BR112020000322A2

BR112020000322A2 - uso de fator de von willebrand recombinante (rvwf)

Info

Publication number: BR112020000322A2
Application number: BR112020000322-0A
Authority: BR
Inventors: Miranda Chapman; Bruce Ewenstein; Bettina Ploder
Original assignee: Baxalta Incorporated; Baxalta GmbH
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2020-07-14
Also published as: EP3648787A1; US20190091298A1; CA3069256A1; JP2023085513A; US20240009279A1; KR20200037251A; JP7326246B2; JP2020526527A; US20220168397A1; RU2766118C2; CN111565741A; RU2020105681A3; AU2018298232A1; WO2019010496A1; RU2020105681A; CO2020001314A2; EP3648787B1

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para pré-tratar um sujeito com doença de von Willebrand grave antes de um procedimento cirúrgico que compreende administrar ao sujeito uma dose que varia de cerca de 20 IU/kg a cerca de 60 IU/kg de rVWF entre cerca de 12 horas e cerca de 24 horas antes do procedimento cirúrgico, e em que o fator VIII não é administrado com o rVWF antes do procedimento cirúrgico.

Description

1 / 145 USO DE FATOR DE VON WILLEBRAND RECOMBINANTE (RVWF)

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisória norte-americano nº 62/546.999, depositado em 17 de agosto de 2017 e Pedido de Patente Provisório norte-americano nº 62/530.024, depositado em 7 de julho de 2017, que são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As doenças de coagulação, tais como a Doença de von Willebrand (VWD) geralmente resultam de uma deficiência na cascata de coagulação. A Doença de von Willebrand (VWD) se refere ao grupo de doenças causadas por uma deficiência do fator de von Willebrand. O fator de von Willebrand ajuda as plaquetas do sangue a se aglomerarem e grudarem à parede do vaso sanguíneo, o que é necessário para a coagulação do sangue normal.

[003] A Doença de von Willebrand (VWD) é o distúrbio de sangramento herdado mais comum, com uma taxa de prevalência estimada de 1% (Veyradier A, et al., Medicine (Baltimore). 2016, 95(11):e3038). Entretanto, excluindo as formas mais brandas da doença, apenas cerca de 1/10.000 pacientes de fato requerem tratamento. O tratamento corrente para estas coagulopatias inclui uma terapia de reposição usando preparações farmacêuticas compreendendo o fator de coagulação normal.

[004] O VWF é uma glicoproteína circulante no plasma como uma série de multímeros variando no tamanho de cerca de 500 a 20.000 kD. O comprimento completo do cDNA do VWF foi clonado; o propolipeptídeo corresponde aos resíduos de aminoácido 23 a 764 do prepro-VWF de comprimento completo (Eikenboom et al (1995) Haemophilia 1, 77 90). As formas multiméricas do VWF são compostas de subunidades de polipeptídeo

2 / 145 de 250 kD ligadas juntas pelas ligações de dissulfeto. O VWF medeia a adesão de plaqueta inicial ao subendotélio da parede de vaso danificada, com os multímeros maiores exibindo atividade hemostática realçada. O VWF multimerizado se liga à glicoproteína da superfície das plaquetas Gp1bα, através de uma interação no domínio A1 do VWF, facilitando a adesão de plaqueta. Outros sítios no VWF medeiam a ligação à parede do vaso sanguíneo. Assim, o VWF forma uma ponte entre a plaqueta e a parede do vaso que é essencial para a adesão de plaqueta e hemostase primária sob condições de estresse de alto cisalhamento. Normalmente, as células endoteliais secretam formas poliméricas grandes de VWF e estas formas de VWF que têm um peso molecular mais baixo surgem da clivagem proteolítica. Os multímeros de massas moleculares excepcionalmente grandes são armazenados nos corpos de Weibel-Pallade das células endoteliais e liberados na estimulação pelos agonistas tais como trombina e histamina.

[005] Para os pacientes com VWD, é recomendado que eles sejam tratados com reposição do fator de von Willebrand (VWF) dada a necessidade para hemostase prolongada, particularmente em cirurgia maior (Mannucci PM e Franchini M., Haemophilia, 2017, 23(2):182-187; National Institutes of Health. National Heart, Lung, and Blood Institute. The Diagnosis, Evaluation, and Management of von Willebrand Disease NIH Publication No. 08-5832; dezembro, 2007). As terapias de VWF derivado de plasma contêm fator VIII (FVIII) e têm o potencial para o acúmulo de FVIII com dosagem repetida. VONVENDI® (fator de von Willebrand [recombinante], Shire, Westlake Village, CA) é o primeiro e único concentrado de VWF recombinante (rVWF) (Turecek PL, et al. Hamostaseologie. 2009;29(supl 1):S32-38; Mannucci PM, et al. Blood, 2013;122(5):648-657; Gill JC, et al. Blood, 2015;126(17):2038-2046).

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

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[006] A presente invenção provê métodos de pré-tratamento para um paciente com doença de von Willebrand severa antes da cirurgia usando- se 20 a 60 IU/kg de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) para o paciente entre 12 horas e 24 horas, por exemplo, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 12 horas e 24 horas, 14 horas e 24 horas, 16 e 24 horas, 18 horas e 24 horas ou 20 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e não usando Fator VIII (FVIII) com o rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, o método de pré-tratar compreende ainda usar no sujeito 5 a 90 IU/kg de rVWF 1 hora antes da cirurgia. Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com 70 a 200 IU de rVWF depois da cirurgia, com ou sem o pré-tratamento descrito acima. Em alguns casos, o procedimento cirúrgico é selecionado de um grupo consistindo de cirurgia maior, cirurgia menor e cirurgia oral.

[007] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com 35 a 60 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes de um procedimento cirúrgico maior. Em outras modalidades, o sujeito é administrado com 15 a 90 IU/kg de rVWF 1 hora antes do procedimento cirúrgico maior. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 150 a 220 IU/kg de rVWF depois de um procedimento cirúrgico maior. Em alguns casos, o sujeito passando por um procedimento cirúrgico maior é administrado com uma dosagem total de 220 a 320 IU/kg. Em alguns casos, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior e o pré-tratamento compreende usar pelo menos duas doses aproximadamente iguais de rVWF antes do procedimento cirúrgico. Por “aproximadamente igual” como aqui usado refere-se às doses que têm concentrações dentro de 1 a 15%, 2 a 14%, 3 a 13%, 4 a 12%, 5 a 11%, 6 a 10%, 7 a 9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% de diferença.

4 / 145

[008] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com 50 a 60 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes de um procedimento cirúrgico menor. Em outras modalidades, o sujeito é administrado com 5 a 50 IU/kg de rVWF 1 hora antes da cirurgia menor. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 70 a 150 IU/kg de rVWF depois de um procedimento cirúrgico menor. Em alguns casos, o sujeito passando por um procedimento cirúrgico menor é administrado com uma dosagem total de 100 a 220 IU/kg. Em alguns casos, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor, o pré-tratamento compreende usar pelo menos duas doses de rVWF antes do procedimento cirúrgico, em que a primeira dose é maior do que a segunda dose.

[009] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com 20 a 40 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes de um procedimento cirúrgico oral. Em outras modalidades, o sujeito é administrado com 20 a 50 IU/kg de rVWF 1 hora antes do procedimento cirúrgico oral. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 10 a 50 IU/kg de rVWF durante o procedimento cirúrgico oral. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 70 a 150 IU/kg de rVWF depois de um procedimento cirúrgico oral. Em alguns casos, o sujeito passando por um procedimento cirúrgico oral é administrado com uma dosagem total de 70 a 190 IU/kg. Em alguns casos, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral e o pré-tratamento compreende usar pelo menos duas doses de rVWF aproximadamente iguais antes do procedimento cirúrgico.

[0010] Outros objetivos, vantagens e modalidades da invenção estarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A FIG. 1 mostra a eficiência hemostática global (ponto final primário) nos pacientes do estudo.

[0012] A FIG. 2 mostra a eficiência hemostática (ponto final

5 / 145 secundário) nos pacientes do estudo.

[0013] A FIG. 3 mostra demografia de linha de base e características clínicas.

[0014] A FIG. 4 mostra parâmetros PK para VWF:RCo (n = 11).

[0015] A FIG. 5A e FIG. 5B mostra VWF:RCo média e Níveis Endógenos de FVIII:C em resposta ao rVWF 50±5 IU rVWF:RCo/kg em todos os pacientes com VWD com dados de PK analisados (n = 11) (FIG. 5A) e o subconjunto de pacientes com VWD Tipo 3 (n = 5) (FIG. 5B).

[0016] A FIG. 6 mostra sequências de ácido nucleico e aminoácido de VWF.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Introdução

[0017] A presente invenção provê métodos para pré-tratar um paciente com doença de von Willebrand severa antes da cirurgia usando-se o fator de von Willebrand recombinante (rVWF) no paciente de 45 a 60 IG/kg de rVWF sem usar o Fator VIII com o rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em alguns casos, o procedimento cirúrgico é selecionado de um grupo consistindo de cirurgia maior, cirurgia menor e cirurgia oral.

[0018] A divulgação da Publicação do Pedido PCT nº WO2012/171031 é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos. Definições

[0019] Como aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “um anticorpo” inclui uma pluralidade de tais anticorpos e referência a “uma célula hospedeira” inclui referência a uma ou mais células hospedeiras e seus equivalentes conhecido por aqueles versados na técnica e assim por diante. É mencionado ainda que as reivindicações podem ser projetadas para excluir

6 / 145 quaisquer elementos opcionais. Como tal, esta declaração é intencionada a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como “unicamente”, “apenas” e similares em conexão com a citação de elementos de reivindicação ou uso de uma limitação “negativa”.

[0020] Antes da invenção ser adicionalmente descrita, deve ser entendido que essa invenção não é limitada às modalidades particulares descritas, visto que tais podem, naturalmente, variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever modalidades particulares e não é intencionada a ser limitante, visto que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0021] Os termos “pré-propeptídeo VWF”, “pré-pró-VWF” ou “pró- VWF” referem-se a um polipeptídeo de VWF não maduro compreendendo um peptídeo de sinal de cerca de 22 resíduos de aminoácido, um propeptídeo de VWF de cerca de 741 resíduos de aminoácido e uma subunidade de VWF madura de cerca de 2050 resíduos de aminoácido. As subunidades pró-VWF podem dimerizar através das ligações de dissulfeto próximo aos seus terminais carboxila no retículo endoplasmático para formar dímeros de cauda a cauda que são depois transportadas para o complexo de Golgi. No complexo de Golgi, ligações de dissulfeto de cabeça a cabeça adicionais são formadas próximo aos terminais amino das subunidades, formando deste modo multímeros. A clivagem proteolítica do propeptídeo de VWF ocorre por intermédio do processamento da protease furina, produzindo assim um complexo maduro de VWF/VWF-PP. Quando “r” é incluído antes da designação VWF, isto refere-se à versão recombinante. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos aplicam-se ao VWF recombinante (rVWF).

[0022] O termo “complexo de VWF” ou “complexo mat- VWF/VWF-PP” refere-se a uma estrutura heterodimérica não

7 / 145 covalentemente ligada compreendendo uma subunidade de VWF madura e propeptídeo de VWF. O complexo de VWF pode ser gerado como um produto da clivagem de furina entre a porção de propeptídeo e a porção de VWF maduro do pré-propeptídeo de VWF. Quando “r” é incluído antes da designação de VWF, este refere-se à versão recombinante. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos aplicam-se ao VWF recombinante (rVWF). Como aqui usado. “rVWF” refere-se ao VWF recombinante.

[0023] Como aqui usado, “rFVIII” refere-se ao FVIII recombinante.

[0024] O termo “recombinante” quando usado com referência, por exemplo, a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor, foram modificados pela introdução de uma proteína ou ácido nucleico heterólogo ou pela alteração de um ácido nucleico ou proteína nativos ou que a célula é derivada de uma célula deste modo modificada. Assim, por exemplo, as células recombinantes expressam genes que não são encontrados dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são por exemplo anormalmente expressos, sob expresso ou não expresso de modo algum.

[0025] Como aqui usado, “VWF recombinante” inclui VWF obtido via tecnologia de DNA recombinante. Em certas modalidades, as proteínas VWF da invenção podem compreender um construto, por exemplo, preparado como na WO 1986/06096 publicada em 23 de outubro de 1986 e pedido de patente norte-americano Nº de série 07/559.509, depositado em 23 de jul. De 1990, no nome de Ginsburg et al., que é aqui incorporada por referência com respeito aos métodos de produzir VWF recombinante. O VWF na presente invenção pode incluir todas as formas potenciais, incluindo as formas monoméricas e multiméricas. Também deve ser entendido que a presente invenção abrange formas diferentes de VWF a serem usadas em combinação. Por exemplo, o VWF da presente invenção pode incluir multímeros diferentes, derivados diferentes e tanto derivados

8 / 145 biologicamente ativos quanto derivados não biologicamente ativos.

[0026] No contexto da presente invenção, o VWF recombinante abrange qualquer membro da família do VWF de, por exemplo, um mamífero tal como um primata, ser humano, macaco, coelho, porco, roedor, camundongo, rato, hamster, gerbil, canino, felino e derivados biologicamente ativos dos mesmos. As proteínas de VWF mutantes e variantes tendo atividade também são abrangidas, como o são fragmentos funcionais e proteínas de fusão das proteínas de VWF. Além disso, o VWF da invenção pode compreender ainda etiquetas que facilitam a purificação, detecção ou ambos. O VWF aqui descrito pode ser adicionalmente modificado com uma porção terapêutica ou uma porção adequada imageando in vitro ou in vivo.

[0027] Como aqui usado, “VWF derivado de plasma (pdVWF)” inclui todas as formas da proteína encontradas no sangue incluindo o VWF maduro obtido de um mamífero tendo a propriedade de estabilizar in vivo, por exemplo a ligação, de pelo menos uma molécula de FVIII.

[0028] O termo “VWF altamente multimérico” ou “VWF de peso molecular alto” refere-se ao VWF compreendendo pelo menos 10 subunidades ou 12, 14 ou 16 subunidades, a cerca de 20, 22, 24 ou 26 subunidades ou mais. O termo “subunidade” refere-se a um monômero do VWF. Como é conhecido na técnica, geralmente são os dímeros do VWF que polimerizam para formar os multímeros de ordem mais alta (ver Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 2010, 36(5): 510-521 que é por meio deste incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações com respeito à análise de multímero do VWF).

[0029] Como aqui usado, o termo “Fator VIII” ou “FVIII” refere-se a qualquer forma de molécula do Fator VIII com as características típicas do Fator VIII de coagulação sanguínea, seja endógena para um paciente,

9 / 145 derivada do plasma sanguíneo ou produzido através do uso de técnicas de DNA recombinante e incluindo todas as formas modificadas do Fator VIII. O Fator VIII (FVIII) existe naturalmente e nas preparações terapêuticas como uma distribuição heterogênea de polipeptídeos que surgem de um único produto de gene (ver, por exemplo, Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:2979-2983 (1986)). Os exemplos comercialmente disponíveis de preparações terapêuticas contendo o Fator VIII incluem aquelas vendidas sob as marcas de HEMOFIL M, ADVATE e RECOMBINATE (disponíveis da Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, Ill., U.S.A.).

[0030] Como aqui usado, “atividade plasmática do FVIII” e “atividade in vivo do FVIII” são usados intercambiavelmente. A atividade in vivo do FVIII medida administrando ensaios padrão pode ser atividade endógena do FVIII, a atividade de um FVIII terapeuticamente administrado (recombinante ou derivado de plasma) ou atividade do FVIII tanto endógena quanto administrada. Similarmente, “FVIII plasmático” refere-se ao FVIII endógeno ou FVIII recombinante administrado ou derivado de plasma.

[0031] Como aqui usado “Doença de von Willebrand” se refere ao grupo de doenças causadas por uma deficiência do fator de von Willebrand. O fator de von Willebrand ajuda na aglomeração das plaquetas do sangue juntas e a grudar na parede do vaso sanguíneo, o que é necessário para a coagulação normal do sangue. Como aqui descrito em detalhes adicionais, existem diversos tipos de Doença de von Willebrand incluindo tipo 1, 2A, 2B, 2M e 3.

[0032] Os termos “isolado”, “purificado”, ou “biologicamente puro” refere-se ao material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrado no seu estado nativo. A pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas administrando técnicas químicas analíticas tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. VWF é a

10 / 145 espécie predominante presente em uma preparação e é substancialmente purificado. O termo “purificado” em algumas modalidades indica que um ácido nucleico ou proteína dá origem a essencialmente uma banda em um gel eletroforético. Em outras modalidades, o mesmo significa que o ácido nucleico ou proteína são pelo menos 50% puros, mais preferivelmente pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais puros. “Purificar” ou “purificação” em outras modalidades significam remover pelo menos um contaminante da composição a ser purificada. Neste sentido, a purificação não requer que o composto purificado seja homogêneo, por exemplo, 100% puro.

[0033] Como aqui usado, “administrar” (e todas os equivalentes gramaticais) incluindo administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea, administração oral, administração como um supositório, contato tópico, administração intraperitoneal, intralesional ou intranasal ou a implantação de um dispositivo de liberação lenta, por exemplo, uma bomba miniosmótica, a um sujeito. A administração é por qualquer via incluindo a parenteral e transmucósica (por exemplo, oral, nasal, vaginal, retal ou transdérmica). A administração parenteral inclui, por exemplo, intravenosa, intramuscular, intra-arteriolar, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular e intracraniana. Outros modos de distribuição incluem, mas não são limitados ao uso de formulações lipossômicas, infusão intravenosa, emplastros transdérmicos, etc.

[0034] Os termos “quantidade ou dose terapeuticamente eficazes” ou “quantidade ou dose terapeuticamente suficientes” ou “quantidade ou dose eficazes ou suficientes” referem-se a uma dose que produz efeitos terapêuticos para os quais a mesma é administrada. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco útil para tratar hemofilia pode ser a quantidade que é capaz de prevenir ou aliviar um ou mais sintomas associados com a hemofilia. A dose exata dependerá do propósito

11 / 145 do tratamento e será averiguável por uma pessoa versada na técnica administrando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); e Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edição, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

[0035] Como aqui usado, os termos “paciente” e “sujeito” são usados intercambiavelmente e se referem a um mamífero (preferivelmente ser humano) que tenha uma doença ou tenha o potencial de contrair uma doença.

[0036] Como aqui usado, o termo “cerca de” indica uma faixa aproximada de mais ou menos 10% de um valor especificado. Por exemplo, a linguagem “cerca de 20%” abrange uma faixa de 18 a 22%.

[0037] Como aqui usado, o termo “meia vida” refere-se ao período de tempo que leva para a quantidade de uma substância desintegrar (ou depurar de uma amostra ou de um paciente) para diminuir pela metade. I. Fator de von Willebrand recombinante (rVWF)

[0038] A presente invenção utiliza composições compreendendo o Fator de von Willebrand (rVWF) para o pré-tratamento de sujeitos com VWD severa que estejam passando por um procedimento cirúrgico, tal como, mas não limitado a cirurgia maior, cirurgia menor ou cirurgia oral.

[0039] Em certas modalidades, as proteínas do VWF da invenção podem compreender um construto, por exemplo, preparado como na WO 1986/06096 publicada em 23 de outubro de 1986 e pedido de patente norte- americano Nº de série 07/559.509, depositado em 23 de julho de 1990, no nome de Ginsburg et al., que é aqui incorporado por referência com respeito aos métodos de produzir VWF recombinante. O VWF útil para a presente invenção inclui todas as formas potenciais, incluindo as formas monomérica e multimérica. Uma forma particularmente útil de VWF é a dos homomultímeros de pelo menos dois VWFs. As proteínas do VWF podem

12 / 145 ser um derivado biologicamente ativo ou, quando for usado isoladamente como um estabilizador para FVIII, o VWF pode ser de uma forma não biologicamente ativa. Também deve ser entendido que a presente invenção abrange formas diferentes de VWF para serem usadas em combinação. Por exemplo, uma composição útil para a presente invenção pode incluir multímeros diferentes, derivados diferentes e tanto derivados biologicamente ativos quanto derivados não biologicamente ativos.

[0040] Na hemostase primária, VWF serve como uma ponte entre plaquetas e componentes específicos da matriz extracelular, tal como colágeno. A atividade biológica de VWF neste processo pode ser medida pelos diferentes ensaios in vitro (Turecek et al., Semin. Thromb. Hemost. 28: 149-160, 2002). O ensaio do cofator de ristocetina está fundamentado na aglutinação de plaquetas frescas ou fixadas em formalina induzidas pelo antibiótico ristocetina na presença de VWF.

[0041] O grau de aglutinação de plaquetas depende da concentração de VWF e pode ser medida pelo método turbidimétrico, por exemplo pelo uso de um agregômetro (Weiss et al., J. Clin. Invest. 52: 2708-2716, 1973; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308, 1975). A segunda método é o ensaio de ligação de colágeno, que está fundamentado na tecnologia ELISA (Brown et Bosak, Thromb. Res. 43: 303-311, 1986; Favaloro, Thromb. Haemost. 83: 127-135, 2000). Uma placa microtituladora é revestida com colágeno tipo I ou III. Depois o VWF é ligado à superfície do colágeno e subsequentemente detectado com um anticorpo policlonal rotulado com enzima. A última etapa é a reação de substrato, que pode ser fotometricamente monitorada com uma leitora de ELISA. Como aqui provido, a atividade do Cofator de Ristocetina específica do VWF (VWF:RCo) da presente invenção é geralmente descrita em termos de mU/μg de VWF, como medida administrando ensaios in vitro.

[0042] Uma vantagem das composições de rVWF da presente

13 / 145 invenção em relação ao pdVWF é que o rVWF exibe uma atividade específica mais alta do que o pdVWF. Em algumas modalidades, o rVWF da invenção tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 ou mais mU/μg.

