiera de las variaciones 1 a 440, tal como se proporciona en la tabla 1.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre y cinc; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que rA13 se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos cobre 1 pg/l y al menos cinc 2 pM. En otras realizaciones, los medios contienen al menos cobre 2 pg/l o al menos cobre 4 pg/l. En una realización en la que los medios se complementan con cobre, el medio de cultivo también contiene cinc al menos a o aproximadamente 5 pM. En una realización, el medio de cultivo también contiene cinc a o aproximadamente entre 2 pM y 12 pM. En otra realización, el medio de cultivo también contiene cinc a o aproximadamente entre 5 pM y 12 pM. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo también puede contener cinc al menos a o aproximadamente 2 pM, o al menos a o aproximadamente 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 11 pM, 12 pM, 13 pM, 14 pM, 15 pM, 20 pM, 25 pM, 30 pM o más. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En una realización preferida, están presentes al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida, están presentes al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida, están presentes al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre y calcio; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que rA13 se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos cobre 1 pg/l y al menos calcio 0,5 mM. En otras realizaciones, los medios contienen al menos cobre 2 pg/l o al menos cobre 4 pg/l. En otra realización en la que los medios se complementan con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos calcio 1,5 mM. En una realización, el medio de cultivo contiene calcio a o aproximadamente entre 0,5 mM y 1,5 mM. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener calcio al menos a o aproximadamente 0,5 mM, o al menos a o aproximadamente 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM,
1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM o más. En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En una realización preferida, están presentes al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por
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litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida, están presentes al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida, están presentes al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre, cinc y calcio; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que rA13 se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,5 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 1,5 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de entre 0,5 mM y 1,5 mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de calcio de al menos 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM, 2,5 mM, 2,75 mM, 3,0 mM, 3,5 mM, 4,0 mM, 4,5 mM, 5,0 mM, o más, y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En una realización preferida, están presentes al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida, están presentes al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida, están presentes al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que rA13 se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo contiene al menos cobre 1 pg/l y al menos nicotinamida 2 mg/l (vitamina B3). En otras realizaciones, los medios contienen al menos cobre 2 pg/l o al menos cobre 4 pg/l. En otra realización en la que los medios se complementan con cobre, el medio de cultivo también contiene al menos nicotinamida 7 mg/l (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene nicotinamida a o aproximadamente entre 2 mg/l y 10 mg/l (vitamina B3). Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo puede contener nicotinamida al menos a o aproximadamente 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l, 5 mg/l, 6 mg/l, 7 mg/l, 8 mg/l, 9 mg/l, 10 mg/l, 15 mg/l, 20 mg/l, o concentraciones mayores de nicotinamida (vitamina B3). En una realización, el medio de cultivo contiene una concentración de cobre y nicotinamida según una cualquiera de las variaciones 1321 a 1760, tal como se expone en la tabla 4. En una realización preferida, están presentes al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida, están presentes al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida, están presentes al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre, cinc y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que rA13 se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo celular tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml mM y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En otra realización específica, el
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medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ml y 10 mg/ml y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, o más, y una concentración de cobre y cinc según una cualquiera de las variaciones 441 a 880, tal como se expone en la tabla 2. En una realización preferida, están presentes al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida, están presentes al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida, están presentes al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para producir una composición de ADAMTS13 recombinante (rA13), comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar medios de cultivo celular basales; (b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre, calcio y nicotinamida; (c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rA13; (d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que rA13 se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo; y (e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo, en el que están presentes al menos 1500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización, el medio de cultivo celular tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 7 mg/ml mM y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En otra realización específica, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de entre 2 mg/ml y 10 mg/ml y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. Aún en otras realizaciones, el medio de cultivo tiene una concentración de nicotinamida de al menos 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, o más, y una concentración de cobre y calcio según una cualquiera de las variaciones 881 a 1320, tal como se expone en la tabla 3. En una realización preferida, están presentes al menos 2000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En una realización más preferida, están presentes al menos 2500 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado. En la realización más preferida, están presentes al menos 3000 unidades de actividad mediante FRETS-vWF73 por litro de medios de cultivo celular basales complementados por día en el sobrenadante de cultivo recuperado.
Pueden producirse proteínas ADAMTS recombinantes mediante la expresión en cualquier sistema huésped procariota o eucariota adecuado. Los ejemplos de células eucariotas incluyen, sin limitación, células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2; células de insecto, por ejemplo células SF9, células SF21, células S2 y células High Five; y células de levadura, por ejemplo células de Saccharomyces o Schizosaccharomyces. En una realización, las proteínas ADAMTS pueden expresarse en células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células de ave, células de mamífero, y similares. Por ejemplo, en una línea celular humana, una línea celular de hámster o una línea celular murina. En una realización particular, la línea celular es una línea celular CHO, BHK o HEK. En una realización preferida, la línea celular es una línea celular CHO. En una realización específica, se preparan clones de CHO capaces de expresar de manera estable rA13 cotransfectando una célula CHO con secuencias codificantes para rA13 y una dihidrofolato reductasa (por ejemplo, un gen de dhfr murino) y seleccionado para crecimiento en presencia de niveles crecientes de metotrexato
En una realización, las células pueden ser células de mamífero que pueden cultivarse, preferiblemente en un procedimiento de fabricación (es decir, al menos 10 litros, preferiblemente al menos 100 litros), para producir una proteína ADAMTS deseada tal como ADAMTS13. Los ejemplos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR, tal como el subclón DUKX-B11 (CHO, Uriaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CcL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de cáncer de cuello uterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón de perro (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y la línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferiblemente, la línea celular es una línea celular de roedor, especialmente una línea celular de hámster tal como CHO o BHK.
Puede usarse una amplia variedad de vectores para la expresión de una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) y pueden seleccionarse de vectores de expresión en eucariotas y procariotas. En determinadas
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realizaciones, se contempla un vector de plásmido para su uso en la expresión de una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13). En general, se usan vectores de plásmido que contienen secuencias de replicón y de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped en relación con esos huéspedes. El vector puede portar un sitio de replicación, así como secuencias de marcaje que pueden proporcionar selección fenotípica en células transformadas. El plásmido comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida operativamente a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor.
Un método preferido de preparación de clones de células CHO estables que expresan una proteína ADAMTS recombinante es tal como sigue. Se transfecta una línea celular CHO deficiente en DHFR, DUKX-B 11, con un vector de expresión de DHFR para permitir la expresión de la proteína recombinante relevante. Un método a modo de ejemplo se describe en Plaimauer et al. (Blood. 15 de noviembre de 2002;100(10):3626-32. Epub 12 de julio de 2002)). Se lleva a cabo la selección mediante crecimiento en medios libres de hipoxantina/timidina (HT) y se logra la amplificación de la región relevante que codifica para la expresión de la proteína ADAMTS recombinante y el gen de DHFR mediante la propagación de las células en concentraciones crecientes de metotrexato. Cuando resulta apropiado, las líneas celulares CHO pueden adaptarse para crecimiento en medio libre de suero y/o proteínas, esencialmente tal como se describe en el documento US 6.100.061 (Reiter et al, lmmuno Aktiengesellschaft).
En otra realización preferida, se preparan células HEK293 estables transfectando con un constructo que contiene un marcador seleccionable de higromicina y seleccionando transformantes mediante resistencia a antibióticos.
La capacidad de determinados virus para infectar células o para entrar en células a través de endocitosis mediada por receptor y para integrarse en el genoma de la célula huésped y expresar genes virales de manera estable y eficaz ha hecho de ellos candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos extraños al interior de células (por ejemplo, células de mamífero). Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se usa un vector viral para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una célula huésped para su expresión. El vector viral comprenderá una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) unida operativamente a una o más secuencias de control, por ejemplo, un promotor. Alternativamente, el vector viral puede no contener una secuencia de control y en cambio se basará en una secuencia de control dentro de la célula huésped para dirigir la expresión de la proteína ADAMTS. Los ejemplos no limitativos de vectores virales que pueden usarse para suministrar un ácido nucleico incluyen vectores adenovirales, vectores de VAA y vectores retrovirales.
