TWI609890B

TWI609890B - 在細胞培養物中生產重組ａｄａｍｔｓ１３的方法

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Publication number: TWI609890B
Application number: TW100124394A
Authority: TW
Inventors: 李奧波葛里柏格; Leopold Grillberger; 曼福烈萊特; Manfred Reiter; 丹尼爾福萊尚德; Daniel Fleischanderl; 葛列格布朗伯格; Gregor Bramberger
Original assignee: 巴克斯歐塔公司; Baxalta Incorporated; 巴克斯歐塔有限公司; Baxalta GmbH
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2018-01-01
Also published as: JP2016025873A; AU2018200206B2; KR102027991B1; CO6680636A2; ES2761692T3; CN107286235A; BR112013000515A2; DK3064508T4; US10100099B2; KR101924120B1; TW201204744A; EP3064508B1; HRP20180136T1; US10822394B2; AU2011274467A1; EA035147B1; HRP20181657T1; TWI670073B; EP3626736A1; CN103097409A

Abstract

在其他態樣中，本發明係關於用於生產高分子量vWF，特別是具有高比活性之高度多聚WF及具有高比活性之ADAMTS13的細胞培養條件。本發明之細胞培養條件可包括例如具有增加之銅濃度的細胞培養基及/或具有低銨(NH₄ ⁺)濃度之細胞培養物上清液。本發明亦提供在細胞培養條件中培養細胞以表現具有高比活性之高分子量vWF及rA13的方法。

Description

在細胞培養物中生產重組ADAMTS13的方法

【申請案之交叉引用】

本申請案主張2010年7月8日申請之美國臨時專利申請案第61/362,635號之優先權，其揭示內容在此出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。

本發明係關於用於生產高分子量vWF及ADAMTS13的細胞培養條件以及在細胞培養條件中培養細胞以表現高分子量vWF及rA13的方法。

在細胞培養物(尤其大規模細胞培養物)，包括真核細胞培養物且更特定言之哺乳動物細胞培養物中治療性蛋白質之重組表現需要使用專用培養基，其提供使細胞有效生長之營養物質。細胞培養基調配物通常補充有多種添加劑，包括胎牛血清(FCS)、源自動物之蛋白質及/或牛來源之蛋白質水解產物以及自植物或酵母獲得之蛋白質水解產物。該等培養物所面臨之一個挑戰為，蛋白質量及所產生蛋白質之總活性及比活性通常隨不同細胞培養物而變化，即使是在細胞培養基之調配物未改變時。該變化性在利用10公升至超過20,000公升體積之細胞培養物之大規模製程情況下尤其明顯。含有水解產物之細胞培養基尤其傾向於在不同細胞培養物之間變化，從而引起總蛋白質產量降低以及總活性及比活性降低。

引起不同細胞培養物間變化性之一可能原因為不同批料間添加劑(諸如水解產物)中之污染物不同。通常，血清或血清衍生物質(諸如白蛋白、轉鐵蛋白或胰島素)可包含不欲試劑，其可污染細胞培養物及由其獲得之生物產品。此外，必須對人類血清衍生之添加劑進行所有已知病毒(包括可經由血清傳輸之肝炎病毒及HIV)之測試。此外，牛血清及其衍生產物具有BSE污染之風險。此外，所有血清衍生產物均可受未知物質污染。當在細胞培養物中使用自人類或動物來源獲得之血清或蛋白質添加劑時，存在許多問題(例如不同批料之組成物之品質不同以及黴漿菌(Mycoplasma)、病毒或BSE之污染風險)，尤其在細胞用以製造供人類投予之藥物或疫苗時。因此，已多次嘗試提供無需血清或其他動物蛋白質化合物之宿主系統及培養條件。

該等無血清培養基已基於自植物或酵母獲得之蛋白質萃取物研發。舉例而言，已知大豆水解產物適用於醱酵過程且可加強許多營養苛求之生物體、酵母及真菌之生長。WO 96/26266描述大豆粉木瓜蛋白酶消化產物為碳水化合物及氮之來源且許多組分可用於組織培養。Franek等人(Biotechnology Progress(2000) 16,688-692)描述所界定之大豆及小麥水解產物肽部分之生長及生產力促進作用。

WO 96/15231揭示一種無血清培養基，其由合成最小必需培養基及酵母萃取物構成，用於脊椎動物細胞繁殖及病毒生產過程。WO 98/15614中揭示一種培養基調配物，其由包含米肽及酵母萃取物及其酶消化物及/或植物脂質之基本細胞培養基構成，供動物細胞生長。WO 01/23527中揭示一種用於培養重組細胞之包含純化之大豆水解產物的培養基。WO 00/03000揭示一種包含大豆水解產物及酵母萃取物，但亦需要存在動物蛋白質之重組形式(諸如生長因子)之培養基。

EP-A-0 481 791描述一種用於培養經工程改造之CHO細胞之生物化學限定培養基，其不含自動物來源分離之蛋白質、脂質及碳水化合物，進一步包含重組胰島素或胰島素類似物、1%至0.025% w/v經木瓜蛋白酶消化之大豆蛋白腖及腐肉鹼。WO 98/08934描述一種無血清真核細胞培養物，其包含水解之大豆肽(1-1000 mg/L)、0.01至1 mg/L腐肉鹼及多種源自動物之組分，包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素及其他蛋白質。在此情形下，應注意，亦已知標準培養基中包含腐肉鹼，例如DMEM/漢氏F12(Ham's F12)中濃度為0.08 mg/L。

然而，植物及/或酵母水解產物為寡肽與其他未知組分及污染物之未限定混合物。此外，市售水解產物批料之品質差異極大。因此，重組蛋白或病毒產物之生產隨所用水解產物批料(「批料間變化」)而極大變化(多達3種因素之變化)。此缺陷影響細胞增殖及各細胞之蛋白質表現。US 2007/0212770描述多種不含動物蛋白質且不含寡肽之化學限定培養基，其適用於重組蛋白生物醫藥劑之大規模生產。

止血涉及各種止血反應途徑之相互作用，最終引起血栓形成。血栓為血管壁表面上血液組分之沈積物，其主要由聚集之血小板及不溶性交聯血纖維蛋白組成。血纖維蛋白形成為凝血酶(凝結血之酶)對血纖維蛋白原之限制蛋白水解作用的結果。凝血酶為凝血級聯反應(活化血小板及白血球及多種血管細胞表面上發生之一連串酶原活化)之最終產物(關於評述參見K. G. Mann等人,Blood,1990,第76卷，第1-16頁)。

凝血級聯反應之一重要功能在於藉由活化因子IX(因子IXa)及活化因子VIII(因子VIIIa)之複合物活化因子X。該複合物之組分缺失或功能異常與稱為血友病之血液病有關(J. E. Sadler及E. W. Davie: Hemophilia A,Hemophilia B,and von Willebrand's Disease,G. Stamatoyannopoulos等人(編): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders公司,Philadelphia,1987,第576-602頁)。A型血友病與因子VIII活性缺失有關，而B型血友病則與因子IX缺失有關。當前治療由使用包含正常凝血因子之醫藥製劑之替代療法組成。該等血小板病中，A型血友病更為常見，約10,000人中即有1人患此病。A型血友病患者中之替代療法包含藉由靜脈內輸注來重複投予含有正常因子VIII之製劑。輸注之間的時間間隔與血液循環中因子VIII活性之降級呈函數關係。輸注後因子VIII活性之半衰期隨各個體而變化，在10至30小時範圍內。因此，預防性療法需要每2天至3天輸注一次。此對血友病患者之生命造成沉重負擔，特別是，為靜脈內輸注而頻繁針穿刺後局部檸檬酸化(citratization)會使靜脈通路不暢通。

若可藉由使用半衰期延長之因子VIII來降低輸注頻率則將尤其有利。應瞭解，在此項技術中，非活化因子VIII雜二聚體之半衰期強烈依賴於馮威里氏因子(von Willebrand Factor)之存在，該因子對因子VIII(而非因子VIIIa)呈現強親和力且充當載體蛋白(J. E. Sadler及E. W. Davie: Hemophilia A,Hemophilia B and von Willebrand's disease,G. Stamatoynnopoulos等人(編): The molecular basis of blood diseases. W.B. Saunders公司,Philadelphia,1987,第576-602頁)。已知罹患III型馮威里氏病(von Willebrand's disease)之患者的血液循環中無可偵測之馮威里氏因子，其亦罹患繼發性因子VIII缺失。此外，該等患者中靜脈內投予之因子VIII之半衰期為2至4小時，顯著短於在A型血友病患者中觀測到的10至30小時。由該等發現，得知因子VIII傾向於自血液循環快速清除且該過程在某種程度上受與其天然載劑(馮威里氏因子)之複合作用抑制。

馮威里氏因子(vWF)為在血漿中循環之呈大小典型地在約500至20,000 kD(或2至40個vWF二聚體)範圍內之一系列多聚體形式的醣蛋白。vWF之二聚體及多聚體形式由藉由二硫鍵連接在一起的250 kD多肽次單元構成。vWF介導受損血管壁之內皮下膜之初始血小板附著；僅較大多聚體亦呈現止血活性。多聚化VWF經由VWF之A1域中的相互作用結合於血小板表面醣蛋白Gp1bα以促進血小板附著。假設內皮細胞隱藏vWF之大型聚合形式且彼等具有低分子量之vWF形式(低分子量vWF)由蛋白裂解產生。具有大分子質量之多聚體儲存於內皮細胞之懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade body)中且在刺激後釋放。

由vWF蛋白含量降低或FVIII結合親和力降低引起之FVIII結合活性降低會引起3種類型之馮威里氏病中的一種。或者或此外，某些類型之馮威里氏病之特性在於Gp1bα介導之血小板締合程度提高或降低，亦即於2A型、2B型及2M型馮威里氏病中(概述於Castaman等人,Disorders of Hemostasis 88(1):94-108(2003)中)。因此，調節vWF與FVIII及Gp1bα兩者之相互作用為治療血友病與馮威里氏病之可行策略。

鑒於vWF之生物學重要性，在此項技術中始終需要改良生產用於治療應用之vWF的方法。熟知可自內源來源(諸如人類血漿)分離vWF。分離之vWF之優點在於其具有高比活性供執行其生物功能，因可有效用作治療性蛋白質供治療相關疾病，諸如馮威里氏病。典型地，血漿vWF具有約100 mU/μg之利黴素(Ristocetin)比活性，但自人類血漿之分離具有缺點，因為例如血漿可含有多種可轉移至患者之病毒，諸如HIV及/或肝炎病毒。此外，血漿為有限資源，因此血漿短缺為提供足夠vWF用於治療中存在的問題。因此，生產vWF之重組方法宜解決一些與依賴於血漿作為vWF來源有關的問題。對於重組生產，選殖vWF之全長cDNA；多肽對應於全長前原vWF之胺基酸殘基23至764(Eikenboom等人(1995) Haemophilia 1,77 90)。

不幸地，vWF為具有複雜的轉譯後修飾之分子。此外，高爾基氏體中vWF二聚體多聚化成大型及超大型多聚體對在哺乳動物細胞中表現而言為一個挑戰。舉例而言，在例如人類(初生)內皮細胞之細胞培養物中表現的高分子量vWF依賴於懷布爾-帕拉德體中超大型vWF分子之比儲存量。該等細胞培養物不適用於生產治療性蛋白質。已報導其他細胞培養方法且已知細胞培養條件可以多種方式影響vWF生產。舉例而言，已表明高濃度銨(NH₄ ⁺)可干擾轉譯後修飾。Mayadas等人(J. Biol. Chem.,264(23):13497-13503,1989)證明25 mM含量銨會引起內皮細胞中vWF多聚化降低，其亦不利地影響重組vWF之利黴素比活性。多聚化降低通常與重組vWF之活性(尤其利黴素比活性)降低有關。

仍然難以預測哪些參數正面或負面影響特定蛋白質，尤其複雜醣蛋白(例如因子VIII及vWF)之產生。舉例而言，已表明細胞培養基之某些組分影響因子VIII之產生。如美國專利第5,804,420號中揭示，添加多元醇、銅及其他微量金屬可正面影響因子VIII之產率。亦如WO 2009/086309中描述，已表明使用銅之細胞培養過程改良因子VIII之產生。此外，Mignot等人(1989)報導重組CHO細胞中vWF之表現。然而，該等實例均未提供關於vWF之比活性或其多聚分佈之資訊。

ADAMTS(具有I型凝血栓蛋白基元之去整合素及金屬蛋白酶)蛋白質為含有大量保守域之金屬蛋白酶家族，該等保守域包括鋅依賴性催化域、半胱胺酸富集域、去整合素樣域及至少一個且在大多數情況下多個I型凝血栓蛋白重複序列(關於評述參見Nicholson等人，BMC Evol Biol.2005年2月4日；5(1)：11)。在進化上而言，該等蛋白質與金屬蛋白酶之ADAM及MMP家族有關(Jones GC,Curr Pharm Biotechnol.2006年2月；7(1)：25-31)，其為與許多疾病及病狀有關聯之分泌酶，該等疾病及病狀包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)(Moake JL,Semin Hematol.2004年1月；41(1)：4-14)、結締組織病症、癌症、炎症(Nicholson等人)及嚴重惡性瘧原蟲型瘧疾(Larkin等人，PLoS Pathog.2009年3月；5(3)：e1000349)。由於該等關聯性，故將ADAMTS酶視作許多病狀之潛在治療目標(Jones GC,Curr Pharm Biotechnol.2006年2月；7(1)：25-31)。因此，需要以高產率生產具有高比活性之ADAMTS蛋白質的方法，該等ADAMTS蛋白質不含諸如病毒、BSE及病原體(例如黴漿菌細菌)之污染物。

一個ADAMTS家族成員ADAMTS13使殘基Tyr 1605與Met 1606之間的馮威里氏因子(vWF)裂解，用以引起活體內大型vWF多聚體降解。ADAMTS13活性損失與許多病狀有關聯，諸如TTP(Mo ake JL,Semin Hematol.2004年1月；41(1)：4-14)、急性及慢性炎症(Chauhan等人，J Exp Med.2008年9月1日；205(9)：2065-74)且最近發現亦與嚴重惡性瘧原蟲型瘧疾有關聯(Larkin等人，PLoS Pathog.2009年3月；5(3)：e1000349)。

ADAMTS13蛋白酶為主要由肝臟產生之190kDa醣基化蛋白(Levy等人，Nature.2001；413：488-494；Fujikawa等人，Blood.2001；98：1662-1666；Zheng等人，J Biol Chem.2001；276：41059-41063；Soejima等人，J Biochem(Tokyo).2001；130：475-480；及Gerritsen等人，Blood.2001；98：1654-1661)。與高級rVWF多聚體極其類似，哺乳動物細胞培養物中大型ADAMTS13之重組表現面臨許多挑戰。

因此，需要提供細胞培養條件，尤其大規模生產培養條件，其在不同細胞培養物中提供一致的總蛋白質產率及/或一致的所產生蛋白質之總活性及比活性。大規模製造製程中培養物之間的一致性對治療性蛋白質之製造而言具有重要性。亦需要一種大規模生產rVWF之細胞培養條件，所生產之rVWF具有多聚分佈且利黴素比活性可與VWF在正常人類血漿中存在時相當或高於VWF在正常人類血漿中存在時。類似地，由於ADAMTS蛋白質與許多疾病及病狀有關，所以此項技術中需要大規模生產具有高比活性且適於醫藥調配及投予之重組ADAMTS蛋白質的方法。本發明滿足此項技術中對生產重組馮威里氏因子及重組ADAMTS13的該等及其他需要。

在某些態樣中，本發明係基於意外發現補充用於表現重組馮威里氏因子(rVWF)及重組ADAMTS13(rA13)之細胞培養基可顯著改良蛋白質表現及酶活性。

在第一態樣中，本發明提供一種生產重組馮威里氏因子(rVWF)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少2.4 μg/L；(c)提供一或多種包含編碼rVWF蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rVWF表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之上清液之rVWF的利黴素輔因子比活性為至少30 mU/μg rVWF。

在以上提供之方法之一具體實例中，該方法進一步包含在培養該一或多種細胞前向基本細胞培養基中補充水解產物之步驟。

在以上提供之方法之一具體實例中，水解產物為植物水解產物。在一特定具體實例中，水解產物為大豆水解產物。

在以上提供之方法之一具體實例中，基本細胞培養基為不含動物蛋白質之培養基。

在以上提供之方法之一具體實例中，基本細胞培養基為不含蛋白質之培養基。

在以上提供之方法之一具體實例中，基本細胞培養基為化學限定培養基。

在以上提供之方法之一具體實例中，補充銅之基本細胞培養基之最終銅濃度為至少4 μg/L銅。

在以上提供之方法之一具體實例中，補充銅之基本細胞培養基之最終銅濃度介於2.4 μg/L與20 μg/L銅之間。

在以上提供之方法之一具體實例中，補充基本細胞培養基之銅以銅鹽、銅螯合物或其組合形式提供。

在以上提供之方法之一具體實例中，銅鹽係選自由硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅及氧化銅組成之群。