[0043] O rVWF da presente invenção é altamente multimérico compreendendo cerca de 10 a cerca de 40 subunidades. Em modalidades adicionais, o rVWF multimérico produzido administrando os métodos da presente invenção compreendem cerca de 10 a 30, 12 a 28, 14 a 26, 16 a 24, 18 a 22, 20 a 21 subunidades. Em modalidades adicionais, o rVWF está presente em multímeros variando no tamanho de dímeros a multímeros acima de 40 subunidades (>10 milhões de Daltons). Os multímeros maiores proveem sítios de ligação múltiplos que podem interagir tanto com receptores de plaqueta quanto sítios de matriz subendotelial de lesão e são a forma mais hemostaticamente ativa de VWF. A aplicação de ADAMTS13 clivará os multímeros de rVWF ultragrandes com o tempo, mas durante a produção (geralmente através da expressão em cultura de célula), as composições de rVWF da presente invenção geralmente não são expostas ao ADAMTS13 e retêm a sua estrutura altamente multimérica.

[0044] Em uma modalidade, uma composição de rVWF usada nos métodos aqui descritos tem uma distribuição de oligômeros de rVWF distinguida em que 95% dos oligômeros têm entre 6 subunidades e 20 subunidades. Em outras modalidades, a uma composição de rVWF tem uma distribuição de oligômeros de rVWF distinguida em que 95% dos oligômeros têm uma faixa de subunidades selecionada das variações 458 a 641 encontradas na Tabela 2 da WO 2012/171031, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

[0045] Em uma modalidade, uma composição de rVWF pode ser

14 / 145 distinguida de acordo com a porcentagem de moléculas de rVWF que estão presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior. Por exemplo, em uma modalidade, pelo menos 20% das moléculas de rVWF em uma composição de rVWF usada nos métodos aqui descritos estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 10 subunidades. Em uma outra modalidade, pelo menos 20% das moléculas de rVWF em uma composição de rVWF usada nos métodos aqui descritos estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 12 subunidades. Já em outras modalidades, uma composição de rVWF usada nos métodos aqui providos tem uma porcentagem mínima (por exemplo, tem pelo menos X%) das moléculas de rVWF presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior (por exemplo, um multímero de pelo menos Y subunidades) de acordo com qualquer uma das variações 134 a 457 encontradas na Tabela 3 até Tabela 5, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

[0046] De acordo com o acima, a composição de rVWF administrada ao sujeito (com ou sem FVIII) geralmente compreende uma porcentagem significante de multímeros de rVWF de peso molecular alto (HMW). Em modalidades adicionais, a composição de multímero de rVWF HMW compreende pelo menos 10% a 80% de decâmeros de rVWF ou multímeros de ordem superior. Em modalidades adicionais, a composição compreende cerca de 10 a 95%, 20 a 90%, 30 a 85%, 40 a 80%, 50 a 75%, 60 a 70% decâmeros ou multímeros de ordem superior. Em modalidades adicionais, a composição de multímero de rVWF HMW compreende pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de decâmeros ou multímeros de ordem superior.

[0047] A avaliação do número e porcentagem de multímeros de rVWF pode ser conduzida administrando métodos conhecidos na técnica, incluindo sem limitação métodos administrando métodos de eletroforese e

15 / 145 cromatografia de exclusão de tamanho para separar multímeros de VWF pelo tamanho, por exemplo como debatido por Cumming et al, (J Clin Pathol. maio de 1993; 46(5): 470 a 473, que é por meio deste incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com a avaliação de multímeros de VWF). Tais técnicas podem incluir ainda técnicas de imunoblot (tal como Western Blot), nas quais o gel é submetido a imunoblot com um anticorpo radiomarcado contra VWF seguido pela detecção quimioluminescente (ver por exemplo Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7: 317-323, que é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com a avaliação de multímeros de VWF). Ensaios adicionais para VWF incluem VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCof) e VWF:Ensaio de Atividade de Ligação de Colágeno (VWF:CBA), que são frequentemente usados para diagnóstico e classificação da Doença de von Willebrand. (ver por exemplo Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341- 456, que é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com os ensaios para VWF).

[0048] Em modalidades adicionais, multímeros de rVWF de ordem superior da invenção são estáveis durante cerca de 1 a cerca de 90 horas após a administração. Ainda em modalidades adicionais, os multímeros de rVWF de ordem superior são estáveis durante cerca de 5 a 80, 10 a 70, 15 a 60, 20 a 50, 25 a 40, 30 a 35 horas após a administração. Ainda em modalidades adicionais, os multímeros de rVWF de ordem superior são estáveis durante pelo menos 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 horas após a administração. Em certas modalidades a estabilidade dos multímeros de rVWF é avaliada in vitro.

[0049] Em uma modalidade, multímeros de rVWF de ordem superior usados nas composições e métodos aqui providos têm uma meia-vida de pelo

16 / 145 menos 12 hora após a administração. Em uma outra modalidade, os multímeros de rVWF de ordem superior têm uma meia-vida de pelo menos 24 horas após a administração. Já em outras modalidades, os multímeros de rVWF de ordem superior têm uma meia-vida selecionada das variações 642 a 1045 encontradas na Tabela 6 da WO 2012/171031, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

[0050] Em aspectos específicos, o rVWF (recombinante ou derivado de plasma) usado de acordo com a presente invenção não é modificado com nenhuma conjugação, após a tradução ou modificações covalentes. Em modalidades particulares, o rVWF da presente invenção não é modificado com um polímero solúvel em água, incluindo sem limitação, um polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxil etil amido, uma porção de policarboidrato e similares.

[0051] Em outros aspectos, o rVWF (recombinante ou derivado de plasma) usado de acordo com a presente invenção é modificado através da conjugação, após a modificação de tradução ou modificação covalente, incluindo modificações dos resíduos de terminal N ou C assim como modificações de cadeias laterais selecionadas, por exemplo, em grupos sulfidrila livres, aminas primárias e grupos hidroxila. Em uma modalidade, um polímero solúvel em água é ligado com a proteína (diretamente ou por intermédio de um ligador) por um grupo lisina ou outra amina primária. Em uma modalidade, as proteínas do rVWF da presente invenção podem ser modificadas pela conjugação de um polímero solúvel em água, incluindo sem limitação, um polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxil etil amido, uma porção de policarboidrato e similares.

[0052] Os polímeros solúveis em água que podem ser usados para modificar o rVWF e/ou FVIII incluem estruturas lineares e ramificadas. Os polímeros conjugados podem ser fixados diretamente às proteínas de

17 / 145 coagulação da invenção ou alternativamente podem ser fixados através de uma porção de ligação. Exemplos não limitantes de conjugação de proteína com polímeros solúveis em água podem ser encontrados nas Pat. norte- americanas nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 e

4.179.337, assim como em Abuchowski e Davis “Enzymes as Drugs”, Holcenberg e Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981) e Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008.

[0053] A conjugação de proteína pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, ver Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2nd Ed., Academic Press, Inc. 2008. Os exemplos incluem conexão através da ligação peptídica entre um grupo carboxila em uma de cada uma da proteína de coagulação ou porção polimérica solúvel em água e um grupo amina do outro ou uma conexão de éster entre um grupo carboxila de um e um grupo hidroxila do outro. Uma outra conexão pela qual uma proteína de coagulação da invenção seria conjugada a um composto polimérico solúvel em água é por intermédio de uma base de Schiff, entre um grupo amino livre na porção polimérica sendo reagida com um grupo aldeído formado na extremidade não redutora do polímero pela oxidação de periodato (Jennings e Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes e Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). A Base de Schiff gerada pode ser estabilizada pela redução específica com NaCNBH3 para formar uma amina secundária. Um método alternativo é a geração de grupos amino livres de terminal no polímero pela aminação redutiva com NH4Cl depois da oxidação anterior. Reagentes bifuncionais podem ser usados para conectar dois grupos amino ou duas hidroxilas. Por exemplo um polímero contendo um grupo amino pode ser unido a um grupo amino da proteína de coagulação com reagentes como BS3 (Bis(sulfossuccinimidil)suberato/Pierce, Rockford, Ill.). Além disso,

18 / 145 reagentes de conexão cruzada heterobifuncionais como Sulfo-EMCS éster de (N-.épsilon.-Maleimidocaproilóxi) sulfossuccinimida/Pierce) pode ser usado por exemplo para conectar grupos amina e tiol. Em outras modalidades, um grupo reativo em aldeído, tal como PEG alcóxido mais dietil acetal bromoacetaldeído; PEG mais DMSO e anidrido acético e cloreto de PEG mais o fenóxido de 4-hidroxibenzaldeído, ésteres ativos de succinimidila, ditiocarbonato PEG ativado, 2,4,5-triclorofenilcloroformiato e PEG ativado em P-nitrofenilcloroformiato, podem ser usados na conjugação de uma proteína de coagulação.

[0054] Em alguns aspectos, o rVWF usado nos métodos da presente invenção foi maturado in vitro com furina. Em modalidades adicionais, a furina é furina recombinante.

[0055] Em aspectos adicionais, o rVWF usado nos métodos da presente invenção são produzidos pela expressão em uma cultura de célula de mamífero administrando métodos conhecidos na técnica. Em modalidades particulares, a cultura de célula de mamífero compreende células CHO. Em uma modalidade exemplar, o rVWF da invenção compreende proteína de rVWF isolada a partir de um sistema de expressão de célula CHO. Em uma modalidade adicional, a remoção do propeptídeo é mediada in vitro através da exposição do pró-VWF para furina -- ainda em uma modalidade adicional, a Furina usada para a remoção de propeptídeo é furina recombinante. Ainda em uma modalidade adicional, glicanos do grupo sanguíneo ABO totalmente glicosilados estão ausentes.

[0056] Ainda em modalidades adicionais, o rVWF usado nos métodos e composições da presente invenção pela expressão em um sistema hospedeiro eucariótico adequado. Os exemplos de células eucarióticas incluem, sem limitação, células de mamífero, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep e HepG2; células de inseto, por exemplo, células SF9, células SF21, células S2 e células High Five; e células de levedura, por

19 / 145 exemplo, células de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Em uma modalidade, o VWF pode ser expresso em células de levedura, células de inseto, células aviárias, células de mamífero e similares. Por exemplo, em uma linhagem de célula humana, uma linhagem de célula de hamster ou uma linhagem de célula de murino. Em uma modalidade particular, a linhagem de célula é uma linhagem de célula CHO, BHK ou HEK. Tipicamente, as células de mamífero, por exemplo, a célula CHO de uma linhagem de célula contínua, pode ser usada para expressar o VWF da presente invenção.

[0057] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando para VWF pode ser um vetor. o vetor pode ser distribuído por um vírus ou pode ser um plasmídeo. A sequência de ácido nucleico codificando a proteína pode ser um gene específico ou uma parte biologicamente funcional do mesmo. Em uma modalidade, a proteína é pelo menos uma parte biologicamente ativa do VWF. Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a expressão do VWF e pode ser selecionada de vetores de expressão eucarióticos. Os exemplos de vetores para a expressão eucariótica incluem: (i) para a expressão em levedura, vetores tais como pAO, pPIC, pYES, pMET, promotores de administração tais como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc; (ii) para a expressão em células de inseto, vetores tais como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., promotores de administração tais como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc. e (iii) para a expressão em células de mamífero, vetores tais como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc. e vetores derivados de sistemas virais tais como vírus da vaccinia, vírus adenoassociados, vírus do herpes, retrovírus, etc., promotores de administração tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β- actina.

[0058] Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de ácido nucleico compreende ainda outras sequências adequadas para uma

20 / 145 expressão controlada de uma proteína tal como sequências promotoras, realçadores, caixas TATA, sítios de início de transcrição, policonectores, sítios de restrição, sequências poli-A, sequências de processamento de proteína, marcadores de seleção e similares que são geralmente conhecidos de um técnico no assunto.

[0059] Em certas modalidades, os métodos de cultura de célula da invenção podem compreender o uso de um microcarreador. Em algumas modalidades, as culturas de célula das modalidades podem ser realizadas em biorreatores grandes sob condições adequadas para prover áreas de superfície de cultura específica de alto volume para se obter altas densidades de célula e expressão de proteína. Um meio para prover tais condições de cultivo é usar microcarreadores para o crescimento de célula em biorreatores de tanque agitado. O conceito de crescimento de célula sobre microcarreadores foi primeiro descrito por van Wezel (van Wezel, A. L., Nature 216:64-5 (1967)) e permite a fixação de célula na superfície de partículas sólidas pequenas colocadas em suspensão no meio de crescimento. Estes métodos proveem altas razões de superfície para volume e assim permitem utilização de nutriente eficiente. Além disso, para a expressão de proteínas secretadas em linhagens de célula eucariótica, a razão de superfície para volume aumentada permite níveis mais altos de secreção e assim rendimentos proteína mais altos no sobrenadante da cultura. Finalmente, estes métodos permitem o aumento fácil de culturas de expressão eucariótica.

[0060] As células expressando VWF pode ser ligado a um microcarreador esférico ou um poroso durante o crescimento da cultura de célula. O microcarreador pode ser um microcarreador selecionado do grupo de microcarreadores com base no dextrano, colágeno, plástico, gelatina e celulose e outros como descrito em Butler (1988. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Também é possível desenvolver as células em um microcarreador de biomassa no esférico e subcultivar as

21 / 145 células quando elas tiverem atingido a biomassa fermentadora final e antes da produção da proteína expressada sobre um microcarreador poroso ou vice e versa. Os microcarreadores esféricos adequados podem incluir microcarreadores de superfície lisa, tais como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 e Cytode™ 3 (GE Healthcare) e microcarreadores macroporosos tais como Cytopore™. 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 e Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

[0061] Em certas modalidades, rVWF é expresso em células cultivadas em meios de cultura de célula que produzem rVWF de peso molecular alto. Os termos “solução de cultura de célula”, “meio ou meios de cultura de célula”, e “sobrenadante de cultura de célula” se referem aos aspectos de processos de cultura de célula geralmente bem conhecidos na técnica. No contexto da presente invenção, uma solução de cultura de célula pode incluir meios de cultura de célula e sobrenadante de cultura de célula. Os meios de cultura de célula são externamente adicionados à solução de cultura de célula, opcionalmente juntos com suplementos, para prover nutrientes e outros componentes para cultivar as células expressando VWF. O sobrenadante de cultura de célula refere-se a uma solução de cultura de célula compreendendo os nutrientes e outros componentes do meio de cultura de célula assim como produtos liberados, metabolizados e/ou excretado das células durante a cultura. Em modalidades adicionais, os meios podem ser livres de proteína animal e quimicamente definidos. Os métodos de preparar meios de cultura livres de proteína animal e quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo na US 2008/0009040 e US 2007/0212770, que são ambas aqui incorporadas para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com meios de cultura de célula. “Livre de proteína” e termos relacionados refere-se à proteína que é de uma fonte exógena para ou outra que não as células na cultura, que naturalmente desprendem proteínas durante o crescimento. Em uma outra modalidade, o meio de cultura é livre de

22 / 145 polipeptídeo. Em uma outra modalidade, o meio de cultura é livre de soro. Em uma outra modalidade o meio de cultura é livre de proteína animal. Em uma outra modalidade o meio de cultura é livre de componente animal. Em uma outra modalidade, o meio de cultura contém proteína, por exemplo, proteína animal a partir do soro tal como soro de bezerro fetal. Em uma outra modalidade, a cultura tem proteínas recombinantes exogenamente adicionadas. Em uma outra modalidade, as proteínas são de um animal livre de patógeno certificado. O termo “quimicamente definido” como aqui usado deve significar, que o meio não compreende nenhum dos suplementos não definidos, tais como, por exemplo, extratos de componentes animais, órgãos, glândulas, plantas ou levedura. Consequentemente, cada componente de um meio quimicamente definido é acuradamente definido. Em uma modalidade preferida, os meios são livres de componente animal e livres de proteína.

[0062] Em modalidades adicionais, subsequente à purificação de uma cultura de célula de mamífero, rFVIII é reconstituído antes da administração. Ainda em modalidades adicionais, o rVWF é tratado com furina antes da ou subsequente à reconstituição. Em modalidades adicionais, a Furina é furina recombinante. Ainda em modalidades adicionais, o rVWF da invenção não é exposto ao ADAMTS13, com o resultado que ultra grande (isto é, compreendendo 10 ou mais subunidades) estão presentes nas composições de rVWF da invenção.

[0063] Em aspectos específicos, o rVWF usado nos métodos da presente invenção está contido em uma formulação contendo um tampão, um açúcar e/ou um álcool de açúcar (incluindo sem limitação trealose e manitol), um estabilizante (tal como glicina) e um tensoativo (tal como polissorbato 80). Em modalidades adicionais, para formulações contendo rFVIII, a formulação pode incluir adicionalmente sódio, histidina, cálcio e glutationa.

[0064] Em um aspecto, as formulações compreendendo rVWF são

23 / 145 liofilizadas antes da administração. A liofilização é realizada administrando- se técnicas comuns na técnica e deve ser otimizada para a composição sendo desenvolvida [Tang et al., Pharm Res. 21:191-200. (2004) e Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)].

[0065] Os métodos de preparar formulações farmacêuticas podem incluir uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente estabilizante como aqui descrito à dita mistura antes da liofilização, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de volume, um agente regulador de osmolaridade e um tensoativo, cada um dos quais como aqui descrito, à dita mistura antes da liofilização. Uma formulação liofilizada é, em um aspecto, pelo menos compreendida de um ou mais de um tampão, um agente de volume e um estabilizante. Neste aspecto, a utilidade de um tensoativo é avaliada e selecionada em casos onde a agregação durante a etapa de liofilização ou durante a reconstituição torna-se um problema. Um agente de tamponamento apropriado é incluído para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização.

[0066] A prática de reconstituição padrão para material liofilizado é adicionar de volta um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFI) (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam algumas vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para administração parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)]. Consequentemente, métodos são providos para a preparação de composições reconstituídas de VWF recombinante compreendendo a etapa de adicionar um diluente a uma composição liofilizada de VWF recombinante da invenção.

[0067] O material liofilizado pode ser reconstituído como uma solução aquosa. Uma variedade de carreadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para uso em dose múltipla ou

24 / 145 água com quantidades apropriadas de tensoativos (por exemplo, uma suspensão aquosa que contenha o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas). Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo e sem limitação, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropilmetil- celulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes de dispersão e umectantes são um fosfatídeo de ocorrência natural, por exemplo e sem limitação, lecitina ou produtos da condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo e sem limitação, estearato de polioxietileno ou produtos da condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo e sem limitação, heptadecaetileno-oxicetanol ou produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tal como mono- oleato de polioxietileno sorbitol ou produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo e sem limitação, mono-oleato de polietileno sorbitano. Em vários aspectos, as suspensões aquosas também contêm um ou mais conservantes, por exemplo e sem limitação, p-hidroxibenzoato de etila ou n- propila.

[0068] Em certas modalidades, as composições da presente invenção são formulações líquidas para administração com o uso de uma seringa ou outros vasos de armazenagem. Em modalidades adicionais, estas formulações líquidas são produzidas a partir de material liofilizado aqui descrito reconstituído como uma solução aquosa.

[0069] Em um aspecto adicional, as composições da invenção compreendem adicionalmente um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases “farmaceuticamente” ou “farmacologicamente” aceitáveis refere-se às entidades e composições moleculares que sejam estáveis, inibam a degradação da proteína tais como produtos de agregação e

25 / 145 clivagem e além disso, não produzam reações alérgicas ou outras reações adversas quando administrados pelas vias de administração bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. “Carreadores farmaceuticamente aceitáveis” incluem qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção e similares clinicamente úteis, incluindo aqueles agentes divulgados acima. II. Produção do VWF recombinante

[0070] O fator de von Willebrand recombinante (rVWF) maduro livre da presente invenção pode ser produzido de maneira recombinante. Uma pessoa versada na técnica reconhece métodos úteis para expressar uma proteína recombinante em uma célula hospedeira. Em alguns casos, o método inclui expressar uma sequência de ácido nucleico codificando rVWF em uma célula hospedeira tal como uma célula CHO e cultivando a célula hospedeira resultante sob certas condições para produzir rVWF, pré-pró- VWF, pró-VWF e similares.

[0071] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando para VWF pode ser um vetor de expressão. O vetor pode ser distribuído por um vírus ou pode ser um plasmídeo. A sequência de ácido nucleico codificando a proteína pode ser um gene específico ou uma parte biologicamente funcional do mesmo. Em uma modalidade, a proteína é pelo menos uma parte biologicamente ativa do VWF. A sequência de ácido nucleico pode compreender adicionalmente outras sequências adequadas para uma expressão controlada de uma proteína tal como sequências promotoras, realçadores, caixas TATA, sítios de início de transcrição, policonectores, sítios de restrição, sequências poli-A, sequências de processamento de proteína, marcadores de seleção e similares que são geralmente conhecidos de um técnico no assunto.

[0072] Uma ampla variedade de vetores pode ser usada para a

26 / 145 expressão do VWF e pode ser selecionada de vetores de expressão eucarióticos. Os exemplos de vetores para a expressão eucariótica incluem: (i) para a expressão em levedura, vetores tais como pAO, pPIC, pYES, pMET, promotores de administração tais como AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc; (ii) para a expressão em células de inseto, vetores tais como pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., promotores de administração tais como PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc. e (iii) para a expressão em células de mamífero, vetores tais como pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc. e vetores derivados de sistemas virais tais como vírus vaccinia, vírus adenoassociados, vírus do herpes, retrovírus, etc., promotores de administração tais como CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV e β- actina.