En una realización, un vector de expresión de adenovirus incluye aquellos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para soportar el empaquetamiento del constructo y en última instancia para expresar un constructo de ADAMTS que se ha clonado en el mismo. Los vectores adenovirales permiten la introducción de secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2):535-546, 1992)).
En otra realización, puede usarse un virus adenoasociado (VAA) para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una célula huésped para su expresión. Los sistemas de VAA se han descrito anteriormente y generalmente se conocen bien en la técnica (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3): 141-64, 1994; Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992). Detalles relativos a la generación y el uso de vectores de VAAr se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.139.941 y 4.797.368,
En una realización, puede usarse un vector de expresión retroviral para introducir una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína ADAMTS (por ejemplo, ADAMTS13) en una célula huésped para su expresión. Estos sistemas se han descrito anteriormente y generalmente se conocen bien en la técnica (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas y Rubinstein, En: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez y Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, págs. 494-513, 1988; Temin, En: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, págs. 149-188, 1986). En una realización específica, el vector retroviral es un vector lentiviral (véase, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; patentes estadounidenses n.os 6.013.516 y 5.994.136).
Los ejemplos no limitativos de vectores para expresión en procariotas incluyen plásmidos tales como pRSET, pET, pBAD, etc., en los que los promotores usados en vectores de expresión en procariotas incluyen lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Los ejemplos de vectores para expresión en eucariotas incluyen: (i) para la expresión en levaduras, vectores tales como pAO, pPIC, pYES, pMET, usando promotores tales como aOX1, GAP, GaL1, AUG1, etc.; (ii) para la expresión en células de insecto, vectores tales como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., usando promotores tales como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc., y (iii) para la expresión en células de mamífero, vectores tales como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., y vectores derivados de sistemas virales tales como virus vaccinia, virus adenoasociados, herpesvirus, retrovirus, etc., usando promotores tales como de CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina. Un vector a modo de ejemplo para expresar rA13 lo describen Plaimauer et al. (Blood. 15 de noviembre de 2002;100(10):3626-32. Epub 12 de julio de 2002).
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En determinadas realizaciones, los métodos de cultivo celular de la divulgación pueden comprender el uso de un microportador. La presente divulgación proporciona, entre otros aspectos, métodos de expresión de la proteína ADAMTS a gran escala. En algunas realizaciones, los cultivos celulares de las realizaciones pueden realizarse en grandes biorreactores en condiciones adecuadas para proporcionar áreas superficiales de cultivo específicas de alto volumen para lograr densidades celulares y expresión de proteínas altas. Un medio para proporcionar tales condiciones de crecimiento es usar microportadores para cultivo celular en biorreactores de tanque con agitación. En otra realización, estos requisitos de crecimiento se cumplen a través del uso de un cultivo celular en suspensión.
V. Realizaciones específicas
A. Factor de von Willebrand recombinante (rvWF)
El vWF recombinante puede expresarse en células de mamífero, pero la actividad específica del vWF puede variar ampliamente dependiendo de las condiciones de cultivo celular y no se ha demostrado que sea comparable o igual a la del vWF aislado de plasma sanguíneo. La presente invención se basa en parte en el resultado sorprendente de que los medios de cultivo celular que tienen entre 2,4 pg/l y 20 pg/l de cobre proporcionan un efecto ventajoso de promover la expresión de vWF de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica. En particular, el vWF recombinante de alto peso molecular de la presente invención pueden incluir una forma altamente multimérica que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. Los procedimientos de cultivo celular según la presente invención también permiten mantener bajos niveles de NH4+ (por ejemplo, menos de 10 mM) durante el procedimiento anterior en sistemas de cultivo celular, reduciendo de ese modo los efectos perjudiciales para modificaciones postraducionales. Se cree que la presente invención proporciona por primera vez condiciones de cultivo celular que comprenden un medio que tiene una concentración de cobre adecuada en combinación con niveles apropiados de amonio en el sobrenadante para expresar un vWF altamente multimérico con una alta actividad específica.
En un aspecto, la presente invención se refiere a condiciones de cultivo celular para producir vWF recombinante, de alto peso molecular con una alta actividad específica. Las condiciones de cultivo celular de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular con una concentración de cobre aumentada y/o sobrenadante de cultivo celular con una concentración de amonio (NH4+) baja. La presente invención también proporciona métodos para cultivar células en condiciones de cultivo celular para expresar un vWF de alto peso molecular con una alta actividad específica.
En un aspecto, la presente invención proporciona una disolución de cultivo celular para producir proteína vVW recombinante, de alto peso molecular, comprendiendo la disolución de cultivo celular: un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 4 mM; y una pluralidad de células que expresan proteína vWF altamente multimérica, en la que la proteína vWF comprende una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg.
En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la disolución de cultivo celular comprende un complemento de medio que comprende cobre.
En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, el complemento de medio comprende un hidrolizado, opcionalmente un hidrolizado de soja.
En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, el complemento de medio comprende una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos.
En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.
En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la concentración de cobre es de desde aproximadamente 2,4 pg/l hasta aproximadamente 20 pg /l.
En una realización específica de los cultivos celulares descritos anteriormente, la proteína vWF comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de una proteína vWF recombinante, de alto peso molecular, comprendiendo el método las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprende un ácido nucleico que codifica para proteína vWF recombinante; b) expresar la proteína vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de aproximadamente 4 mM, en el que la proteína vWF es proteína vWF altamente multimérica y
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En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, las células son células de mamífero.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, las células son de una línea celular continua.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, las células son células CHO.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la concentración de cobre es de al menos aproximadamente 4 pg/l.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la concentración de cobre es de desde aproximadamente 2,4 pg/l hasta aproximadamente 20 pg/l.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mü/pg.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de desde aproximadamente 30 mü/pg hasta aproximadamente 100 mü/pg.
En una realización específica de los métodos descritos anteriormente, la proteína vWF recombinante comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros.
En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína vWF recombinante, de alto peso molecular producida mediante un procedimiento, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células que comprende un ácido nucleico que codifica para proteína vWF recombinante; y b) expresar la proteína vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos 2,4 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM, en el que la proteína vWF es proteína vWF altamente multimérica y comprende una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mü/pg.
En una realización específica de las composiciones de rvWF descritas anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mü/pg.
En una realización específica de las composiciones de rvWF descritas anteriormente, la proteína vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de desde aproximadamente 30 mü/pg hasta aproximadamente 100 mü/pg.
En una realización específica de las composiciones de rvWF descritas anteriormente, la proteína vWF recombinante comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros.
En un aspecto, la presente invención proporciona una disolución de cultivo celular para producir proteína vVW recombinante, de alto peso molecular, comprendiendo la disolución de cultivo celular: un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de al menos aproximadamente 2,4 pg/l; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 10 mM; y una pluralidad de células que expresan proteína vWF altamente multimérica, en la que la proteína vWF comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mü/pg.
En un aspecto, la presente invención se refiere a condiciones de cultivo celular para producir vWF recombinante de alto peso molecular que está en forma altamente multimérica con una alta actividad específica. Las condiciones de cultivo celular de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo celular con una concentración de cobre aumentada y sobrenadante de cultivo celular con una concentración de amonio baja (NH4+). La presente invención también proporciona métodos para cultivar células en condiciones de cultivo celular para expresar un vWF de alto peso molecular con una alta actividad específica.