在以上提供之方法之一具體實例中，該一或多種細胞為哺乳動物細胞。在一特定具體實例中，哺乳動物細胞為CHO細胞。

在以上提供之方法之一具體實例中，培養該一或多種細胞包含分批培養細胞。

在以上提供之方法之一具體實例中，培養該一或多種細胞包含連續培養細胞。在一特定具體實例中，以恆化模式(chemostatic mode)連續培養細胞。在另一特定具體實例中，以灌注模式連續培養細胞。

在以上提供之方法之一具體實例中，在至少100 L經補充之基本細胞培養基中培養一或多種細胞。

在以上提供之方法之一具體實例中，在培養一或多種細胞之步驟期間維持細胞密度小於2.5×10⁶個細胞/毫升。

在以上提供之方法之一具體實例中，在培養一或多種細胞之步驟期間維持細胞密度小於2.0×10⁶個細胞/毫升。

在以上提供之方法之一具體實例中，在培養一或多種細胞之步驟期間維持細胞密度小於1.5×10⁶個細胞/毫升。

在以上提供之方法之一具體實例中，回收至少一部分培養物上清液之步驟包含過濾或離心以自該培養物上清液部分移除細胞。

在以上提供之方法之一具體實例中，回收之上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少40 mU/μg rVWF。在一特定具體實例中，回收之上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更特定具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少60 mU/μg rVWF。在一更特定具體實例中，回收之上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。在又一更特定具體實例中，回收之上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少80 mU/μg rVWF。

在以上提供之方法之一具體實例中，上清液中至少10% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在一特定具體實例中，至少15% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少20% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少25% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少30% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。

在以上提供之方法之一具體實例中，上清液含有具有14至22個二聚體之高分子量VWF多聚體。

在以上提供之方法之一具體實例中，維持培養物上清液之NH4⁺含量於低於10 mM之濃度下。

在以上提供之方法之一具體實例中，維持培養物上清液之NH4⁺含量於低於4 mM之濃度下。

在以上提供之方法之一具體實例中，rVWF與重組因子VIII(rF VIII)共表現。在一特定具體實例中，該方法進一步包含純化rVWF以除去回收之上清液中存在之至少50%rFVIII的步驟。在一具體實例中，純化步驟後rVWF與rFVIII之比率為至少10：1。

在以上提供之方法之一具體實例中，該方法進一步包含rVWF富集步驟。

在第二態樣中，本發明提供藉由本文中提供之方法製備之重組馮威里氏因子(rVWF)組成物。

在以上提供之組成物之一具體實例中，該組成物進一步包含重組因子VIII(rFVIII)。在一特定具體實例中，rVWF與rFVIII之比率為至少10：1。

在以上提供之組成物之一具體實例中，組成物經調配以用於醫藥投予。在一特定具體實例中，組成物經調配以用於靜脈內投予。

在第三態樣中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少1.0 μg/L；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。

在以上提供之方法之一具體實例中，經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度為至少1 μg/L銅。

在以上提供之方法之一具體實例中，經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度為至少2 μg/L銅。

在以上提供之方法之一具體實例中，經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度為至少4 μg/L銅。

在以上提供之方法之一具體實例中，經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度介於1 μg/L與6 μg/L銅之間。

在以上提供之方法之一具體實例中，經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度介於2 μg/L與4 μg/L銅之間。

在以上提供之方法之一具體實例中，補充基本細胞培養基之銅以銅鹽、銅螯合物或其組合形式提供。在一特定具體實例中，銅鹽係選自由硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅及氧化銅組成之群。

在以上提供之方法之一具體實例中，培養該一或多種細胞包含連續培養細胞。在一特定具體實例中，以恆化模式連續培養細胞。在另一特定具體實例中，以灌注模式連續培養細胞。

在以上提供之方法之一具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。

在以上提供之方法之一具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。

在以上提供之方法之一具體實例中，回收之上清液之rA13 FRETS-VWF73比活性為至少1600 mU/μg。

在以上提供之方法之一具體實例中，維持培養物上清液之NH4⁺含量於低於10mM之濃度下。

在以上提供之方法之一具體實例中，維持培養物上清液之NH4⁺含量於低於4mM之濃度下。

在以上提供之方法之一具體實例中，該方法進一步包含rA13富集步驟。

在第四態樣中，本發明提供藉由根據上述方法中之任一方法製備的重組ADAMTS13(rA13)組成物。

I.前言

可藉由在大規模哺乳動物細胞培養物中表現來生產重組vWF(rVWF)及重組ADAMTS13(rA13)。然而，當使用標準細胞培養條件生產時，即使通用培養基調配物未變化，該等蛋白質之活性通常亦隨細胞培養物而變化，且重組蛋白質之比活性通常不等於自血漿獲得之vWF及rA13之比活性。此外，在哺乳動物細胞培養物中表現之rVWF傾向於產生具有低(10%以下)百分比之高級多聚體(高級多聚體包括含有超過10個VWF二聚體之分子)的蛋白質組成物。rVWF及rA13之標準生產方法中之該等缺陷在開發用於大規模生產之培養物(亦即10至超過20,000公升培養物)時尤其成問題。

不同細胞培養物批料中通常發現之變化性之一可能原因為細胞培養基之組分中存在污染物。不同批料中可能存在不同量的該等污染物，引起rVWF及rA13生產中之變化結果。在研究於各種細胞培養基添加劑中發現之不同污染物後，本發明者發現水解產物之存在會引起細胞培養基中銅濃度變化。深入研究得出以下驚人之結果：細胞培養基中補充銅濃度使得總銅濃度為至少約1μg/L至約20μg/L可始終增加rVWF及rA13之總活性及比活性及/或亦可引起總蛋白質產率增加。因此，本發明提供用於高產率生產具有高比活性之rVWF及rA13蛋白質之方法及組成物。

在一態樣中，本發明提供用於生產大量活性與血漿衍生vWF(pdVWF)或血漿衍生ADAMTS13(pdA13)相當或高於血漿衍生vWF或血漿衍生ADAMTS13之rVWF及rA13的細胞培養方法及組成物。在其他態樣中，根據本發明產生之rVWF及rA13蛋白質展示活性始終比使用標準細胞培養方法於未補充銅或本文中進一步詳述之其他補充物的培養基中產生之蛋白質高。有利的是，在本文中提供之方法及組成物之某些具體實例中，根據本發明產生之rVWF及rA13蛋白質展示比活性(亦即U/mg蛋白質)始終比使用標準細胞培養方法於未補充銅或本文中進一步詳述之其他補充物的培養基中產生之蛋白質高。類似地，本文中提供之用於產生rVWF及rA13之方法與利用未補充銅或本文中進一步詳述之其他補充物的培養基之標準細胞培養方法相比，每體積培養物之活性產率(亦即U/L/D)更高。

在另一態樣中，本發明提供細胞培養方法，其中向基本細胞培養基中補充銅，使得總濃度為至少約1 μg/L。在其他具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得總濃度為至少約2 μg/L。在其他具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得總濃度為至少約1 μg/L至約20 μg/L。在一些具體實例中，銅之總濃度為約1.5-4.5 μg/L。在某些具體實例中，補充細胞培養基，達到約1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/L銅或20 μg/L銅以上。基本細胞培養基通常具有低於1μg/L之微量銅濃度。

在一些具體實例中，本發明提供細胞培養方法，其中向基本細胞培養基中補充約1.0 μg/L至約20 μg/L銅以用於產生rVWF。在其他具體實例中，向基本細胞培養基中補充約1.5-15、2.0-10、2.5-8、3.0-6、4.0-5.0 μg/L銅以用於產生rVWF。在其他具體實例中，除補充之銅外，基本細胞培養基亦可包括一或多種水解產物。

在其他具體實例中，本發明提供細胞培養方法，其中向基本細胞培養基中補充約1.5 μg/L至約4 μg/L銅以用於產生rA13。在其他具體實例中，向基本細胞培養基中補充約1.6-3.8、1.7-3.6、1.8-3.4、1.9-3.2、2.0-3.0、2.1-2.8、2.2-2.6、2.3-2.4 μg/L銅以用於產生rA13。在其他具體實例中，除補充之銅外，基本細胞培養基亦可包括一或多種水解產物。在其他具體實例中，除銅及/或一或多種水解產物外，基本細胞培養基亦包括約1.0 μM至約30 μM鋅。在其他具體實例中，除銅及/或一或多種水解產物及/或鋅外，基本細胞培養基進一步包括約0.5 mM至約5.0 mM鈣。

在其他態樣中且根據任一上述態樣，本發明提供細胞培養方法，其中細胞培養溶液之銨含量較低(低於10 mM)。在某些具體實例中，本發明之細胞培養方法利用具有超過1、2、3、4或5 μg/L銅及較低含量之銨的細胞培養基。

本發明之方法及組成物之一優點為其可勝任大規模細胞培養物生產。該等大規模細胞培養物為至少10 L、50 L、100 L、150 L、200 L、250 L、500 L、750 L、1,000 L、1,500 L、2,000 L、5,000 L、10,000 L或20,000公升培養物。

在某些態樣中，本發明之方法不一定產生總量更高之重組蛋白質，但所產生之重組蛋白質(rVWF或rA13)展示總活性及比活性比使用標準細胞培養物產生之蛋白質，尤其於細胞培養基未補充額外銅之細胞培養物中產生之蛋白質高。在其他態樣中，於補充銅之培養基中培養之細胞中產生的rVWF及rA13蛋白質與於未補充銅之基本細胞培養基中培養之細胞相比，展示每公升細胞培養物之活性始終提高。在其他態樣中，本發明之補充銅之培養基與未補充銅之培養基相比，蛋白質產率增加、培養物中細胞數目增加及/或每公升培養物之總活性提高。

本發明之方法及組成物之其他優點為其可產生含有高百分比(超過10%)之高度多聚rVWF之蛋白質群。

儘管本文中關於ADAMTS蛋白質之大部分論述係關於ADAMTS13(A13)，但應瞭解，因為所有ADAMTS蛋白質享有共同核心域架構及共同結構-功能關係，所以本文中所描述之方法及組成物適用於生產任何ADAMTS蛋白質，而不僅僅限於rA13。

II.定義

如本文中所用，「重組vWF」包括經由重組DNA技術獲得之vWF。在某些具體實例中，本發明之vWF蛋白質可包含構築體，例如1986年10月23日公開之WO 1986/06096及1990年7月23日以Ginsburg等人名義申請之美國專利申請案第07/559,509號(其關於生產重組vWF之方法的內容以引用的方式併入本文中)中製備之構築體。本發明之vWF可包括所有可能形式，包括單體形式及多聚體形式。亦應瞭解，本發明涵蓋不同形式之vWF組合使用。舉例而言，本發明之vWF可包括不同多聚體、不同衍生物及生物活性衍生物與非生物活性衍生物。

術語「重組」在關於例如細胞或核酸、蛋白質或載體使用時指示細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由引入異源核酸或蛋白質或改變原生核酸或蛋白質而修飾，或自經如此修飾之細胞獲得細胞。因此，舉例而言，重組細胞表現在細胞之原生(非重組)形式內未發現之基因或表現以其他方式異常表現、表現不足或完全未表現之原生基因。

在本發明之上下文中，重組vWF涵蓋來自例如哺乳動物(諸如靈長類動物、人類、猴、兔、豬、齧齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬、貓)之vWF家族之任何成員及其生物活性衍生物。在一較佳具體實例中，重組VWF為人類VWF。亦涵蓋具有活性之突變及變異vWF蛋白質以及vWF蛋白質之功能片段及融合蛋白質。此外，本發明之vWF可進一步包含有助於純化、偵測或兩者之標籤。本文中所描述之vWF可進一步經治療性部分或適於活體外或活體內成像之部分修飾。

術語「高度多聚vWF」、「高分子量vWF」及「HMW VWF」可互換使用且係指含有超過10個VWF二聚體之共價連接之vWF多聚體。在某些具體實例中，HMW VWF含有至少11個VWF二聚體或至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或22個以上VWF二聚體。

如本文中所用，「ADAMTS蛋白質」係指具有I型凝血栓蛋白基元之去整合素及金屬蛋白酶之多肽的金屬蛋白酶家族。該家族之成員包括人類蛋白質ADAMTS1(NM_006988)、ADAMTS2(NM_014244；NM_021599)、ADAMTS3(NM_014243)、ADAMTS4(NM_005099)、ADAMTS5(NM_007038)、ADAMTS6(NM_014273)、ADAMTS7(NM_0142727)、ADAMTS8(NM_007037)、ADAMTS9(NM_182920；NM_182921；NM_020249)、ADAMTS10(NM_030957)、ADAMTS12(NM_030955)、ADAMTS13(NM_139025；NM_139026；NM_139027；NM_139028)、ADAMTS14(NM_139155；NM_080722)、ADAMTS15(NM_139055)、ADAMTS16(NM_139056)、ADAMTS17(NM_139057)、ADAMTS18(NM_199355；NM_139054)、ADAMTS19(NM_133638)及ADAMTS20(NM_025003、NM_175851)。ADAMTS蛋白質包括全長蛋白質與顯示至少部分生物活性，例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上由全長蛋白質顯示之活性(特別是由全長蛋白質顯示之蛋白酶活性)的部分多肽。在某些情況下，ADAMTS蛋白質將例如藉由酶方式或化學方式在活體內或活體外進行轉譯後修飾。應瞭解，本發明之ADAMTS蛋白質包括經交替剪接之同功異型物、經保守修飾之蛋白質、實質上相同之蛋白質、同系物及其類似物。

在本發明之上下文中，ADAMTS蛋白質涵蓋來自例如哺乳動物(諸如靈長類動物、人類、猴、兔、豬、齧齒動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬、貓)之ADAMTS家族之任何成員及其生物活性衍生物。亦涵蓋具有活性之突變及變異ADAMTS蛋白質以及ADAMTS蛋白質之功能片段及融合蛋白質。此外，本發明之ADAMTS蛋白質可進一步包含有助於純化、偵測或兩者之標籤。本文中所描述之ADAMTS蛋白質可進一步經治療性部分或適於活體外或活體內成像之部分修飾。

如本文中所用，「ADAMTS13蛋白質」係指任何具有ADAMTS13活性，尤其使VWF之殘基Tyr-842與Met-843之間的肽鍵裂解之能力的蛋白質或多肽。在一例示性具體實例中，ADAMTS13蛋白質係指胺基酸序列與NP_620594(ADAMTS13同功異型物1，前原蛋白)或NP_620594之胺基酸75至1427(ADAMTS13同功異型物1，成熟多肽)高度類似的多肽。在另一具體實例中，ADAMTS13蛋白質係指胺基酸序列與NP_620596(ADAMTS13同功異型物2，前原蛋白)或NP_620594之胺基酸75至1371(ADAMTS13同功異型物2，成熟多肽)高度類似的多肽。在又一具體實例中，ADAMTS13蛋白質包括胺基酸序列與NP_620595(ADAMTS13同功異型物3，前原蛋白)或NP_620595之胺基酸75至1340(ADAMTS13同功異型物1，成熟多肽)高度類似的多肽。如本文中所用，ADAMTS13蛋白質包括具有vWF裂解活性之天然變異體及具有vWF裂解活性之人造構築體。如本發明中所用，ADAMTS13涵蓋任何保留一些基本活性之天然變異體、替代性序列、同功異型物或突變蛋白質。人類群體中發現之ADAMTS13突變之實例包括(但不限於)R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T196I、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1123C、C1213Y、T1226I、G1239V、R1336W，已發現其中多者與血栓性血小板減少性紫癜(TTP)有關。ADAMTS13蛋白質亦包括含有轉譯後修飾之多肽。舉例而言，已展示ADAMTS13在殘基614、667及1354處經N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)修飾且預期亦可以此方式修飾殘基142、146、552、579、707、828及1235。

可如Plaimauer等人,(2002,Blood. 15;100(10):3626-32)及US 2005/0266528(其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)中所描述，藉由於哺乳動物細胞培養物中表現來製備蛋白質水解活性重組ADAMTS13。用於在細胞培養物中表現重組ADAMTS13之方法揭示於Plaimauer B,Scheiflinger F.(Semin Hematol. 2004年1月；41(1):24-33)及US 2011/0086413中，其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。