[0073] Em alguns aspectos, o rVWF usado nos métodos da presente invenção é produzido pela expressão em uma cultura de célula de mamífero administrando métodos conhecidos na técnica. Em modalidades particulares, a cultura de célula de mamífero compreende células CHO. Em modalidades adicionais, o rVWF é coexpresso com Fator VIII recombinante (rFVIII) na mesma cultura. Em tais modalidades, o rVWF e o rFVIII são purificados juntos (copurificados) ou separadamente administrando métodos conhecidos na técnica. Em outras modalidades, o rVWF é expresso em uma cultura que não contém rFVIII.

[0074] Em algumas modalidades, rVWF é expresso e isolado de um sistema hospedeiro eucariótico adequado. Os exemplos de células eucarióticas incluem, sem limitação, células de mamífero, tais como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep e HepG2; células de inseto, por exemplo, células SF9, células SF21, células S2 e células High Five; e células de levedura, por exemplo, células de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces. Em uma modalidade, o VWF pode ser expresso em células de levedura, células de inseto, células aviárias, células de mamífero e similares. Por

27 / 145 exemplo, em uma linhagem de célula humana, uma linhagem de célula de hamster ou uma linhagem de célula de murino. Em uma modalidade particular, a linhagem de célula é uma linhagem de célula CHO, BHK ou HEK. Tipicamente, células de mamífero, por exemplo, célula CHO de uma linhagem de célula contínua, podem ser usadas para expressar o VWF da presente invenção. Em certos casos, a proteína VWF é expressa e isolada a partir de um sistema de expressão de célula CHO.

[0075] O VWF pode ser produzido em um sistema de cultura de célula ou de acordo com qualquer método de cultura de célula reconhecido por aqueles na técnica. Em algumas modalidades, a cultura de células pode ser realizada em biorreatores grandes sob condições adequadas para prover áreas de superfície de cultura específica de alto volume para se obter altas densidades de célula e expressão de proteína. Um meio para prover tais condições de cultivo é usar microcarreadores para a cultura de célula em biorreatores de tanque agitado. O conceito de cultura de célula sobre microcarreadores foi primeiro descrito por van Wezel (van Wezel, A. L., Nature , 1967, 216:64-5) e permite a fixação de célula na superfície de partículas sólidas pequenas colocadas em suspensão no meio de crescimento. Estes métodos proveem altas razões de superfície para volume e assim permitem a utilização de nutriente eficiente. Além disso, para a expressão de proteínas secretadas em linhagens de célula eucariótica, a razão de superfície para volume aumentada permite níveis mais altos de secreção e assim rendimentos de proteína mais altos no sobrenadante da cultura. Finalmente, estes métodos permitem o aumento fácil de culturas de expressão eucariótica.

[0076] As células expressando VWF podem ser ligadas a um microcarreador esférico ou um poroso durante o crescimento da cultura de célula. O microcarreador pode ser um microcarreador selecionado do grupo de microcarreadores com base no dextrano, colágeno, plástico, gelatina e

28 / 145 celulose e outros como descrito em Butler (1988. Em: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Também é possível desenvolver as células em uma biomassa nos microcarreadores esféricos e subcultivar as células quando elas tiverem atingidos biomassa de fermentador final e antes da produção da proteína expressada sobre um microcarreador poroso ou vice e versa. Os microcarreadores esféricos adequados podem incluir microcarreadores de superfície lisa, tais como Cytodex™ 1, Cytodex™ 2 e Cytodex™ 3 (GE Healthcare) e macromicrocarreadores porosos tais como Cytopore™ 1, Cytopore™ 2, Cytoline™ 1 e Cytoline™ 2 (GE Healthcare).

[0077] Em uma modalidade adicional, o propeptídeo de VWF é clivado do VWF não maduro in vitro através da exposição do pró-VWF à furina. Em algumas modalidades, a furina usada para a clivagem do propeptídeo é furina recombinante.

[0078] Em certas modalidades, rVWF é expresso em células cultivadas em meios de cultura de célula que produzem rVWF de peso molecular alto. Os termos “solução de cultura de célula”, “meio ou meios de cultura de célula”, e “sobrenadante de cultura de célula” se referem aos aspectos de processos de cultura de célula geralmente bem conhecidos na técnica. No contexto da presente invenção, uma solução de cultura de célula pode incluir meios de cultura de célula e sobrenadante de cultura de célula. Os meios de cultura de célula são externamente adicionados à solução de cultura de célula, opcionalmente juntos com suplementos, para prover nutrientes e outros componentes para a cultura das células expressando VWF. O sobrenadante de cultura de célula refere-se a uma solução de cultura de célula compreendendo os nutrientes e outros componentes do meio de cultura de célula assim como produtos liberados, metabolizados e/ou excretados das células durante a cultura. Em modalidades adicionais, os meios podem ser livres de proteína animal e quimicamente definidos. Os métodos de preparar meios de cultura livres de proteína animal e

29 / 145 quimicamente definidos são conhecidos na técnica, por exemplo na US 2006/0094104, US 2007/0212770 e US 2008/0009040, que são ambas aqui incorporadas para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com meios de cultura de célula. “Livres de proteína” e termos relacionados referem-se à proteína que é de uma fonte exógena para ou outra que não as células na cultura, que naturalmente soltam proteínas durante crescimento. Em uma outra modalidade, o meio de cultura é livre de polipeptídeo. Em uma outra modalidade, o meio de cultura é livre de soro. Em uma outra modalidade o meio de cultura é livre de proteína animal. Em uma outra modalidade o meio de cultura é livre de componente animal. Em uma outra modalidade, o meio de cultura contém proteína, por exemplo, proteína animal do soro tal como soro de bezerro fetal. Em uma outra modalidade, a cultura tem proteínas recombinantes exogenamente adicionadas. Em uma outra modalidade, as proteínas são de um animal livre de patógeno certificado. O termo “quimicamente definido” como aqui usado deve significar, que o meio não compreende nenhum suplemento não definido, tal como, por exemplo, extratos de componentes animais, órgãos, glândulas, plantas ou levedura. Consequentemente, cada componente de um meio quimicamente definido é acuradamente definido. Em uma modalidade preferida, os meios são livres de componente animal e livres de proteína.

[0079] Em certas modalidades, a cultura de células expressando VWF pode ser mantida durante pelo menos cerca de 7 dias ou pelo menos cerca de 14 dias, 21 dias, 28 dias ou pelo menos cerca de 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas ou pelo menos cerca de 2 meses ou 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 meses ou mais longo. A densidade de célula na qual uma cultura de célula é mantida na produção de uma proteína de VWF recombinante dependerá das condições de cultura e meio usado para expressão de proteína. Uma pessoa versada na técnica facilmente será capaz de determinar a densidade de célula ótima para uma cultura de célula

30 / 145 produzindo um VWF. Em uma modalidade, a cultura é mantida em uma densidade de célula dentre cerca de 0,5x106 e 4x107 células/ml durante um período prolongado de tempo. Em outras modalidades, a densidade de célula é mantida em uma concentração dentre cerca de 1,0x106 e cerca de 1,0x107 células/ml durante um período prolongado de tempo. Em outras modalidades, a densidade de célula é mantida em uma concentração dentre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/ml durante um período prolongado de tempo. Em outras modalidades, a densidade de célula é mantida em uma concentração dentre cerca de 1,0x106 e cerca de 4,0x106 células/ml durante um período prolongado de tempo. Já em outras modalidades, a densidade de célula pode ser mantida em uma concentração entre cerca de 2,0x106 e cerca de 4,0x106 ou entre cerca de 1,0x106 e cerca de 2,5x106 ou entre cerca de 1,5x106 e cerca de 3,5x106 ou qualquer outra faixa similar, durante um período prolongado de tempo. Depois de um tempo apropriado na cultura de célula, o rVWF pode ser isolado do sistema de expressão administrando métodos conhecidos na técnica.

[0080] Em uma modalidade específica, a densidade de célula da cultura de célula contínua para a produção de rVWF é mantida em uma concentração de não mais do que 2,5x106 células/mL durante um período prolongado. Em outras modalidades específicas, a densidade de célula é mantida em não mais do que 2,0x106 células/mL, 1,5x106 células/mL, 1,0x106 células/mL, 0,5x106 células/mL ou menos. Em uma modalidade, a densidade de célula é mantida entre 1,5x106 células/mL e 2,5x106 células/mL.

[0081] Em uma modalidade das culturas de células descritas acima, a solução de cultura de célula compreende um suplemento de meio compreendendo cobre. Tais soluções de cultura de célula são descritas, por exemplo, na Patente norte-americana nº 8.852.888 e Patente norte-americana nº 9,409,971, que são por meio deste incorporada por referência na sua

31 / 145 totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com métodos de cultura de células e composições para produzir VWF recombinante.

[0082] As sequências de polinucleotídeo e aminoácido de pré-pró- VWF são apresentadas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente e estão disponíveis no GenBank Acessos nº NM_000552 (mRNA do fator de von Willebrand (VWF) de Homo sapiens) e NP_000543, respectivamente. A sequência de aminoácido correspondente à proteína de VWF madura é apresentada na SEQ ID NO: 3 (correspondendo aos aminoácidos 764 a 2813 da sequência de aminoácido de pré-pró-VWF de comprimento completo). Em algumas modalidades, o VWF exibe pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o rVWF da invenção exibe pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com a sequência da SEQ ID NO: 3. Ver, por exemplo, a Patente norte-americana nº 8.597.910, Publicação de Patente norte-americana nº 2016/0129090, assim como FIG. 6.

[0083] Uma forma de rVWF útil tem pelo menos a propriedade de estabilização in vivo, por exemplo ligação, de pelo menos uma molécula do Fator VIII (FVIII) e tendo opcionalmente um padrão de glicosilação que é farmacologicamente aceitável. Os exemplos específicos dos mesmos incluem VWF sem o domínio A2 assim resistente à proteólise (Lankhof et al., Thromb. Haemost. 77: 1008-1013, 1997) e um fragmento VWF de Val 449 a Asn 730 incluindo o domínio de ligação da glicoproteína 1b e sítios de ligação para colágeno e heparina (Pietu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 1339-1347, 1989). A determinação da capacidade de um VWF para estabilizar pelo menos uma molécula FVIII é, em um aspecto,

32 / 145 realizada em mamíferos deficientes em VWF de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica.

[0084] O rVWF da presente invenção pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica. Um exemplo específico é divulgado na WO86/06096 publicada em 23 de outubro de 1986 e Pedido de Patente norte-americano nº 07/559.509, depositado em 23 de julho de 1990, que são aqui incorporados por referência com respeito aos métodos de produzir VWF recombinante. Assim, métodos são conhecidos na técnica para (i) a produção de DNA recombinante pela engenharia genética, por exemplo por intermédio da transcrição reversa de RNA e/ou amplificação de DNA, (ii) introdução de DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas pela transfecção, por exemplo por intermédio de eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivo das células transformadas, por exemplo em uma maneira contínua ou por lotes, (iv) expressar VWF, por exemplo constitutivamente ou na indução e (administração) isolando o VWF, por exemplo do meio de cultura ou colhendo-se as células transformadas, de modo a (vi) obter rVWF purificado, por exemplo por intermédio da cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de afinidade. Um VWF recombinante é, em um aspecto, fabricado em células hospedeiras transformadas administrando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica. Por exemplo, sequências codificando o polipeptídeo seriam excisadas do DNA administrando enzimas de restrição adequadas. Alternativamente, a molécula de DNA é, em um outro aspecto, sintetizada administrando técnicas de síntese química, tal como o método do fosforamidato. Ainda em um outro aspecto, uma combinação destas técnicas também é usada.

[0085] A invenção também provê vetores codificando polipeptídeos da invenção em um hospedeiro apropriado. O vetor compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo operativamente ligado às sequências de controle de expressão apropriadas. Os métodos de efetuar esta

33 / 145 conexão operativa, antes ou depois do polinucleotídeo ser inserido dentro do vetor, são bem conhecidos. As sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, realçadores, operadores, sítios de ligação ribossômica, sinais de partida, sinais de parada, sinais de capuz, sinais de poliadenilação e outros sinais envolvidos com o controle de transcrição ou tradução. O vetor resultante tendo o polinucleotídeo nele é usado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada administrando métodos bem conhecidos na técnica.

[0086] Qualquer uma de um grande número de células hospedeiras disponíveis e bem conhecidas é usada na prática dessa invenção. A seleção de um hospedeiro particular é dependente de vários fatores reconhecidos pela técnica, incluindo, por exemplo, compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, toxicidade dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, características de expressão, biossegurança e custos. Um equilíbrio destes fatores deve ser calculado com o entendimento de que nem todas as células hospedeiras são igualmente eficazes para a expressão de uma sequência de DNA particular. Dentro destas diretrizes gerais, as células hospedeiras microbianas úteis incluem, sem limitação, células bacterianas, de levedura e outros fungos, insetos, plantas, mamíferos (incluindo ser humano) em cultura ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.

[0087] As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob condições de fermentação convencionais de modo que os compostos desejados sejam expressos. Tais condições de fermentação são bem conhecidas na técnica. Finalmente, os polipeptídeos são purificados a partir dos meios de cultura ou das próprias células hospedeiras pelos métodos bem conhecidos na técnica.

[0088] Dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar um composto da invenção, grupos de carboidrato (oligossacarídeo) são

34 / 145 opcionalmente fixados aos sítios que são conhecidos ser sítios de glicosilação em proteínas. Geralmente, os oligossacarídeos ligados em O são fixados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto que os oligossacarídeos ligados em N são fixados aos resíduos de asparagina (Asn) quando eles são parte da sequência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos de ocorrência natural não incluindo prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é habitualmente encontrado nos oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O é o ácido N-acetilneuramínico (aludido como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente o resíduo de terminal de oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O e, em virtude da sua carga negativa, em um aspecto, confere propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ligador dos compostos dessa invenção e são preferivelmente glicosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos polipeptídicos (por exemplo, nas células de mamífero tais como CHO, BHK, COS). Em outros aspectos, tais sítios são glicosilados pelos procedimentos sintéticos ou semissintéticos conhecidos na técnica.

[0089] Em algumas modalidades, a sialização (também aludida como sialilação), pode ser realizada na coluna como parte dos procedimentos de purificação aqui descritos (incluindo métodos de troca aniônica, troca catiônica, exclusão de tamanho e/ou imunoafinidade). Em algumas modalidades, a sialilação resulta em estabilidade aumentada do rVWF quando comparado com rVWF que não passou pela sialilação. Em algumas modalidades, a sialilação resulta em estabilidade aumentada do rVWF na circulação sanguínea (por exemplo, depois da administração a um sujeito) quando comparado com rVWF que não passou pela sialilação. Em algumas

35 / 145 modalidades, a estabilidade aumentada de rVWF salivated resulta em um aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais quando comparado com rVWF que não passou pela sialilação. Em algumas modalidades, a sialilação resulta em meia-vida aumentada para o rVWF quando comparado com rVWF que não passou pela sialilação. Em algumas modalidades, a sialilação resulta em meia-vida aumentada para o rVWF na circulação sanguínea (por exemplo, depois da administração a um sujeito) quando comparado com rVWF que não passou pela sialilação. Em algumas modalidades, a meia-vida aumentada de rVWF sialilado resulta em um aumento de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais quando comparado com rVWF que não passou pela sialilação. Em algumas modalidades, a meia-vida aumentada de rVWF sialilado resulta em rVWF que é estável durante 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas ou mais na circulação sanguínea (por exemplo, depois da administração a um sujeito) quando comparado com rVWF que não passou pela sialilação. Em algumas modalidades, a sialilação aumenta o número de 2,3 sialilação e/ou 2,6 sialilação. Em algumas modalidades, a sialilação é aumentada pela adição de 2,3 sialiltransferase e/ou 2,6 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5’-monofosfo-N- acetilneuramínico) como uma etapa de tampão adicional. Em algumas modalidades, a sialilação é aumentada pela adição de 2,3 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5’-monofosfo-N- acetilneuramínico) como uma etapa de tampão adicional. Em algumas modalidades, a 2,3 sialilação é aumentada pela adição de 2,3 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5’-monofosfo-N- acetilneuramínico) como uma etapa de tampão adicional.

[0090] Em algumas modalidades, a 2,6 sialilação é aumentada pela adição de 2,6 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina- 5’-monofosfo-N-acetilneuramínico) como uma etapa de tampão adicional.

36 / 145 Em algumas modalidades, a 2,3 sialilação e/ou 2,6 sialilação são aumentadas pela adição de 2,3 sialiltransferase e/ou 2,6 sialiltransferase e CMP-NANA (sal de sódio do ácido citidina-5’-monofosfo-N-acetilneuramínico) como uma etapa de tampão adicional. Em algumas modalidades, CMP-NANA é quimicamente ou enzimaticamente modificado para transferir o ácido siálico modificado para a posição livre potencial. Em algumas modalidades, a sialilação é realizada carregando-se rVWF sobre a resina, lavando com um ou mais tampões como descrito aqui para esgotar impurezas não desejadas, aplicando um ou mais tampões contendo sialiltransferase e CMP-NANA em condições que permitam sialilação adicional e lavagem com um ou mais tampões para esgotar o excesso dos reagentes de sialilação e elução com um ou mais tampões o rVWF realçado (por exemplo, o rVWF com sialilação aumentada). Em algumas modalidades, o processo de sialilação é realizado como parte de um método de troca catiônica, um método de troca aniônica, um método de exclusão de tamanho ou um método de purificação por imunoafinidade, como aqui descrito.

[0091] Alternativamente, os compostos são fabricados pelos métodos sintéticos administrando, por exemplo, técnicas de síntese de fase sólida. As técnicas adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem aquelas descritas em Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335 a 61 (Katsoyannis e Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart e Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Pat. U.S. No. 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 105 a 253; e Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 257-527’. A síntese de fase sólida é a técnica preferida de fabricar peptídeos individuais visto que o mesmo é o método mais barato de fabricar peptídeos pequenos.

[0092] Fragmentos, variantes e análogos do VWF podem ser produzidos de acordo com métodos que são bem conhecidos na técnica.

37 / 145 Fragmentos de um polipeptídeo pode ser preparado administrando, sem limitação, clivagem enzimática (por exemplo, tripsina, quimotripsina) e também administrando meios recombinantes para gerar um fragmento de polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido específica. O fragmento de polipeptídeo pode ser gerado compreendendo uma região da proteína tendo uma atividade particular, tal como um domínio de multimerização ou qualquer outro domínio VWF identificável conhecido na técnica.

[0093] Métodos de fabricar análogos de polipeptídeo também são bem conhecidos. Os análogos da sequência de aminoácido de um polipeptídeo podem ser análogos de substituição, inserção, adição ou deleção. Os análogos de deleção, incluindo fragmentos de um polipeptídeo, carecem de um ou mais resíduos da proteína nativa que não são essenciais para a função ou atividade imunogênica. Os análogos insercionais envolvem a adição de, por exemplo, aminoácido(s) em um ponto não terminal no polipeptídeo. Este análogo pode incluir, por exemplo e sem limitação, a inserção de um epítopo imunorreativo ou simplesmente um resíduo único. Análogos adicionais, incluindo fragmentos de um polipeptídeo, incluem a adição de um ou mais aminoácidos em cada um ou ambos os terminais de uma proteína e incluem, por exemplo, proteínas de fusão. As combinações dos análogos anteriormente mencionados também são consideradas.

[0094] Os análogos de substituição tipicamente trocam um aminoácido do tipo selvagem por um outro em um ou mais sítios dentro da proteína e podem ser planejados para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo sem a perda completa de outras funções ou propriedades. Em um aspecto, as substituições são substituições conservativas. A “substituição de aminoácido conservativa” é a substituição de um aminoácido com um aminoácido tendo uma cadeia lateral ou um caractere químico similar. Os aminoácidos similares para fazer substituições conservativas incluem aqueles tendo uma cadeia lateral ácida (ácido glutâmico, ácido aspártico);

38 / 145 uma cadeia lateral básica (arginina, lisina, histidina); uma cadeia lateral de amida polar (glutamina, asparagina); uma cadeia lateral hidrofóbica, alifática (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); uma cadeia lateral aromática (fenilalanina, triptofano, tirosina); uma cadeia lateral pequena (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); ou uma cadeia lateral de hidroxila alifática (serina, treonina).

[0095] Em um aspecto, os análogos são substancialmente homólogos ou substancialmente idênticos ao VWF recombinante a partir do qual eles são derivados. Os análogos incluem aqueles que retêm pelo menos alguma da atividade biológica do polipeptídeo tipo selvagem, por exemplo atividade de coagulação do sangue.

[0096] As variantes de polipeptídeo consideradas incluem, sem limitação, polipeptídeos quimicamente modificados por tais técnicas como ubiquitinação, glicosilação, incluindo polissialização (ou polissialilação), conjugação aos agentes terapêuticos ou de diagnóstico, rotulação, fixação de polímero covalente tal como peguilação (derivatização com polietileno glicol), introdução de ligações não hidrolisáveis e inserção ou substituição pela síntese química de aminoácidos tais como ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. As variantes retêm as mesmas ou essencialmente as mesmas propriedades de ligação de moléculas não modificadas da invenção. Tal modificação química pode incluir a fixação direta ou indireta (por exemplo, por intermédio de um ligador) de um agente ao polipeptídeo de VWF. No caso de fixação indireta, é considerado que o conector possa ser hidrolisável ou não hidrolisável.

[0097] A preparação de análogos de polipeptídeo peguilado em um aspecto compreenderá as etapas de (a) reagir o polipeptídeo com polietileno glicol (tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG) sob condições por meio das quais o polipeptídeo construto de ligação torna-se fixado a um ou mais grupos PEG e (b) obter o(s) produto(s) de reação. No

39 / 145 geral, as condições de reação ótimas para as reações de acilação são determinadas com base nos parâmetros conhecidos e o resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão de PEG:proteína, maior a porcentagem de produto polipeguilado. Em algumas modalidades, o construto de ligação tem uma única porção de PEG no terminal N. Polietileno glicol (PEG) pode ser fixado ao fator de coagulação do sangue para, por exemplo, prover uma meia vida mais longa in vivo. O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e é linear ou ramificado. O peso molecular médio do PEG varia de cerca de 2 quiloDaltons (“kD”) a cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa ou de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Em certos aspectos, os grupos PEG são fixados ao fator de coagulação do sangue por intermédio de acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo natural ou engenheirado na porção PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no fator de coagulação sanguínea (por exemplo, um grupo aldeído, amino ou éster) ou por qualquer outra técnica conhecida na técnica.