En un aspecto, la presente invención incluye una disolución de cultivo celular para producir vWF recombinante, de alto peso molecular, que comprende un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l; un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 4 mM; y una pluralidad de células que expresan vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mü/pg. En una realización de las disoluciones de cultivo celular descritas anteriormente, al menos el 10 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de
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alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre puede ser de al menos aproximadamente 4 pg/l o la concentración de cobre puede oscilar entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 20 pg/l. En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden un complemento de medio que comprende cobre. En determinadas realizaciones, el complemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre u óxido de cobre. En determinadas realizaciones, las células pueden proceder de una línea celular continua y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En algunas realizaciones, el vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/pg, o la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/pg y aproximadamente 100 mU/pg.
En otro aspecto, la presente invención incluye un método de producción de un vWF recombinante, de alto peso molecular, que comprende a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica para vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de aproximadamente 4 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. En una realización del sobrenadante de cultivo celular descrito anteriormente, al menos el 10 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En algunas realizaciones, las células pueden proceder de una línea celular continua y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre pueden ser de al menos aproximadamente 4 pg/l o la concentración de cobre puede oscilar entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden un complemento de medio que comprende cobre. En determinadas realizaciones, el complemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre u óxido de cobre. En algunas realizaciones, el vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/pg, o la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/pg y aproximadamente 100 mU/pg.
Aún en otro aspecto, la presente invención incluye un vWF recombinante, de alto peso molecular producido mediante un procedimiento, que comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica para vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 4 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mU/pg. En una realización del sobrenadante de cultivo celular descrito anteriormente, al menos el 10 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En algunas realizaciones, las células pueden proceder de una línea celular continua y pueden incluir células de mamífero, tales como células CHO. En determinadas realizaciones, la concentración de cobre pueden ser de al menos aproximadamente 4 pg/l o la concentración de cobre puede oscilar entre aproximadamente 2,4 pg/l y aproximadamente 20 pg/l. En algunas realizaciones, los medios de cultivo celular comprenden un complemento de medio que comprende cobre. En determinadas realizaciones, el complemento de medio puede comprender un hidrolizado o una sal de cobre, quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la sal de cobre puede incluir sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre u óxido de cobre. En algunas realizaciones, el vWF recombinante tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos aproximadamente 50 mU/pg, o la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/pg y aproximadamente 100 mU/pg.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende factor de von Willebrand
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recombinante (rvWF) que tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 30 mü/pg. En una realización preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 40 mü/pg. En una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 50 mü/pg. En una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina
específica de al menos 60 mü/pg. En una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor
de ristocetina específica de al menos 70 mü/pg. Aún en una realización más preferida, la composición tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 80 mü/pg.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, al menos el 10 % del rvWF en la composición está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En una realización específica, al menos el 15 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 20 % del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 25 % del rvWF está presente en un
multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros. En otra realización específica, al menos el 30 %
del rvWF está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición comprende un sobrenadante de cultivo. En una realización específica, el sobrenadante de cultivo es un sobrenadante de cultivo celular de mamífero. En una realización más específica, el sobrenadante de cultivo celular de mamífero es un sobrenadante de células CHO.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el rvWF se expresa en un cultivo celular que comprende más de cobre 2,4 pg/l. En una realización específica, el cultivo celular comprende al menos cobre 4 pg/l. En una realización más específica, el cultivo comprende cobre entre 2,4 pg/l y 20 pg/l. En una realización, el cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En una realización específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo discontinuo.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo continuo. En una realización específica, el cultivo continuo se realiza en modo quimiostático. En otra realización específica, el cultivo continuo se realiza en modo de perfusión.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el nivel de NH4+ en el cultivo se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2,5 x 106 células por ml.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a menos de 2,0 x 106 células por ml.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo se mantiene a menos de 1,5 x 106 células por ml.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el rvWF se coexpresa con factor VIII recombinante (rFVIII). En una realización específica, se ha retirado la mayoría del rFVIII coexpresado. En una realización más específica, la razón de rvWF con respecto a rFVIII en la composición es de al menos 10:1.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición se formula para la administración farmacéutica. En una realización específica, la composición se formula para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición se liofiliza.
Aún en otro aspecto, la presente invención incluye un vWF recombinante, de alto peso molecular producido mediante un procedimiento, que comprende las etapas de: a) proporcionar un cultivo de células; b) introducir una secuencia de ácido nucleico que codifica para vWF; c) seleccionar las células que portan la secuencia de ácido nucleico; y, d) expresar vWF en las células en condiciones de cultivo celular que comprenden un medio de cultivo celular que comprende una concentración de cobre de entre 2,4 pg/l y 20 pg/l y un sobrenadante de cultivo celular que comprende una concentración de amonio de menos de 4 mM, en el que el vWF es vWF altamente multimérico que comprende de aproximadamente 14 a aproximadamente 22 dímeros y una actividad de ristocetina específica de al menos aproximadamente 30 mü/pg. Se entiende que todas las realizaciones y concentraciones descritas en las secciones de “Medios de cultivo celular” y “Métodos de producción de vWF recombinante” anteriores pueden
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aplicarse en este caso.
El vWF recombinante de la presente invención puede incluir una proteína vWF recombinante de alto peso molecular que tiene una alta actividad específica. En una realización, el vWF de la presente invención es una forma altamente multimérica de vWF. En algunas realizaciones, la forma altamente multimérica de vWF incluye al menos hasta aproximadamente 14 dímeros y en otras realizaciones al menos hasta aproximadamente 22 dímeros. Aún en otras realizaciones, la forma altamente multimérica de vWF puede oscilar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 dímeros, o entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 dímeros, o entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 dímeros. En determinadas realizaciones, el vWF recombinante es comparable a vWF plasmático.
Tal como se describe en el presente documento, la presente invención proporciona el resultado sorprendente de que la concentración de cobre aumentada en medios de cultivo celular puede producir vWF de alto peso molecular con alta actividad específica. Los medios de cultivo celular que comprenden una concentración de cobre, por ejemplo, mayor de aproximadamente 2,4 pg/l pueden aumentar el rendimiento del vWF multimérico recombinante, en comparación con medios sin cobre. En determinadas realizaciones, el porcentaje de vWF multimérico (es decir, rvWF que comprende al menos 2 dímeros) puede ser mayor de aproximadamente el 50 %, o mayor de aproximadamente el 75 %, o mayor de aproximadamente el 90 %. La distribución multimérica del vWF puede analizarse usando técnicas convencionales tales como, por ejemplo, en electroforesis en agarosa en condiciones no reductoras.
Tal como se proporciona en el presente documento, el vWF recombinante producido mediante los métodos de la presente invención puede tener una alta actividad específica, por ejemplo, una alta actividad de cofactor de ristocetina específica. En una realización, el vWF recombinante producido mediante los métodos de la presente invención puede incluir una actividad de cofactor de ristocetina específica de al menos 30 mU/pg y en otra realización de al menos 50 mU/pg. En otras realizaciones, la actividad de cofactor de ristocetina específica puede oscilar entre aproximadamente 30 mU/pg y aproximadamente 100 mU/pg o entre aproximadamente 50 mU/pg y aproximadamente 100 mU/pg.
B. ADAMTS13 recombinante (rA13) de la presente divulgación
Las proteínas ADAMTS (es decir, de ADAMTS-1 a ADAMTS-20) son una familia de cinc-metaloproteinasas secretadas que comparten una organización de dominios modulares común (para revisión, véase, Flannery C.R., Front Biosci. 1 de enero de 2006;11:544-69). Todas las proteínas ADAMTS comparten una arquitectura de dominio central común que consiste en un péptido señal, seguido por un prodominio, un dominio catalítico de metaloproteinasa dependiente de cinc, un dominio similar a desintegrina, una repetición de trombospondina de tipo I, un dominio rico en cisteína y un dominio espaciador (Apte S.S., J Biol Chem. 13 de noviembre de 2009;284(46):31493-7). Adicionalmente, todas excepto AdAmTS-4 contienen al menos un dominio más de repetición de trombospondina de tipo I, y muchas de las proteínas ADAMTS contienen uno o más dominios auxiliares complementarios. De manera notable, se ha notificado que todas las proteínas ADAMTS parecen contener al menos un sitio de unión a calcio y al menos un sitio de unión a cinc ubicados dentro del dominio catalítico de metaloproteinasa (Andreini et al., J. Proteome Res., 2005, 4 (3), págs. 881-888).