如本文中所用，術語「生物活性衍生物」在用於ADAMTS蛋白質情形時亦涵蓋經由重組DNA技術獲得之多肽。此可包括此項技術中已知之用於達成以下目的之任何方法：(i)藉由遺傳工程改造，例如經由RNA反轉錄及/或DNA擴增，產生重組DNA；(ii)藉由轉染，亦即經由電穿孔或顯微注射，將重組DNA引入原核或真核細胞中；(iii)以例如連續或分批方式培養該等經轉型之細胞；(iv)例如組成性或在誘導後表現ADAMTS蛋白質；及(v)將該ADAMTS蛋白質例如與培養基分離或藉由收集經轉型之細胞分離，從而(vi)獲得實質上純化之重組ADAMTS蛋白質，例如經由離子交換層析、尺寸排阻層析、親和層析、疏水性相互作用層析及其類似方法。術語「生物活性衍生物」亦包括嵌合分子，諸如ADAMTS蛋白質或其功能性片段與第二多肽(例如免疫球蛋白Fc域或白蛋白域)組合以改良生物學/藥理學性質，例如哺乳動物(尤其人類)循環系統中ADAMTS蛋白質之半衰期。

術語「經分離」、「經純化」或「生物學上純」係指物質實質上或基本上不含通常在其天然狀態下發現伴隨其之組分。典型地使用分析化學技術(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析)測定純度及均質性。在一具體實例中，rVWF為實質上經純化之製劑中存在之主要物質。在另一具體實例中，rA13為實質上經純化之製劑中存在之主要物質。在一些具體實例中，術語「純化」表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中基本上產生1條亮帶。在其他具體實例中，其意謂核酸或蛋白質之純度為至少50%，更佳為至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。在其他具體實例中，「純化」意謂自待純化組成物移除至少一種污染物。在此意義上，純化無需所純化化合物為均質，例如100%純。

可藉由已知之活體外檢定量測vWF之生物活性。舉例而言，利黴素輔因子檢定係基於在vWF存在下抗生素利黴素誘導之新鮮或福馬林固定之血小板的凝集。血小板凝集度視vWF濃度而定且可藉由比濁法，例如使用血小板凝集計量測(Weiss等人,J. Clin. Invest. 52: 2708-2716,1973；Macfarlane等人,Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308,1975)。如本文中提供，如使用活體外檢定所量測，本發明vWF之利黴素輔因子比活性係根據mU/μg vWF描述。

如本文中所用，「1單位ADAMTS活性」定義為1 mL彙集之正常人類血漿中之活性量，與所用檢定無關。舉例而言，當ADAMTS蛋白質為ADAMTS13時，1單位ADAMTS13 FRETS-VWF73活性為裂解與1 mL彙集之正常人類血漿所裂解相同量之FRETS-VWF73受質所需的活性量(Kokame等人,Br J Haematol. 2005年4月;129(1):93-100)。宜由功能檢定測定ADAMTS13活性，諸如使用經修飾之馮威里氏因子肽作為ADAMTS13之受質的功能檢定(Tripodi等人J Thromb Haemost. 2008年9月;6(9):1534-41)。一種測定重組人類ADAMTS13活性之較佳方法揭示於Gerritsen等人(Assay of von Willebrand factor(vWF)-cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF: a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura(TTP). Thromb Haemost 1999;82: 1386-1389)中。在一具體實例中，為視作如上文所定義之ADAMTS13蛋白質，多肽或蛋白質必須具有至少1%的原生ADAMTS13之vWF裂解活性。在其他具體實例中，ADAMTS13蛋白質將含有至少10%的原生ADAMTS13活性。在其他具體實例中，ADAMTS13蛋白質將含有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的原生ADAMTS13活性。亦可藉由例如使用Rieger等人(2006,Thromb Haemost. 2006 95(2):212-20)中揭示之ELISA方法量測ADAMTS13抗原來測定ADAMTS13蛋白質之量。此項技術中之公認約定為1 mL彙集之正常人類血漿含有1 μg ADAMTS13。因此，此項技術中之約定為1 μg血漿衍生之ADAMTS13具有1單位ADAMTS13活性。

術語「細胞培養溶液」、「細胞培養基」及「細胞培養物上清液」係指在此項技術中通常熟知的細胞培養過程之態樣。在本發明之上下文中，細胞培養溶液可包括細胞培養基及細胞培養物上清液。細胞培養基視情況與補充物一起自外部添加至細胞培養溶液中以提供用於培養表現rVWF或rA13之細胞的養分及其他組分。細胞培養物上.清液係指包含來自細胞培養基之養分及其他組分以及培養期間自細胞釋放、代謝及/或分泌之產物，但無細胞本身的細胞培養溶液。因此在一種情形下，細胞培養物上清液可指細胞培養溶液之液相(亦即排除細胞之細胞培養溶液)。舉例而言，培養物上清液之銨濃度通常係指細胞培養溶液中之銨濃度。在其他情形下，細胞培養物上清液係指已移除細胞之細胞培養溶液(亦即回收之細胞培養物上清液)。

如本文中所用，術語「維生素B3」、「菸鹼醯胺」、及「菸鹼酸」可互換使用以指代維生素B3家族之任何成員。因此，該家族中之任何成員均可用於補充本發明方法中所用之培養基。

如本文中所用，術語「化學限定培養基」係指合成生長培養基，其中所有組分之身分及濃度均為已知。化學限定培養基不含細菌、酵母、動物或植物萃取物，但其可包括或不包括個別植物或動物衍生之組分(例如蛋白質、多肽等)。市售化學限定培養基之非限制性實例包括各種EX-CELL

培養基(SAFC Biosciences公司)、各種杜貝克改良伊格爾(DME)培養基(Dulbecco's Modified Eagle'smedium)(Sigma-Aldrich公司；SAFC Biosciences公司)、哈姆養分混合物(Ham's Nutrient Mixture)(Sigma-Aldrich公司；SAFC Biosciences公司)及其類似物。此項技術中已知製備化學限定培養基之方法，例如美國專利第6,171,825號及第6,936,441號、WO 2007/077217及美國專利申請公開案第2008/0009040號及第2007/0212770號(其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)中之方法。

如本文中所用，術語「無寡肽培養基」係指不包含寡肽(例如自蛋白質水解產物獲得之寡肽)之無蛋白質培養基。在一具體實例中，培養基不包含具有20個或20個以上胺基酸之寡肽。在本發明之一具體實例中，培養基不包含具有15個或15個以上胺基酸之寡肽。在本發明之另一具體實例中，培養基不包含具有10個或10個以上胺基酸之寡肽。在一具體實例中，培養基不包含具有7個或7個以上胺基酸之寡肽。在另一具體實例中，培養基不包含具有5個或5個以上胺基酸之寡肽。在另一具體實例中，培養基不包含具有3個或3個以上胺基酸之寡肽。根據本發明之另一具體實例，培養基不包含具有2個或2個以上胺基酸之寡肽。此項技術中已知製備無寡肽培養基之方法，例如美國專利第6,171,825號及第6,936,441號、WO 2007/077217及美國專利申請公開案第2008/0009040號及第2007/0212770號(其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)中之方法。

如本文中所用，術語「無血清培養基」係指未補充動物血清之培養基。儘管通常無血清培養基為化學限定培養基，但無血清培養基可補充有個別動物或植物蛋白質或蛋白質部分。此項技術中已知製備無血清培養基之方法，例如美國專利第6,171,825號及第6,936,441號、WO 2007/077217及美國專利申請公開案第2008/0009040號及第2007/0212770號(其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)中之方法。

如本文中所用，術語「無動物蛋白質培養基」係指未補充動物血清、蛋白質或蛋白質部分之培養基。儘管通常無動物蛋白質培養基為化學限定培養基，但無動物蛋白質培養基可含有植物或酵母水解產物。此項技術中已知製備無動物蛋白質培養基之方法，例如美國專利第6,171,825號及第6,936,441號、WO 2007/077217及美國專利申請公開案第2008/0009040號及第2007/0212770號(其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)中之方法。

如本文中所用，術語「基本細胞培養基」係指化學限定培養基、無寡肽培養基、無血清培養基或無動物蛋白質培養基，其未補充水解產物，例如植物或酵母水解產物。基本培養基為此項技術中所熟知，例如DMEM、哈姆F12、DMEM/哈姆F12、培養基199、McCoy或RPMI。基本培養基可包括許多成分，包括胺基酸、維生素、有機及無機鹽以及碳水化合物來源。各成分可以維持細胞培養之量存在，該等量通常為熟習此項技術者已知。培養基可包括輔助物質，諸如緩衝物質(例如碳酸氫鈉)、抗氧化劑、用於抵消機械應力之穩定劑或蛋白酶抑制劑。必要時，可添加非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物及/或混合物。

III.細胞培養基及細胞培養物上清液

本發明之一態樣係關於用於生產與基本細胞培養基產生之rVWF及rA13相比活性增加之rVWF及/或rA13的細胞培養基。在一態樣中，本發明係關於用於生產rVWF及/或rA13之細胞培養基，其中基本細胞培養基補充有一或多種其他物質。在特定具體實例中且如下文進一步詳細論述，本發明之細胞培養條件包括經補充具有至少1.0 μg/L銅之基本細胞培養基。在其他具體實例中，本發明中所用細胞培養基亦包括低含量(低於10 mM)銨。在一特定具體實例中，控制用於表現rVWF及/或rA13之細胞培養條件，使得細胞培養物上清液維持低含量銨，亦即小於10 mM且較佳小於4 mM。

本發明之培養基可以此項技術中熟知之適合基本培養基(例如DMEM、哈姆F12、DMEM/哈姆F12、培養基199、McCoy或RPMI)為基礎。基本培養基可包括許多成分，包括胺基酸、維生素、有機及無機鹽以及碳水化合物來源。各成分可以維持細胞培養之量存在，該等量通常為熟習此項技術者已知。培養基可包括輔助物質，諸如緩衝物質(例如碳酸氫鈉)、抗氧化劑、用於抵消機械應力之穩定劑或蛋白酶抑制劑。必要時，可添加非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物及/或混合物。

通常，基本培養基含有小於1 μg/L銅，例如DMEM/哈姆F12之銅濃度為約0.3 μg/L。該等銅濃度提供之銅離子不足以維持展示高比活性之本發明rVWF及rA13蛋白質之生產。

可經由多種方式向本發明之細胞培養基中提供銅，諸如經由添加培養基補充物。在一些具體實例中，培養基補充物可含有水解產物，用以增加培養基中之銅濃度。水解產物可包括此項技術中熟知之任何水解產物，諸如植物水解產物、大豆水解產物及麵筋水解產物。在某些具體實例中，添加水解產物可使銅濃度增加約0.2至約10 μg/L Cu²⁺。在一些具體實例中，由水解產物提供之銅的量可視水解產物中銅之量以及添加之水解產物量而定。可藉由元素分析，例如原子吸收光譜法(GFAA：石墨爐原子吸收)或質譜分析法(例如ICP-MS)測定水解產物之銅含量。

在某些具體實例中，銅可單獨提供至培養基中，或除水解產物外，藉由提供包括適合銅鹽或銅螯合物之培養基補充物來提供至培養基中。適合銅鹽可包括(但不限於)硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅及氧化銅。適合銅螯合物可包括(但不限於)白蛋白、乙二胺四乙酸(EDTA)、多元胺螯合劑、乙二胺、二伸乙基三胺、三伸乙基四胺、三伸乙基二胺、四伸乙基五胺、胺基乙基乙醇胺、胺基乙基哌

、五伸乙基六胺、三伸乙基四胺鹽酸鹽、四伸乙基五胺鹽酸鹽、五伸乙基六胺鹽酸鹽、四乙基五胺、卡托普利(captopril)、青黴胺(penicilamine)、N,N'-雙(3-胺基丙基)-1,3-丙二胺、N,N,雙(2-胺基乙基)-1,3-丙二胺、1,7-二氧雜-4,10-二氮雜環十二烷、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-5,7-二酮、1,4,7-三氮雜環壬烷三鹽酸鹽、1-氧雜-4,7,10-三氮雜環十二烷、1,4,8,12-四氮雜環十五烷及1,4,7,10-四氮雜環十二烷。

在某些具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得總銅濃度為約1.0 μg/L至約20 μg/L。在一特定具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終濃度介於約1.0 μg/L至約10 μg/L之間。在其他具體實例中，基本細胞培養基經補充，使得最終銅濃度為約1.0-5.0、1.2-4.0、1.3-3.0、1.4-2.9、1.5-2.8、1.6-2.7、1.7-2.6、1.8-2.5、1.9-2.4、2.0-2.3、2.1-2.2 μg/L銅。在其他具體實例中，補充本發明之方法中所用基本細胞培養基，達到約1.2-9.5、1.4-9、1.6-8.5、1.8-8、2.0-7.5、2.2-7、2.4-6.5、2.6-6.0、2.8-5.5、3.0-5.0、3.2-4.5、3.4-4及2-4 μg/L銅。在其他具體實例中，補充本發明之方法中所用基本細胞培養基，達到約1-6、2-5、3-4 μg/L銅。在一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得總銅濃度為至少1 μg/L。在另一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得總銅濃度為至少2 μg/L。在又一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得總銅濃度為至少4 μg/L。在某些具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得總銅濃度為至少1 μg/L或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 μg/L銅或20 μg/L銅以上。在某些具體實例中且如本文中進一步詳細論述，用於生產rA13之培養物可含有約2-4 μg/L銅，而用於生產rVWF之培養物可含有至少2 μg/L銅。

上述濃度為呈二價銅形式(Cu²⁺)之純銅的各別濃度。若使用銅衍生物(例如水合鹽)或含銅化合物(例如銅螯合物)，則所添加之衍生物或螯合物之量使得最終銅濃度在本文中所描述之範圍內。舉例而言，2 μg/L CuSO₄‧5H₂O等同於約0.51 μg/L之銅濃度(無硫酸根及5H₂O)。

有利的是，細胞培養過程中使用使細胞培養溶液中(亦即培養物上清液中)銨(NH₄ ⁺)濃度低之細胞培養基可表現具有較高比活性之重組VWF及/或rA13。因此，在某些具體實例中，上清液之NH₄ ⁺濃度不超過10 mM。在一較佳具體實例中，上清液之NH₄ ⁺濃度不超過5 mM。在一較佳具體實例中，上清液之NH₄ ⁺濃度不超過4 mM。在其他具體實例中，上清液之NH₄ ⁺濃度不超過10 mM、9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下。

因此，在某些具體實例中，本文中提供之方法及組成物依賴於在使上清液中NH₄ ⁺濃度不超過10 mM之過程中使用且補充有銅(例如補充至最終濃度為至少2 μg/L)之基本細胞培養基的使用。在其他具體實例中，基本細胞培養基經補充以提供如表1中提供之變體1至440中任一者之最終銅及銨濃度。

在一些具體實例中，藉由補充不含動物蛋白質及/或化學限定之基本培養基來產生本發明之補充銅之培養基。此項技術中已知製備無動物蛋白質及化學限定培養基之方法，例如美國專利第6,171,825號及第6,936,441號、WO 2007/077217及美國專利申請公開案第2008/0009040號及第2007/0212770號(其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)中之方法。在一具體實例中，本文中所描述之方法中所用基本培養基為無動物蛋白質培養基或無寡肽培養基。在某些具體實例中，培養基可為化學限定培養基。在某些具體實例中，培養基可含有至少一種其濃度為約0.5 mg/L至約10 mg/L之多元胺。

在其他具體實例中且除上文提供之任何描述外，提供向基礎培養基補充銅以及鈣、鋅及/或維生素B3中至少一者的本發明培養基。在某些具體實例中，培養基可為無動物蛋白質、無寡肽或化學限定培養基。在某些具體實例中，如美國專利第6,171,825號及第6,936,441號、WO 2007/077217及美國專利申請公開案第2008/0009040號及第2007/0212770號(其揭示內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中，均出於所有目的以全文引用的方式併入本文中)中教示製備無動物蛋白質或無寡肽培養基，且補充額外銅且視情況補充鈣、鋅及維生素B3中之一或多者。在一特定具體實例中，化學限定培養基可類似於杜貝克改良伊格爾培養基/哈姆F12 1:1混合物(DMEM/哈姆F12)，其已補充額外銅且視情況補充鈣、鋅及/或維生素B3以增加於培養基中培養之細胞中表現之rVWF或rA13的比活性。在其他具體實例中，培養基不含動物組分。在另一具體實例中，培養基含有蛋白質，例如來自血清(諸如胎牛血清)之動物蛋白質。在另一具體實例中，培養物具有自外部添加之重組蛋白質。在另一具體實例中，蛋白質來自合格的無病原體之動物。