[0098] Os métodos para preparar polipeptídeo polissialilado são descritos na Publicação de Patente dos Estados Unidos 20060160948, Fernandes e Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997 e Saenko et al., Haemophilia 12:42-51, 2006. Em resumo, uma solução de ácido colomínico (CA) contendo 0,1 M de NaIO4 é agitada no escuro na temperatura ambiente para oxidar o CA. A solução de CA ativado é dialisada contra, por exemplo, 0,05 M de tampão de fosfato de sódio, pH 7,2 no escuro e esta solução foi adicionada a uma solução de rVWF e incubada durante 18 h na temperatura ambiente no escuro sob agitação suave. Os reagentes livres devem ser opcionalmente separados do conjugado de rVWF- ácido polissiálico, por exemplo, pela ultrafiltração/diafiltração. A conjugação de rVWF com ácido polissiálico é obtida administrando-se glutaraldeído como reagente de reticulação (Migneault et al., Biotechniques 37: 790 a 796,

40 / 145 2004).

[0099] Também é considerado em um outro aspecto que os polipeptídeos pré-pró-VWF e pró-VWF proverão um benefício terapêutico nas formulações da presente invenção. Por exemplo, a Patente norte- americana nº 7.005.502 descreve uma preparação farmacêutica compreendendo quantidades substanciais de pró-VWF que induz a geração de trombina in vitro. Além disso, para fragmentos, variantes ou outros análogos recombinantes, biologicamente ativos do VWF maduro de ocorrência natural, a presente invenção considera o uso de fragmentos, variantes ou análogos recombinantes biologicamente ativos do pré-pró-VWF (apresentado na SEQ ID NO: 2) ou polipeptídeos pró-VWF (resíduos de aminoácido 23 a 764 da SEQ ID NO: 2) nas formulações aqui descritas.

[00100] Polinucleotídeos codificando fragmentos, variantes e análogos podem ser facilmente gerados por um trabalhador de competência para codificar biologicamente fragmentos, variantes ou análogos ativos da molécula de ocorrência natural que possui a mesma atividade biológica ou similar à molécula de ocorrência natural. Em vários aspectos, estes polinucleotídeos são preparados para administrar técnicas de PCR, digestão/ligação da molécula codificadora de DNA e similares. Assim, uma pessoa versada na técnica será capaz de gerar mudanças de base única no filamento de DNA para resultar em um códon alterado e uma mutação de sentido errado, administrando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado à mutagênese específica de sítio. Como aqui usado, a frase “condições de hibridização moderadamente severa” significa, por exemplo, hibridização a 42ºC em 50% de formamida e lavagem a 60ºC em 0,1 x SSC, 0,1% de SDS. É entendido por aqueles de competência na técnica que a variação nestas condições ocorre com base no comprimento e conteúdo de base de nucleotídeo GC das sequências a serem hibridizadas. As fórmulas padrão na técnica são apropriadas para determinar as condições de

41 / 145 hibridização exatas. Ver Sambrook et al., 9.47-9.51 em Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). a. MULTÍMEROS VWF

[00101] A avaliação do número e porcentagem de multímeros de rVWF pode ser conduzida administrando-se métodos conhecidos na técnica, incluindo sem limitação métodos administrando métodos de eletroforese e cromatografia de exclusão de tamanho para separar multímeros de VWF pelo tamanho, por exemplo como debatido por Cumming et al., (J Clin Pathol., maio de 1993; 46(5): 470 a 473, que é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com avaliação de multímeros de VWF). Tais técnicas podem incluir adicionalmente técnicas de imunoblot (tais como Western Blot), em que o gel é submetido a imunoblot com um anticorpo radiomarcado contra VWF seguido pela detecção quimioluminescente (ver, por exemplo, Wen et al., J. Clin. Lab. Anal., 1993, 7: 317-323, que é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com avaliação de multímeros de VWF). Ensaios adicionais para VWF incluem VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCof) e VWF:Ensaio de Atividade de Ligação de Colágeno (VWF:CBA), que são frequentemente usados para diagnóstico e classificação da Doença de von Willebrand (ver, por exemplo, Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341- 456; Sadler, JE, Annu Rev Biochem, 1998, 67:395 a 424; e Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36:510 a 521, que são por meio deste incorporadas por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com os ensaios para VWF). Em algumas modalidades, o rVWF obtido administrando os presentes métodos inclui qualquer padrão de multímero presente na amostra de carga

42 / 145 do rVWF. Em algumas modalidades, o rVWF obtido administrando os presentes métodos inclui padrões multiméricos de ocorrência fisiológica assim como padrões multiméricos de VWF ultragrande. b. Ensaio de VWF

[00102] Na hemostase primária VWF serve como uma ponte entre plaquetas e componentes específicos da matriz extracelular, tais como colágeno. A atividade biológica do VWF neste processo pode ser medida pelos diferentes ensaios in vitro (Turecek et al., Semin Thromb Hemost, 2010, 36: 510 a 521).

[00103] O ensaio de VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCof) está fundamentado na aglutinação de plaquetas frescas ou fixadas em formalina induzidas pelo antibiótico ristocetina na presença de VWF. O grau de aglutinação de plaquetas depende da concentração de VWF e pode ser medida pelo método turbidimétrico, por exemplo, pelo uso de um agregômetro (Weiss et al., J. Clin. Invest., 1973, 52: 2708-2716; Macfarlane et al., Thromb. Diath. Haemorrh., 1975, 34: 306-308). Como aqui provido, a atividade específica do Cofator de Ristocetina do VWF (VWF:RCo) da presente invenção é geralmente descrita em termos de mU/µg do VWF, como medida administrando ensaios in vitro.

[00104] Em algumas modalidades, o rVWF purificado de acordo com os métodos da presente invenção tem uma atividade específica de pelo menos cerca de 20, 22,5, 25, 27,5, 30, 32,5, 35, 37,5, 40, 42,5, 45, 47,5, 50, 52,5, 55, 57,5, 60, 62,5, 65, 67,5, 70, 72,5, 75, 77,5, 80, 82,5, 85, 87,5, 90, 92,5, 95, 97,5, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 ou mais mU/µg. Em algumas modalidades, o rVWF usado nos métodos aqui descritos tem uma atividade específica de 20 mU/μg a 150 mU/μg. Em algumas modalidades, o rVWF tem uma atividade específica de 30 mU/μg a 120 mU/μg. Em algumas modalidades, o rVWF tem uma atividade específica de 40 mU/μg a 90 mU/μg. Em algumas modalidades, o rVWF tem

43 / 145 uma atividade específica selecionada das variações 1 a 133 encontradas na Tabela 3, abaixo. Tabela 3. Modalidades exemplares para a atividade específica de rVWF encontrada nas composições e usada nos métodos aqui providos. (mU/µg) (mU/µg) (mU/µg) (mU/µg) 20 Var. 1 110 Var. 35 40-150 Var. 68 70-120 Var. 101 22,5 Var. 2 115 Var. 36 40-140 Var. 69 70-110 Var. 102 25 Var. 3 120 Var. 37 40-130 Var. 70 70-100 Var. 103 27,5 Var. 4 125 Var. 38 40-120 Var. 71 70-90 Var. 104 30 Var. 5 130 Var. 39 40-110 Var. 72 70-80 Var. 105 32,5 Var. 6 135 Var. 40 40-100 Var. 73 80-150 Var. 106 35 Var. 7 140 Var. 41 40-90 Var. 74 80-140 Var. 107 37,5 Var. 8 145 Var. 42 40-80 Var. 75 80-130 Var. 108 40 Var. 9 150 Var. 43 40-70 Var. 76 80-120 Var. 109 42,5 Var. 10 20-150 Var. 44 40-60 Var. 77 80-110 Var. 110 45 Var. 11 20-140 Var. 45 40-50 Var. 78 80-100 Var. 111 47,5 Var. 12 20-130 Var. 46 50-150 Var. 79 80-90 Var. 112 50 Var. 13 20-120 Var. 47 50-140 Var. 80 90-150 Var. 113 52,5 Var. 14 20-110 Var. 48 50-130 Var. 81 90-140 Var. 114 55 Var. 15 20-100 Var. 49 50-120 Var. 82 90-130 Var. 115 57,5 Var. 16 20-90 Var. 50 50-110 Var. 83 90-120 Var. 116 60 Var. 17 20-80 Var. 51 50-100 Var. 84 90-110 Var. 117 62,5 Var. 18 20-70 Var. 52 50-90 Var. 85 90-100 Var. 118 65 Var. 19 20-60 Var. 53 50-80 Var. 86 100-150 Var. 119 67,5 Var. 20 20-50 Var. 54 50-70 Var. 87 100-140 Var. 120 70 Var. 21 20-40 Var. 55 50-60 Var. 88 100-130 Var. 121 72,5 Var. 22 30-150 Var. 56 60-150 Var. 89 100-120 Var. 122 75 Var. 23 30-140 Var. 57 60-140 Var. 90 100-110 Var. 123 77,5 Var. 24 30-130 Var. 58 60-130 Var. 91 110-150 Var. 124 80 Var. 25 30-120 Var. 59 60-120 Var. 92 110-140 Var. 125 82,5 Var. 26 30-110 Var. 60 60-110 Var. 93 110-130 Var. 126 85 Var. 27 30-100 Var. 61 60-100 Var. 94 110-120 Var. 127 87,5 Var. 28 30-90 Var. 62 60-90 Var. 95 120-150 Var. 128 90 Var. 29 30-80 Var. 63 60-80 Var. 96 120-140 Var. 129 92,5 Var. 30 30-70 Var. 64 60-70 Var. 97 120-130 Var. 130 95 Var. 31 30-60 Var. 65 70-150 Var. 98 130-150 Var. 131 97,5 Var. 32 30-50 Var. 66 70-140 Var. 99 130-140 Var. 132 100 Var. 33 30-40 Var. 67 70-130 Var. 100 140-150 Var. 133 105 Var. 34 Var. = Variação

[00105] O rVWF da presente invenção é altamente multimérico compreendendo cerca de 10 a cerca de 40 subunidades. Em modalidades adicionais, o rVWF multimérico produzido administrando métodos da presente invenção compreendem cerca de 10-30, 12-28, 14-26, 16-24, 18-22,

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20-21 subunidades.

Em algumas modalidades, o rVWF está presente em multímeros variando no tamanho de dímeros para multímeros acima de 40 subunidades (> 10 milhões de Daltons). Os multímeros maiores proveem sítios de ligação múltiplos que podem interagir tanto com receptores de plaqueta quanto sítios de matriz subendotelial de lesão e estão na forma mais hemostaticamente ativa do VWF.

Em algumas modalidades, o rVWF da presente invenção compreende multímeros ultragrandes (ULMs). Geralmente, multímeros altos e ultragrandes são considerados ser hemostaticamente mais eficaz (ver, por exemplo, Turecek, P., Hämostaseologie, (Vol. 37): Suplemento 1, páginas S15 a S25 (2017)). Em algumas modalidades, o rVWF está entre 500 kDa e 20.000 kDa.

Em algumas modalidades, qualquer padrão de multímero desejado pode ser obtido administrando os métodos descritos.

Em algumas modalidades, quando os métodos de troca aniônica e/ou troca catiônica são utilizadas, o pH, condutividade e/ou concentração de contraíon dos tampões na uma ou mais etapa(s) de lavagem ou os tampões de gradiente podem ser manipulados para obter o padrão multimérico desejado.

Em algumas modalidades, depois que os métodos de cromatografia de exclusão de tamanho são utilizados, os critérios de coleta podem ser utilizados para se obter o padrão multimérico desejado.

Em algumas modalidades, o padrão multimérico descrito compreende multímeros ultragrande.

Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes são pelo menos 10.000 kDa, pelo menos 11.000 kDa, pelo menos 12.000 kDa, pelo menos 13.000 kDa, pelo menos 14.000 kDa, pelo menos 15.000 kDa, pelo menos 16.000 kDa, pelo menos 17.000 kDa, pelo menos 18.000 kDa, pelo menos 19.000 kDa, pelo menos 20.000 kDa.

Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes

45 / 145 estão entre cerca de 10.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de 11.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de

12.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de 13.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de 14.000 kDa e

20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de 15.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de 16.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de

17.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de 18.000 kDa e 20.000 kDa. Em algumas modalidades, os multímeros ultragrandes estão entre cerca de 19.000 kDa e

20.000 kDa. Em algumas modalidades, o rVWF obtido administrando os presentes métodos incluem qualquer padrão de multímero presente na amostra de carga do rVWF. Em algumas modalidades, o rVWF obtido administrando os presentes métodos incluem padrões multiméricos de ocorrência fisiológica assim como ultra padrões de multímero VWF grande.

[00106] Em algumas modalidades, a composição de rVWF preparada pelo método de purificação aqui descrito tem uma distribuição de oligômeros de rVWF distinguida em que 95% dos oligômeros têm entre 6 subunidades e 20 subunidades. Em algumas modalidades, a composição de rVWF tem uma distribuição de oligômeros de rVWF distinguida em que 95% dos oligômeros têm uma faixa de subunidades selecionadas das variações 458 a 641 encontradas em 4.

46 / 145 Tabela 4. Modalidades exemplares para a distribuição de oligômeros de rVWF encontrados nas composições e usados nos métodos aqui providos. Subunidades Subunidades Subunidades Subunidades 2-40 Var. 458 6-16 Var. 504 12-20 Var. 550 20-28 Var. 596 2-38 Var. 459 6-14 Var. 505 12-18 Var. 551 20-26 Var. 597 2-36 Var. 460 6-12 Var. 506 12-16 Var. 552 20-24 Var. 598 2-34 Var. 461 6-10 Var. 507 12-14 Var. 553 20-22 Var. 599 2-32 Var. 462 6-8 Var. 508 14-40 Var. 554 22-40 Var. 600 2-30 Var. 463 8-40 Var. 509 14-38 Var. 555 22-38 Var. 601 2-28 Var. 464 8-38 Var. 510 14-36 Var. 556 22-36 Var. 602 2-26 Var. 465 8-36 Var. 511 14-34 Var. 557 22-34 Var. 603 2-24 Var. 466 8-34 Var. 512 14-32 Var. 558 22-32 Var. 604 2-22 Var. 467 8-32 Var. 513 14-30 Var. 559 22-30 Var. 605 2-20 Var. 468 8-30 Var. 514 14-28 Var. 560 22-28 Var. 606 2-18 Var. 469 8-28 Var. 515 14-26 Var. 561 22-26 Var. 607 2-16 Var. 470 8-26 Var. 516 14-24 Var. 562 22-24 Var. 608 2-14 Var. 471 8-24 Var. 517 14-22 Var. 563 24-40 Var. 609 2-12 Var. 472 8-22 Var. 518 14-20 Var. 564 24-38 Var. 610 2-10 Var. 473 8-20 Var. 519 14-18 Var. 565 24-36 Var. 611 2-8 Var. 474 8-18 Var. 520 14-16 Var. 566 24-34 Var. 612 4-40 Var. 475 8-16 Var. 521 16-40 Var. 567 24-32 Var. 613 4-38 Var. 476 8-14 Var. 522 16-38 Var. 568 24-30 Var. 614 4-36 Var. 477 8-12 Var. 523 16-36 Var. 569 24-28 Var. 615 4-34 Var. 478 8-10 Var. 524 16-34 Var. 570 24-26 Var. 616 4-32 Var. 479 10-40 Var. 525 16-32 Var. 571 26-40 Var. 617 4-30 Var. 480 10-38 Var. 526 16-30 Var. 572 26-38 Var. 618 4-28 Var. 481 10-36 Var. 527 16-28 Var. 573 26-36 Var. 619 4-26 Var. 482 10-34 Var. 528 16-26 Var. 574 26-34 Var. 620 4-24 Var. 483 10-32 Var. 529 16-24 Var. 575 26-32 Var. 621 4-22 Var. 484 10-30 Var. 530 16-22 Var. 576 26-30 Var. 622 4-20 Var. 485 10-28 Var. 531 16-20 Var. 577 26-28 Var. 623 4-18 Var. 486 10-26 Var. 532 16-18 Var. 578 28-40 Var. 624 4-16 Var. 487 10-24 Var. 533 18-40 Var. 579 28-38 Var. 625 4-14 Var. 488 10-22 Var. 534 18-38 Var. 580 28-36 Var. 626 4-12 Var. 489 10-20 Var. 535 18-36 Var. 581 28-34 Var. 627 4-10 Var. 490 10-18 Var. 536 18-34 Var. 582 28-32 Var. 628 4-8 Var. 491 10-16 Var. 537 18-32 Var. 583 28-30 Var. 629 6-40 Var. 492 10-14 Var. 538 18-30 Var. 584 30-40 Var. 630 6-38 Var. 493 10-12 Var. 539 18-28 Var. 585 30-38 Var. 631 6-36 Var. 494 12-40 Var. 540 18-26 Var. 586 30-36 Var. 632 6-34 Var. 495 12-38 Var. 541 18-24 Var. 587 30-34 Var. 633 6-32 Var. 496 12-36 Var. 542 18-22 Var. 588 30-32 Var. 634 6-30 Var. 497 12-34 Var. 543 18-20 Var. 589 32-40 Var. 635 6-28 Var. 498 12-32 Var. 544 20-40 Var. 590 32-38 Var. 636 6-26 Var. 499 12-30 Var. 545 20-38 Var. 591 32-36 Var. 637 6-24 Var. 500 12-28 Var. 546 20-36 Var. 592 32-34 Var. 638 6-22 Var. 501 12-26 Var. 547 20-34 Var. 593 34-40 Var. 639 6-20 Var. 502 12-24 Var. 548 20-32 Var. 594 36-38 Var. 640 6-18 Var. 503 12-22 Var. 549 20-30 Var. 595 38-40 Var. 641 Var. = Variação

[00107] Em algumas modalidades, a composição de rVWF preparada pelos métodos aqui providos pode ser distinguida de acordo com a porcentagem de moléculas de rVWF que estão presentes em um multímero

47 / 145 de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior.

Por exemplo, em uma modalidade, pelo menos 20% das moléculas de rVWF em uma composição de rVWF usada nos métodos aqui descritos estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 10 subunidades.

Em uma outra modalidade, pelo menos 20% das moléculas de rVWF em uma composição de rVWF usada nos métodos aqui descritos estão presentes em um complexo oligomérico de pelo menos 12 subunidades.

Já em outras modalidades, uma composição de rVWF usada nos métodos aqui providos tem uma porcentagem mínima (por exemplo, tem pelo menos X%) das moléculas de rVWF presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior (por exemplo, um multímero de pelo menos Y subunidades) de acordo com qualquer uma das variações 134 a 457 encontradas na Tabela 5 até a Tabela 7. Tabela 5. Modalidades exemplares para a porcentagem de moléculas de rVWF que estão presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior encontrados nas composições e usados nos métodos aqui providos.

Número Mínimo de Subunidades em Multímero de rVWF 6 8 10 12 14 16 10% Var. 134 Var. 152 Var. 170 Var. 188 Var. 206 Var. 224 15% Var. 135 Var. 153 Var. 171 Var. 189 Var. 207 Var. 225 Porcentagem mínima das moléculas de rVWF

20% Var. 136 Var. 154 Var. 172 Var. 190 Var. 208 Var. 226 25% Var. 137 Var. 155 Var. 173 Var. 191 Var. 209 Var. 227 30% Var. 138 Var. 156 Var. 174 Var. 192 Var. 210 Var. 228 35% Var. 139 Var. 157 Var. 175 Var. 193 Var. 211 Var. 229 40% Var. 140 Var. 158 Var. 176 Var. 194 Var. 212 Var. 230 45% Var. 141 Var. 159 Var. 177 Var. 195 Var. 213 Var. 231 50% Var. 142 Var. 160 Var. 178 Var. 196 Var. 214 Var. 232 55% Var. 143 Var. 161 Var. 179 Var. 197 Var. 215 Var. 233 60% Var. 144 Var. 162 Var. 180 Var. 198 Var. 216 Var. 234 65% Var. 145 Var. 163 Var. 181 Var. 199 Var. 217 Var. 235 70% Var. 146 Var. 164 Var. 182 Var. 200 Var. 218 Var. 236 75% Var. 147 Var. 165 Var. 183 Var. 201 Var. 219 Var. 237 80% Var. 148 Var. 166 Var. 184 Var. 202 Var. 220 Var. 238 85% Var. 149 Var. 167 Var. 185 Var. 203 Var. 221 Var. 239 90% Var. 150 Var. 168 Var. 186 Var. 204 Var. 222 Var. 240 95% Var. 151 Var. 169 Var. 187 Var. 205 Var. 223 Var. 241 Var. = Variação

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Tabela 6. Modalidades exemplares para a porcentagem de moléculas de rVWF que estão presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior encontrados nas composições e usados nos métodos aqui providos.