Se han notificado los papeles biológicos para las proteínas ADAMTS para diversas enfermedades y estados, incluyendo, antiangiogénesis, fibrosis intersticial renal, remodelación ósea, foliculogénesis de ovario, aterosclerosis, desarrollo genitourinario y crecimiento/remodelación tumoral (ADAMTS-1); síndrome de Ehler-Danlos de tipo 7C y dermatopraxis bovina (ADAMTS-2); artritis, aterosclerosis y tendinopatía (ADAMTS-4); artritis y glioblastoma (ADAMTS-5); artritis (ADAMTS-7); antiangiogénesis, tumores malignos cerebrales, artritis y aterosclerosis (ADAMTS-8); artritis (ADAMtS-9, -12); púrpura trombótica trombocitopénica (aDaMTS-13); y antitrombosis/accidente cerebrovascular (ADAMTS18) (para revisión, véase, Lin y Liu, Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131).
ADAMTS13 (A13) recombinante se ha expresado antes en células de mamífero, sin embargo la actividad específica varía ampliamente dependiendo de las condiciones de cultivo celular. Se ha encontrado que muchos medios de cultivo disponibles comercialmente no son suficientes para la expresión de A13 con altas actividades específicas, expresadas como la razón de actividad, medida mediante el ensayo de FRETS-VWF73, con respecto al contenido de antígenos, tal como se determina mediante ELISA. En un aspecto, los métodos proporcionados en el presente documento se basan en varios hallazgos ventajosos que permiten la expresión de cultivo celular de rA13 que tiene niveles aumentados de actividad total y específica.
Por consiguiente, debido a la relación estructura-función compartida entre la familia ADAMTS de metaloproteinasas secretadas, los métodos proporcionados por la presente divulgación permiten la expresión de todas las proteínas ADAMTS en cultivo celular y la recuperación del medio celular.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que comprende ADAMTS 13 recombinante
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En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el rA13 tiene una actividad mediante FRETS-vWF específica de al menos 800 mü/pg.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición comprende un sobrenadante de cultivo. En una realización específica, el sobrenadante de cultivo es un sobrenadante de cultivo celular de mamífero. En una realización más específica, el sobrenadante de cultivo celular de mamífero es un sobrenadante de células CHO.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el rA13 se expresa en un cultivo celular que comprende al menos cobre 1 pg/l. En una realización específica, el cultivo celular comprende al menos cobre 2 pg/l. En una realización más específica, el cultivo comprende cobre entre 2 pg/l y 20 pg/l.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cobre se proporciona como una sal de cobre, un quelato de cobre, o una combinación de los mismos. En una realización específica, la sal de cobre se selecciona del grupo que consiste en sulfato de cobre, acetato de cobre, carbonato de cobre, cloruro de cobre, hidróxido de cobre, nitrato de cobre y óxido de cobre.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo discontinuo.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el cultivo celular es un cultivo continuo. En una realización específica, el cultivo continuo se realiza en modo quimiostático. En otra realización específica, el cultivo se realiza en modo de perfusión.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el nivel de NH4+ en el cultivo se mantiene a una concentración por debajo de 5 mM.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, el nivel de NH4+ en el cultivo se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM.

En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la densidad celular del cultivo se mantiene a

menos de 4,0 x 106 células por ml. En una realización específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a

menos de 3,0 x 106 células por ml. En una realización específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a

menos de 2,0 x 106 células por ml. En una realización más específica, la densidad celular del cultivo se mantiene a
menos de 1,5 x 106 células por ml.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición se formula para administración farmacéutica. En una realización específica, la composición se formula para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.
En una realización de las composiciones descritas anteriormente, la composición se liofiliza.
VI. Formulaciones
En un aspecto, las formulaciones que comprenden las proteínas terapéuticas recombinantes rvWF o rA13 de la presente invención se liofilizan antes de la administración. La liofilización se lleva a cabo usando técnicas comunes en la técnica y debe optimizarse para la composición que está desarrollándose [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) y Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].
Los métodos de preparación de formulaciones farmacéuticas pueden incluir una o más de las siguiente etapas: añadir un agente de estabilización tal como se describe en el presente documento a dicha mezcla antes de liofilizar, añadir al menos un agente seleccionado de un agente de carga, un agente de regulación de la osmolaridad y un tensioactivo, cada uno de los cuales es tal como se describe en el presente documento, a dicha mezcla antes de la liofilización. En un aspecto, una formulación liofilizada está compuesta por uno o más de un tampón, un agente de carga y un estabilizador. En este aspecto, la utilidad de un tensioactivo se evalúa y se selecciona en casos en los que la agregación durante la etapa de liofilización o durante la reconstitución se convierte en un problema. Se incluye un agente tamponante apropiado para mantener la formulación dentro de zonas estables de pH durante la liofilización.
La práctica de reconstitución convencional para material liofilizado es añadir de nuevo un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI) (normalmente equivalente al volumen retirado durante la liofilización), aunque en ocasiones se usan disoluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de productos farmacéuticos para la administración parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de composiciones de vWF recombinante reconstituidas que comprenden la etapa de añadir un diluyente a una composición de vWF recombinante liofilizada de la invención.
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El material liofilizado puede reconstituirse como una disolución acuosa. Una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyección, agua con conservantes para el uso en dosis múltiples, o agua con cantidades apropiadas de tensioactivos (por ejemplo, una suspensión acuosa que contiene el principio activo en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas). En diversos aspectos, tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo y sin limitación, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes que son un fosfátido que se produce manera natural, por ejemplo y sin limitación, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo y sin limitación, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo y sin limitación, heptadecaetil-eneoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooletato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo y sin limitación monooleato de polietilensorbitano. En diversos aspectos, las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo y sin limitación, etilo, o n-propilo, p- hidroxibenzoato.
Para administrar las composiciones a humanos o animales de prueba, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las expresiones “farmacéuticamente” o “farmacológicamente” aceptable se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de proteínas tal como productos de agregación y escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas cuando se administran usando vías bien conocidas en la técnica, tal como se describe a continuación. Los “portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción y similares, clínicamente útiles, incluyendo los agentes divulgados anteriormente.
Las formulaciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, oral, tópica, transdérmica, parenteral, mediante pulverización por inhalación, vaginal, rectal o mediante inyección intracraneal. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal, o técnicas de infusión. También se contempla la administración mediante inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser perjudiciales para el receptor.
Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones se llevan a cabo con niveles de dosis y regímenes que se seleccionan por el médico que atiende. Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada depende del tipo de enfermedad que va a tratarse, de la gravedad y del transcurso de la enfermedad, de si el fármaco se administra por fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica del paciente y de la respuesta al fármaco, y de la opinión del médico especialista.
En un aspecto, las formulaciones de la invención se administraron mediante un bolo inicial seguido por una infusión continua para mantener niveles circulantes terapéuticos del producto farmacológico. Como otro ejemplo, el compuesto inventivo se administra como una dosis única. Los expertos habituales en la técnica optimizarán fácilmente las dosificaciones eficaces y los regímenes de administración tal como se determina por la buena práctica médica y el estado clínico del paciente individual. La frecuencia de la dosificación depende de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y de la vía de administración. La formulación farmacéutica óptima la determina un experto en la técnica dependiendo de la vía de administración y de la dosificación deseada. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712. Tales formulaciones influyen en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo, y la tasa de aclaramiento in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la vía de administración, se calcula una dosis adecuada según el peso corporal, el área de superficie corporal y el tamaño del órgano. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse a través del uso de ensayos establecidos para determinar dosificaciones en concentración sanguínea conjuntamente con datos de dosis-respuesta apropiados. El régimen de dosificación final lo determina el médico especialista, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la capacidad de respuesta del paciente, la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. A modo de ejemplo, una dosis típica de un vWF recombinante de la presente invención es de aproximadamente 50 U/kg, igual a 500 pg/kg. A medida que se realicen estudios, surgirá más información con respecto a los niveles de dosificación apropiados y la duración del tratamiento para diversas enfermedades y estados.