在某些具體實例中，培養基含有至少一種其濃度為0.5 mg/L至30 mg/L或約0.5 mg/L至約30 mg/L之多元胺。在另一具體實例中，培養基含有至少一種0.5 mg/L至10 mg/L或約0.5 mg/L至約10 mg/L之多元胺。在一具體實例中，培養基含有至少一種2 mg/L至8 mg/L或約2 mg/L至約8 mg/L之多元胺。在某些具體實例中，多元胺係來自鳥胺酸、腐肉鹼、精胺或亞精胺或其類似物之群。在一較佳具體實例中，多元胺為腐肉鹼。在一特定具體實例中，培養基含有2 mg/L至8 mg/L或約2 mg/L至約8 mg/L腐肉鹼。

在一具體實例中，培養基含有至少一種其濃度為0.5 mg/L至30 mg/L或約0.5 mg/L至約30 mg/L之多元胺及如表1中闡述之變體1至440中任一者之銅與銨組合。在另一具體實例中，培養基含有至少一種0.5 mg/L至10 mg/L或約0.5 mg/L至約10 mg/L之多元胺及如表1中闡述之變體1至440中任一者之銅與銨組合。在一具體實例中，培養基含有至少一種2 mg/L至8 mg/L或約2 mg/L至約8 mg/L之多元胺及如表1中闡述之變體1至440中任一者之銅與銨組合。在某些具體實例中，多元胺係來自鳥胺酸、腐肉鹼、精胺或亞精胺或其類似物之群。在一較佳具體實例中，多元胺為腐肉鹼。在一特定具體實例中，培養基含有2 mg/L至8 mg/L或約2 mg/L至約8 mg/L腐肉鹼及如表1中闡述之變體1至440中任一者之銅與銨組合。

在其他態樣中，除銅外，本發明中所用細胞培養基可進一步包括以下一或多者：額外鈣、鋅、一或多種維生素及其任何組合。

通常，任何鈣鹽均可用於補充本發明之培養基，可接受之鹽之非限制性實例包括CaCl₂、CaCl₂、CaFPO₃‧2H₂O、CaI₂、CaBr₂、(C₂H₃O₂)₂Ca、(CHO₂)₂Ca、(C₆H₇O₆)₂Ca、(C₆H₅O₇)₂Ca₃‧2H₂O及其類似物。在某些具體實例中，使用醫藥學上可接受之鈣鹽補充本發明之培養基。

通常，任何鋅鹽均可用於補充本發明之培養基，可接受之鹽之非限制性實例包括ZnSO₄‧7H₂O、ZnSO₃‧2H₂O、(C₆H₅O₇)₂Zn₃‧2H₂O、ZnBr₂、ZnBr₂‧2H₂O、ZnCl₂、Zn(NO₃)₂‧6H₂O、Zn(H₂PO₄)₂‧H₂O、(C₂H₃O₂)₂Zn‧2H₂O及其類似物。在某些具體實例中，使用醫藥學上可接受之鋅鹽補充本發明之培養基。在其他具體實例中，可使用含鋅之肽或蛋白質製劑(例如胰島素)補充本文中提供之培養物。

在其他態樣中，上述補充有銅及一或多種其他物質之基本細胞培養基可進一步用於上清液中銨含量較低之培養物中。在某些具體實例中，本發明中所用經補充之細胞培養基使細胞培養溶液中之銨含量低於10 mM。在其他具體實例中，本發明之經補充之細胞培養基在細胞培養物銨含量為約0.5-9.5、1.0-9.0、1.5-8.5、2.0-8.0、2.5-7.5、3.0-7.0、3.5-6.5、4.0-6.0、4.5-5.5 mM下使用。

在一具體實例中，在製造製程期間長時間維持細胞培養基及細胞培養物上清液之銅及銨濃度。在一特定具體實例中，在製造製程期間，亦即rVWF或rA13被表現且自大規模細胞培養物回收之時間期間，維持細胞培養物之銅及銨濃度。在某些具體實例中，維持培養溶液中銅及銨濃度在如表1中闡述之變體1至440中任一者之含量下。在一較佳具體實例中，在整個該製造製程期間維持銅及銨濃度。

在一些具體實例中，本發明提供之培養基可以液體形式或乾燥或粉末形式提供。培養基可預先等分成適於單次使用之量或以可用於一次以上細胞培養物之較大量提供。通常，本發明之培養基將以無菌方式提供。

下文論述用於生產rVWF或rA13之細胞培養基之具體細節。儘管下文圍繞rVWF或rA13進行論述，但應瞭解，下文提供之任何關於rVWF之論述均適用於rA13且反之亦然。

A.重組VWF細胞培養基

本發明之一態樣係關於用於生產重組vWF，更特定言之具有高比活性之高分子量vWF(本文中將進一步描述)之細胞培養溶液。在一具體實例中，本發明提供用於生產高分子量、重組vWF之細胞培養溶液，其包含細胞培養基，該細胞培養基包含濃度為至少約2.4 μg/L之銅及複數個表現包含約14個至約22個二聚體之高度多聚vWF之細胞且利黴素輔因子比活性為至少約30 mU/μg。

在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在一較佳具體實例中，細胞培養物包含不超過5 mM之銨濃度。在其他具體實例中，細胞培養物包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在其他具體實例中，細胞培養物具有如表1中闡述之變體1至440中任一者之銅與銨濃度。在某些具體實例中，細胞培養物之銨濃度長時間維持於以上提供之濃度下。舉例而言，在一具體實例中，銨濃度維持於低濃度下至少3天或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少14天。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少14天。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。

在本發明之一具體實例中，細胞培養基可包含銅濃度為至少約2.4 μg/L，在另一具體實例中至少約3 μg/L，在又一具體實例中至少約4 μg/L，在又一具體實例中至少約8 μg/L，在又一具體實例中至少約10 μg/L，在又一具體實例中至少約15 μg/L且在另一具體實例中至少約20 μg/L。

在其他具體實例中，本發明之細胞培養基中之銅濃度可在約2.4 μg/L至約20 μg/L範圍內，在另一具體實例中在約2.4 μg/L至約15 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約2.4 μg/L至約10 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約2.4 μg/L至約8 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約2.4 μg/L至約6 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約2.4 μg/L至約4 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約4 μg/L至約20 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約4 μg/L至約15 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約4 μg/L至約10 μg/L範圍內，在又一具體實例中在約4 μg/L至約8 μg/L範圍內且在另一具體實例中在約4 μg/L至約6 μg/L範圍內。

本發明亦提供用於表現或生產rVWF之套組，該等套組包含適於表現具有高比活性之rVWF之培養基。

B.ADAMTS13(A13)細胞培養基

在一態樣中，本發明提供適用於表現具有高比活性之ADAMTS蛋白質之培養基。有利的是，已發現藉由向培養基中補充銅，可極大增強在經補充之培養基中培養之細胞中表現的重組ADAMTS(例如rADAMTS13)酶之活性，同時酶之表現量若未比於未經補充之培養基中培養之細胞高，則與其同樣高。

在一態樣中，本發明提供用於表現具有高比活性之重組ADAMTS13蛋白質的補充有銅之細胞培養基。在一具體實例中，培養基經補充，使得總銅濃度為約2 μg/L至約4μg/L。在其他具體實例中，培養基經補充，使得總銅濃度為約1-3 μg/L、2-3 μg/L、3-4 μg/L。在一具體實例中，培養基含有銅濃度為至少1 μg/L。在另一具體實例中，培養基含有至少2 μg/L銅。在另一具體實例中，培養基含有至少4 μg/L銅。在其他具體實例中，培養基含有2 μg/L至20 μg/L銅。在另一具體實例中，培養基含有1 μg/L至6 μg/L銅。在另一具體實例中，培養基含有2 μg/L至5 μg/L銅。在另一具體實例中，培養基含有3 μg/L至4 μg/L銅。在其他具體實例中，培養基含有至少1 μg/L銅或至少2 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L、7 μg/L、8 μg/L、9 μg/L、10 μg/L、11 μg/L、12 μg/L、13 μg/L、14 μg/L、15 μg/L、16 μg/L、17 μg/L、18 μg/L、19 μg/L、20 μg/L或更高濃度的銅。

在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在其他具體實例中，細胞培養溶液具有如表1中闡述之變體1至440中任一者之銅與銨濃度。在某些具體實例中，細胞培養物之銨濃度長時間維持於以上提供之濃度下。舉例而言，在一具體實例中，銨濃度維持於低濃度下至少3天或至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少14天。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少14天。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rA13之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。

在一具體實例中，提供含有至少1 μg/L銅及至少2 μM鋅之培養基來表現重組ADAMTS蛋白質(例如rADAMTS13)。在其他具體實例中，培養基含有至少2 μg/L銅或至少4 μg/L銅。在培養基補充銅之另一具體實例中，培養基亦含有至少5 μM或至少約5 μM鋅。在一具體實例中，培養基亦含有2 μM至12 μM或約2 μM至約12 μM鋅。在另一具體實例中，培養基亦含有5 μM至12 μM或約5 μM至約12 μM鋅。在其他具體實例中，培養基亦可含有至少2 μM或至少約2 μM鋅，或至少3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、11 μM、12 μM、13 μM、14 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM或30 μM以上或至少約3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、11 μM、12 μM、13 μM、14 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM或30 μM以上之鋅。在一具體實例中，培養基含有如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。

在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含低銨濃度。在一具體實例中，細胞培養溶液包含小於10 mM之銨濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過10 mM至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過6 mM之銨濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過6 mM至少7天。在另一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過5 mM至少7天。在另一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過4 mM至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在又一特定具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rA13之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。

在一具體實例中，提供含有至少1 μg/L銅及至少0.5 mM或至少約0.5 mM鈣之培養基來表現重組ADAMTS蛋白質(例如rADAMTS13)。在其他具體實例中，培養基含有至少2 μg/L銅或至少4 μg/L銅。在培養基補充銅之另一具體實例中，培養基亦含有至少1.5 mM鈣。在一具體實例中，培養基含有0.5 mM至1.5 mM或約0.5 mM至1.5 mM鈣。在其他具體實例中，培養基可含有至少0.5 mM或至少約0.5 mM鈣，或至少0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM、2.5 mM、2.75 mM、3.0 mM、3.5 mM、4.0 mM、4.5 mM、5.0 mM或5.0 mM以上或至少約0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM、2.5 mM、2.75 mM、3.0 mM、3.5 mM、4.0 mM、4.5 mM、5.0 mM或5.0 mM以上鈣。在一具體實例中，培養基含有如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。

在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含低銨濃度。在一具體實例中，細胞培養溶液包含小於10 mM之銨濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過10 mM至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養基包含不超過6 mM之銨濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過6 mM至少7天。在另一較佳具體實例中，細胞培養基包含不超過5 mM之銨濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過5 mM至少7天。在另一較佳具體實例中，細胞培養基包含不超過4 mM之銨濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過4 mM至少7天。在其他具體實例中，細胞培養基包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在又一特定具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rA13之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。

在一具體實例中，向細胞培養基中補充銅、鋅及鈣。在一特定具體實例中，培養基具有至少0.5 mM之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有至少1.5 mM之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有0.5 mM至1.5 mM之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在其他具體實例中，培養基具有至少0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM、2.5 mM、2.75 mM、3.0 mM、3.5 mM、4.0 mM、4.5 mM、5.0 mM或5.0 mM以上之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。

在一具體實例中，提供含有至少1 μg/L銅及至少2 mg/L菸鹼醯胺(維生素B3)之培養基來表現重組ADAMTS蛋白質(例如rADAMTS13)。在其他具體實例中，培養基含有至少2 μg/L銅或至少4 μg/L銅。在培養基補充銅之另一具體實例中，培養基亦含有至少7 mg/L菸鹼醯胺(維生素B3)。在一具體實例中，培養基含有2 mg/L至10 mg/L或約2 mg/L至約10 mg/L菸鹼醯胺(維生素B3)。在其他具體實例中，培養基可含有至少2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L或更高濃度或至少約2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L或更高濃度的菸鹼醯胺(維生素B3)。在一具體實例中，培養基含有如表4中闡述之變體1321至1760中任一者之銅與菸鹼醯胺濃度。

在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含低銨濃度。在一具體實例中，培養基包含小於10 mM之銨濃度及如表4中闡述之變體1321至1760中任一者之銅與菸鹼醯胺濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過10 mM至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過6 mM濃度之銨及如表4中闡述之變體1321至1760中任一者之銅與菸鹼醯胺濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過6 mM至少7天。在另一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM濃度之銨及如表4中闡述之變體1321至1760中任一者之銅與菸鹼醯胺濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過5 mM至少7天。在另一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度及如表 4中闡述之變體1321至1760中任一者之銅與菸鹼醯胺濃度。在一特定具體實例中，維持銨濃度不超過4 mM至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度及如表4中闡述之變體1321至1760中任一者之銅與菸鹼醯胺濃度。在又一特定具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rA13之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。

在一具體實例中，向細胞培養基中補充銅、鋅及菸鹼醯胺。在一特定具體實例中，培養基具有至少2 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有至少7 mg/mL mM之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有2 mg/mL至10 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在其他具體實例中，培養基具有至少2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL或15 mg/mL以上之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。

在一具體實例中，向細胞培養基中補充銅、鈣及菸鹼醯胺。在一特定具體實例中，培養基具有至少2 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有至少7 mg/mL mM之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有2 mg/mL至10 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在其他具體實例中，培養基具有至少2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL或15 mg/mL以上之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。

IV.生產具有高比活性之血液因子之方法

A.　細胞培養方法

本發明提供大規模生產重組蛋白質(諸如rVWF及rA13)之方法。在某些具體實例中，該等大規模生產方法利用攪拌/攪動槽反應器來製造該等治療性重組蛋白質。

在某些具體實例中，本發明之方法可包含使用在分批或連續操作模式下操作之細胞培養系統。舉例而言，當利用分批細胞培養時，其可在單批、分批補料或重複分批模式下操作。類似地，連續細胞培養可在例如灌注、恆濁或恆化模式下操作。分批及連續細胞培養可在懸浮或附著條件下進行。當在懸浮條件下操作時，細胞將在培養基內自由懸浮及混合。或者，在附著條件下，細胞將結合於固相，例如微載體、多孔微載體、盤式載體、陶瓷濾筒(ceramic cartridge)、空心纖維、平板、凝膠基質及其類似物。

分批培養典型為大規模細胞培養，其中在培養槽或醱酵槽中培養細胞接種物至最大密度，且單批收集及處理。分批補料培養典型為分批培養，其供應有新鮮養分(例如生長限制基質)或添加劑(例如產物之前驅體)。補料溶液通常高度濃縮以避免生物反應器之稀釋。重複分批培養中，細胞置放於培養基中且生長至所需細胞密度。為避免開始衰退期及細胞死亡，接著在細胞達到其最大濃度前用完全生長培養基稀釋培養物。稀釋量及頻率廣泛變化且視細胞系之生長特徵及培養過程之便利性而定。可視需要多次重複該過程，且除非在繼代培養中廢棄細胞及培養基，否則培養物體積將隨每次稀釋而逐步增加。可藉由使用大小足以允許在容器內稀釋之反應器或藉由將稀釋之培養物分至若干個容器中來處理體積增加。此類型培養之基本原理為維持細胞處於指數生長狀態。連續繼代培養之特徵在於培養物體積始終逐步增加，可進行多次收集，細胞持續生長及過程可持續所需要長之時間。在某些具體實例中，可在收集一批培養物之上清液後回收重組ADAMTS蛋白質(例如rADAMTS13)。在其他具體實例中，可在收集一批培養物之上清液後回收重組VWF。

連續培養可為懸浮培養，其藉由注入新鮮培養基連續供應養分，其中培養物體積通常伴隨著移除用過之培養基而保持恆定。在恆化及恆濁方法中，萃取之培養基含有細胞。因此，細胞培養容器中之剩餘細胞必須生長以維持穩定狀態。在恆化方法中，典型地藉由控制稀釋速率(亦即添加新鮮培養基之速率)來控制生長速率。培養物中細胞之生長速率可藉由改變稀釋速率來控制在例如次最大生長速率下。相反地，在恆濁方法中，設定稀釋速率以容許細胞在既定操作條件(諸如pH值及溫度)下可達到的最大生長速率。在某些具體實例中，在收集連續培養物之上清液後回收rVWF或rA13。連續細胞培養之一例示性方法描述於WO/2011/012725(Grillberger等人)中，其內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。