Número Mínimo de Subunidades no Multímero de rVWF 18 20 22 24 26 28 10% Var. 242 Var. 260 Var. 278 Var. 296 Var. 314 Var. 332 15% Var. 243 Var. 261 Var. 279 Var. 297 Var. 315 Var. 333 Porcentagem mínima das moléculas de rVWF

20% Var. 244 Var. 262 Var. 280 Var. 298 Var. 316 Var. 334 25% Var. 245 Var. 263 Var. 281 Var. 299 Var. 317 Var. 335 30% Var. 246 Var. 264 Var. 282 Var. 300 Var. 318 Var. 336 35% Var. 247 Var. 265 Var. 283 Var. 301 Var. 319 Var. 337 40% Var. 248 Var. 266 Var. 284 Var. 302 Var. 320 Var. 338 45% Var. 249 Var. 267 Var. 285 Var. 303 Var. 321 Var. 339 50% Var. 250 Var. 268 Var. 286 Var. 304 Var. 322 Var. 340 55% Var. 251 Var. 269 Var. 287 Var. 305 Var. 323 Var. 341 60% Var. 252 Var. 270 Var. 288 Var. 306 Var. 324 Var. 342 65% Var. 253 Var. 271 Var. 289 Var. 307 Var. 325 Var. 343 70% Var. 254 Var. 272 Var. 290 Var. 308 Var. 326 Var. 344 75% Var. 255 Var. 273 Var. 291 Var. 309 Var. 327 Var. 345 80% Var. 256 Var. 274 Var. 292 Var. 310 Var. 328 Var. 346 85% Var. 257 Var. 275 Var. 293 Var. 311 Var. 329 Var. 347 90% Var. 258 Var. 276 Var. 294 Var. 312 Var. 330 Var. 348 95% Var. 259 Var. 277 Var. 295 Var. 313 Var. 331 Var. 349 Var. = Variação

Tabela 7. Modalidades exemplares para a porcentagem de moléculas de rVWF que estão presentes em um multímero de rVWF de ordem superior particular ou multímero maior encontrados nas composições e usados nos métodos aqui providos.

Número Mínimo de Subunidades no Multímero de rVWF 30 32 34 36 38 40 10% Var. 350 Var. 368 Var. 386 Var. 404 Var. 422 Var. 440 15% Var. 351 Var. 369 Var. 387 Var. 405 Var. 423 Var. 441 Porcentagem mínima das moléculas de rVWF

20% Var. 352 Var. 370 Var. 388 Var. 406 Var. 424 Var. 442 25% Var. 353 Var. 371 Var. 389 Var. 407 Var. 425 Var. 443 30% Var. 354 Var. 372 Var. 390 Var. 408 Var. 426 Var. 444 35% Var. 355 Var. 373 Var. 391 Var. 409 Var. 427 Var. 445 40% Var. 356 Var. 374 Var. 392 Var. 410 Var. 428 Var. 446 45% Var. 357 Var. 375 Var. 393 Var. 411 Var. 429 Var. 447 50% Var. 358 Var. 376 Var. 394 Var. 412 Var. 430 Var. 448 55% Var. 359 Var. 377 Var. 395 Var. 413 Var. 431 Var. 449 60% Var. 360 Var. 378 Var. 396 Var. 414 Var. 432 Var. 450 65% Var. 361 Var. 379 Var. 397 Var. 415 Var. 433 Var. 451 70% Var. 362 Var. 380 Var. 398 Var. 416 Var. 434 Var. 452 75% Var. 363 Var. 381 Var. 399 Var. 417 Var. 435 Var. 453 80% Var. 364 Var. 382 Var. 400 Var. 418 Var. 436 Var. 454 85% Var. 365 Var. 383 Var. 401 Var. 419 Var. 437 Var. 455 90% Var. 366 Var. 384 Var. 402 Var. 420 Var. 438 Var. 456 95% Var. 367 Var. 385 Var. 403 Var. 421 Var. 439 Var. 457 Var. = Variação

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[00108] De acordo com o acima, o rVWF compreende uma porcentagem significante de multímeros de rVWF de peso molecular alto (HMW). Em modalidades adicionais, a composição de multímero de rVWF HMW compreende pelo menos 10% a 80% decâmeros de rVWF ou multímeros de ordem superior. Em modalidades adicionais, a composição compreende cerca de 10 a 95%, 20 a 90%, 30 a 85%, 40 a 80%, 50 a 75%, 60 a 70% decâmeros ou multímeros de ordem superior. Em modalidades adicionais, a composição de multímero de rVWF HMW compreende pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% decâmeros ou multímeros de ordem superior.

[00109] Avaliação do número e porcentagem de multímeros de rVWF pode ser conduzida administrando métodos conhecidos na técnica, incluindo sem limitação métodos administrando métodos de eletroforese e cromatografia de exclusão de tamanho para separar multímeros de rVWF pelo tamanho, por exemplo como debatido por Cumming et al, (J Clin Pathol. maio de 1993; 46(5): 470-473, que é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com avaliação de multímeros de rVWF). Tais técnicas podem incluir adicionalmente técnicas de imunoblot (tais como Western Blot), nas quais o gel é submetido a imunoblot com um anticorpo radiomarcado contra VWF seguido pela detecção quimioluminescente (ver por exemplo Wen et al., (1993), J. Clin. Lab. Anal., 7: 317–323, que é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com a avaliação de multímeros de rVWF). Ensaios adicionais para VWF incluem VWF:Antígeno (VWF:Ag), VWF:Cofator de Ristocetina (VWF:RCof) e VWF:Ensaio de Atividade de Ligação de Colágeno (VWF:CBA), que são frequentemente usados para diagnóstico e classificação da Doença de von Willebrand. (ver por exemplo Favaloro et al., Pathology, 1997, 29(4): 341-

50 / 145 456, que é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com os ensaios para VWF).

[00110] Em algumas modalidades, a razão da atividade pró- coagulante de rFVIII (IU rFVIII:C) para a atividade do Cofator de Ristocetina de rVWF (IU rVWF:RCo) para o rVWF preparado de acordo com os métodos da presente invenção está entre 3:1 e 1:5. Em modalidades adicionais, a razão está entre 2:1 e 1:4. Ainda em modalidades adicionais, a razão está entre 5:2 e 1:4. Em modalidades adicionais, a razão está entre 3:2 e 1:3. Ainda em modalidades adicionais, a razão é de cerca de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 2:1, 2:3, 2:4, 2:5, 3:1, 3:2, 3:4 ou 3:5. Em modalidades adicionais, a razão está entre 1:1 e 1:2. Ainda em modalidades adicionais, a razão é 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1 ou 2:1. Em certas modalidades, a razão da atividade pró-coagulante de rFVIII (IU rFVIII:C) para a atividade de Cofator de Ristocetina de rVWF (IU rVWF:RCo) em uma composição útil para um método aqui descrito é selecionada das variações 1988 a 2140 encontradas na Tabela 8. Tabela 8. Modalidades exemplares para a razão da atividade pró-coagulante de rFVIII (IU rFVIII:C) para a atividade do Cofator de Ristocetina de rVWF (IU rVWF:RCo) nas composições e usadas nos métodos aqui providos. (IU rFVIII:C) a (IU rFVIII:C) a (IU rFVIII:C) a (IU rFVIII:C) a (IU rVWF:RCo) (IU rVWF:RCo) (IU rVWF:RCo) (IU rVWF:RCo) 4:1 Var. 1988 3:1-3:5 Var. 2027 4:3-1:4 Var. 2065 4:5-2:3 Var. 2103 3:1 Var. 1989 3:1-2:3 Var. 2028 4:3-1:3 Var. 2066 4:5-3:4 Var. 2104 2:1 Var. 1990 3:1-3:4 Var. 2029 4:3-2:5 Var. 2067 3:4-1:6 Var. 2105 3:2 Var. 1991 3:1-4:5 Var. 2030 4:3-1:2 Var. 2068 3:4-1:5 Var. 2106 4:3 Var. 1992 3:1-5:6 Var. 2031 4:3-3:5 Var. 2069 3:4-1:4 Var. 2107 1:1 Var. 1993 3:1-1:1 Var. 2032 4:3-2:3 Var. 2070 3:4-1:3 Var. 2108 5:6 Var. 1994 3:1-4:3 Var. 2033 4:3-3:4 Var. 2071 3:4-2:5 Var. 2109 4:5 Var. 1995 3:1-3:2 Var. 2034 4:3-4:5 Var. 2072 3:4-1:2 Var. 2110 3:4 Var. 1996 3:1-2:1 Var. 2035 4:3-5:6 Var. 2073 3:4-3:5 Var. 2111 2:3 Var. 1997 2:1-1:6 Var. 2036 4:3-1:1 Var. 2074 3:4-2:3 Var. 2112 3:5 Var. 1998 2:1-1:5 Var. 2037 1:1-1:6 Var. 2075 2:3-1:6 Var. 2113 1:2 Var. 1999 2:1-1:4 Var. 2038 1:1-1:5 Var. 2076 2:3-1:5 Var. 2114 2:5 Var. 2000 2:1-1:3 Var. 2039 1:1-1:4 Var. 2077 2:3-1:4 Var. 2115 1:3 Var. 2001 2:1-2:5 Var. 2040 1:1-1:3 Var. 2078 2:3-1:3 Var. 2116 1:4 Var. 2002 2:1-1:2 Var. 2041 1:1-2:5 Var. 2079 2:3-2:5 Var. 2117 1:5 Var. 2003 2:1-3:5 Var. 2042 1:1-1:2 Var. 2080 2:3-1:2 Var. 2118 1:6 Var. 2004 2:1-2:3 Var. 2043 1:1-3:5 Var. 2081 2:3-3:5 Var. 2119

51 / 145 (IU rFVIII:C) a (IU rFVIII:C) a (IU rFVIII:C) a (IU rFVIII:C) a (IU rVWF:RCo) (IU rVWF:RCo) (IU rVWF:RCo) (IU rVWF:RCo) 4:1-1:6 Var. 2005 2:1-3:4 Var. 2044 1:1-2:3 Var. 2082 3:5-1:6 Var. 2120 4:1-1:5 Var. 2006 2:1-4:5 Var. 2045 1:1-3:4 Var. 2083 3:5-1:5 Var. 2121 4:1-1:4 Var. 2007 2:1-5:6 Var. 2046 1:1-4:5 Var. 2084 3:5-1:4 Var. 2122 4:1-1:3 Var. 2008 2:1-1:1 Var. 2047 1:1-5:6 Var. 2085 3:5-1:3 Var. 2123 4:1-2:5 Var. 2009 2:1-4:3 Var. 2048 5:6-1:6 Var. 2086 3:5-2:5 Var. 2124 4:1-1:2 Var. 2010 2:1-3:2 Var. 2049 5:6-1:5 Var. 2087 3:5-1:2 Var. 2125 4:1-3:5 Var. 2011 3:2-1:6 Var. 2050 5:6-1:4 Var. 2088 1:2-1:6 Var. 2126 4:1-2:3 Var. 2012 3:2-1:5 Var. 2051 5:6-1:3 Var. 2089 1:2-1:5 Var. 2127 4:1-3:4 Var. 2013 3:2-1:4 Var. 2052 5:6-2:5 Var. 2090 1:2-1:4 Var. 2128 4:1-4:5 Var. 2014 3:2-1:3 Var. 2053 5:6-1:2 Var. 2091 1:2-1:3 Var. 2129 4:1-5:6 Var. 2015 3:2-2:5 Var. 2054 5:6-3:5 Var. 2092 1:2-2:5 Var. 2130 4:1-1:1 Var. 2016 3:2-1:2 Var. 2055 5:6-2:3 Var. 2093 2:5-1:6 Var. 2131 4:1-4:3 Var. 2017 3:2-3:5 Var. 2056 5:6-3:4 Var. 2094 2:5-1:5 Var. 2132 4:1-3:2 Var. 2018 3:2-2:3 Var. 2057 5:6-4:5 Var. 2095 2:5-1:4 Var. 2133 4:1-2:1 Var. 2019 3:2-3:4 Var. 2058 4:5-1:6 Var. 2096 2:5-1:3 Var. 2134 4:1-3:1 Var. 2020 3:2-4:5 Var. 2059 4:5-1:5 Var. 2097 1:3-1:6 Var. 2135 3:1-1:6 Var. 2021 3:2-5:6 Var. 2060 4:5-1:4 Var. 2098 1:3-1:5 Var. 2136 3:1-1:5 Var. 2022 3:2-1:1 Var. 2061 4:5-1:3 Var. 2099 1:3-1:4 Var. 2137 3:1-1:4 Var. 2023 3:2-4:3 Var. 2062 4:5-2:5 Var. 2100 1:4-1:6 Var. 2138 3:1-1:3 Var. 2024 4:3-1:6 Var. 2063 4:5-1:2 Var. 2101 1:4-1:5 Var. 2139 3:1-2:5 Var. 2025 4:3-1:5 Var. 2064 4:5-3:5 Var. 2102 1:5-1:6 Var. 2140 3:1-1:2 Var. 2026 Var. = Variação

[00111] Em modalidades adicionais, multímeros de rVWF de ordem superior da invenção são estáveis durante cerca de 1 a cerca de 90 horas após a administração. Ainda em modalidades adicionais, os multímeros de rVWF de ordem superior são estáveis durante cerca de 5 a 80, 10 a 70, 15 a 60, 20 a 50, 25 a 40, 30 a 35 horas após a administração. Ainda em modalidades adicionais, os multímeros de rVWF de ordem superior são estáveis durante pelo menos 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 horas após a administração. Em certas modalidades a estabilidade dos multímeros de rVWF é avaliada in vitro.

[00112] Em uma modalidade, multímeros de rVWF de ordem superior usados nas composições e métodos aqui providos têm uma meia-vida de pelo menos 12 horas após a administração. Em uma outra modalidade, os multímeros de rVWF de ordem superior têm uma meia-vida de pelo menos 24 horas após a administração. Já em outras modalidades, os multímeros de rVWF de ordem superior têm uma meia-vida selecionada das variações 642 a 1045 encontradas na Tabela 9. Tabela 9. Modalidades exemplares para a meia-vida de multímeros de rVWF de ordem superior encontrados nas composições preparadas pelos métodos

52 / 145 aqui providos.

Horas Horas Horas Horas pelo menos 1 Var. 642 4-22 Var. 743 14-78 Var. 844 24-30 Var. 945 pelo menos 2 Var. 643 4-20 Var. 744 14-72 Var. 845 24-27 Var. 946 pelo menos 3 Var. 644 4-18 Var. 745 14-66 Var. 846 27-90 Var. 947 pelo menos 4 Var. 645 4-16 Var. 746 14-60 Var. 847 27-84 Var. 948 pelo menos 5 Var. 646 4-14 Var. 747 14-54 Var. 848 27-78 Var. 949 pelo menos 6 Var. 647 4-12 Var. 748 14-48 Var. 849 27-72 Var. 950 pelo menos 7 Var. 648 4-10 Var. 749 14-45 Var. 850 27-66 Var. 951 pelo menos 8 Var. 649 4-8 Var. 750 14-42 Var. 851 27-60 Var. 952 pelo menos 9 Var. 650 4-6 Var. 751 14-39 Var. 852 27-54 Var. 953 pelo menos 10 Var. 651 6-90 Var. 752 14-36 Var. 853 27-48 Var. 954 pelo menos 11 Var. 652 6-84 Var. 753 14-33 Var. 854 30-90 Var. 955 pelo menos 12 Var. 653 6-78 Var. 754 14-30 Var. 855 30-84 Var. 956 pelo menos 14 Var. 654 6-72 Var. 755 14-27 Var. 856 30-78 Var. 957 pelo menos 16 Var. 655 6-66 Var. 756 14-24 Var. 857 30-72 Var. 958 pelo menos 18 Var. 656 6-60 Var. 757 14-22 Var. 858 30-66 Var. 959 pelo menos 20 Var. 657 6-54 Var. 758 14-20 Var. 859 30-60 Var. 960 pelo menos 22 Var. 658 6-48 Var. 759 14-18 Var. 860 30-54 Var. 961 pelo menos 24 Var. 659 6-45 Var. 760 14-16 Var. 861 30-48 Var. 962 pelo menos 27 Var. 660 6-42 Var. 761 16-90 Var. 862 30-45 Var. 963 pelo menos 30 Var. 661 6-39 Var. 762 16-84 Var. 863 30-42 Var. 964 pelo menos 33 Var. 662 6-36 Var. 763 16-78 Var. 864 30-39 Var. 965 pelo menos 36 Var. 663 6-33 Var. 764 16-72 Var. 865 30-36 Var. 966 pelo menos 39 Var. 664 6-30 Var. 765 16-66 Var. 866 30-33 Var. 967 pelo menos 42 Var. 665 6-27 Var. 766 16-60 Var. 867 33-90 Var. 968 pelo menos 45 Var. 666 6-24 Var. 767 16-54 Var. 868 33-84 Var. 969 pelo menos 48 Var. 667 6-22 Var. 768 16-48 Var. 869 33-78 Var. 970 pelo menos 54 Var. 668 6-20 Var. 769 16-45 Var. 870 33-72 Var. 971 pelo menos 60 Var. 669 6-18 Var. 770 16-42 Var. 871 33-66 Var. 972 pelo menos 66 Var. 670 6-16 Var. 771 16-39 Var. 872 33-60 Var. 973 pelo menos 72 Var. 671 6-14 Var. 772 16-36 Var. 873 33-54 Var. 974 pelo menos 78 Var. 672 6-12 Var. 773 16-33 Var. 874 33-48 Var. 975 pelo menos 84 Var. 673 6-10 Var. 774 16-30 Var. 875 33-45 Var. 976 pelo menos 90 Var. 674 6-8 Var. 775 16-27 Var. 876 33-42 Var. 977 2-90 Var. 675 8-90 Var. 776 16-24 Var. 877 33-29 Var. 978 2-84 Var. 676 8-84 Var. 777 16-22 Var. 878 33-36 Var. 979 2-78 Var. 677 8-78 Var. 778 16-20 Var. 879 36-90 Var. 980 2-72 Var. 678 8-72 Var. 779 16-18 Var. 880 36-84 Var. 981 2-66 Var. 679 8-66 Var. 780 18-90 Var. 881 36-78 Var. 982 2-60 Var. 680 8-60 Var. 781 18-84 Var. 882 36-72 Var. 983 2-54 Var. 681 8-54 Var. 782 18-78 Var. 883 36-66 Var. 984 2-48 Var. 682 8-48 Var. 783 18-72 Var. 884 36-60 Var. 985 2-45 Var. 683 8-45 Var. 784 18-66 Var. 885 36-54 Var. 986 2-42 Var. 684 8-42 Var. 785 18-60 Var. 886 36-48 Var. 987 2-39 Var. 685 8-39 Var. 786 18-54 Var. 887 36-45 Var. 988 2-36 Var. 686 8-36 Var. 787 18-48 Var. 888 36-42 Var. 989 2-33 Var. 687 8-33 Var. 788 18-45 Var. 889 36-39 Var. 990 2-30 Var. 688 8-30 Var. 789 18-42 Var. 890 39-90 Var. 991 2-27 Var. 689 8-27 Var. 790 18-39 Var. 891 39-84 Var. 992 2-24 Var. 690 8-24 Var. 791 18-36 Var. 892 39-78 Var. 993 2-22 Var. 691 8-22 Var. 792 18-33 Var. 893 39-72 Var. 994 2-20 Var. 692 8-20 Var. 793 18-30 Var. 894 39-66 Var. 995 2-18 Var. 693 8-18 Var. 794 18-27 Var. 895 39-60 Var. 996 2-16 Var. 694 8-16 Var. 795 18-24 Var. 896 39-54 Var. 997 2-14 Var. 695 8-14 Var. 796 18-22 Var. 897 39-48 Var. 998 2-12 Var. 696 8-12 Var. 797 18-20 Var. 898 39-45 Var. 999

53 / 145 Horas Horas Horas Horas 2-10 Var. 697 8-10 Var. 798 20-90 Var. 899 39-42 Var. 1000 2-8 Var. 698 10-90 Var. 799 20-84 Var. 900 42-90 Var. 1001 2-6 Var. 699 10-84 Var. 800 20-78 Var. 901 42-84 Var. 1002 2-4 Var. 700 10-78 Var. 801 20-72 Var. 902 42-78 Var. 1003 3-90 Var. 701 10-72 Var. 802 20-66 Var. 903 42-72 Var. 1004 3-84 Var. 702 10-66 Var. 803 20-60 Var. 904 42-66 Var. 1005 3-78 Var. 703 10-60 Var. 804 20-54 Var. 905 42-60 Var. 1006 3-72 Var. 704 10-54 Var. 805 20-48 Var. 906 42-54 Var. 1007 3-66 Var. 705 10-48 Var. 806 20-45 Var. 907 42-48 Var. 1008 3-60 Var. 706 10-45 Var. 807 20-42 Var. 908 42-45 Var. 1009 3-54 Var. 707 10-42 Var. 808 20-39 Var. 909 45-90 Var. 1010 3-48 Var. 708 10-39 Var. 809 20-36 Var. 910 45-84 Var. 1011 3-45 Var. 709 10-36 Var. 810 20-33 Var. 911 45-78 Var. 1012 3-42 Var. 710 10-33 Var. 811 20-30 Var. 912 45-72 Var. 1013 3-39 Var. 711 10-30 Var. 812 20-27 Var. 913 45-66 Var. 1014 3-36 Var. 712 10-27 Var. 813 20-24 Var. 914 45-60 Var. 1015 3-33 Var. 713 10-24 Var. 814 20-22 Var. 915 45-54 Var. 1016 3-30 Var. 714 10-22 Var. 815 22-90 Var. 916 45-48 Var. 1017 3-27 Var. 715 10-20 Var. 816 22-84 Var. 917 48-90 Var. 1018 3-24 Var. 716 10-18 Var. 817 22-78 Var. 918 48-84 Var. 1019 3-22 Var. 717 10-16 Var. 818 22-72 Var. 919 48-78 Var. 1020 3-20 Var. 718 10-14 Var. 819 22-66 Var. 920 48-72 Var. 1021 3-18 Var. 719 10-12 Var. 820 22-60 Var. 921 48-66 Var. 1022 3-16 Var. 720 12-90 Var. 821 22-54 Var. 922 48-60 Var. 1023 3-14 Var. 721 12-84 Var. 822 22-48 Var. 923 48-54 Var. 1024 3-12 Var. 722 12-78 Var. 823 22-45 Var. 924 54-90 Var. 1025 3-10 Var. 723 12-72 Var. 824 22-42 Var. 925 54-84 Var. 1026 3-8 Var. 724 12-66 Var. 825 22-39 Var. 926 54-78 Var. 1027 3-6 Var. 725 12-60 Var. 826 22-36 Var. 927 54-72 Var. 1028 3-4 Var. 726 12-54 Var. 827 22-33 Var. 928 54-66 Var. 1029 4-90 Var. 727 12-48 Var. 828 22-30 Var. 929 54-60 Var. 1030 4-84 Var. 728 12-45 Var. 829 22-27 Var. 930 60-90 Var. 1031 4-78 Var. 729 12-42 Var. 830 22-24 Var. 931 60-84 Var. 1032 4-72 Var. 730 12-39 Var. 831 24-90 Var. 932 60-78 Var. 1033 4-66 Var. 731 12-36 Var. 832 24-84 Var. 933 60-72 Var. 1034 4-60 Var. 732 12-33 Var. 833 24-78 Var. 934 60-66 Var. 1035 4-54 Var. 733 12-30 Var. 834 24-72 Var. 935 66-90 Var. 1036 4-48 Var. 734 12-27 Var. 835 24-66 Var. 936 66-84 Var. 1037 4-45 Var. 735 12-24 Var. 836 24-60 Var. 937 66-78 Var. 1038 4-42 Var. 736 12-22 Var. 837 24-54 Var. 938 66-72 Var. 1039 4-39 Var. 737 12-20 Var. 838 24-48 Var. 939 72-90 Var. 1040 4-36 Var. 738 12-18 Var. 839 24-45 Var. 940 72-84 Var. 1041 4-33 Var. 739 12-16 Var. 840 24-42 Var. 941 72-78 Var. 1042 4-30 Var. 740 12-14 Var. 841 24-39 Var. 942 78-90 Var. 1043 4-27 Var. 741 14-90 Var. 842 24-36 Var. 943 78-84 Var. 1044 4-24 Var. 742 14-84 Var. 843 24-33 Var. 944 84-90 Var. 1045 Var. = Variação

[00113] Em algumas modalidades, o pró-VWF e/ou rVWF purificado de acordo com a presente invenção não é modificado com nenhuma conjugação, após a tradução ou modificações covalentes. Em modalidades particulares, o pró-VWF e/ou rVWF purificado da presente invenção não é modificado com um polímero solúvel em água, incluindo sem limitação, um

54 / 145 polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxil etil amido, uma porção de policarboidrato e similares.