VII. Métodos de tratamiento de la presente divulgación
La presente divulgación contempla además métodos de tratamiento de un paciente que necesita rvWF o rA13 producidos según los métodos descritos en el presente documento. Tales métodos de tratamiento pueden incluir la administración de formulaciones farmacéuticas que comprenden la rA13 recombinante o el vWF recombinante, de alto peso molecular de la presente divulgación.
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En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratamientos terapéuticos o profilácticos que comprenden la administración de una composición de rvWF o rA13 proporcionada en el presente documento. Generalmente, para aplicaciones terapéuticas, las formulaciones se administran a un sujeto con una enfermedad o estado asociado con una disfunción de ADAMTS 13 o vWF o que en cualquier caso necesita los mismos, en una “dosis terapéuticamente eficaz.” Las formulaciones y las cantidades eficaces para sus usos dependerán de la gravedad de la enfermedad o estado y del estado general de salud del paciente. Las administraciones individuales o múltiples de las formulaciones pueden administrarse dependiendo de la dosificación y la frecuencia requeridas y toleradas por el paciente.
En una realización, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o estado asociado con una disfunción de AdAmTS13 o vWF. En una realización adicional, las formulaciones farmacéuticas que comprenden vWF recombinante pueden administrarse para tratar enfermedades relacionadas con vWF, tal como la enfermedad de von Willebrand o la hemofilia. En otra realización, la divulgación proporciona métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o estado asociado con la formación y/o la presencia de uno o más trombos, que comprende la administración de una composición de rA13 proporcionada en el presente documento. En otra realización, la divulgación proporciona métodos de disgregar uno o más trombos en un sujeto que lo necesita. Aún en otras realizaciones, la divulgación proporciona métodos de tratamiento o prevención de un infarto en un sujeto que lo necesita. Generalmente, los métodos proporcionados por la divulgación comprenden administrar una composición de rADAMTS13 tal como se proporciona en el presente documento a un sujeto que lo necesita.
Los ejemplos no limitativos de trastornos asociados con la formación y/o la presencia de uno o más trombos son púrpura trombocitopética trombótica (TTP) hereditaria, TTP adquirida, trombosis arterial, infarto de miocardio agudo (AMI), accidente cerebrovascular, septicemia y coagulación intravascular diseminada (DIC).
Los ejemplos no limitativos de trastornos asociados con un infarto, incluyen sin limitación, infarto de miocardio (ataque cardiaco), embolia pulmonar, acontecimientos cerebrovasculares tales como accidente cerebrovascular, enfermedad oclusiva arterial periférica (tal como gangrena), síndrome antifosfolipídico, septicemia, arteritis de células gigantes (GCA), hernia y vólvulo.
VIII. Ejemplos
Ahora se ilustrará adicionalmente la presente invención en los siguientes ejemplos, sin limitarse a los mismos. Ejemplo 1
Se realizaron experimentos de cultivo celular continuo usando cultivos de una línea celular CHO recombinante que expresaba vWF. El medio basal era DMEM/F12, que contenía aproximadamente 0,3 pg/l de Cu2+. Se complementó el medio con hidrolizado de soja y sulfato de cobre (CuSO4'5H2O) para llevar la concentración de cobre final en el medio a más de al menos 2,4 pg/l.
Se cultivaron células CHO recombinantes que expresaban vWF mediante cultivos celulares continuos de modo que los niveles de amonio (NH4+) se mantuvieron a una concentración de menos de aproximadamente 10 mM. Se encontró que los sistemas de producción que proporcionaban un suministro continuo de medio (por ejemplo, cultivos por perfusión o quimiostato) eran preferibles porque las técnicas convencionales discontinuas o semicontinuas producían concentraciones altas de NH4+ al final del cultivo. Al final del cultivo, se aisló el vWF altamente multimérico y se midió la actividad de cofactor de ristocetina específico del vWF.
Ejemplo 2
Se coexpresaron factor VIII recombinante (rFVIII) y factor de von Willebrand (rvWF) en cultivos discontinuos de células GD8/6 para determinar el efecto de la composición del medio de cultivo sobre la expresión y actividad de vWF. En resumen, se sometieron células GD8/6 a cultivo discontinuo en medio BAV-SP compuesto por un polvo basal de DMEM/F12 modificado (tabla 5) y complementos adicionales que también contenían 4 g/l de hidrolizado de soja, véase la tabla 6, con y sin complementación con cobre adicional. Para someter a prueba el efecto de concentraciones bajas de cobre sobre la expresión y actividad de rvWF, se usaron medios BAV-SP basales. Los medios basales contenían 0,3 pg/l de cobre y se complementaron con hidrolizado de soja, lo que contribuyó 0,7 pg/l adicionales de cobre, tal como se determinó experimentalmente, proporcionando una concentración de cobre final de 1,0 pg/l. En comparación, los medios BAV-SP usados para los cultivos discontinuos se complementaron adicionalmente con 3,3 pg/l adicionales de Cu2+, proporcionando una concentración de cobre final de 4,3 pg/l, para determinar el efecto de concentraciones altas de cobre sobre la expresión y actividad de vWF.
Medio BAV-SP
Componentes
mg/l
Aminoácidos
L-Alanina
4,45
L-Arginina HCl
147,50
L-Asparagina-H2O
30,21
L-Ácido aspártico
6,65
L-Cisteína HCPH2O
32,55
L-Cistina 2HCl
57,35
L-Ácido glutámico
7,35
Glicina
18,75
L-Histidina-H2O HCl
31,48
Hidroxi-L-Prolina
L-Isoleucina
54,47
L-Leucina
59,05
L-Lisina HCl
91,25
L-Metionina
17,24
L-Fenilalanina
35,48
L-Prolina
52,24
L-Serina
26,25
L-Treonina
53,45
L-Triptófano
29,01
L-Tirosina 2Na 2H2O
55,79
L-Valina
52,85
Vitaminas
Ácido ascórbico
3,499
Biotina
0,0035
Cloruro de colina
8,980
D-Pantotenato de Ca
2,240
Ácido fólico
2,650
L-Inositol
12,600
Nicotinamida
2,020
Piridoxina HCl
2,031
Riboflavina
0,219
Tiamina HCl
2,170
Vitamina B12
0,680
Sales inorgánicas
Cloruro de calcio (CaCh)
116,600
Sulfato de cobre (CuSO4-5H2O)
0,0013
Nitrato férrico (Fe(NO3)3-9H2O)
0,050
Sulfato ferroso (FeSO4-7H2O)
0,417
Cloruro de magnesio (MgCh)
28,640
Sulfato de magnesio (MgSO4)
48,840
Cloruro de potasio (KCl)
311,800
Cloruro de sodio (NaCl)
6995,500
Fosfato de sodio (Na2HPO4)
71,020
Fosfato de sodio (NaH2PO4)
62,500
Sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4-7H2O)
0,432
Selenito de sodio
0,0131
Otros
D-Glucosa
3151
Ácido linoleico
0,042
Ácido lipoico
0,105
Putrescina 2HCl
0,081
Timidina
0,365
Hipoxantina Na
2,390
Piruvato de sodio
55,000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Componentes para formulación final
L-Glutamina
600,00
Etanolamina
1,530
Synperonic F68
250,000
Bicarbonato de sodio (NaHCOa)
2000,000
Peptona de soja
4000,00
Formulación total
18596,8
Se hicieron crecer células GD8/6 que expresaban rvWF o bien en medios con bajo contenido en cobre (tabla 7) o medios con alto contenido en cobre (tabla 8) durante 7 días. Tras 2 días se subcultivaron los cultivos para realizar un cultivo discontinuo durante un periodo de 5 días. Se sometieron a prueba diariamente muestras del sobrenadante de cultivo para determinar el contenido en rvWF (ELISA de vWF), total (ristocetina) y específico (actividad específica) mediante un ensayo de cofactor de ristocetina. También se monitorizaron diariamente diversos parámetros de cultivo, incluyendo recuento celular, viabilidad celular y concentración de amonio (excepto por los días 3 y 4 de lote).