在灌注培養中，萃取之培養基不含細胞，該等細胞例如藉由過濾或離心法(使細胞再次引入培養物中)而留存於培養容器中。然而，典型地，用於過濾之膜不留存100%細胞，因此一部分細胞在萃取培養基時被移除。此情況在以極高生長速率操作灌注培養時並不重要，因為大部分細胞仍留存於培養容器中。在某些具體實例中，在收集灌注培養物之上清液後回收rVWF或rA13。

攪拌槽反應器系統可用於以懸浮或附著模式操作之分批及連續細胞培養。通常，攪拌槽反應器系統可以具有任何類型攪動器(諸如若世頓槳(Rushton)、水翼、斜葉槳或船推進器型攪動器(marine))之任何習知攪拌槽反應器操作。

在某些具體實例中，本發明之細胞培養方法可包含使用微載體。在一些具體實例中，可於大型生物反應器中在適於提供高體積-培養物比表面積條件下進行細胞培養具體實例以獲得高細胞密度及蛋白質表現。一種提供該等生長條件之手段為在攪拌槽生物反應器中使用細胞培養物之微載體。微載體上之細胞生長概念由van Wezel(van Wezel,A.L.,Nature 216:64-5(1967))首先描述且允許細胞附著於懸浮於生長培養基中之小固體顆粒之表面上。該等方法提供高表面積-體積比，因此實現有效的養分利用。此外，對於真核細胞系中分泌之蛋白質之表現，表面積-體積比增加可使分泌量更高，因此培養物上清液中蛋白質產率更高。最終，該等方法使真核表現培養物易於擴大。

在細胞培養生長期間表現vWF及/或rA13之細胞可結合於球形或多孔微載體。微載體可為選自基於聚葡萄糖、膠原蛋白、塑膠、明膠及纖維素之微載體及如Butler(1988. Spier & Griffiths,Animal Cell Biotechnology 3:283-303)中所描述之其他微載體之群的微載體。亦可使細胞於球形微載體上生長至一生物質量且在其達到最終醱酵生物質量時繼代培養該等細胞，隨後在多孔微載體上產生表現之蛋白質，或反之亦然。適合球形微載體可包括平滑表面微載體，諸如Cytodex^TM 1、Cytodex^TM 2及Cytodex^TM 3(GE Healthcare)及巨孔微載體，諸如Cytopore^TM 1、Cytopore^TM 2、Cytoline^TM 1及Cytoline^TM 2(GE Healthcare)。

如上文所描述，本發明包括具有增加之銅濃度的細胞培養基。應瞭解，以上「細胞培養基」部分中描述之所有具體實例及濃度均可用於本文中描述之本發明方法。

在某些具體實例中，培養物可維持至少約7天，或至少約14天、21天、28天或至少約5週、6週、7週、8週、9週或至少約2個月，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個月或18個月以上。細胞培養物被維持在用於生產重組vWF或重組rA13蛋白質之細胞密度將視用於蛋白質表現之培養條件及培養基而定。熟習此項技術者將能夠容易地測定生產rVWF或rA13之細胞培養物之最佳細胞密度。在一具體實例中，培養物長時間維持於約0.5×10⁶至4×10⁷個細胞/毫升的細胞密度下。在其他具體實例中，細胞密度長時間維持於約1.0×10⁶至約1.0×10⁷個細胞/毫升的濃度下。在其他具體實例中，細胞密度長時間維持於約1.0×10⁶至約4.0×10⁶個細胞/毫升的濃度下。在其他具體實例中，細胞密度長時間維持於約1.0×10⁶至約4.0×10⁶個細胞/毫升的濃度下。在其他具體實例中，細胞密度可長時間維持於約2.0×10⁶至約4.0×10⁶，或約1.0×10⁶至約2.5×10⁶，或約1.5×10⁶至約3.5×10⁶或任何其他類似範圍內之濃度下。

在一具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少7天。在一特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少14天。在一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少21天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少28天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少5週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少6週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少7週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少8週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過4.0×10⁶個細胞之濃度下至少9週。

在一具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少7天。在一特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少14天。在一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少21天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少28天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少5週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少6週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少7週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少8週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.5×10⁶個細胞之濃度下至少9週。

在另一具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少7天。在一特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少14天。在一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少21天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少28天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少5週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少6週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少7週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少8週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過2.0×10⁶個細胞之濃度下至少9週。

在一具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少7天。在一特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少14天。在一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少21天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少28天。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少5週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少6週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少7週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少8週。在又一更特定具體實例中，本文中提供之連續細胞培養物之細胞密度維持於不超過1.5×10⁶個細胞之濃度下至少9週。

以下提供有關用於生產rVWF及rA13之方法之具體細節。應瞭解，儘管該等條件係關於rVWF或rA13特定地呈現，但用於rVWF之條件亦可用於生產rA13且反之亦然。

B.生產高分子量重組vWF之方法

在另一態樣中，本發明進一步關於在包含具有增加之銅濃度之細胞培養基的細胞培養條件下生產vWF之方法。在某些具體實例中，培養物亦包含低銨濃度。如本文中所用，術語「細胞培養物」及「細胞培養溶液」可互換使用。

在一具體實例中，本發明提供一種生產高分子量重組vWF之方法，其包含：a)提供細胞培養物；b)引入編碼vWF之核酸序列；c)選擇攜帶該核酸序列之細胞；及d)在包含銅濃度為至少約2.4 μg/L之細胞培養基及包含銨濃度小於約10 mM之細胞培養物上清液的細胞培養條件下於細胞中表現vWF，其中vWF為包含約14至約22個二聚體及至少約30 mU/μg之利黴素比活性之高度多聚vWF。在其他具體實例中，使用本發明之方法生產之多聚rVWF包含約10-30、12-28、14-26、16-24、18-22、20-21個二聚體。在其他具體實例中，根據本發明生產之rVWF之比活性為至少約20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80 mU/μg或80 mU/μg以上。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組馮威里氏因子(rVWF)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少2.0 μg/L；(c)提供一或多種包含編碼rVWF蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rVWF表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少30 mU/μg rVWF。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少2.4 μg/L。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養溶液之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少3 μg/L。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養溶液之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少4 μg/L。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養基包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養溶液之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為約4.3 μg/L。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養溶液之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度介於2 μg/L與20 μg/L之間。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度介於3 μg/L與10 μg/L之間。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養溶液之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養溶液之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度介於4 μg/L與7.5 μg/L之間。在一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rVWF之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組馮威里氏因子(rVWF)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅；(c)提供一或多種包含編碼rVWF蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rVWF表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中上清液之NH₄ ⁺濃度維持於低含量下至少7天，且此外其中回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少30 mU/μg rVWF。在一特定具體實例中，細胞培養溶液之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少14天。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少21天。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少28天。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少5週。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少6週。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少7週。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少8週。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養物之銅濃度及NH₄ ⁺濃度維持於如表1中闡述之變體1至440中任一者之濃度下至少9週。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組馮威里氏因子(rVWF)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少2.0 μg/L；(c)提供一或多種包含編碼rVWF蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rVWF表現且自細胞分泌至培養物上清液中；(e)監測培養物上清液之銨濃度；及(f)回收至少一部分培養物上清液，其中不使用包含超過10 mM之銨濃度的培養物上清液來生產rVWF組成物，且此外其中回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少30 mU/μg rVWF。在某些具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度為至少2.4 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L、7 μg/L、8 μg/L、9 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L或20 μg/L以上。在其他具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度介於2-20 μg/L、2-10 μg/L、3-8 μg/L或4-6 μg/L之間。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，不使用包含超過6 mM之銨濃度的培養物上清液來生產rVWF組成物。在某些具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度為至少2.4 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L、7 μg/L、8 μg/L、9 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L或20 μg/L以上。在其他具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度介於2-20 μg/L、2-10 μg/L、3-8 μg/L或4-6 μg/L之間。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，不使用包含超過5 mM之銨濃度的培養物上清液來生產rVWF組成物。在某些具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度為至少2.4 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L、7 μg/L、8 μg/L、9 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L或20 μg/L以上。在其他具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度介於2-20 μg/L、2-10 μg/L、3-8 μg/L或4-6 μg/L之間。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

在上述方法之一具體實例中，不使用包含超過4 mM之銨濃度的培養物上清液來生產rVWF組成物。在某些具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度為至少2.4 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L、7 μg/L、8 μg/L、9 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L或20 μg/L以上。在其他具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度介於2-20 μg/L、2-10 μg/L、3-8 μg/L或4-6 μg/L之間。在一較佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg rVWF。在一更佳具體實例中，回收上清液之rVWF利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg rVWF。

可藉由於適合真核宿主系統中表現來產生重組vWF。真核細胞之實例包括(但不限於)哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2；昆蟲細胞，例如SF9細胞、SF21細胞、S2細胞及High Five細胞；及酵母細胞，例如酵母菌(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)細胞。在一具體實例中，vWF可於酵母細胞、昆蟲細胞、禽類細胞、哺乳動物細胞及其類似細胞中表現。舉例而言，於人類細胞系、倉鼠細胞系或鼠類細胞系中表現。在一特定具體實例中，細胞系為CHO、BHK或HEK細胞系。典型地，哺乳動物細胞(例如來自連續細胞系之CHO)可用於表現本發明之vWF。

在某些具體實例中，包含編碼vWF之序列的核酸序列可為載體。載體可由病毒傳遞或可為質體。編碼蛋白質之核酸序列可為特異性基因或其生物功能部分。在一具體實例中，蛋白質至少為vWF之生物活性部分。

多種載體可用於表現vWF且可選自真核表現載體。用於真核表現之載體之實例包括：(i)對於酵母中之表現，諸如pAO、pPIC、pYES、pMET之載體，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等啟動子；(ii)對於昆蟲細胞中之表現，諸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等載體，使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等啟動子，及(iii)對於哺乳動物細胞中之表現，諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等載體及來源於諸如痘瘡病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒等病毒系統之載體，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。用於表現rVWF之一例示性載體由Kaufman等人(Mol Cell Biol. 1989年3月；9(3):1233-42)描述，其內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。

在本發明之一些具體實例中，核酸序列進一步包含其他適於蛋白質之受控表現之序列，諸如啟動子序列、增強子、TATA盒、轉錄起始位點、多酶切點接頭、限制位點、聚-A-序列、蛋白質加工序列、選擇標記物及一般技術者通常已知之其類似物。

除包含增加之銅濃度的細胞培養基外，本發明之細胞培養條件可在培養系統中整個上游過程中始終包括小於約25 mM之銨濃度。在一具體實例中，細胞培養條件包括小於約25 mM，在另一具體實例中小於約20 mM，在又一具體實例中小於約15 mM，在又一具體實例中小於約10 mM且在另一具體實例中小於約5 mM之銨濃度。

在一些具體實例中，本發明之銨濃度在細胞培養系統之整個上游過程中始終保持恆定。可例如藉由與習知分批培養及分批補料培養(各自通常為此項技術中已知)相比經改良之方法培養根據本發明使用之細胞。然而，該等習知技術可在培養結束時產生高濃度銨。本發明之方法藉由使用可經由諸如灌注或恆化培養之技術連續供應培養基之生產系統來克服此問題。在培養宿主細胞後，可使用標準方法(諸如超濾或離心)自用過之培養基回收vWF。必要時，可藉由例如離子交換及/或尺寸排阻層析及其類似方法純化vWF。

連續培養(例如灌注或恆化培養)可為藉由注入新鮮培養基連續供應養分之懸浮培養，其中培養物體積通常恆定。類似地，連續醱酵係指藉由連續添加新鮮培養基使細胞或微生物於培養物中維持於指數生長期之過程，其藉由自生物反應器移除細胞懸浮液來精確平衡。此外，攪拌槽反應器系統可用於懸浮、灌注、恆化及/或微載體培養。通常，可以具有任何類型攪拌器(諸如若世頓槳、水翼、斜葉槳或船推進器型攪動器)之任何習知攪拌槽反應器操作攪拌槽反應器系統。

C.生產重組　ADAMTS13(A13)之方法

在另一態樣中，本發明進一步關於在包含具有增加之銅濃度之細胞培養基的細胞培養條件下生產rA13之方法。在某些具體實例中，培養物亦包含低銨濃度。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅，使得最終銅濃度為至少1.0 μg/L；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性(亦即每天每公升細胞培養物1500單位FRETS-VWF73活性；P FRETS)。在某些具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度為至少2 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L或6 μg/L以上。在其他具體實例中，經補充之基本培養基之最終銅濃度介於1-6 μg/L、2-5 μg/L、2-4 μg/L或3-4 μg/L之間。在一較佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少3000單位FRETS-VWF73活性。在某些具體實例中，該等方法可持續地改良P FRETS生產。舉例而言，在某些具體實例中，每天每公升經補充之基本細胞培養基回收至少1500單位FRETS-VWF73活性歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一較佳具體實例中，每天每公升經補充之基本細胞培養基回收至少2000單位FRETS-VWF73活性歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一更佳具體實例中，每天每公升經補充之基本細胞培養基回收至少2500單位FRETS-VWF73活性歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一最佳具體實例中，每天每公升經補充之基本細胞培養基回收至少3000單位FRETS-VWF73活性歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。

在上述方法之一具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少4單位FRETS-VWF73活性(FRETS)。在一較佳具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少6單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少8單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少10單位FRETS-VWF73活性。在某些具體實例中，該等方法可持續地改良FRETS生產。舉例而言，在某些具體實例中，每天回收每毫升具有至少4單位FRETS-VWF73活性之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一較佳具體實例中，每天回收每毫升具有至少6單位FRETS-VWF73活性之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一更佳具體實例中，每天回收每毫升具有至少8單位FRETS-VWF73活性之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一最佳具體實例中，每天回收每毫升具有至少10單位FRETS-VWF73活性之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少800 mU FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞(亦即qFRETS)。在一較佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少1 U FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞。在一更佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少1.2 U FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞。在一最佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少1.4 U FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞。在某些具體實例中，該等方法可持續地改良qFRETS生產。舉例而言，在某些具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少800 mU FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一較佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少1 U FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一更佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少1.2 U FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一最佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少1.4 U FRETS-VWF73活性/10⁶個細胞歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養引起每天每公升培養物生產至少1 mg rA13，如ELISA所量測(PELISA)。在一較佳具體實例中，細胞培養引起每天每公升培養物生產至少1.5 mg rA13，如ELISA所量測。在一更佳具體實例中，細胞培養引起每天每公升培養物生產至少2 mg rA13，如ELISA所量測。在某些具體實例中，該等方法可持續地改良rA13生產。舉例而言，在某些具體實例中，細胞培養引起每天每公升培養物生產至少1 mg rA13(如ELISA所量測)歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一較佳具體實例中，細胞培養引起每天每公升培養物生產至少1.5 mg rA13(如ELISA所量測)歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一更佳具體實例中，細胞培養引起每天每公升培養物生產至少2 mg rA13(如ELISA所量測)歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少0.5 μg rA13/10⁶個細胞，如ELISA所量測(亦即qELISA)。在一較佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少0.7 μg rA13/10⁶個細胞，如ELISA所量測。在一更佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少0.9 μg rA13/10⁶個細胞，如ELISA所量測。在某些具體實例中，該等方法可持續地改良qELISA生產。舉例而言，在某些具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少0.5 μg rA13/10⁶個細胞(如ELISA所量測)歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一較佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少0.7 μg rA13/10⁶個細胞(如ELISA所量測)歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一更佳具體實例中，細胞培養引起培養物中每天生產至少0.9 μg rA13/10⁶個細胞(如ELISA所量測)歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。

在上述方法之一具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少3 μg rA13，如ELISA所量測。在一較佳具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少4 μg rA13，如ELISA所量測。在一更佳具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少5 μg rA13，如ELISA所量測。在一最佳具體實例中，回收之上清液中每毫升上清液具有至少6 μg rA13，如ELISA所量測。在某些具體實例中，該等方法可持續地改良rA13生產。舉例而言，在某些具體實例中，每天回收每毫升具有至少3 μg rA13之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一較佳具體實例中，每天回收每毫升具有至少4 μg rA13之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一更佳具體實例中，每天回收每毫升具有至少5 μg rA13之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。在一最佳具體實例中，每天回收每毫升具有至少6 μg rA13之上清液歷時至少7天或至少14、21、28、35、42、49、56、63、70天或70天以上。