[00114] Em algumas modalidades, o pró-VWF e/ou rVWF purificado de acordo com a presente invenção é modificado através da conjugação, após a modificação de tradução ou modificação covalente, incluindo modificações dos resíduos de terminal N ou C assim como modificações de cadeias laterais selecionadas, por exemplo, em grupos sulfidrila livres, aminas primárias e grupos hidroxila. Em uma modalidade, um polímero solúvel em água é ligado com a proteína (diretamente ou por intermédio de um ligador) por um grupo lisina ou outra amina primária. Em algumas modalidades, o pró-VWF e/ou rVWF purificado da presente invenção podem ser modificados pela conjugação de um polímero solúvel em água, incluindo sem limitação, um polietileno glicol (PEG), um polipropileno glicol, um polioxialquileno, um ácido polissiálico, hidroxil etil amido, uma porção de policarboidrato e similares.

[00115] Os polímeros solúveis em água que podem ser usados para modificar o pró-VWF e/ou rVWF purificado incluem estruturas lineares e ramificadas. Os polímeros conjugados podem ser fixados diretamente às proteínas de coagulação da invenção ou alternativamente podem ser fixados através de uma porção de ligação. Os exemplos não limitantes de conjugação de proteína com polímeros solúveis em água podem ser encontrados nas Patentes norte-americanas nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417,

4.791.192 e 4.179.337, assim como em Abuchowski e Davis “Enzymes as Drugs”, Holcenberg e Roberts, Eds., pp. 367 383, John Wiley and Sons, New York (1981) e Hermanson G., Bioconjugate Techniques 2a Ed., Academic Press, Inc. 2008.

[00116] A conjugação de proteína pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, ver Hermanson G.,

55 / 145 Bioconjugate Techniques 2a Ed., Academic Press, Inc. 2008. Os exemplos incluem conexão através da ligação peptídica entre um grupo carboxila em uma de cada uma da proteína de coagulação ou porção polimérica solúvel em água e um grupo amina do outro ou uma conexão de éster entre um grupo carboxila de um e um grupo hidroxila do outro. Uma outra conexão pela qual uma proteína de coagulação da invenção seria conjugada a um composto polimérico solúvel em água é por intermédio de uma base de Schiff, entre um grupo amino livre na porção polimérica sendo reagido com um grupo aldeído formado na extremidade não redutora do polímero pela oxidação de periodato (Jennings e Lugowski, J. Immunol. 1981; 127:1011-8; Femandes e Gregonradis, Biochim Biophys Acta. 1997; 1341; 26-34). A Base de Schiff gerada pode ser estabilizada pela redução específica com NaCNBH3 para formar uma amina secundária. Um método alternativo é a geração de grupos amino livres de terminal no polímero pela aminação redutiva com NH4Cl depois da oxidação anterior. Reagentes bifuncionais podem ser usados para conectar dois grupos amino ou duas hidroxilas. Por exemplo, um polímero contendo um grupo amino pode ser unido a um grupo amino da proteína de coagulação com reagentes como BS3 (Bis(sulfossuccinimidil)suberato/Pierce, Rockford, Ill.). Além disso, reagentes de conexão cruzada heterobifuncionais como Sulfo-EMCS (éster de N-ε-Maleimidocaproilóxi)sulfossuccinimida/Pierce) podem ser usados por exemplo para conectar grupos amina e tiol. Em outras modalidades, um grupo reativo em aldeído, tal como PEG alcóxido mais dietil acetal de bromoacetaldeído; PEG mais DMSO e anidrido acético e cloreto de PEG mais o fenóxido de 4-hidroxibenzaldeído, ésteres ativos de succinimidila, PEG ativado com ditiocarbonato, 2,4,5-triclorofenilcloroformiato e PEG ativado com P-nitrofenilcloroformiato, pode ser usado na conjugação de uma proteína de coagulação.

[00117] Um outro método para medir a atividade biológica do VWF é

56 / 145 o ensaio de ligação de colágeno, que está fundamentado na tecnologia ELISA (Brown e Bosak, Thromb. Res., 1986, 43:303-311; Favaloro, Thromb. Haemost., 2000, 83 127-135). Uma placa microtituladora é revestida com colágeno tipo I ou III. Depois o VWF é ligado à superfície do colágeno e subsequentemente detectado com um anticorpo policlonal rotulado com enzima. A última etapa é uma reação de substrato, que pode ser fotometricamente monitorada com uma leitora de ELISA.

[00118] Os ensaios imunológicos dos fatores de von Willebrand (VWF:Ag) são imunoensaios que medem a concentração da proteína de VWF no plasma. Eles não dão nenhuma indicação de como o VWF funciona. Vários métodos existem para medir VWF:Ag e estes incluem tanto ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA) ou imunoensaios de látex automatizados (LIA.) Muitos laboratórios agora usam um imunoensaio de látex totalmente automatizado. Historicamente os laboratórios usaram uma variedade de técnicas incluindo eletroimunoensaio de Laurell ‘Laurell Rockets’ mas esses são raramente usados atualmente na maioria dos laboratórios. III. Kits

[00119] Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem uma ou mais composições liofilizadas embalada em uma maneira que facilite o seu uso para a administração aos sujeitos. Em uma modalidade, um tal kit inclui a formulação farmacêutica aqui descrita (por exemplo, uma composição compreendendo uma proteína ou peptídeo terapêuticos), embalados em um recipiente tal como uma garrafa ou vaso selados, com um rótulo fixado ao recipiente ou incluído na embalagem que descreva o uso do composto ou composição na prática do método. Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é embalada no recipiente tal que a quantidade de topo livre no recipiente (por exemplo, a quantidade de ar entre a formulação líquida e o topo do recipiente) seja muito pequena.

57 / 145 Preferivelmente, a quantidade de topo livre seja negligenciável (por exemplo, quase nenhuma). Em uma modalidade, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma proteína ou composição peptídica terapêuticas e um segundo recipiente tendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição. Em um aspecto, a formulação farmacêutica é empacotada em uma forma de dosagem unitária. O kit pode incluir adicionalmente um dispositivo adequado para administrar a formulação farmacêutica de acordo com uma via específica de administração. Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso das formulações farmacêuticas. IV. rVWF para Métodos de Pré-Tratar Sujeitos com VWD Passando Por Cirurgia

[00120] Uma das vantagens de administrar rVWF aos sujeitos com VWD severa para pré-tratar para a cirurgia é que a atividade específica mais alta de rVWF quando comparado com pdVWF permite flexibilidade na quantidade de rVWF administrado e no número de vezes que o sujeito é redosado. Como será avaliado e como é aqui debatido em detalhes adicionais, o FVIII coadministrado pode ser recombinante ou derivado de plasma.

[00121] Administrações únicas ou múltiplas de rVWF são realizadas com os níveis e padrão de dose sendo selecionados pelo médico responsável. Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada depende do tipo de doença a ser tratado (por exemplo, Doença de von Willebrand), da severidade e curso da doença, se o fármaco é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, o histórico clínico do paciente e resposta ao fármaco e o critério do médico responsável.

[00122] Em alguns aspectos, rVWF é administrado antes de um procedimento cirúrgico a um sujeito em uma faixa de 20 a 60 IU/kg, por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

58 / 145 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 20 a 60, 35 a 70, 20 a 40, 35 a 60, 45 a 60, 45 a 55, 45 a 50, 50 a 60, 55 a 60 ou 50 a 55 IU/kg. Em algumas modalidades, o rVWF é administrado entre 12 horas e 24 horas, por exemplo, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 12 horas e 24 horas, 14 horas e 24 horas, 16 e 24 horas, 18 horas e 24 horas ou 20 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico. Em alguns aspectos, o Fator VIII (FVIII) não é administrado com o rVWF antes do procedimento cirúrgico.

[00123] Em algumas modalidades, o rVWF é administrado ao sujeito em uma faixa de 5 a 90 IU/kg, por exemplo, 5 a 90, 5 a 50, 10 a 90, 15 a 90, 20 a 90, 30 a 90, 40 a 90, 50 a 90, 60 a 90, 70 a 90, 80 a 90, 5 a 80, 10 a 70, 20 a 60, 30 a 50, 35 a 60, 5 a 50, 5 a 40, 5 a 30. 5 a 20, 10 a 90, 10 a 50 ou 20 a 40 IU/kg 1 hora antes da cirurgia. Em outras modalidades, o rVWF é administrado em uma dose de 70 a 200 IU/kg, por exemplo, 70 a 200, 80 a 200, 90 a 200, 100 a 200, 110 a 200, 120 a 200, 130 a 200, 130 a 200, 140 a 200, 150 a 200, 160 a 200, 170 a 200, 180 a 200, 190 a 200, 70 a 170, 80 a 180, 60 a 160, 50 a 150, 40 a 140, 30, 130, 20 a 120, 10 a 110, 70 a 100 ou 70 a 90 IU/kg depois da cirurgia. Em alguns casos, o procedimento cirúrgico é selecionado de um grupo consistindo de cirurgia maior, cirurgia menor e cirurgia oral.

[00124] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com 35 a 60 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes da cirurgia maior. Em outras modalidades, o sujeito é administrado com 15 a 90 IU/kg de rVWF 1 hora antes da cirurgia maior. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 150 a 220 IU/kg de rVWF depois da cirurgia maior. Em alguns casos, o sujeito passando pela cirurgia maior é administrado com uma dosagem total de 220 a 320 IU/kg.

[00125] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com 50 a

59 / 145 60 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes da cirurgia menor. Em outras modalidades, o sujeito é administrado com 5 a 50 IU/kg de rVWF 1 hora antes da cirurgia menor. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 70 a 150 IU/kg de rVWF depois da cirurgia menor. Em alguns casos, o sujeito passando pela cirurgia menor é administrado com uma dosagem total de 100 a 220 IU/kg.

[00126] Em algumas modalidades, o sujeito é administrado com 20 a 40 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes da cirurgia oral. Em outras modalidades, o sujeito é administrado com 20 a 50 IU/kg de rVWF 1 hora antes da cirurgia oral. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 10 a 50 IU/kg de rVWF durante cirurgia oral. Em uma outra modalidade, o sujeito é administrado com 20 a 50 IU/kg de rVWF depois da cirurgia oral. Em alguns casos, o sujeito passando pela cirurgia oral é administrado com uma dosagem total de 70 a 190 IU/kg.

[00127] As composições de rVWF podem estar contidas em formulações farmacêuticas, como aqui descritas. Tais formulações podem ser administradas oralmente, topicamente, transdermicamente, parenteralmente, pela pulverização de inalação, vaginalmente, retalmente ou pela injeção intracraniana. O termo parenteral como aqui usado inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, técnicas de injeção ou infusão intracistérnicas. A administração pela injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e/ou implantação cirúrgica em um sítio particular também são consideradas. Geralmente, as composições são essencialmente livres de pirogênios, assim como outras impurezas que seriam nocivas ao receptor.

[00128] Em um aspecto, as formulações da invenção são administradas por um bolo inicial seguido por uma infusão contínua para manter os níveis terapêuticos circulantes de produto de fármaco. Como um

60 / 145 outro exemplo, o composto inventivo é administrado como uma dose única.

Técnicos no assunto facilmente otimizarão dosagens eficazes e regimes de administração como determinado pela boa prática médica e a condição clínica do paciente individual.

A via de administração pode ser, mas não é limitada pela administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular.

A frequência de dosagem depende dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração.

A formulação farmacêutica ótima é determinada por uma pessoa versada na técnica dependendo da via de administração e dosagem desejada.

Ver por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 páginas 1435 a 1712, a divulgação da qual é por meio deste incorporada por referência na sua totalidade para todos os propósitos e em particular para todas as divulgações relacionadas com as formulações, vias de administração e dosagens para produtos farmacêuticos.

Tais formulações influenciam o estado físico, a estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo dos agentes administrados.

Dependendo da via de administração, uma dose adequada é calculada de acordo com o peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão.

As dosagens apropriadas podem ser averiguadas através do uso de ensaios estabelecidos para determinar as dosagens de nível sanguíneo em conjunção com dados de dose-resposta apropriados.

O regime de dosagem final é determinado pelo médico responsável, considerando vários fatores que modificam a ação de fármacos, por exemplo a atividade específica do fármaco, a severidade do dano e a responsividade do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos.

A título de exemplo, uma dose típica de um VWF recombinante da presente invenção é de aproximadamente 50 IU/kg, igual a 500 μg/kg.

Conforme estudos são conduzidos, informação adicional emergirá com respeito aos níveis de dosagem apropriados e duração de

61 / 145 tratamento para várias doenças e condições.

[00129] A prática da presente invenção pode utilizar, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais e descrições de química orgânica, tecnologia de polímero, biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), biologia celular, bioquímica e imunologia, que estejam dentro da competência da técnica. tais técnicas convencionais incluem síntese de arranjo de polímero, hibridização, ligação e detecção de hibridização administrando um rótulo. Ilustrações específicas de técnicas adequadas podem ser adquiridas por referência ao exemplo aqui abaixo. Entretanto, outros procedimentos convencionais equivalentes, naturalmente, também podem ser usados. Tais técnicas e descrições convencionais podem ser encontradas em manuais de laboratório padrão tais como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV), V Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual e Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos da Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, Highly Stabilized York, Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984, IRL Press, London, Nelson e Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3a Ed., W. H. Freeman Pub., Highly Stabilized York, N.Y. e Berg et al. (2002) Biochemistry, 5a Ed., W. H. Freeman Pub., Highly Stabilized York, N.Y., todas as quais são aqui incorporadas na sua totalidade por referência para todos os propósitos.

[00130] Observe que como aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “uma polimerase” refere-se a um agente ou misturas de tais agentes e referência à “o método” inclui referência às etapas e métodos equivalentes conhecidos por aqueles versados na técnica e assim por diante.

[00131] Observe que como aqui usado e nas reivindicações anexas, as

62 / 145 formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “uma polimerase” refere-se a um agente ou misturas de tais agentes e referência à “o método” inclui referência às etapas equivalentes e métodos conhecidos por aqueles versados na técnica e assim por diante.

[00132] A menos que definidos por exemplo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por um técnico no assunto ao qual essa invenção pertence. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para o propósito de descrever e divulgar dispositivos, composições, formulações e metodologias que são descritas na publicação e que seriam usadas em conexão com a invenção presentemente descrita.

[00133] Onde uma faixa de valores é provida, é entendido que cada valor interveniente, até o décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto claramente dite de outro modo, entre os limites superior e inferior desta faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nesta faixa estabelecida é abrangido dentro da invenção. Os limites superior e inferior destas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas menores também está abrangido dentro da invenção, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos dos limites, faixas excluindo ambos destes limites incluídos também são incluídos na invenção.

[00134] Na descrição acima, numerosos detalhes específicos são apresentados para prover uma compreensão mais completa da presente invenção. Entretanto, estará evidente para uma pessoa versada na técnica que a presente invenção pode ser praticada sem um ou mais destes detalhes específicos. Em outros casos, traços e procedimentos bem conhecidos por aqueles versados na técnica não foram descritos de modo a evitar confundir a invenção.

63 / 145

[00135] Embora a presente invenção seja descrita primariamente com referência às modalidades específicas, também é previsto que outras modalidades tornar-se-ão evidentes por aqueles versados na técnica na leitura da presente divulgação e é intencionado que tais modalidades estejam contidas dentro do presente método inventivo. a. Formulações VWF Liofilizadas

[00136] O presente método também provê formulações de rVWF para o uso nos métodos de tratamento aqui providos. Em algumas modalidades, a composição de rVWF é usada para a produção de uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, o rVWF pode ser formulado em uma formulação liofilizada.

[00137] Em algumas modalidades, as formulações compreendendo um polipeptídeo de VWF da invenção são liofilizadas depois da purificação e antes da administração a um sujeito. A liofilização é realizada administrando técnicas comuns na técnica e deve ser otimizada para a composição sendo desenvolvida (Tang et al., Pharm Res. 21:191-200, (2004) e Chang et al., Pharm Res. 13:243-9 (1996)).

[00138] Um ciclo de liofilização é, em um aspecto, composto de três etapas: congelamento, secagem primária e secagem secundária (A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278:167 (1977)). Na etapa de congelamento, a solução é esfriada para iniciar a formação de gelo. Além disso, esta etapa induz a cristalização do agente de volume. O gelo sublima no estágio de secagem primária, que é conduzido pela redução da pressão da câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, administrando um vácuo e introduzindo calor para promover a sublimação. Finalmente, a água adsorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundária sob pressão de câmara reduzida e em uma temperatura de prateleira elevada. O processo produz um material conhecido como uma torta liofilizada. Em seguida a torta pode ser reconstituída com água estéril ou diluente adequado

64 / 145 para injeção.

[00139] O ciclo de liofilização não apenas determina o estado físico final de excipientes, mas também afeta outros parâmetros tais como tempo de reconstituição, aparência, estabilidade e teor de umidade final. A estrutura da composição no estado congelado se processa através das diversas transições (por exemplo, transições vítreas, umectação e cristalizações) que ocorrem em temperaturas específicas e a estrutura pode ser usada para entender e otimizar o processo de liofilização. A temperatura de transição vítrea (Tg e/ou Tg’) pode prover informação acerca do estado físico de um soluto e pode ser determinada pela calorimetria de varredura diferencial (DSC). A Tg e Tg’ são um parâmetro importante que deve ser levado em conta quando do planejamento do ciclo de liofilização. Por exemplo, a Tg’ é importante para a secagem primária. Além disso, no estado seco, a temperatura de transição vítrea provê informação sobre a temperatura de armazenagem do produto final. b. Formulações Farmacêuticas e Excipientes no Geral

[00140] Excipientes são aditivos que comunicam ou realçam a estabilidade e distribuição de um produto de fármaco (por exemplo, proteína). Independente da razão para a sua inclusão, excipientes são um componente integral de uma formulação e, portanto, precisam ser seguros e bem tolerados pelos pacientes. Para fármacos de proteína, a escolha dos excipientes é particularmente importante porque eles podem afetar tanto a eficácia quanto a imunogenicidade do fármaco. Consequentemente, as formulações de proteína precisam ser desenvolvidas com seleção apropriada de excipientes que proporcionem estabilidade, segurança e comerciabilidade adequadas.