De manera inesperada, cultivos celulares que se hicieron crecer con concentraciones altas de cobre produjeron sobrenadantes que contenían significativamente más actividad de rvWF total y específica (compárense los resultados de la tabla 7 y la tabla 8). Por ejemplo, en el día 4 de lote, el cultivo celular que se hizo crecer con una concentración alta de cobre contenía 1,52 UI de actividad de rvWF/ml, en comparación con 0,2 UI de actividad de rvWF/ml para el cultivo con bajo contenido en cobre. Esto era así a pesar del hecho de que el cultivo celular con bajo contenido en cobre produjo casi el doble de la cantidad de rvWF que el cultivo celular con alto contenido en cobre. Además, la actividad específica del sobrenadante obtenido a partir del cultivo con alto contenido en cobre era más de 13 veces superior a la del sobrenadante de cultivo con bajo contenido en cobre (831 mU/10 pg de rvWF frente a 62 mU/10 pg de rvWF).
Tal como se observa en la tabla 7 y la tabla 8, la actividad de cofactor de ristocetina específico y total del cultivo con alto contenido en cobre era el doble de la del cultivo con bajo contenido en cobre en el día 1 de lote. Además, a diferencia de los aumentos posteriores de la actividad observados en el cultivo con alto contenido en cobre, no se observó ningún aumento en la cantidad de actividad de cofactor de ristocetina tras el día 1 de lote para el cultivo celular con bajo contenido en cobre. De manera que concuerda con este resultado, el análisis por electroforesis en gel de agarosa del estado multimérico de rvWF reveló que estaba presente una concentración baja de rvWF de alto peso molecular, con respecto a la concentración de especies de rvWF de bajo peso molecular, en el sobrenadante del cultivo celular con bajo contenido en cobre en el día 1 de lote, y que la concentración relativa disminuyó adicionalmente a lo largo del tiempo (figura 1A y 1B). En cambio, la complementación del medio de cultivo con Cu2+ dio como resultado una formación sistemática de antígeno activo de cofactor de ristocetina (RiCoF) a lo largo del cuarto día. Sistemáticamente, no se produjo ninguna pérdida en la cantidad de multímeros de rvWF de alto peso molecular estables a lo largo del día 4 del cultivo discontinuo (figura 1A y 1B). Los resultados densitométricos del gel de electroforesis de agarosa mostrados en la figura 1B revelaron que en condiciones de bajo contenido en cobre el cultivo sólo podía producir una población de rvWF en la que más de 10 % (es decir, el 16,3 %) del rvWF estaba presente en moléculas que tenían más de 10 dímeros durante un día del cultivo discontinuo (es decir muestra de “día 3” en el carril 2 del gel de agarosa de la figura 1A), y de manera notable, esta población disminuyó hasta tan sólo el 4 % en el día 5 del cultivo discontinuo (muestra de “día 7” en el carril 6). En cambio, en condiciones de alto contenido en cobre la cantidad relativa de multímeros de vWF con más de 10 dímeros es sistemáticamente de aproximadamente el 30 % a lo largo del día 4 del cultivo discontinuo (de “día 3” a “día 6” en los carriles 7-10; del 28 % al 31,4 %).
De manera notable, comenzando en el día 5 de lote del cultivo discontinuo con alto contenido en cobre, cuando los niveles de NH4+ superaron 100 mg/l (más de aproximadamente 5,0 mM), la expresión de antígeno adicional (de 18,3 a 35,4 pg/l; compárense los días 4 y 5 de lote de la tabla 8) no dieron como resultado un aumento concomitante en la actividad de RiCoF presente en el sobrenadante. De manera que concuerda con este resultado, el nivel de multímeros de rvWF de alto peso molecular en el día 5 de lote (día 7 del cultivo) disminuyó con respecto a la concentración de multímeros de rvWF de bajo peso molecular. También sólo en el día 5 de lote (muestra de “día 7” del cultivo en el carril 11) la cantidad relativa del vWF con más de 10 dímeros se reduce hasta el 21,4 %.
Tomados en conjunto, los datos proporcionados anteriormente demuestran que la complementación de concentraciones de cobre en cultivos celulares que expresan rvWF aumenta drásticamente la actividad de cofactor de ristocetina rvWF total y específico, así como la producción estable de multímeros de rvWF de alto peso molecular. Además, los datos muestran una correlación entre la presencia de concentraciones altas de NH4+ en el cultivo celular y la pérdida de actividad de cofactor de ristocetina rvWF y producción de multímeros de rvWF de alto peso molecular.
5
10
15
20
25
30
día de lote
Recuento celular [10E6 células/ml] NH4+ [mg/l] Viabilidad [ %] ELISA de vWF [pg/ml] Ristocetina [UI/ml] Actividad específica, mU/10 pg
0
0,42 21 98,8 n.d. n.d. n.d.
1
0,78 43 n.d. 6,3 0,23 365
2
1,24 64 99,1 12,8 0,23 180
3
1,86 n.d. n.d. 22,7 0,21 93
4
2,49 n.d. n.d. 32,2 0,20 62
5
3,11 106 98,3 44,4 0,20 45
Tabla 8. Expresión de rvWF en cultivo celular de mamífero realizado en modo discontinuo usando medios BAV-SP con una concentración alta de cobre (4,3 pg/l).
día de lote
Recuento celular [10E6 células/ml] NH4+ [mg/l] Viabilidad [%] ELISA de vWF [pg/ml] Ristocetina [UI/ml] Actividad específica, mU/10 pg
0
0,40 21 99,3 n.d. n.d. n.d.
1
0,71 42 n.d. 4,8 0,40 833
2
1,23 63 99,5 8,7 0,62 713
3
1,85 n.d. n.d. 15,0 1,07 713
4
2,54 n.d. n.d. 18,3 1,52 831
5
3,32 109 98,9 35,4 1,55 438
Ejemplo 3
Se coexpresaron factor VIII recombinante (rFVIII) y factor de von Willebrand (rvWF) en cultivos continuos de células GD8/6 realizados en condiciones quimiostáticas para determinar el efecto de la composición del medio de cultivo sobre la expresión y actividad de vWF. En resumen, se cultivaron células GD8/6 en medio BAV-SP que contenía 4 g/l de hidrolizado de soja con y sin complementación con cobre tal como se describió en el ejemplo 2. Para someter a prueba el efecto de concentraciones bajas de cobre sobre la expresión y actividad de rvWF, se usaron medios BAV-SP basales. Los medios basales contenían 0,3 pg/l de cobre y se complementaron con hidrolizado de soja, lo que contribuyó 0,7 pg/l adicionales de cobre, proporcionando una concentración de cobre final de 1,0 pg/l. Como comparación, se complementaron adicionalmente los medios BAV-SP usados para los cultivos discontinuos con 3,3 pg/l adicionales de Cu2+, proporcionando una concentración de cobre final de 4,3 pg/l, para determinar el efecto de concentraciones altas de cobre sobre la expresión y actividad de vWF. Se cultivaron cultivos que se hicieron crecer en presencia de concentraciones altas y bajas de cobre con densidades celulares tanto alta (2,8 x 106 células/ml) como baja (apr. 1,4 x 10E06 células/ml).