在上述方法之一具體實例中，細胞培養溶液進一步包含小於10 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過10 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過5 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過5 mM之銨濃度下至少7天。在一較佳具體實例中，細胞培養溶液包含不超過4 mM之銨濃度。在另一特定具體實例中，細胞培養物之銨濃度維持於不超過4 mM之銨濃度下至少7天。在其他具體實例中，細胞培養溶液包含不超過10 mM或不超過9 mM、8 mM、7 mM、6 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM或1 mM以下之銨濃度。在又一具體實例中，在過程期間(亦即在培養物用於生產rA13之整個時間內)細胞培養物之銨濃度維持於低含量下。在一特定具體實例中，培養溶液具有如表1中提供之變體1至440中任一者之銅與銨濃度。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅及鋅；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。在一具體實例中，培養基含有至少1 μg/L銅及至少2 μM鋅。在其他具體實例中，培養基含有至少2 μg/L銅或至少4 μg/L銅。在培養基補充銅之一具體實例中，培養基亦含有至少5 μM或至少約5 μM鋅。在一具體實例中，培養基亦含有2 μM至12 μM或約2 μM至約12 μM鋅。在另一具體實例中，培養基亦含有5 μM至12 μM或約5 μM至約12 μM鋅。在其他具體實例中，培養基亦可含有至少2 μM或至少約2 μM鋅，或至少3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、11 μM、12 μM、13 μM、14 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM或30 μM以上或至少約3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM、11 μM、12 μM、13 μM、14 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM或30 μM以上鋅。在一具體實例中，培養基含有如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在一較佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少3000單位FRETS-VWF73活性。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅及鈣；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。在一具體實例中，培養基含有至少1 μg/L銅及至少0.5 mM鈣。在其他具體實例中，培養基含有至少2 μg/L銅或至少4 μg/L銅。在培養基補充銅之另一具體實例中，培養基亦含有至少1.5 mM鈣。在一具體實例中，培養基含有0.5 mM至1.5 mM或約0.5 mM至約1.5 mM鈣。在其他具體實例中，培養基可含有至少0.5 mM或至少約0.5 mM鈣，或至少0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM、2.5 mM、2.75 mM、3.0 mM、3.5 mM、4.0 mM、4.5 mM、5.0 mM或5.0 mM以上或至少約0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM、2.5 mM、2.75 mM、3.0 mM、3.5 mM、4.0 mM、4.5 mM、5.0 mM或5.0 mM以上鈣。在一具體實例中，培養基含有如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在一較佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少3000單位FRETS-VWF73活性。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅、鋅及鈣；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。在一具體實例中，培養基具有至少0.5 mM之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有至少1.5 mM之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有0.5 mM至1.5 mM之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在其他具體實例中，培養基具有至少0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mM、1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM、2.5 mM、2.75 mM、3.0 mM、3.5 mM、4.0 mM、4.5 mM、5.0 mM或5.0 mM以上之鈣濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在一較佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少3000單位FRETS-VWF73活性。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅及菸鹼醯胺；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。在一具體實例中，培養基含有至少1 μg/L銅及至少2 mg/L菸鹼醯胺(維生素B3)。在其他具體實例中，培養基含有至少2 μg/L銅或至少4 μg/L銅。在培養基補充銅之另一具體實例中，培養基亦含有至少7 mg/L菸鹼醯胺(維生素B3)。在一具體實例中，培養基含有2 mg/L至10 mg/L或約2 mg/L至約10 mg/L菸鹼醯胺(維生素B3)。在其他具體實例中，培養基可含有至少2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L或更高濃度或至少約2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L或更高濃度的菸鹼醯胺(維生素B3)。在一具體實例中，培養基含有如表4中闡述之變體1321至1760中任一者之銅與菸鹼醯胺濃度。在一較佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少3000單位FRETS-VWF73活性。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅、鋅及菸鹼醯胺；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。在一具體實例中，細胞培養基具有至少2 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有至少7 mg/mL mM之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有2 mg/mL至10 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在其他具體實例中，培養基具有至少2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL或15 mg/mL以上之菸鹼醯胺濃度及如表2中闡述之變體441至880中任一者之銅與鋅濃度。在一較佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少3000單位FRETS-VWF73活性。

在一具體實例中，本發明提供一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向基本細胞培養基中補充銅、鈣及菸鹼醯胺；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)在補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13表現且自細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分培養物上清液，其中回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。在一具體實例中，細胞培養基具有至少2 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅及鈣濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有至少7 mg/mL mM之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在另一特定具體實例中，培養基具有2 mg/mL至10 mg/mL之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在其他具體實例中，培養基具有至少2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL或15 mg/mL以上之菸鹼醯胺濃度及如表3中闡述之變體881至1320中任一者之銅與鈣濃度。在一較佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。在一更佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。在一最佳具體實例中，回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少3000單位FRETS-VWF73活性。

可藉由於任何適合原核或真核宿主系統中表現來產生重組ADAMTS蛋白質。真核細胞之實例包括(但不限於)哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2；昆蟲細胞，例如SF9細胞、SF21細胞、S2細胞及High Five細胞；及酵母細胞，例如酵母菌或裂殖酵母細胞。在一具體實例中，ADAMTS蛋白質可在細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、禽類細胞、哺乳動物細胞及其類似物中表現。舉例而言，在人類細胞系、倉鼠細胞系或鼠類細胞系中表現。在一特定具體實例中，細胞系為CHO、BHK或HEK細胞系。在一較佳具體實例中，細胞系為CHO細胞系。在一特定具體實例中，藉由以rA13及二氫葉酸還原酶之編碼序列(例如鼠類dhfr基因)共轉染CHO細胞且針對在增加含量之甲胺喋呤存在下之生長進行選擇來製備能夠穩定表現rA13之CHO純系。

在一具體實例中，細胞可為任何哺乳動物細胞，該等哺乳動物細胞可較佳在製造製程中(亦即至少10公升，較佳至少100公升)培養以產生所需ADAMTS蛋白質，諸如ADAMTS13。實例包括藉由SV40轉型之猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞系(293細胞或經次選殖以在懸浮培養中生長之293細胞，Graham等人,J. Gen Virol.,36:59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR，諸如DUKX-B11次純系(CHO，Uriaub及Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:4216(1980))；小鼠足細胞(TM4，Mather,Biol. Reprod,23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(海拉(HeLa)，ATCC CCL2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人,Annals N. Y. Acad. Sci.,383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞系(Hep G2)。細胞系較佳為囓齒動物細胞系，尤其倉鼠細胞系，諸如CHO或BHK。

多種載體可用於表現ADAMTS蛋白質(例如ADAMTS13)且可選自真核及原核表現載體。在某些具體實例中，質體載體預期用於表現ADAMTS蛋白質(例如ADAMTS13)。通常，來源於與宿主細胞相容之物種的含有複製子及控制序列之質體載體結合該等宿主使用。載體可攜帶複製位點以及標記序列，該等標記序列能夠提供轉型細胞中之表型選擇。質體將包含編碼ADAMTS蛋白質(例如ADAMTS13)之核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接於一或多個控制序列(例如啟動子)。

製備表現重組ADAMTS蛋白質之穩定CHO細胞純系之一較佳方法如下。用DHFR表現載體轉染DHFR缺失之CHO細胞系DUKX-B11以允許相關重組蛋白質表現。Plaimauer等人(Blood. 2002年11月15日；100(10):3626-32. Epub 2002年7月12日)描述一例示性方法，其內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。藉由於不含次黃嘌呤/胸苷(HT)之培養基中生長來選擇，且藉由於增加濃度之甲胺喋呤中繁殖細胞來擴增編碼重組ADAMTS蛋白質及DHFR基因之表現之相關區域。在適當時，CHO細胞系可適於在不含血清及/或蛋白質之培養基中生長，基本上如US 6,100,061(Reiter等人,lmmuno Aktiengesellschaft)中所描述。

在另一較佳具體實例中，藉由以含有潮黴素可選擇標記物之構築體轉染且藉由抗生素抗性選擇轉型株來製備穩定HEK293細胞。

某些病毒感染細胞或經由受體介導之胞吞作用進入細胞以及整合至宿主細胞基因組中且穩定並有效地表現病毒基因之能力使得其成為用於將外部核酸轉移至細胞(例如哺乳動物細胞)中的具有吸引力之候選物。因此，在某些具體實例中，使用病毒載體將編碼ADAMTS蛋白質(例如ADAMTS13)之核苷酸序列引入宿主細胞中以進行表現。病毒載體將包含編碼ADAMTS蛋白質(例如ADAMTS13)之核苷酸序列，該核苷酸序列可操作地連接於一或多個控制序列(例如啟動子)。或者，病毒載體可不含控制序列且將改為依賴於宿主細胞內之控制序列來驅動ADAMTS蛋白質之表現。可用於傳遞核酸之病毒載體之非限制性實例包括腺病毒載體、AAV載體及反轉錄病毒載體。

在一具體實例中，腺病毒表現載體包括如下構築體，其中該等構築體含有足以支援構築體之封裝及最終表現其中選殖之ADAMTS構築體之腺病毒序列。腺病毒載體允許引入高達7 kb之外部序列(Grunhaus等人,Seminarin Virology,200(2):535-546,1992)。

在另一具體實例中，腺相關病毒(AAV)可用於將編碼ADAMTS蛋白質(例如ADAMTS13)之核苷酸序列引入宿主細胞中以進行表現。AAV系統已於先前描述且通常為此項技術中熟知(Kelleher及Vos,Biotechniques,17(6):1110-7,1994；Cotton等人,Proc Natl Acad Sci USA,89(13): 6094-6098,1992；Curiel,Nat Immun,13(2-3):141-64,1994；Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol 158:97-129,1992)。有關rAAV載體之產生及用途之細節描述於例如美國專利第5,139,941號及第4,797,368號中，其各出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。

在一具體實例中，反轉錄病毒表現載體可用於將編碼ADAMTS蛋白質(例如ADAMTS13)之核苷酸序列引入宿主細胞中以進行表現。該等系統已於先前描述且通常在此項技術中熟知(Mann等人,Cell,33:153-159,1983；Nicolas及Rubinstein,Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez及Denhardt編,Stoneham: Butterworth,第494-513頁,1988；Temin,Gene Transfer,Kucherlapati(編),New York: Plenum Press,第149-188頁,1986)。在一特定具體實例中，反轉錄病毒載體為慢病毒載體(參見例如Naldini等人,Science,272(5259):263-267,1996;Zufferey等人,Nat Biotechnol,15(9):871-875,1997；Blomer等人,J Virol,71(9):6641-6649,1997；美國專利第6,013,516號及第5,994,136號)。

用於原核表現之載體之非限制性實例包括質體，諸如pRSET、pET、pBAD等，其中用於原核表現載體之啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用於真核表現之載體之實例包括：(i)對於酵母中表現，諸如pAO、pPIC、pYES、pMET之載體，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等啟動子；(ii)對於昆蟲細胞中表現，諸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等載體，使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等啟動子，及(iii)對於哺乳動物細胞中表現，諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等載體及來源於諸如痘瘡病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒等病毒系統之載體，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。Plaimauer等人(Blood. 2002年11月15日；100(10):3626-32. Epub 2002年7月12日)描述用於表現rA13之一例示性載體，其內容出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。

在某些具體實例中，本發明之細胞培養方法可包含使用微載體。在其他態樣中，本發明提供大規模ADAMTS蛋白質表現之方法。在一些具體實例中，可於大型生物反應器中在適於提供高體積-培養物比表面積之條件下進行細胞培養具體實例以獲得高細胞密度及蛋白質表現。一種提供該等生長條件之手段為在攪拌槽生物反應器中使用細胞培養物之微載體。在另一具體實例中，經由使用懸浮細胞培養滿足該等生長要求。

V.特定具體實例

A.　重組馮威里氏因子(rVWF)

重組vWF可在哺乳動物細胞中表現，但vWF之比活性可視細胞培養物條件而廣泛變化且未顯示等於自血漿分離之vWF之比活性。本發明係部分基於如下意外結果：具有至少2.4 μg/L銅之細胞培養基提供促進具有高比活性之高分子量vWF表現之有利作用。特別是，本發明之高分子量重組vWF可包括包含約14至約22個二聚體且利黴素比活性為至少約30 mU/μg之高度多聚形式。根據本發明之細胞培養過程亦允許在細胞培養系統中之上游過程期間維持低NH₄ ⁺含量(例如小於10 mM)，藉此降低對轉譯後修飾之有害影響。咸信本發明首次提供包含具有適合銅濃度之培養基及上清液中之適量銨以表現具有高比活性之高度多聚vWF的細胞培養條件。

在一態樣中，本發明係關於用於生產具有高比活性之重組高分子量vWF之細胞培養條件。本發明之細胞培養條件可包括例如具有增加之銅濃度的細胞培養基及/或具有低銨(NH₄ ⁺)濃度之細胞培養物上清液。本發明亦提供在細胞培養條件中培養細胞以表現具有高比活性之高分子量vWF之方法。

在一態樣中，本發明提供用於生產高分子量重組vWF蛋白質之細胞培養溶液，該細胞培養溶液包含：包含至少約2.4 μg/L之銅濃度的細胞培養基；包含小於10 mM之銨濃度的細胞培養物上清液；及複數個表現高度多聚vWF蛋白質之細胞，其中該vWF蛋白質包含至少約30 mU/μg之利黴素比活性。

在上述細胞培養物之一特定具體實例中，細胞培養溶液包含含銅之培養基補充物。

在上述細胞培養物之一特定具體實例中，培養基補充物包含水解產物，視情況為大豆水解產物。

在上述細胞培養物之一特定具體實例中，培養基補充物包含銅鹽、銅螯合物或其組合。

在上述細胞培養物之一特定具體實例中，銅鹽係選自由硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅及氧化銅組成之群。

在上述細胞培養物之一特定具體實例中，銅濃度為至少約4 μg/L。

在上述細胞培養物之一特定具體實例中，銅濃度為約2.4 μg/L至約20 μg/L。

在上述細胞培養物之一特定具體實例中，vWF蛋白質包含約14至約22個二聚體。

在一態樣中，本發明提供一種生產高分子量重組vWF蛋白質之方法，該方法包含以下步驟：a)提供包含編碼重組vWF蛋白質之核酸之細胞的培養物；b)在包含銅濃度為至少約2.4 μg/L之細胞培養基及銨濃度小於約10 mM之細胞培養物上清液的細胞培養條件下於細胞中表現vWF蛋白質，其中vWF蛋白質為高度多聚vWF蛋白質且包含至少約30 mU/μg之利黴素比活性。

在上述方法之一特定具體實例中，細胞為哺乳動物細胞。

在上述方法之一特定具體實例中，細胞係來自連續細胞系。

在上述方法之一特定具體實例中，細胞為CHO細胞。

在上述方法之一特定具體實例中，銅濃度為至少約4 μg/L。

在上述方法之一特定具體實例中，銅濃度為約2.4 μg/L至約20 μg/L。

在上述方法之一特定具體實例中，重組vWF蛋白質之利黴素輔因子比活性為至少約50 mU/μg。

在上述方法之一特定具體實例中，重組vWF蛋白質之利黴素輔因子比活性為約30 mU/μg至約100 mU/μg。

在上述方法之一特定具體實例中，重組vWF蛋白質包含約14至約22個二聚體。

在一態樣中，本發明提供藉由一種方法生產之高分子量重組vWF蛋白質，該方法包含以下步驟：a)提供包含編碼重組vWF蛋白質之核酸之細胞的培養物；及b)在包含銅濃度為至少2.4 μg/L之細胞培養基及銨濃度小於10 mM之細胞培養物上清液的細胞培養條件下於細胞中表現vWF蛋白質，其中vWF蛋白質為高度多聚vWF蛋白質且包含至少約30 mU/μg之利黴素比活性。

在上述rVWF組成物之一特定具體實例中，重組vWF蛋白質之利黴素輔因子比活性為至少約50 mU/μg。

在上述rVWF組成物之一特定具體實例中，重組vWF蛋白質之利黴素輔因子比活性為約30 mU/μg至約100 mU/μg。

在上述rVWF組成物之一特定具體實例中，重組vWF蛋白質包含約14至約22個二聚體。

在一態樣中，本發明提供一種用於生產高分子量重組vWF蛋白質之細胞培養溶液，該細胞培養溶液包含：包含至少約2.4 μg/L之銅濃度的細胞培養基；包含小於10 mM之銨濃度的細胞培養物上清液；及複數個表現高度多聚vWF蛋白質之細胞，其中vWF蛋白質包含約14至約22個二聚體及至少約30 mU/μg之利黴素比活性。