[00141] Uma formulação liofilizada é, em um aspecto, pelo menos compreendida de um ou mais de um tampão, um agente de volume e um estabilizante. Neste aspecto, a utilidade de um tensoativo é avaliada e

65 / 145 selecionada em casos onde a agregação durante a etapa de liofilização ou durante a reconstituição torna-se um problema. Um agente de tamponamento apropriado é incluído para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização. Uma comparação dos componentes de excipiente considerados para as formulações de proteína líquidas e liofilizadas é provida na Tabela 10. Tabela 1: Componentes Excipientes de formulações de proteína liofilizada Componente excipiente Função na formulação liofilizada Tampão ○ Manter o pH da formulação durante a liofilização e na reconstituição ○ Os estabilizantes incluem crio e lioprotetores ○ Os exemplos incluem polióis, açúcares e polímeros Agente de ○ Os crioprotetores protegem as proteínas dos estresses do tonicidade/estabilizante congelamento ○ Os lioprotetores estabilizam as proteínas no estado seco por congelamento ○ Usados para realçar a elegância do produto e para impedir blowout Agentes de volume ○ Prover resistência estrutural para a torta liofilizada ○ Os exemplos incluem manitol e glicina ○ Utilizado se a agregação durante o processo de liofilização para um problema Tensoativo ○ Pode servir para reduzir os tempos de reconstituição ○ Os exemplos incluem polissorbato 20 e 80 ○ Usualmente não utilizado, as reações moleculares na torta liofilizada Antioxidante são enormemente retardadas ○ Pode ser incluído se um íon metálico específico for incluído apenas como um cofator ou onde o metal é requerido para a atividade da Íons metálicos/agentes protease queladores ○ Agentes queladores geralmente não são necessários nas formulações liofilizadas ○ Apenas para formulações de dose múltipla ○ Provê proteção contra o crescimento microbiano na formulação Conservantes ○ É usualmente incluído no diluente de reconstituição (por exemplo, bWFI)

[00142] O principal desafio no desenvolvimento de formulações para proteínas é estabilizar o produto contra os estresses de fabricação, remessa e armazenagem. O papel dos excipientes de formulação é prover estabilização contra estes estresses. Os excipientes também devem ser utilizados para reduzir a viscosidade de formulações de proteína de alta concentração de modo a permitir a sua distribuição e realçar a conveniência do paciente. No geral, os excipientes podem ser classificados com base nos mecanismos pelos quais eles estabilizam proteínas contra vários estresses químicos e físicos. Alguns excipientes são usados para aliviar os efeitos de um estresse

66 / 145 específico ou para regular uma susceptibilidade particular de uma proteína específica. Outros excipientes têm efeitos mais gerais sobre as estabilidades físicas e covalentes de proteínas. Os excipientes aqui descritos são organizados pelo seu tipo químico ou seu papel funcional nas formulações. descrições breves dos modos de estabilização são providas quando do debate de cada tipo de excipiente.

[00143] Dadas as divulgações e orientação aqui providas, aqueles versados na técnica saberão qual quantidade ou faixa de excipientes podem ser incluídas em qualquer formulação particular para se obter uma formulação biofarmacêutica da invenção que promova a retenção na estabilidade do produto biofarmacêutico (por exemplo, uma proteína). Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção são selecionados com base na osmolalidade desejada (por exemplo, isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução final assim como as quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem incluídos na formulação.

[00144] A título de exemplo, a inclusão de cerca de 5% de sorbitol pode alcançar a isotonicidade enquanto cerca de 9% de um excipiente de sacarose é necessário para se alcançar a isotonicidade. A seleção da quantidade ou faixa de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos dentro de uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificado acima por referência aos sais, polióis e açúcares. Entretanto, aqueles versados na técnica entenderão que as considerações aqui descritas e adicionalmente exemplificadas por referência aos excipientes específicos são igualmente aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes incluindo, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizantes, agentes de volume, crioprotetores, lioprotetores, antioxidantes, íons metálicos, agentes queladores e/ou conservantes.

[00145] Além disso, onde um excipiente particular é relatado na

67 / 145 concentração molar, aqueles versados na técnica reconhecerão que o percentual equivalente (%) w/v (por exemplo, (gramas de substância em uma amostra em solução/mL de solução) X 100%) de solução também é considerado.

[00146] Naturalmente, um técnico no assunto reconheceria que as concentrações dos excipientes aqui descritos compartilham uma interdependência dentro de uma formulação particular. A título de exemplo, a concentração de um agente de volume pode ser diminuída onde, por exemplo, existe uma alta concentração de proteína ou onde, por exemplo, existe uma alta concentração de agente estabilizante. Além disso, um técnico no assunto reconheceria, de modo a manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não há nenhum agente de volume, a concentração de um agente estabilizante seria ajustada consequentemente (por exemplo, uma quantidade “tonificante” de estabilizante seria usado). Os excipientes comuns são conhecidos na técnica e podem ser encontrados em Powell et al., Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52:238-311. c. Tampões Farmacêuticos e Agentes de Tamponização

[00147] A estabilidade de uma formulação de proteína farmacologicamente ativa é usualmente observada ser máxima em uma faixa estreita de pH. Esta faixa de pH de estabilidade ótima precisa ser identificada cedo durante os estudos de pré-formulação. Diversos métodos, tais como estudos de estabilidade acelerados e estudos de triagem calorimétrica, são úteis nesta diligência (Remmele R.L. Jr., et al., Biochemistry, 38(16): 5241- 7 (1999)). Uma vez que uma formulação é finalizada, a proteína deve ser fabricada e mantida por toda a sua vida de prateleira. Consequentemente, agentes de tamponamento são quase sempre utilizados para controlar o pH na formulação.

[00148] A capacidade de tamponamento das espécies de

68 / 145 tamponamento é máxima em um pH igual ao pKa e diminui conforme o pH aumenta ou diminui deste valor. Noventa por cento da capacidade de tamponamento existe dentro de uma unidade de pH do seu pKa. A Capacidade de tamponamento também aumenta proporcionalmente com o aumento da concentração de tampão.

[00149] Diversos fatores precisam ser considerados quando da escolha de um tampão. Primeiro e o mais importante, a espécie de tampão e a sua concentração precisam ser definidos com base no seu pKa e o pH desejado da formulação. Igualmente importante é garantir que o tampão seja compatível com a proteína e outros excipientes de formulação e não catalisem nenhuma reação de degradação. Um terceiro aspecto importante a ser considerado é a sensação de ardência e irritação que o tampão pode induzir na administração. Por exemplo, citrato é conhecido causar ardor na injeção (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). O potencial para ardência e irritação é maior para fármacos que são administrados por intermédio das vias subcutânea (SC) ou intramuscular (IM), onde a solução de fármaco permanece no local durante um período relativamente mais longo de tempo do que quando administrado pela via IV onde a formulação torna-se rapidamente diluída no sangue na administração. Para as formulações que são administradas pela infusão IV direta, a quantidade total de tampão (e qualquer outro componente de formulação) precisa ser monitorada. Uma pessoa tem que ser particularmente cuidadosa acerca dos íons potássio administrados na forma do tampão de fosfato de potássio, que pode induzir efeitos cardiovasculares em um paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)).

[00150] Os tampões para as formulações liofilizadas precisam de consideração adicional. Alguns tampões como fosfato de sódio podem cristalizar da fase amorfa de proteína durante congelamento resultando em

69 / 145 mudanças no pH. Outros tampões comuns tais como acetato e imidazol podem sublimar ou evaporar durante o processo de liofilização, mudando deste modo o pH da formulação durante a liofilização ou depois da reconstituição.

[00151] O sistema de tampão presente nas composições é selecionado para ser fisiologicamente compatível e para manter um pH desejado da formulação farmacêutica. Em uma modalidade, o pH da solução está entre pH 2,0 e pH 12,0. Por exemplo, o pH da solução pode ser 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 7,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7 ou 12,0.

[00152] O composto de tamponamento do pH pode estar presente em qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação em um nível predeterminado. Em uma modalidade, a concentração de tamponização do pH está entre 0,1 mM e 500 mM (1 M). Por exemplo, é considerado que o agente de tamponização do pH seja pelo menos 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 ou 500 mM.

[00153] Os agentes de tamponamento de pH exemplares usados para tamponar a formulação como aqui apresentada incluem, mas não são limitados aos ácidos orgânicos, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, citrato, Tris, HEPES e aminoácidos ou misturas de aminoácidos, incluindo, mas não limitados a aspartato, histidina e glicina. Em uma modalidade da presente invenção, o agente de tamponização é citrato. d. Estabilizantes Farmacêuticos e Agentes de Volume

[00154] Em um aspecto das presentes formulações farmacêuticas, um estabilizante (ou uma combinação de estabilizantes) é adicionado para prevenir ou reduzir a agregação induzida pela armazenagem e degradação

70 / 145 química. Uma solução turva ou túrbida na reconstituição indica que a proteína precipitou ou pelo menos agregou. O termo “estabilizante” significa um excipiente capaz de prevenir a agregação ou degradação física, incluindo degradação química (por exemplo, autólise, desamidação, oxidação, etc.) em um estado aquoso. Os estabilizantes considerados incluem, mas não são limitados a sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose, manitol, sorbitol, glicina, arginina HCL, compostos de poli-hidróxi, incluindo polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio, (Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74:225, (1991)). Nas presentes formulações, o estabilizante é incorporado em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 ou 1000 mM. Em uma modalidade da presente invenção, manitol e trealose são usados como agentes estabilizantes.

[00155] Se desejado, as formulações também incluem quantidades apropriadas de agentes reguladores de volume e osmolalidade. Os agentes de volume incluem, por exemplo e sem limitação, manitol, glicina, sacarose, polímeros tais como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose ou xilitol. Em uma modalidade, o agente de volume é manitol. O agente de volume é incorporado em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900 ou 1000 mM. e. Tensoativos Farmacêuticos

[00156] As proteínas têm uma alta propensão para interagir com as superfícies tornando-as susceptíveis à adsorção e desnaturação nas interfaces ar-líquido, frasco-líquido e líquido-líquido (óleo de silicone). Este caminho

71 / 145 da degradação foi observada ser inversamente dependente da concentração de proteína e resulta na formação de agregados de proteína solúvel e insolúvel ou a perda de proteína da solução por intermédio da adsorção para as superfícies. Além disso, para a adsorção da superfície do recipiente, degradação induzida pela superfície é exacerbada com agitação física, como seria experienciado durante a remessa e manuseio do produto.

[00157] Os tensoativos são habitualmente usados em formulações de proteína para prevenir a degradação induzida pela superfície. Os tensoativos são moléculas anfipáticas com a capacidade das proteínas fora da competição quanto às posições interfaciais. As porções hidrofóbicas das moléculas tensoativas ocupam as posições interfaciais (por exemplo, ar/líquido), enquanto que as porções hidrofílicas das moléculas permanecem orientadas para o solvente volumoso. Em concentrações suficientes (tipicamente em torno da concentração micelar crítica do detergente), uma camada superficial de moléculas de tensoativo serve para impedir as moléculas de proteína de adsorverem na interface. Por meio disso, a degradação induzida pela superfície é minimizada. Os tensoativos aqui considerados incluem, sem limitação, ésteres de ácido graxo de polietoxilatos sorbitano, por exemplo, polissorbato 20 e polissorbato 80. Os dois diferem apenas no comprimento da cadeia alifática que comunica caráter hidrofóbico para as moléculas, C-12 e C-18, respectivamente. Consequentemente, polissorbato 80 é mais ativo na superfície e tem uma concentração micelar crítica mais baixa do que o polissorbato 20.

[00158] Detergentes também podem afetar a estabilidade conformacional termodinâmica de proteínas. Aqui mais uma vez, os efeitos de um dado excipiente detergente serão específicos da proteína. Por exemplo, polissorbatos foram mostrados reduzir a estabilidade de algumas proteínas e aumentar a estabilidade de outras. A desestabilização pelo detergente de proteínas pode ser racionalizada em termos das caudas

72 / 145 hidrofóbicas das moléculas de detergente que podem engrenar em ligação específica com estados de proteína parcial ou totalmente desdobrados. Estes tipos de interações causariam uma mudança no equilíbrio conformacional para os estados de proteína mais expandidos (por exemplo aumentando a exposição de porções hidrofóbicas da molécula de proteína em complemento ao polissorbato da ligação). Alternativamente, se o estado nativo da proteína exibe alguma superfície hidrofóbica, a ligação do detergente ao estado nativo pode estabilizar esta conformação.

[00159] Um outro aspecto de polissorbatos é que eles são inerentemente susceptíveis à degradação oxidativa. Frequentemente, como matérias primas, eles contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar oxidação de cadeias laterais de resíduo de proteína, especialmente metionina. O potencial para dano oxidativo que surge da adição de estabilizante enfatiza o ponto que as concentrações mais baixas eficazes de excipientes devam ser usadas nas formulações. Para os tensoativos, a concentração eficaz para uma dada proteína dependerá do mecanismo de estabilização.

[00160] Tensoativos também são adicionados em quantidades apropriadas para prevenir o fenômeno de agregação relacionada com a superfície durante o congelamento e secagem (Chang, B, J. Pharm. Sci. 85: 1325, (1996)). Assim, os tensoativos incluem, sem limitação, tensoativos aniônicos, catiônicos, não iônicos, zwitteriônicos e anfotéricos incluindo tensoativos derivados de aminoácidos de ocorrência natural. Os tensoativos aniônicos incluem, mas não são limitados a lauril sulfato de sódio, dioctil sulfo succinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio, ácido quenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, sal sódico do ácido 1-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, desoxicolato de sódio e sal sódico do ácido glicodesoxicólico. Os tensoativos catiônicos incluem, mas não são limitados a cloreto de benzalcônio ou

73 / 145 cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio mono-hidratado e brometo de hexadeciltrimetilamônio. Os tensoativos zwitteriônico incluem, mas não são limitados a CHAPS, CHAPSO, SB3-10 e SB3-12. Os tensoativos não iônicos incluem, mas não são limitados a digitonina, Triton X-100, Triton X- 114, TWEEN-20 e TWEEN-80. Os tensoativos também incluem, mas não são limitados a lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, óleo de mamona hidrogenado com polioxietileno 10, 40, 50 e 60, monoestearato de glicerol, polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolipídeos tais como dioleil fosfatidil colina (DOPC), dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidil colina (DMPC) e (dioleil fosfatidil glicerol) DOPG; éster do ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. As composições compreendendo estes tensoativos, individualmente ou como uma mistura em razões diferentes, são, portanto, adicionalmente providos. Em uma modalidade da presente invenção, o tensoativo é TWEEN-80. Nas presentes formulações, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 g/L. Nas formulações providas, a concentração de tensoativo é de 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 g/L. f. Sais Farmacêuticos

[00161] Os sais são frequentemente adicionados para aumentar a concentração iônica da formulação, que pode ser importante para a solubilidade, estabilidade física e isotonicidade da proteína. Os sais podem afetar a estabilidade física de proteínas em uma variedade de modos. Os íons podem estabilizar o estado nativo das proteínas pela ligação aos resíduos carregados na superfície da proteína. Alternativamente, os sais podem estabilizar o estado desnaturado pela ligação aos grupos peptídicos junto com a cadeia principal de proteína (-CONH-). Os sais também podem estabilizar a conformação da proteína nativa pela proteção das interações eletrostáticas repulsivas entre os resíduos dentro de uma molécula de

74 / 145 proteína. Os sais nas formulações de proteína também podem proteger das interações eletrostáticas atrativas entre as moléculas de proteína que podem levar à agregação e insolubilidade da proteína. Nas formulações providas, a concentração salina está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 e 500 mM. g. Outros Componentes de Excipiente Comum: Aminoácidos Farmacêuticos

[00162] Os aminoácidos têm encontrado uso versátil nas formulações de proteína como tampões, agentes de volume, estabilizantes e antioxidantes. Assim, em um aspecto histidina e ácido glutâmico são utilizados para formulações de proteína tampão na faixa de pH de 5,5 a 6,5 e 4,0 a 5,5 respectivamente. O grupo de imidazol de histidina tem um pKa = 6,0 e o grupo carboxila de cadeia lateral de ácido glutâmico tem um pKa de 4,3 que torna estes aminoácidos adequados para tamponar nas suas respectivas faixas de pH. O ácido glutâmico é particularmente útil em tais casos. A histidina é habitualmente encontrada em formulações de proteína comercializadas e este aminoácido provê uma alternativa para o citrato, um tampão conhecido arder na injeção. Interessantemente, a histidina também foi relatada ter um efeito estabilizante, com respeito à agregação quando usado em altas concentrações nas apresentações tanto líquida quanto liofilizada (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). A histidina também foi observada por outros reduzir a viscosidade de uma formulação de alta concentração de proteína. Entretanto, no mesmo estudo, os autores observaram a agregação e descoloração aumentadas em formulações contendo histidina durante estudos de congelamento-descongelamento do anticorpo em recipientes de aço inoxidável. Uma outra nota de cautela com histidina é que a mesma sofre foto-oxidação na presença de íons metálicos (Tomita M, et al., Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). O uso de metionina como um antioxidante em formulações parece promissora; a mesma foi observada ser eficaz contra vários estresses oxidativos (Lam XM, et al., J Pharm ScL, 86(11): 1250 a 5

75 / 145 (1997)).

[00163] Em vários aspectos, formulações são providas que incluem um ou mais dos aminoácidos glicina, prolina, serina, arginina e alanina têm mostrado estabilizar proteínas pelo mecanismo de exclusão preferencial. A glicina também é um agente de volume habitualmente usado em formulações liofilizadas. A arginina foi mostrada ser um agente eficaz na inibição da agregação e foi usado nas formulações tanto líquidas quanto liofilizadas.

[00164] Nas formulações providas, a concentração de aminoácido está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300 e 500 mM. Em uma modalidade da presente invenção, o aminoácido é glicina. h. Outros Componentes de Excipiente Comum: Antioxidantes Farmacêuticos

[00165] A oxidação de resíduos de proteína surge de várias fontes diferentes. Além da adição de antioxidantes específicos, a prevenção do dano oxidativo da proteína envolve o controle cuidadoso de vários fatores por todo o processo de fabricação e armazenagem do produto tal como oxigênio atmosférico, temperatura, exposição à luz e contaminação química. A invenção, portanto, considera o uso dos antioxidantes farmacêuticos incluindo, sem limitação, agentes redutores, descontaminantes de oxigênio/ radical livre ou agentes quelantes. Os antioxidantes nas formulações de proteína terapêutica são, em um aspecto, solúveis em água e permanecem ativos por toda a vida de prateleira do produto. Os agentes redutores e descontaminantes de oxigênio/radical livre funcionam pela remoção das espécies de oxigênio ativo em solução. Os agentes quelantes tais como EDTA são eficazes pela ligação de contaminantes de metal traço que promovem a formação de radical livre. Por exemplo, EDTA foi utilizado na formulação líquida do fator de crescimento de fibroblasto ácido para inibir a oxidação catalisada por íon metálico de resíduos de cisteína.

[00166] Além disso, para a eficácia de vários excipientes para prevenir a oxidação de proteína, o potencial para os próprios antioxidantes

76 / 145 induzirem outras mudanças covalentes ou físicas para a proteína é preocupante. Por exemplo, os agentes redutores podem causar rompimento das conexões de dissulfeto intramolecular, que pode levar ao embaralhamento de dissulfeto. Na presença de íons de metal de transição, ácido ascórbico e EDTA foram mostrados promover a oxidação de metionina em várias proteínas e peptídeos (Akers MJ e Defelippis MR. Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editores. Pharmaceutical Science. Taylor and Francis, UK (1999)); Fransson J.R., /. Pharm. Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin J, et al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). O tiossulfato de sódio foi relatado reduzir os níveis de oxidação da metionina induzida por luz e temperatura em rhuMab HER2; entretanto, a formação de um aduto de tiossulfato- proteína também foi relatada neste estudo (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250 a 5 (1997)). A seleção de um antioxidante apropriado é feita de acordo com os estresses e sensibilidades específicos da proteína. Os antioxidantes considerados em certos aspectos incluem, sem limitação, agentes redutores e descontaminantes de oxigênio/radical livre, EDTA e tiossulfato de sódio. i. Outros Componentes de Excipiente Comum: Íons Metálicos Farmacêuticos

[00167] No geral, os íons de metal de transição são indesejados nas formulações de proteína porque elas podem catalisar as reações de degradação física e química em proteínas. Entretanto, íons metálicos específicos são incluídos em formulações quando eles são cofatores para as proteínas e em formulações em suspensão de proteínas onde eles formam complexos de coordenação (por exemplo, suspensão em zinco de insulina). Recentemente, o uso de íons magnésio (10 a 120 mM) foi proposto para inibir a isomerização de ácido aspártico para ácido isoaspártico (WO

77 / 145 2004039337).

[00168] Dois exemplos onde íons metálicos conferem estabilidade ou atividade aumentada em proteínas são desoxirribonuclease humana (rhDNase, Pulmozyme®) e Fator VIII. No caso de rhDNase, os íons Ca+2 (até 100 mM) aumentaram a estabilidade da enzima através da um sítio de ligação específico (Chen B, et al., / Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). De fato, a remoção de íons cálcio da solução com EGTA causou um aumento na desamidação e agregação. Entretanto, este efeito foi observado apenas com íons Ca+2; outros cátions bivalentes Mg+2, Mn+2 e Zn+2 foram observados desestabilizar rhDNase. Efeitos similares foram observados no Fator VIII. Os íons Ca+2 e Sr+2 estabilizaram a proteína enquanto outros como Mg+2, Mn+2 e Zn+2, Cu+2 e Fe+2 desestabilizaram a enzima (Fatouros, A., et al., Int. J. Pharm., 155, 121-131 (1997). Em um estudo separado com Fator VIII, um aumento significante na taxa de agregação foi observado na presença de íons Al+3 (Derrick TS, et al., /. Pharm. Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Os autores mencionam que outros excipientes como sais de tampão são frequentemente contaminados com íons Al+3 e ilustram a necessidade quanto ao uso de excipientes de qualidade apropriada em produtos formulados. j. Outros Componentes de Excipiente Common: Conservantes Farmacêuticos

[00169] Conservantes são necessários quando do desenvolvimento de formulações parenterais de uso múltiplo que envolva mais do que uma extração do mesmo recipiente. A sua função primária é inibir o crescimento microbiano e garantir a esterilidade do produto por toda a vida de prateleira ou prazo de uso do produto de fármaco. Os conservantes habitualmente usados incluem, sem limitação, álcool benzílico, fenol e m-cresol. Embora conservantes tenham uma longa história de uso, o desenvolvimento de formulações de proteína que incluem conservantes pode ser desafiador. Os conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizante (agregação) sobre as proteínas e isto tem se tornado um fator principal na limitação do seu uso

78 / 145 em formulações de proteína de dose múltipla (Roy S, et al., J Pharm ScL, 94(2): 382-96 (2005)).