Como anteriormente, se sometieron a prueba muestras del sobrenadante de cultivo para determinar el contenido en rvWF (ELISA de vWF), actividad total (ristocetina) y específica (actividad específica) mediante un ensayo de cofactor de ristocetina. También se monitorizaron diversos parámetros de cultivo, incluyendo recuento celular, viabilidad celular y concentración de amonio. Se generaron datos a partir de la fase en estado estacionario de las semanas 2 y 3 de los cultivos con quimiostato (de tabla 9 a tabla 13).
Tabla 9. Datos medios para la expresión de rvWF en cultivo celular quimiostático durante las semanas 2 y 3.
Recuento celular
Concentración de cobre Recuento celular [10E6 células/ml] NH4+ [mM] Viabilidad [%] ELISA de vWF [pg/ml] Ristocetina [UI/ml] actividad específica [mU/10 pg]
alto
baja 2,88 3,88 97,74 44,56 0,10 21,62
alto
alta 2,79 4,04 98,25 38,38 0,19 53,11
bajo
baja 1,55 3,33 98,63 18,96 0,10 50,16
bajo
alta 1,43 3,17 98,59 11,76 0,70 598,76
Tabla 10. Expresión de rvWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de alto recuento celular, bajo contenido en cobre durante las semanas 2 y 3.
Día
Recuento celular [10E6 células/ml] NH4+ [mM] Viabilidad [%] ELISA de vWF [mg/ml] Ristocetina [UI/ml] actividad específica [mU/10 ugl
8
2,54 3,7 98,20 39,8 0,095 23,86934673
9
3,02 4,2 97,40
10
2,97 3,9 97,90 41,3 0,095 23,00242131
11
2,78
13
2,91 3,8 97,60 41,7 0,095 22,78177458
14
2,90 3,8 97,40
15
3,05 3,9 97,70 44,7 0,095 21,25279642
16
2,99 3,8 98,30
17
2,76 3,9 97,40 55,3 0,095 17,17902351
2,88 3,88 97,74 44,56 0,10 21,62
5 Tabla 11. Expresión de rvWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de alto recuento celular, alto contenido en cobre durante las semanas 2 y 3.
Día
Recuento celular [10E6 células/ml] NH4+ [mM] Viabilidad [ %] ELISA de vWF [pg/ml] Ristocetina [UI/ml] actividad específica [mU/10 ug]
8
2,52 3,9 98,30 31,8 0,35 110,0628931
9
2,92 4,3 98,50
10
2,80 4,2 98,60 37,4 0,32 85,56149733
11
2,57
13
2,81 3,9 98,50 37,6 0,095 25,26595745
14
2,92 3,9 97,80
15
2,77 3,9 97,80 43,0 0,095 22,09302326
16
2,72 4,0 98,30
17
3,04 4,1 98,20 42,1 0,095 22,56532067
2,79 4,04 98,25 38,38 0,19 53,11
Tabla 12. Expresión de rvWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de bajo recuento celular, bajo contenido 10 en cobre durante las semanas 2 y 3.
Día
Recuento celular [10E6 células/ml] NH4+ [mM] Viabilidad [%] ELISA de vWF [pg/ml] Ristocetina [UI/ml] actividad específica [mU/10 ug]
8
1,61 3,3 99,10 19,3 0,095 49,22279793
9
1,65 3,3 98,00
10
1,49 3,3 98,90 18,6 0,095 51,07526882
11
1,58
13
1,58 3,4 98,10 18,1 0,095 52,48618785
14
1,56 3,3 99,30
15
1,52 3,3 98,50 18,9 0,095 50,26455026
16
1,50 3,3 98,40
17
1,50 3,4 98,70 19,9 0,095 47,73869347
1,55 3,33 98,63 18,96 0,10 50,16
Tabla 13. Expresión de rvWF en cultivo celular quimiostático en condiciones de bajo recuento celular, alto contenido en cobre durante las semanas 2 y 3.
15
Día
Recuento celular [10E6 células/ml] NH4+ [mM] Viabilidad [%] ELISA de vWF [pg/ml] Ristocetina [UI/ml] actividad específica [mU/10 ug]
8
1,46 3,2 98,80 11,6 0,73 629,3103448
9
1,45 3,2 98,20
10
1,37 3,1 98,90 11,0 0,7 636,3636364
11
1,43
13
1,33 3,2 98,10 11,1 0,68 612,6126126
14
1,39 3,2 97,20
5
10
15
20
25
30
35
15
1,51 3,2 99,70 12,4 0,69 556,4516129
16
1,49 3,2 98,60
17
1,43 3,2 99,20 12,7 0,71 559,0551181
1,43 3,17 98,59 11,76 0,70 598,76
Tal como se muestra en la figura 2A, el sobrenadante recogido de cultivo celular de rvWF continuo que se hizo crecer a bajas densidades celulares y altas concentraciones de cobre contenía alta actividad específica (promedio de 600 mU/10 pg), mientras que el sobrenadante recogido de cultivos celulares de rvWF que se hicieron crecer a altas densidades celulares en presencia de concentraciones altas o bajas de cobre y cultivos celulares de rvWF que se hicieron crecer a baja densidad celular en presencia de concentración baja de cobre contenían bajas actividades específicas (menos de 100 mU/10 pg). De manera que concuerda con los resultados observados para cultivos discontinuos, la figura 2B muestra que los cultivos celulares de mamífero continuos que expresan rvWF con altas actividades específicas tienen concentraciones de NH4+ menores que los cultivos que producen rvWF con bajas actividades específicas. Estos datos refuerzan adicionalmente la correlación entre la concentración de NH4+ en el cultivo celular y la actividad específica de rvWF producida por el cultivo. De manera notable, la combinación de concentración alta de cobre y concentración baja de amonio en el cultivo celular permitida para la producción mejoró significativamente la actividad de rvWF.
De manera que concuerda con este resultado, el análisis mediante electroforesis en gel de agarosa del estado multimérico de rvWF de cultivos con quimiostato (figura 6) reveló que sólo los sobrenadantes de cultivos realizados a alto contenido en cobre y baja densidad celular y por tanto bajo contenido en amonio dieron como resultado una expresión sistemática alta de vWF multimérico (aproximadamente del 23 % al 27 % en el día 8, 17 y 24 de CST en los carriles 4, 8 y 12, respectivamente). Ninguna de las demás condiciones alcanza sistemáticamente altas cantidades de más del 10 % de vWF con más de 10 dímeros a lo largo de un periodo de cultivo prolongado.
Ejemplo 4 (referencia)
Para determinar el efecto de la concentración de cobre en medios de cultivo sobre la expresión y actividad específica de rA13, se hicieron crecer cultivos celulares de mamífero que expresaban rA13 durante 4 semanas en condiciones de cultivo continuo quimiostático en medio ADAMTS 13 que comprendía medios basales DMEM/F12 modificados BESP845 y complementos adicionales (tabla 14) que contenían concentraciones de cobre que oscilaban entre 0,66 pg/l (sin complementación adicional de cobre) y con complementación adicional de cobre hasta 4 pg/l. Tal como se muestra en la tabla 15, aumentar la concentración de cobre en los medios de cultivo celular dio como resultado un aumento significativo de la productividad volumétrica (P) y específica (q) expresada como la actividad de rA13 total producida por litro de cultivo y día y la actividad de rA13 total producida por célula y día, respectivamente.
Tabla 14. Composición de medio ADAMTS13.