在一態樣中，本發明係關於用於生產呈具有高比活性之高度多聚形式之重組高分子量vWF的細胞培養條件。本發明之細胞培養條件可包括例如具有增加之銅濃度的細胞培養基及具有低銨(NH₄ ⁺)濃度之細胞培養物上清液。本發明亦提供在細胞培養條件中培養細胞以表現具有高比活性之高分子量vWF之方法。

在一態樣中，本發明包括用於生產高分子量重組vWF之細胞培養溶液，該細胞培養溶液包含：包含至少約2.4 μg/L之銅濃度的細胞培養基；包含小於10 mM之銨濃度的細胞培養物上清液；及複數個表現高度多聚vWF之細胞，該高度多聚vWF包含約14至約22個二聚體及至少約30mU/μg之利黴素比活性。在上述細胞培養溶液之一具體實例中，至少10% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在一特定具體實例中，至少15% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少20% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少25% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少30% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在某些具體實例中，銅濃度可為至少約4 μg/L或銅濃度可在約2.4 μg/L至約20 μg/L範圍內。在一些具體實例中，細胞培養基包含含銅之培養基補充物。在某些具體實例中，培養基補充物可包含水解產物或銅鹽、銅螯合物或其組合。在一些具體實例中，銅鹽可包括硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅或氧化銅。在某些具體實例中，細胞可來自連續細胞系且可包括哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。在一些具體實例中，重組vWF之利黴素輔因子比活性為至少約50 mU/μg或利黴素輔因子比活性可在約30 mU/μg至約100 mU/μg範圍內。

在另一態樣中，本發明包括一種生產高分子量重組vWF之方法，其包含：a)提供細胞培養物；b)引入編碼vWF之核酸序列；c)選擇載運核酸序列之細胞；及d)在包含銅濃度為至少約2.4 μg/L之細胞培養基及銨濃度小於約10 mM之細胞培養物上清液的細胞培養條件下於細胞中表現vWF，其中vWF為包含約14至約22個二聚體及至少約30 mU/μg之利黴素比活性的高度多聚vWF。在上述細胞培養物上清液之一具體實例中，至少10% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在一特定具體實例中，至少15% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少20% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少25% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少30% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在一些具體實例中，細胞可來自連續細胞系且可包括哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。在某些具體實例中，銅濃度可為至少約4 μg/L或銅濃度可在約2.4 μg/L至約20 μg/L範圍內。在一些具體實例中，細胞培養基包含含銅之培養基補充物。在某些具體實例中，培養基補充物可包含水解產物或銅鹽、銅螯合物或其組合。在一些具體實例中，銅鹽可包括硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅或氧化銅。在一些具體實例中，重組vWF之利黴素輔因子比活性為至少約50 mU/μg或利黴素輔因子比活性可在約30 mU/μg至約100 mU/μg範圍內。

在又一態樣中，本發明包括藉由一種方法生產之高分子量重組vWF，該方法包含以下步驟：a)提供細胞培養物；b)引入編碼vWF之核酸序列；c)選擇載運核酸序列之細胞；及d)在包含銅濃度為至少2.4 μg/L之細胞培養基及銨濃度小於10 mM之細胞培養物上清液的細胞培養條件下於細胞中表現vWF，其中vWF為包含約14至約22個二聚體及至少約30 mU/μg之利黴素比活性的高度多聚vWF。在上述細胞培養物上清液之一具體實例中，至少10% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在一特定具體實例中，至少15% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少20% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少25% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少30% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在一些具體實例中，細胞可來自連續細胞系且可包括哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。在某些具體實例中，銅濃度可為至少約4 μg/L或銅濃度可在約2.4 μg/L至約20 μg/L範圍內。在一些具體實例中，細胞培養基包含含銅之培養基補充物。在某些具體實例中，培養基補充物可包含水解產物或銅鹽、銅螯合物或其組合。在一些具體實例中，銅鹽可包括硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅或氧化銅。在一些具體實例中，重組vWF之利黴素輔因子比活性為至少約50 mU/μg或利黴素輔因子比活性可在約30 mU/μg至約100 mU/μg範圍內。

在一態樣中，本發明提供一種包含重組馮威里氏因子(rVWF)之組成物，其利黴素輔因子比活性為至少30 mU/μg。在一較佳具體實例中，組成物之利黴素輔因子比活性為至少40 mU/μg。在一更佳具體實例中，組成物之利黴素輔因子比活性為至少50 mU/μg。在一更佳具體實例中，組成物之利黴素輔因子比活性為至少60 mU/μg。在一更佳具體實例中，組成物之利黴素輔因子比活性為至少70 mU/μg。在一更佳具體實例中，組成物之利黴素輔因子比活性為至少80 mU/μg。

在上述組成物之一具體實例中，組成物中至少10% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在一特定具體實例中，至少15% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少20% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少25% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。在另一特定具體實例中，至少30% rVWF以具有超過10個二聚體之高分子量VWF多聚體形式存在。

在上述組成物之一具體實例中，組成物包含培養物上清液。在一特定具體實例中，培養物上清液為哺乳動物細胞培養物上清液。在一更特定具體實例中，哺乳動物細胞培養物上清液為CHO細胞上清液。

在上述組成物之一具體實例中，於包含至少2.4 μg/L銅之細胞培養物中表現rVWF。在一特定具體實例中，細胞培養物包含至少4 μg/L銅。在一更特定具體實例中，培養物包含2.4 μg/L至20 μg/L銅。在一具體實例中，銅以銅鹽、銅螯合物或其組合形式提供。在一特定具體實例中，銅鹽係選自由硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅及氧化銅組成之群。

在上述組成物之一具體實例中，細胞培養為分批培養。

在上述組成物之一具體實例中，細胞培養為連續培養。在一特定具體實例中，以恆化模式進行連續培養。在另一特定具體實例中，以灌注模式進行連續培養。

在上述組成物之一具體實例中，培養物中NH₄ ⁺之含量維持於低於4 mM之濃度下。

在上述組成物之一具體實例中，培養物之細胞密度維持於小於2.5×10⁶個細胞/毫升下。

在上述組成物之一具體實例中，培養物之細胞密度維持於小於2.0×10⁶個細胞/毫升下。

在上述組成物之一具體實例中，培養物維持於小於1.5×10⁶個細胞/毫升下。

在上述組成物之一具體實例中，rVWF與重組因子VIII(rFVIII)共表現。在一特定具體實例中，移除大部分共表現之rFVIII。在一更特定具體實例中，組成物中rVWF與rFVIII之比率為至少10:1。

在上述組成物之一具體實例中，組成物經調配以用於醫藥投予。在一特定具體實例中，組成物經調配以用於靜脈內、皮下或肌肉內投予。

在上述組成物之一具體實例中，組成物經凍乾。

在又一態樣中，本發明包括藉由一種方法生產之高分子量重組vWF，該方法包含以下步驟：a)提供細胞培養物；b)引入編碼vWF之核酸序列；c)選擇載運核酸序列之細胞；及d)在包含銅濃度為至少2.4 μg/L之細胞培養基及銨濃度小於10 mM之細胞培養物上清液的細胞培養條件下於細胞中表現vWF，其中vWF為包含約14至約22個二聚體及至少約30 mU/μg之利黴素比活性的高度多聚vWF。應瞭解，以上「細胞培養基」及「生產重組vWF之方法」部分中描述之所有具體實例及濃度均可適用於此處。

本發明之重組vWF可包括具有高比活性之高分子量重組vWF。在一具體實例中，本發明之vWF為vWF之高度多聚形式。在一些具體實例中，vWF之高度多聚形式包括至少多達約14個二聚體且在其他具體實例中包括至少多達約22個二聚體。在其他具體實例中，vWF之高度多聚形式可在約10至約20個二聚體，或約15至約25個二聚體，或約20至約40個二聚體範圍內。在某些具體實例中，重組vWF可與血漿vWF相比。

如本文中所描述，本發明提供如下意外結果：細胞培養基中增加之銅濃度可產生具有高比活性之高分子量vWF。與無銅培養基相比，包含例如大於約2.4 μg/L之銅濃度的細胞培養基可增加重組多聚vWF之產率。在某些具體實例中，多聚vWF(亦即包含至少2個二聚體之rVWF)之百分比可大於約50%，或大於約75%，或大於約90%。可使用標準技術，諸如在非還原條件下於瓊脂糖電泳中，分析vWF之多聚體分佈。

如本文中提供，藉由本發明方法生產之重組vWF可具有高比活性，例如高利黴素輔因子比活性。在一具體實例中，藉由本發明方法生產之重組vWF可包括至少30 mU/μg且在另一具體實例中至少50 mU/μg之利黴素輔因子比活性。在其他具體實例中，利黴素輔因子比活性可在約30 mU/μg至約100 mU/μg或約50 mU/μg至約100 mU/μg範圍內。

B.　重組ADAMTS13(rA13)

ADAMTS蛋白質(亦即ADAMTS-1至ADAMTS-20)為分泌之鋅金屬蛋白酶家族，其享有共同模組域組織(關於評述參見Flannery C.R.,Front Biosci. 2006年1月1日；11:544-69)。所有ADAMTS蛋白質均享有共同核心域架構，該核心域架構由信號肽、接著前結構域、鋅依賴性金屬蛋白酶催化域、去整合素樣域、I型凝血栓蛋白重複、半胱胺酸富集域及間隔域組成(Apte S.S.,J Biol Chem. 2009年11月13日；284(46):31493-7)。此外，除ADAMTS-4外所有ADAMTS蛋白質均含有至少另一個I型凝血栓蛋白重複域且許多ADAMTS蛋白質含有一或多個額外輔助域。應注意，已報導所有ADAMTS蛋白質似乎均含有位於金屬蛋白酶催化域內的至少1個鈣結合位點及至少1個鋅結合位點(Andreini等人,J. Proteome Res.,2005,4(3),第881-888頁)。

已報導ADAMTS蛋白質對多種疾病及病狀之生物學作用，包括抗血管生成、腎間質性纖維化、骨重塑、卵巢濾泡生成、動脈粥樣硬化、泌尿生殖發育及腫瘤生長/重塑(ADAMTS-1)；7C型艾登二氏症候群(Ehler-Danlos syndrome type 7C)及牛皮膚脆裂症(bovine dermatopraxis)(ADAMTS-2)；關節炎、動脈粥樣硬化及肌腱病(ADAMTS-4)；關節炎及神經膠母細胞瘤(ADAMTS-5)；關節炎(ADAMTS-7)；抗血管生成、腦部惡性腫瘤、關節炎及動脈粥樣硬化(ADAMTS-8)；關節炎(ADAMTS-9、ADAMTS-12)；血栓性血小板減少性紫癜(ADAMTS-13)；及抗血栓形成/中風(ADAMTS18)(關於評述參見Lin及Liu,Open Access Rheumatology Research and Reviews 2009:1 121-131)。

先前已於哺乳動物細胞中表現重組ADAMTS13(A13)，然而比活性視細胞培養條件而廣泛變化。已發現許多市售培養基不足以表現具有高比活性之rA13，比活性表示為活性(由FRETS-VWF73檢定量測)與抗原含量(如ELISA所測定)之比率。在一態樣中，本文中提供之方法係基於細胞培養物可表現具有增加之總活性量及比活性量之rA13的若干有利發現。

因此，歸因於分泌之金屬蛋白酶之ADAMTS家族之間的共享結構功能關係，本發明提供之方法使所有ADAMTS蛋白質均可在細胞培養物中表現且自細胞培養基回收。

在一態樣中，本發明提供一種包含重組ADAMTS13(rA13)之組成物，其FRETS-VWF比活性為至少1600 mU/μg。

在上述組成物之一具體實例中，rA13之FRETS-VWF比活性為至少800 mU/μg。

在上述組成物之一具體實例中，於包含至少1 μg/L銅之細胞培養物中表現rA13。在一特定具體實例中，細胞培養物包含至少2 μg/L銅。在一更特定具體實例中，培養物包含2 μg/L至20 μg/L銅。

在上述組成物之一具體實例中，銅以銅鹽、銅螯合物或其組合形式提供。在一特定具體實例中，銅鹽係選自由硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅及氧化銅組成之群。

在上述組成物之一具體實例中，細胞培養為分批培養。

在上述組成物之一具體實例中，培養物之細胞密度維持於小於4.0×10⁶個細胞/毫升下。在一特定具體實例中，培養物之細胞密度維持於小於3.0×10⁶個細胞/毫升下。在一特定具體實例中，培養物之細胞密度維持於小於2.0×10⁶個細胞/毫升下。在一更特定具體實例中，培養物之細胞密度維持於小於1.5×10⁶個細胞/毫升下。

在上述組成物之一具體實例中，組成物經凍乾。

VI.調配物

在一態樣中，包含本發明之重組治療性蛋白質rVWF或rA13之調配物在投予前經凍乾。使用此項技術中常用技術進行凍乾且應針對研發之組成物最佳化[Tang等人,Pharm Res. 21:191-200,(2004)及Chang等人,Pharm Res. 13:243-9(1996)]。

製備醫藥調配物之方法可包括以下步驟中之一或多者；在凍乾前向該混合物中添加如本文中所描述之穩定劑；在凍乾前向該混合物中添加至少一種選自增積劑、滲透壓濃度調節劑及界面活性劑(各如本文中所描述)之試劑。在一態樣中，凍乾調配物至少包含緩衝劑、增積劑及穩定劑中之一或多者。在此態樣中，評估界面活性劑之效用且在凍乾步驟期間或復原期間凝集造成問題之情況下選擇使用。包括適當緩衝劑以使調配物在凍乾期間維持於穩定pH值區域內。

凍乾物質之標準復原方法為回添一定體積之純水或無菌注射用水(WFI)(典型地等於凍乾期間移除之體積)，不過用於非經腸投予之醫藥劑的生產中有時使用稀抗菌劑溶液[Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,18:1311-1354(1992)]。因此，提供製備復原之重組VWF組成物之方法，其包含向本發明之凍乾重組VWF組成物中添加稀釋劑之步驟。

凍乾物質可復原為水溶液。可使用多種水性載劑，例如無菌注射用水、用於多次給藥用途之含防腐劑之水或含適量界面活性劑之水(例如含有活性化合物與適於製造水性懸浮液之賦形劑混合的水性懸浮液)。在多個態樣中，該等賦形劑為懸浮劑，例如且不限於羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑為天然存在之磷脂(例如且不限於卵磷脂)，或環氧烷與脂肪酸之縮合產物(例如且不限於聚氧乙烯硬脂酸酯)，或環氧乙烷與長鏈脂族醇之縮合產物(例如且不限於十七伸乙基氧基十六醇)，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己醣醇之偏酯之縮合產物(諸如聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)，或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己醣醇酐之偏酯之縮合產物(例如且不限於聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。在多個態樣中，水性懸浮液亦含有一或多種防腐劑，例如且不限於對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯。

為向人類或測試動物投予組成物，在一態樣中，組成物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑。片語「醫藥學上」或「藥理學上」可接受係指當使用如下文描述之此項技術中熟知的途徑投予時穩定，抑制蛋白質降解(諸如凝集及裂解產物)且此外不產生過敏性或其他不良反應之分子實體及組成物。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有臨床有效溶劑、分散介質、塗料、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物，包括上文揭示之試劑。

醫藥調配物可靜脈內、經口、局部、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、經陰道、經直腸或藉由顱內注射投予。如本文中所用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸注技術。亦考慮藉由靜脈內、皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及/或特定部位之外科手術植入來投予。通常，組成物基本上不含熱原以及其他可能對接受者有害的雜質。

以治療醫師選擇之劑量及模式進行組成物之單次或多次投予。對於疾病之預防或治療，適當劑量視所治療疾病之類型、疾病之嚴重性及病程、投予藥物係出於預防目的還是治療目的、先前療法、患者病史及對藥物之反應以及主治醫師之判斷而定。

在一態樣中，藉由開始快速給藥(bolus)接著連續輸注來投予本發明調配物以維持治療循環量之藥物產品。作為另一實例，本發明之化合物以單次劑量投予。如根據優良醫療實踐及個別患者之臨床病狀確定，一般技術者將易於最佳化有效劑量及投予方案。給藥頻率視藥劑之藥理動力學參數及投予途徑而定。最佳醫藥調配物由熟習此項技術者根據投予途徑及所需劑量確定。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(1990,Mack Publishing公司,Easton,Pa. 18042)第1435-1712頁，其揭示內容以引用的方式併入本文中。該等調配物影響所投予劑之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。視投予途徑而定，根據體重、體表面積或器官大小計算適合劑量。可經由使用測定血液水準之劑量之已建立檢定結合適當劑量-反應資料來確定適當劑量。最終給藥方案由主治醫師考慮改變藥物作用之多種因素(例如藥物比活性；損害嚴重性及患者反應；患者年齡、病狀、體重、性別及飲食；任何感染之嚴重性；投予時間及其他臨床因素)確定。作為實例，本發明之重組vWF之典型劑量為約50 U/kg，等於500 μg/kg。隨著研究進行，將出現關於治療各種疾病及病狀之適當劑量及持續時間的其他資訊。