DMEM/F12 BESP845
Aminoácidos
mg/l
L-Alanina
13,3500
L-Arginina HCl
147,5000
L-Asparagina-H2O
45,1600
L-Ácido aspártico
19,9500
L-Cisteína HCFH2O
32,5500
L-Cistina 2HCl
102,3500
L-Ácido glutámico
22,0500
Glicina
26,2500
L-Histidina-H2O HCl
51,4800
L-Isoleucina
74,4700
L-Leucina
119,0500
L-Lisina HCl
146,2500
L-Metionina
100,0000
L-Fenilalanina
60,4800
L-Prolina
63,7400
L-Serina
36,7500
L-Treonina
53,4500
L-Triptófano
29,0100
L-Tirosina 2Na 2H2O
75,7900
L-Valina
82,8500
sales
mg/l
Cloruro de calcio (CaCh)
116,6000
Sulfato de cobre (CuSO4,5H2O)
0,0026
Nitrato férrico (Fe(NO3)3-9H2O)
0,0500
Sulfato ferroso (FeSO4-7H2O)
1,0170
Cloruro de magnesio (MgCh)
28,6400
Sulfato de magnesio (MgSO4)
48,8400
Cloruro de potasio (KCl)
311,8000
Cloruro de sodio (NaCl)
5495,5000
Na2HPO4 anhidro
213,0200
NaH2PO4 anhidro
54,3500
Sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4- 27H2O)
0,4320
Selenito de sodio anhidro
0,0087
Vitaminas
mg/l
Ácido ascórbico
3,4990
Biotina
0,2035
Cloruro de colina
26,9800
D-Pantotenato de Ca
6,2400
Ácido fólico
6,6500
L-Inositol
36,6000
Nicotinamida
7,0200
Piridoxina HCl
6,0310
Riboflavina
0,6590
Tiamina HCl
6,5100
Vitamina B12
2,6800
varios
mg/l
D-Glucosa
5000,0000
Ácido linoleico
0,0420
Ácido lipoico
1,0050
Putrescina 2HCl
3,6810
Timidina
0,3650
Hipoxantina Na
2,3900
Piruvato de sodio
55,0000
DMEM/F12 BESP845: Total
12738,3
Suplementos de medio ADAMTS-13
mg/l
L-Glutamina
1300,0000
Pluronic F68
1000,0000
Etanolamina
1,5300
ZnSO4*7 H2O
1,0000
Hidrogenocarbonato de Na
1500,0000
Total de complementos
3802,5
Cantidad total de componentes
16540,8
Para determinar si las concentraciones de cobre aumentadas afectaban a la integridad de la rA13 expresada, se examinó sobrenadante recogido de cultivos celulares de rA13 que se hicieron crecer en medios que contenían 0,66 pg/l, 1 pg/l y 4 pg/l de cobre mediante análisis de SDS-PAGE. Tal como se observa en la figura 3A (tinción con 5 plata) y la figura 3B (inmunotransferencia de tipo Western anti-A13), no se observó ningún cambio evidente en la calidad de producto mediante electroforesis en gel. Específicamente, ningún aumento en el nivel de variantes de rA13 de 170 kD truncada u otras variantes de bajo Pm y ninguna otra banda de HCP adicional o aumentada resultaron de la expresión de rA13 en presencia de concentraciones de cobre aumentadas.
10 Para estimar una concentración de cobre óptima sobre la actividad de rA13, una extrapolación de datos de la tabla 15 de P Frets frente a la concentración de cobre (figura 4) muestra que el efecto óptimo se alcanza probablemente a aproximadamente 2 pg/l, con una estimación conservadora de un efecto negativo por encima de aproximadamente 4 pg/l.
Escala de 10 l Experimento de I+D Media de 4 semanas de CST
ZZ-NC P Frets q Frets Actividad espec.
[10E6 células/ml]
[U/(l*d)] [U/(10E9 células*d)] U/mg
0,66 pg/l Cu2+
1,35 1322 1028 1759
1 pg/l Cu2+
1,64 1962 1247 1690
4 pg/l Cu2+
2,26 2960 1338 1768
5 Basándose en los resultados obtenidos anteriormente, se realizó un experimento adicional que comparó la expresión de rA13 en medios de cultivo celular que contenían 0,66 pg/l de cobre con 2,0 pg/l de cobre. Tal como se muestra en la tabla 16, la complementación de los medios celulares basales con cobre, con una concentración final de 2,0 pg/l de cobre, dio como resultado un aumento significativo de la productividad volumétrica (P) y específica (q) expresada como actividad de rA13 total producida por litro de cultivo y día y la actividad de rA13 total producida por célula y día, 10 respectivamente, a lo largo de un periodo de 8 semanas. Los datos específicos para cada semana de producción de rA13 en los dos cultivos se muestran en la figura 5. A partir de estos datos, queda claro que la complementación con cobre tiene un efecto beneficioso medible sobre el metabolismo celular, la tasa de crecimiento específica y la productividad de rA13.
15 Tabla 16. Expresión de rA13 en cultivo celular de mamífero realizado en modo de cultivo continuo quimiostático usando medios que contienen concentraciones variables de cobre.
Escala de 10 l Media de 8 semanas de CST
ZZ-NC P Frets q Frets Actividad espec.
[10E6 células/ml]
[U/(l*d)] [U/(10E9 células*d)] U/mg
0,66 pg/l Cu2+
1,29 1049 821 1862
2 pg/l Cu2+
2,17 2470 1146 1749
Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritos en el presente documento son únicamente con fines 20 ilustrativos y que a los expertos en la técnica se les ocurrirán diversas modificaciones o cambios a la vista de los mismos y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
1. Método para producir una composición de factor de von Willebrand recombinante (rvWF), comprendiendo el método las etapas de:
(a) proporcionar medios de cultivo celular basales;
(b) complementar los medios de cultivo celular basales con cobre para proporcionar una concentración de cobre final de entre cobre 2,4 pg/l y 20 pg/l;
(c) proporcionar una o más células que comprenden un ácido nucleico que codifica para una proteína rvWF;
(d) cultivar la una o más células en los medios de cultivo celular complementados con cobre de manera que el rvWF se expresa en y se excreta de las células en un sobrenadante de cultivo en el que el contenido de NH4+ del sobrenadante de cultivo celular se mantiene a una concentración por debajo de 4 mM; y
(e) recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo,
en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 30 mU/pg de rvWF.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de complementar los medios de cultivo celular basales con un hidrolizado antes de cultivar la una o más células.
3. Método según la reivindicación 2, en el que el hidrolizado es un hidrolizado de plantas o un hidrolizado de soja.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los medios de cultivo celular basales son medios de cultivo libres de proteínas animales, medios de cultivo libres de proteínas o medios de cultivo definidos químicamente.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de cobre final de los medios de cultivo celular basales complementados con cobre es al menos cobre 4 pg/l.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la una o más células son células de mamífero, preferiblemente células CHO.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que cultivar la una o más células comprende el cultivo discontinuo de las células o comprende el cultivo continuo de las células.
8. Método según la reivindicación 7, en el que el cultivo continuo de células se realiza en modo quimiostático o en modo de perfusión.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la una o más células se cultivan en al menos 100 l de los medios de cultivo celular basales complementados.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la densidad celular se mantiene a menos de 2,5 * 106 células por ml durante la etapa de cultivar la una o más células, menos de 2,0 * 106 células por ml durante la etapa de cultivar la una o más células, o menos de 1,5 * 106 células por ml durante la etapa de cultivar la una o más células.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa de recuperar al menos una parte del sobrenadante de cultivo comprende filtración o centrifugación para retirar células de la parte del sobrenadante de cultivo.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 40 mU/pg de rvWF.
13. Método según la reivindicación 12, en el que el sobrenadante recuperado tiene una actividad de cofactor de ristocetina específica para rvWF de al menos 50 mU/pg de rvWF, al menos 60 mU/pg de rvWF, al menos 70 mU/pg de rvWF, o al menos 80 mU/pg de rvWF.
14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que al menos el 10 %, el 20 % o el 30 % del rvWF en el sobrenadante está presente en un multímero de vWF de alto peso molecular de más de 10 dímeros.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el sobrenadante contiene multímeros de vWF de alto peso molecular de 14 a 22 dímeros.
5 16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que rvWF se coexpresa con factor VIII
recombinante (rFVIII).
17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el método comprende además una etapa de enriquecimiento de rvWF.
10
ES11736502.3T 2010-07-08 2011-07-08 Método de producción de vWF recombinante de alto peso molecular en cultivo celular Active ES2664392T3 (es)

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