VII.治療方法

本發明進一步考慮治療需要根據本文中描述之方法生產之rVWF或rA13之患者的方法。該等治療方法可包括投予包含本發明之重組rA13或高分子量重組vWF之醫藥調配物。

在另一態樣中，本發明提供用於治療性或預防性處理之方法，其包含投予本文中提供之rVWF或rA13組成物。通常，對於治療性應用，調配物係以「治療有效劑量」投予罹患與ADAMTS13或VWF功能障礙有關之疾病或病狀或以其他方式有需要之個體。有效用於該等用途之調配物及量將視疾病或病狀之嚴重性及患者一般健康狀況而定。可視患者所需及耐受之劑量及頻率單次或多次投予調配物。

在一具體實例中，本發明提供治療或預防與ADAMTS13或VWF功能障礙有關之疾病或病狀的方法。在另一具體實例中，可投予包含重組vWF之醫藥調配物以治療與vWF有關之疾病，諸如馮威里氏病或血友病。在另一具體實例中，本發明提供治療或預防與一或多個血栓之形成及/或存在有關之疾病或病狀的方法，其包含投予本文中提供之rA13組成物。在另一具體實例中，本發明提供使有需要之個體中之一或多個血栓崩解的方法。在其他具體實例中，本發明提供治療或預防有需要之個體之梗塞的方法。通常，本發明提供之方法包含投予有需要之個體本文中提供之rADAMTS13組成物。

與一或多個血栓之形成及/或存在有關之病症的非限制性實例為遺傳性血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、後天性TTP、動脈血栓症、急性心肌梗塞(AMI)、中風、敗血症及散播性血管內凝血(DIC)。

與梗塞形成有關之病症之非限制性實例包括(但不限於)心肌梗塞(心臟病發作)、肺栓塞、腦血管事件(諸如中風)、周邊動脈阻塞性疾病(諸如壞疽)、抗磷脂症候群、敗血症、巨細胞動脈炎(GCA)、疝氣及腸扭結。

VIII.實施例

現將於以下實施例中進一步說明本發明且不限制本發明。

實施例1

使用表現vWF之重組CHO細胞系之培養物進行灌注培養及連續懸浮實驗。基本培養基為含有約0.3 μg/L Cu²⁺之DMEM/F12。向培養基中補充大豆水解產物及硫酸銅(CuSO₄‧5H₂O)，使得培養基中最終銅濃度大於至少2.4 μg/L。

藉由灌注及連續懸浮細胞培養物培養表現vWF之重組CHO細胞，使得銨含量(NH₄ ⁺)保持於小於約10 mM之濃度下。發現提供連續供應之培養基的生產系統(例如灌注或恆化培養)為較佳，因為習知分批或分批補料技術在培養結束時會產生高NH₄ ⁺濃度。培養結束時，分離高度多聚vWF且量測vWF之利黴素輔因子比活性。

實施例2

重組因子VIII(rFVIII)及馮威里氏因子(rVWF)於GD8/6細胞之分批培養物中共表現以測定培養基之組成對VWF表現及活性之作用。簡言之，在補充及未補充銅的情況下於由改良之DMEM/F12基本粉末(表5)及亦含有4 g/L大豆水解產物之其他補充物(參見表6)構成之BAV-SP培養基中分批培養GD8/6細胞。為測試低銅濃度對rVWF表現及活性之作用，使用基本BAV-SP培養基。基本培養基含有0.3 μg/L銅且補充有大豆水解產物(其貢獻額外0.7 μg/L銅，如以實驗方式測定)，使得最終銅濃度為1.0 μg/L。作為比較，向用於分批培養之BAV-SP培養基中進一步補充額外3.3 μg/L Cu²⁺，使得最終銅濃度為4.3 μg/L以測定高銅濃度對VWF表現及活性之作用。

表現rVWF之GD8/6細胞以分批模式於低銅培養基(表7)或高銅培養基(表8)中生長7天。經由利黴素輔因子檢定每天測試培養物上清液樣品之rVWF含量(vWF ELISA)、總活性(利黴素)及比活性(比活性)。亦每天(除第3天及第4天外)監測多種培養物參數，包括細胞計數、細胞活力及銨濃度。

意外地，在高銅濃度下生長之細胞培養物產生含有顯著較高rVWF總活性及rVWF比活性之上清液(比較結果示於表7及表8中)。舉例而言，在第4天，與低銅培養物下每毫升0.2 IU rVWF活性相比，在高銅濃度下生長之細胞培養物每毫升含有1.52 IU rVWF活性。此與低銅細胞培養物產生之rVWF量近乎高銅細胞培養物2倍的事實無關。此外，自高銅培養物獲得之上清液之比活性為低銅培養物上清液之比活性的13倍(831 mU/10 μg rVWF對62 mU/10 μg rVWF)。

如表7及表8中所示，在第1天，高銅培養物之利黴素輔因子總活性及利黴素輔因子比活性為低銅培養物的2倍。此外，與高銅培養物中觀測到的活性隨後增加相反，第1天後在低銅細胞培養物中未發現利黴素輔因子活性量增加。與此結果一致，rVWF多聚體狀態之瓊脂糖凝膠電泳分析表明，在第1天低銅細胞培養物之上清液中存在低濃度之高分子量rVWF(相對於低分子量rVWF物質之濃度)，且相對濃度隨時間推移而進一步降低(圖1)。相反，向培養基中補充Cu²⁺會始終形成利黴素輔因子(RiCoF)活性抗原至第4天。至分批培養之第4天，穩定高分子量rVWF多聚體量始終未有損失(圖1)。圖1A中展示之瓊脂糖電泳凝膠之密度測定結果表明，在低銅條件下，培養物僅能在2天內產生其中超過10%的rVWF呈具有超過10個二聚體之分子形式的rVWF群體，且應注意，該群體在培養第6天降至僅4%。相反，在高銅條件下，至培養第6天，具有超過10個二聚體之vWF多聚體之相對量始終為約30%(28%至31.4%)。

應注意，自高銅分批培養之第5天開始，當NH₄ ⁺含量超過100 mg/L(大於約5.0 mM)時，額外抗原(18.3至35.4 μg/L；比較表8之第4天與第5天)之表現未引起上清液中RiCoF活性伴隨增加。與此結果一致，相對於低分子量rVWF多聚體之濃度，第5天(培養第7天)時高分子量rVWF多聚體之含量降低。亦僅在第5天(培養第7天)時具有超過10個二聚體之vWF之相對量降至21.4%。

總而言之，以上提供之資料表明向表現rVWF之細胞培養物中補充銅濃度可顯著增加rVWF利黴素輔因子總活性及rVWF利黴素輔因子比活性以及穩定產生高分子量rVWF多聚體。此外，資料展示細胞培養物中高NH₄ ⁺濃度與rVWF利黴素輔因子活性損失及高分子量rVWF多聚體產生降低之間的相關性。

實施例3

重組因子VIII(rFVIII)及馮威里氏因子(rVWF)於在恆化條件下操作之GD8/6細胞之連續培養物中共表現以測定培養基之組成對VWF表現及活性之作用。簡言之，在補充銅及未補充銅的情況下於含有4 g/L大豆水解產物之BAV-SP培養基中培養GD8/6細胞。為測試低銅濃度對rVWF表現及活性之作用，使用基本BAV-SP培養基。基本培養基含有0.3 μg/L銅且補充有大豆水解產物(其貢獻額外0.7 μg/L銅)，使得最終銅濃度為1.0 μg/L。作為比較，向用於分批培養之BAV-SP培養基中進一步補充額外3.3 μg/L Cu²⁺，使得最終銅濃度為4.3 μg/L以測定高銅濃度對VWF表現及活性之作用。在高(2.8×10⁶個細胞/毫升)及低(約1.4×10E06個細胞/毫升)細胞密度下培養在高銅濃度及低銅濃度下生長之培養物。

同前，經由利黴素輔因子檢定測試培養物上清液樣品之rVWF含量(vWF ELISA)、總活性(利黴素)及比活性(比活性)。亦監測多種培養物參數，包括細胞計數、細胞活力及銨濃度。自恆化培養之第2週及第3週穩態階段獲得數據(表9至表13)。

如圖2A所示，自低細胞密度及高銅濃度下生長之連續rVWF細胞培養物收集之上清液含有高比活性(平均值為600 mU/10 μg)，而自高銅濃度或低銅濃度下以高細胞密度生長之rVWF細胞培養物及低銅濃度下以低細胞密度生長之rVWF細胞培養物收集之上清液含有低比活性(小於100 mU/10 μg)。與分批培養之觀測結果一致，圖2B展示表現具有高比活性之rVWF的連續哺乳動物細胞培養物之NH₄ ⁺濃度比產生具有低比活性之rVWF的培養物低。該資料進一步加強細胞培養物中NH₄ ⁺濃度與培養物產生之rVWF之比活性之間的相關性。應注意，細胞培養物中高銅濃度與低銨濃度之組合可顯著改良rVWF活性。

與此結果一致，恆化培養物之rVWF多聚體狀態之瓊脂糖凝膠電泳分析(圖6)表明，僅來自在高銅及低細胞密度且因此低銨濃度下操作之培養物之上清液始終表現高度多聚vWF(在CST第8、17及24天時約23%至27%)。所有其他條件均未在長時間培養期內始終獲得超過10%高量的具有超過10個二聚體之vWF。

實施例4

為測定培養基銅濃度對rA13之表現及比活性之作用，表現rA13之哺乳動物細胞培養物於銅濃度在0.66 μg/L(無額外銅補充)至額外銅補充至4 μg/L範圍內的改良之DMEM/F12基本培養基BESP845(表14)中在恆化連續培養條件下生長超過4週。如表15中所示，增加細胞培養基中之銅濃度引起體積生產率(P)及比生產率(q)顯著增加，體積生產率及比生產率分別表示為每公升培養物每天產生之總rA13活性及每個細胞每天產生之總rA13活性。

為測定增加之銅濃度是否影響表現之rA13之完整性，藉由SDS-PAGE分析檢驗自於含有0.66 μg/L、1 μg/L及4 μg/L銅之培養基中生長之rA13細胞培養物收集之上清液。如圖3A(銀染色法)及圖3B(抗A13西方墨點法)所示，藉由凝膠電泳未觀測到產物品質之顯著變化。特定言之，在增加之銅濃度下截短之170 kD或其他低MW rA13變異體之含量未增加且rA13表現未產生其他額外或增加之HCP亮帶。

為估計對rA13活性而言之最佳銅濃度，來自表15之P Frets對銅濃度之資料之外推(圖4)表明可能在約2 μg/L下獲得最佳作用，且保守估計在高於約4 μg/L時出現負面作用。

基於以上所得結果，進行另一實驗，其比較含有0.66 μg/L銅之細胞培養基中rA13之表現與含有2.0 μg/L銅之細胞培養基中rA13之表現。如表16所示，向基本細胞培養基中補充銅至最終濃度為2.0 μg/L銅引起在8週時間內體積生產率(P)及比生產率(q)顯著增加，體積生產率及比生產率分別表示為每公升培養物每天產生之總rA13活性及每個細胞每天產生之總rA13活性。兩種培養物中每週rA13產生之特定資料展示於圖5中。由該等資料可見銅補充對細胞代謝、比生長速率及rA13生產率具有可量測之有益作用。

應瞭解，本文中所描述之實施例及具體實例僅出於說明性目的且熟習此項技術者將根據其進行各種修改或變化且該等修改或變化將包括於本申請案之精神及權限以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文中引用之所有公開案、專利及專利申請案均出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。

圖1.　(1A)在存在低(1.0 μg/L)銅濃度及高(4.3 μg/L)銅濃度下之哺乳動物細胞培養物中表現之rVWF的低解析度(1%)瓊脂糖凝膠電泳。注意培養第3天等同於表7及表8中之分批培養第1天。(1B)如由圖1A中界定之亮帶指示，藉由光密度分析定量具有1至10個二聚體及超過10個二聚體之VWF多聚體之相對量。

圖2.　(2A)在存在高或低含量銅下以高及低細胞密度生長之rVWF細胞培養物上清液中存在之平均rVWF比活性的區間圖。(2B)在存在高或低含量銅下以高及低細胞密度生長之rVWF細胞培養物上清液中發現之平均NH₄ ⁺濃度的區間圖。

圖3.　藉由SDS-PAGE分析研究在銅含量增加下表現重組ADAMTS13之細胞培養物的上清液。在SDS-PAGE後藉由(3A)銀染色及(3B)抗A13西方墨點法觀察rA13。

圖4. P Frets資料與銅濃度之關係圖，其展示銅濃度對rA13活性之最佳作用之外推(實線)。

圖5A-K. 表現rA13之連續懸浮(恆化)細胞培養物之柱狀圖，其比較基本銅含量(0.66μg/L)之作用與補充2μg/L銅之培養物之作用。各柱表示一週恆化培養之平均數據。圖例係指資料中呈現之具體週數。

圖6. (6A)在高及低細胞密度下在存在低(1.0μg/L)及高(4.3μg/L)銅濃度下之哺乳動物細胞培養物中表現之rVWF的低解析度(1%)瓊脂糖凝膠電泳。(6B)如由圖6A中界定之亮帶指示，藉由光密度分析定量具有1至10個二聚體及超過10個二聚體之VWF多聚體之相對量。

Claims

一種生產重組ADAMTS13(rA13)組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)提供基本細胞培養基；(b)向該基本細胞培養基補充銅，使得最終銅濃度為1μg/L至6μg/L；(c)提供一或多種包含編碼rA13蛋白質之核酸的細胞；(d)於該補充銅之細胞培養基中培養該一或多種細胞，使得rA13被表現且自該等細胞分泌至培養物上清液中；及(e)回收至少一部分該培養物上清液，其中該細胞培養物上清液之NH₄ ⁺含量被維持於低於10mM之濃度，其中該回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少1500單位FRETS-VWF73活性。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該基本細胞培養基為不含動物蛋白質之培養基。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該基本細胞培養基為不含蛋白質之培養基。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該基本細胞培養基為化學限定培養基。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度為至少2μg/L銅。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度為至少4μg/L銅。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度介於2μg/L與4μg/L銅之間。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該經補充之基本細胞培養基之最終銅濃度為從1.7μg/L至2.6μg/L。
如申請專利範圍第1項之方法，其中補充該基本細胞培養基之銅係以銅鹽、銅螯合物或其組合提供。
如申請專利範圍第9項之方法，其中該銅鹽係選自由硫酸銅、乙酸銅、碳酸銅、氯化銅、氫氧化銅、硝酸銅及氧化銅組成之群。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種細胞為哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第11項之方法，其中該等哺乳動物細胞為CHO細胞。
如申請專利範圍第1項之方法，其中培養該一或多種細胞包含該等細胞之分批培養。
如申請專利範圍第1項之方法，其中培養該一或多種細胞包含該等細胞之連續培養。
如申請專利範圍第14項之方法，其中該等細胞之連續培養係以恆化模式進行。
如申請專利範圍第14項之方法，其中該等細胞之連續培養係以灌注模式進行。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種細胞係培養於至少100L該經補充之基本細胞培養基中。
如申請專利範圍第1項之方法，其中細胞密度在該培養一或多種細胞之步驟期間被維持於小於每毫升2.5×10⁶個細胞。
如申請專利範圍第18項之方法，其中細胞密度在該培養一或多種細胞之步驟期間被維持於小於每毫升2.0×10⁶個細胞。
如申請專利範圍第18項之方法，其中細胞密度在該培養一或多種細胞之步驟期間被維持於小於每毫升1.5×10⁶個細胞。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該回收至少一部分培養物上清液之步驟包含過濾或離心以自該部分培養物上清液移除細胞。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2000單位FRETS-VWF73活性。
如申請專利範圍第22項之方法，其中該回收之培養物上清液中存在每天每公升經補充之基本細胞培養基至少2500單位FRETS-VWF73活性。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該回收之上清液具有至少1600mU/μg之rA13 FRETS-VWF73比活性。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該經補充之基本細胞培養基中之NH₄ ⁺含量被維持於低於4mM之濃度下。
如申請專利範圍第1項至第25項中任一項之方法，其中該方法進一步包含rA13富集步驟。