[00170] Até agora, a maior parte dos fármacos de proteína foram formulados apenas para uso único. Entretanto, quando formulações de dose múltipla são possíveis, elas têm a vantagem adicional de permitir a conveniência do paciente e comerciabilidade aumentada. Um bom exemplo é aquele do hormônio do crescimento humano (hGH) onde o desenvolvimento de formulações preservada tem levado à comercialização de apresentações mais convenientes, de canetas de injeção de uso múltiplo. Pelo menos quatro de tais dispositivos de caneta contendo formulações preservadas de hGH estão correntemente disponíveis no mercado. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) & Genotropin (liofilizada – cartucho de câmara dupla, Pharmacia & Upjohn) contém fenol enquanto Somatrope® (Eli Lilly) é formulado com m-cresol.

[00171] Diversos aspectos precisam ser considerados durante o desenvolvimento de formulação de formas de dosagem preservadas. A concentração de conservante eficaz no produto de fármaco deve ser otimizada. Isto requer testar um dado conservante na forma de dosagem com faixas de concentração que confiram a eficácia antimicrobiana sem comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, três conservantes foram triados com êxito no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina 1 (Tipo I), administrando a calorimetria de varredura diferencial (DSC). Os conservantes foram classificados ordenados com base no seu impacto sobre a estabilidade em concentrações habitualmente usadas em produtos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200 a 8 (1998)).

[00172] O desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes são mais desafiadoras do que as formulações liofilizadas. Os produtos secos por congelamento podem ser liofilizados sem o conservante e

79 / 145 reconstituídos com um conservante contendo diluente no momento de uso. Isto encurta o tempo no qual um conservante está em contato com a proteína minimizando significantemente os riscos de estabilidade associados. Com formulações líquidas, a eficácia e estabilidade do conservante tem que ser mantida durante a vida de prateleira inteira do produto (- 18 -24 meses). Um ponto importante a observar é que a eficácia do conservante tem que ser demonstrada na formulação final contendo o fármaco ativo e todos os componentes de excipiente.

[00173] Alguns conservantes podem causar reações no local da injeção, o que é um outro fator que precisa consideração quando da escolha de um conservante. Nos testes clínicos que focalizam na avaliação de conservantes e tampões em Norditropin, a percepção de dor foi observada ser mais baixa nas formulações contendo fenol e álcool benzílico quando comparada a uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3:98-103 (2004)). Interessantemente, entre os conservantes habitualmente usados, o álcool benzílico possui propriedades anestésicas (Minogue SC e Sun DA., AnesthAnalg., 100(3): 683-6 (2005)). Em vários aspectos o uso de conservantes provê um benefício que supera quaisquer efeitos colaterais. k. Métodos de Preparação de Formulações Farmacêuticas

[00174] A presente invenção considera adicionalmente métodos para a preparação de formulações farmacêuticas.

[00175] Os presentes métodos compreendem adicionalmente uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente estabilizante como aqui descrito à dita mistura antes da liofilização, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de volume, um agente regulador da osmolalidade e um tensoativo, cada um dos quais como aqui descrito, à dita mistura antes da liofilização.

[00176] A prática da reconstituição padrão para o material liofilizado

80 / 145 é adicionar de volta um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFI) (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam algumas vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para administração parenteral (Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18:1311-1354 (1992)). Consequentemente, métodos são providos para a preparação de composições reconstituídas de rVWF compreendendo a etapa de adicionar um diluente a uma composição liofilizada de rVWF da invenção.

[00177] O material liofilizado pode ser reconstituído como uma solução aquosa. Uma variedade de carreadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para o uso em dose múltipla ou água com quantidades apropriadas de tensoativos (por exemplo, uma suspensão aquosa que contenha o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas). Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo e sem limitação, carboximetilcelulose sódica, metilcelulose, hidroxipropilmetil- celulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes de dispersão e umectantes são um fosfatídeo de ocorrência natural, por exemplo e sem limitação, lecitina ou produtos da condensação de um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo e sem limitação, estearato de polioxietileno ou produtos da condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia longa, por exemplo e sem limitação, heptadecaetil-eneoxicetanol ou produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tal como mono- oleato de polioxietileno sorbitol ou produtos da condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo e sem limitação, mono-oleato de polietileno sorbitano. Em vários aspectos, as suspensões aquosas também contêm um ou mais conservantes, por exemplo e sem limitação, p-hidroxibenzoato de etila ou n-

81 / 145 propila. l. Formulação de rVWF Exemplar para Administração

[00178] Em algumas modalidades, o presente método provê uma formulação realçada que permite um produto final com alta potência (alta concentração de rVWF e estabilidade de longa duração realçada) de modo a reduzir o volume para o tratamento (100 IU/ml para 10000 IU/ml). Em algumas modalidades, a concentração de rVWF na formulação para a administração é de cerca de 100 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 500 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 1000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 2000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 3000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 4000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 5000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 6000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 7000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 8000 IU/ml a 10000 IU/ml. Em algumas modalidades, a concentração do rVWF na formulação para administração é de cerca de 9000 IU/ml a 10000 IU/ml.

[00179] Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um ou mais compostos zwitteriônicos, incluindo por exemplo, aminoácidos como Histidina, Glicina, Arginina. Em algumas modalidades, a

82 / 145 formulação para administração compreende um componente com características anfipáticas tendo um mínimo de um grupo hidrofóbico e um hidrofílico, incluindo por exemplo polissorbato 80, octilpiranosídeo, dipeptídeos e/ou peptídeos anfipáticos. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um açúcar não redutor ou álcool de açúcar ou dissacarídeos, incluindo por exemplo, sorbitol, manitol, sacarose ou trealose. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um sal não tóxico solúvel em água, incluindo por exemplo, cloreto de sódio, que resulta em uma osmolalidade fisiológica. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um pH em uma faixa de 6,0 a 8,0. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um pH de cerca de 6,0, cerca de 6,5, cerca de 7, cerca de 7,5 ou cerca de 8,0. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende um ou mais cátions bivalentes que estabilizam rVWF, incluindo por exemplo, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ e/ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a formulação para administração compreende cerca de 1 mM a cerca de 50 mM de Glicina, cerca de 1 mM a cerca de 50 mM de Histidina, cerca de zero a cerca de 300 mM de cloreto de sódio (por exemplo, menos do que 300 mM de sódio), cerca de 0,01% a cerca de 0,05% de polissorbato 20 (ou polissorbato 80) e cerca de 0,5% a cerca de 20% (p/p) de sacarose com um pH de cerca de 7,0 e tendo uma osmolalidade fisiológica no ponto de tempo da administração.

[00180] Em algumas modalidades, a formulação para administração pode ser seca por congelamento. Em algumas modalidades, a formulação para administração é estável e pode ser armazenada no estado líquido de cerca de 2°C a cerca de 8°C, assim como de cerca de 18°C a cerca de 25°C. Em algumas modalidades, a formulação para administração é estável e pode ser armazenada no estado líquido de cerca de 2°C a cerca de 8°C. Em algumas modalidades, a formulação para administração é estável e pode ser

83 / 145 armazenada no estado líquido de cerca de 18°C a cerca de 25°C. m. Administração/Dosagem

[00181] Para administrar composições ao ser humano ou animais de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases “farmaceuticamente” ou “farmacologicamente” aceitável referem-se às entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação da proteína tal como produtos de agregação e clivagem e além disso, não produzem reações alérgicas ou outras adversas quando administradas em vias de administração bem conhecidas na técnica, como descritas abaixo. “Carreadores farmaceuticamente aceitáveis” incluem qualquer e todo solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similares clinicamente úteis, incluindo aqueles agentes divulgados acima.

[00182] As formulações farmacêuticas são administradas oralmente, topicamente, transdermicamente, parenteralmente, pela pulverização de inalação, vaginalmente, retalmente ou pela injeção intracraniana. O termo parenteral como aqui usado inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, técnicas de injeção ou infusão intracistérnicas. A administração pela injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar e/ou intrapulmonar em um local particular também é considerada. Geralmente, as composições são essencialmente livres de pirógenos, assim como outras impurezas que seriam nocivas para o receptor.

[00183] De acordo com a presente invenção, rVWF é administrado na ausência do fator VIII (FVIII). Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00184] Em algumas modalidades, o rVWF é administrado antes do procedimento cirúrgico, como aqui debatido. Em algumas modalidades, o

84 / 145 rVWF é administrado pelo menos 12 horas, pelo menos 13 horas, pelo menos 14 horas, pelo menos 15 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 17 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 19 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 21 horas, pelo menos 22 horas, pelo menos 23 horas ou pelo menos 24 horas, antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00185] Em algumas modalidades, 35 a 60 IU/kg de rVWF são administrados pelo menos 12 horas, pelo menos 13 horas, pelo menos 14 horas, pelo menos 15 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 17 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 19 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 21 horas, pelo menos 22 horas, pelo menos 23 horas ou pelo menos 24 horas, antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, 50 a 60 IU/kg de rVWF são administrados pelo menos 12 horas, pelo menos 13 horas, pelo menos 14 horas, pelo menos 15 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 17 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 19 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 21 horas, pelo menos 22 horas, pelo menos 23 horas ou pelo menos 24 horas, antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, 20 a 40 IU/kg de rVWF são administrados pelo menos 12 horas, pelo menos 13 horas, pelo menos 14 horas, pelo menos 15 horas, pelo menos 16 horas, pelo menos 17 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 19 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 21 horas, pelo menos 22 horas, pelo menos 23 horas ou pelo menos 24 horas, antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

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[00186] Em algumas modalidades, cerca de 50 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, 50 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 55 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 50 a 55 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg, cerca de 52 IU/kg, cerca de 54 IU/kg, cerca de 56 IU/kg, cerca de 58 IU/kg ou cerca de 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00187] Em algumas modalidades, cerca de 35 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 35 a 55 IU/kg de rVWF é administrado entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 30 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 40 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 45 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 50 a 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12

86 / 145 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 35 IU/kg, cerca de 40 IU/kg, cerca de 45 IU/kg, cerca de 50 IU/kg, cerca de 55 IU/kg ou cerca de 60 IU/kg de rVWF são administrados entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00188] Em algumas modalidades, cerca de 20 a 40 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 20 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 25 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 30 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 35 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00189] Em algumas modalidades, o método compreende uma segunda etapa de pré-tratamento de usar rVWF 1 hora antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 5 a 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas

87 / 145 modalidades, cerca de 5 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 10 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 15 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 20 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 25 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 30 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 35 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 45 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00190] Em algumas modalidades, cerca de 15 a 90 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas

88 / 145 modalidades, cerca de 15 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 20 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 25 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 30 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 35 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 45 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 55 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 60 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 65 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, cerca de 70 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o

89 / 145 procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 75 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 80 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 85 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 90 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00191] Em algumas modalidades, cerca de 20 a 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 25 a 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 30 a 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 25 a 40 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 40 a 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 20 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 25 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o

90 / 145 procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 30 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 35 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 45 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg de rVWF são administrados 1 hora antes do procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00192] Em algumas modalidades, o método compreende administração de rVWF durante o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 10 a 50 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 20 a 50 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 30 a 50 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 40 a 50 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 20 a 40 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 30 a 40

91 / 145 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, 10 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 15 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 20 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 25 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 30 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 35 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 45 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg de rVWF são administrados durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00193] Em algumas modalidades, cerca de 70 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 90 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 110 a 220 IU/kg

92 / 145 de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 120 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 140 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 150 a 200 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 160 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 180 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 180 a 200 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 180 a 190 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 190 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 190 a 210 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 200 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 210 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 80 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 90 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 100 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 110 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 120 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 130 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 140 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico.

Em algumas modalidades, cerca de 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o

93 / 145 procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 160 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 170 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 180 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 190 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 200 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 210 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, cerca de 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00194] Em algumas modalidades, cerca de 70 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 80 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 90 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 100 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 110 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 120 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, cerca de 130 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento

94 / 145 cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 100 a 140 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 90 a 140 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 140 a 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 70 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 80 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 90 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 100 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 110 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 120 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 130 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 140 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, cerca de 150 IU/kg de rVWF são

95 / 145 administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor, o pré- tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses de rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor, o pré-tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses de rVWF antes do procedimento cirúrgico, em que a primeira dose é maior do que a segunda dose. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00195] Em algumas modalidades, cerca de 150 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 160 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 170 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 180 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 180 a 210 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 190 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 190 a 210 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 200 a 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico

96 / 145 maior. Em algumas modalidades, cerca de 150 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 160 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 170 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 180 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 190 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 200 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 210 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, cerca de 220 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior, o pré-tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses aproximadamente iguais de rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00196] Em algumas modalidades, cerca de 20 a 50 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, cerca de 25 a 50 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico

97 / 145 oral.

Em algumas modalidades, cerca de 30 a 50 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 25 a 40 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 30 a 40 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 40 a 50 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 45 a 50 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 20 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 25 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 30 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 35 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 40 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 45 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, cerca de 50 IU/kg de rVWF são administrados depois o procedimento cirúrgico quando o procedimento cirúrgico é um

98 / 145 procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral e o pré-tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses aproximadamente iguais de rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00197] Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 100 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 110 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 120 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 130 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 140 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 150 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 160 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 170 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 180 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 190 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em

99 / 145 algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 180 a 210 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 190 a 210 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 200 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 210 a 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 100 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 110 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 120 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 130 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 140 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 150 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 160 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 170 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de

100 / 145 180 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 200 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 210 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00198] Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 220 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 230 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 240 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 250 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 260 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 270 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 280 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas

101 / 145 modalidades, uma dosagem total de cerca de 280 a 310 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 290 a 310 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 290 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 300 a 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 300 a 310 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 220 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 230 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 240 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 250 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 260 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 270 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 280 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de

102 / 145 290 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 300 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 310 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 320 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00199] Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 70 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 80 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de 9 cerca de 0 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 100 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 110 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 120 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 130 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 140 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas

103 / 145 modalidades, uma dosagem total de cerca de 150 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 160 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 170 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 180 a 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 70 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 80 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 90 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 100 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 110 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 120 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 130 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 140 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 150 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um

104 / 145 procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 160 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 170 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 180 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, uma dosagem total de cerca de 190 IU/kg de rVWF são administrados quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

[00200] Em algumas modalidades, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior, o pré-tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses aproximadamente iguais de rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, a dosagem é uma dosagem como listada acima. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado. Em algumas modalidades, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor, o pré-tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses de rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, quando o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor, o pré-tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses de rVWF antes do procedimento cirúrgico, em que a primeira dose é maior do que a segunda dose. Em algumas modalidades, a dosagem é uma dosagem como listado acima. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral e o pré-tratamento compreende o uso de pelo menos duas doses aproximadamente iguais de rVWF antes do procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, a dosagem é uma dosagem como listado acima. Em algumas modalidades, FVIII não é administrado.

105 / 145

[00201] Geralmente, a VWD Tipo 1 é indicada por <30 IU/dL de VWF:RCo, <30 IU/dL de VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e >0,5 a 0,7 IU/dL da Razão VWF:RCo/VWF:Ag. A VWD Tipo 2A é indicada por <30 IU/dL de VWF:RCo, <30 a 200 IU/dL de VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e <0,5 a 0,7 IU/dL da Razão VWF:RCo/VWF:Ag. A VWD Tipo 2B é indicada por <30 a 200 IU/dL de VWF:RCo, <30 IU/dL de VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e usualmente <0,5 a 0,7 IU/dL da Razão VWF:RCo/VWF:Ag. A VWD Tipo 2M é indicada por <30 IU/dL de VWF:RCo, <30 a 200 IU/dL de VWF:Ag, FVIII baixo ou normal e <0,5 a 0,7 IU/dL da Razão VWF:RCo/VWF:Ag. A VWD Tipo 2N é indicada por 30 a 2000 IU/dL de VWF:RCo, 30 a 200 IU/dL de VWF:Ag, FVIII muito baixo e >0,5 a 0,7 IU/dL da Razão VWF:RCo/VWF:Ag. A VWD Tipo 3 é indicada por <3 IU/dL de VWF:RCo, <3 IU/dL de VWF:Ag, FVIII extremamente baixo (<10 IU/dL) e a Razão VWF:RCo/VWF:Ag não é aplicável. Normal é indicada por 50 a 200 IU/dL de VWF:RCo, 50 a 200 IU/dL de VWF:Ag, FVIII normal e >0,5 a 0,7 IU/dL da Razão VWF:RCo/VWF:Ag. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD Tipo 3. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD Tipo 1 severa. Em algumas modalidades, o sujeito tem VWD Tipo 2 severa. V. Procedimento cirúrgicos

[00202] O procedimento cirúrgico de acordo com os métodos da presente invenção pode ser um procedimento cirúrgico maior ou um procedimento cirúrgico menor.

[00203] Geralmente, a cirurgia maior inclui qualquer procedimento operatório invasivo no qual uma resseção mais extensiva é realizada, por exemplo, uma cavidade corporal é penetrada, órgãos são removidos ou a anatomia normal é alterada. Geralmente, se uma barreira mesenquimatosa é aberta (por exemplo, cavidade pleural, peritônio, meninges), a cirurgia é considerada maior. Em algumas modalidades, uma cirurgia maior é uma na

106 / 145 qual há uma perda de sangue esperada de mais de 500 mL, mudanças fluídicas significantes e tipicamente, pelo menos uma noite no hospital.

Os procedimentos cirúrgicos maiores exemplares incluem mas não são limitados às cirurgias bariátricas/desvios gástricos, miotomia septal, pancreatectomia, reparo da dissecação aórtica toráxica, esofagotomia, cistectomia da bexiga, revascularização coronária, cirurgia de osteomielite espinhal, restauração ventricular cirúrgica, craniectomia, cirurgia laparoscópica (exceto colecistectomia e ligação tubal), resseção aberta de órgãos, substituições de junta grande, mastectomia com reconstrução e/ou cirurgia na espinha, toráxica, vascular e/ou intracraniana.

Exemplos adicionais de cirurgias maiores incluem mas não são limitados à osteotomia maxilar ou mandibular, laringotomia, resseção de massa benigna ou maligna grande e/ou dissecação de linfonodo requerendo permanência durante a noite em hospital (com ou sem cirurgia reconstrutiva), mastectomia com reconstrução de tecido imediata (com ou sem biópsia de linfônodo ou dissecação axilar), reparo ou ressecção laparoscópica ou aberta (de, por exemplo, estômago, intestino delgado, cólon, fígado, pâncreas, baço, adrenais ou fígado), colecistectomia aberta, reparos de hérnia incisional grande, epigástrica ou ventral, ressecção ou ablação histeroscópica, histerectomia e/ou cirurgia adnexal, laparoscopia para endometriose extensivas, cirurgia do piso pélvico abdominal ou transvaginal, cirurgia intracraniana, laminectomia e/ou fusão espinhal, substituição de joelho, substituição de quadril, substituição de ombro, substituição de junta do cotovelo, remoção de ferragens ou revisão para infecção ou falha, amputação, laminectomia espinhal e/ou fusão, reconstrução de retalho livre (cirurgia plástica), paniculectomia, mediastinoscopia, ressecção pulmonar, ressecção esofágica, ressecção de massa mediastinal (toracoscópica ou aberta), reparo de hérnia hiatal (toracoscópica ou aberta), ressecção de tumor vesical (transuretral ou aberta), tumor prostático (transuretral ou aberta), ressecção de ressecção renal

107 / 145 (laparoscópica ou aberta), ressecção ureteral (laparoscópica ou aberta), ressecção de testículo (transescrotal ou abdominal), amputação, cirurgia de desvio arterial periférico, reparo de aneurisma aórtico (endovascular ou aberta) e/ou endarterectomia carótida.

[00204] Cirurgia menor é qualquer procedimento operatório invasivo no qual apenas pele ou membranas mucósicas e tecido conectivo são ressecados por exemplo diminuição vascular para a colocação de cateter, bombas de implantação em tecidos subcutâneos. Um procedimento cirúrgico menor tipicamente inclui qualquer procedimento que possa ser realizado com segurança em um cenário ambulatorial, sem o uso de anestesia geral ou a necessidade quanto à assistência respiratória. Em algumas modalidades, uma cirurgia menor é uma em que existe uma perda de sangue esperada menor do que 500 mL, mudanças fluídicas mínimas e é tipicamente feita em uma base ambulatorial (dia da cirurgia/alta no mesmo dia). Tais procedimentos cirúrgicos ambulatoriais podem incluir, mas não são limitados à cirurgia de catarata, cirurgia mamária sem reconstrução, colecistectomia laparoscópica e ligação tubal e a maioria dos procedimentos cutâneos, superficiais, endoscópicos e artroscópicos. Exemplos adicionais de cirurgias menores incluem mas não são limitados à extração dentária, tonsilectomia, adenoidectomia, septoplastia, turbinectomia, rinoplastia, biópsia faríngea, biópsia laríngea, excisão menor por laser ou outros meios, cirurgia do ouvido médio, mastoidectomia, implantação coclear, cirurgia endoscópica sinusal, ressecções pequenas de massas benignas e malignas (feitas em uma base ambulatorial; isto é, tórus mandibular, cisto de fissura braquial, câncer de língua pequena), tireoidectomia, lumpectomia mamária (com ou sem biópsia de linfonodo ou dissecção axilar), mastectomia (com ou sem biópsia de linfônodo ou dissecção axilar), reparo de hérnia inguinal (método laparoscópico ou aberto), reparo de hérnia umbilical (método laparoscópico ou aberto), colecistectomia laparoscópica, hemorroidectomia,

108 / 145 dilatação, curetagem, histeroscopia de diagnóstico, laparoscopia, ablação endometrial pelo balão térmico, ligação tubal, laparoscopia – endometriose limitada, inserção de fita transvaginal, discectomia, extração de catarata, a maioria dos procedimentos oftalmológicos, cirurgia artroscópica (incluindo reparo de ACL), remoção de ferragens de rotina (não para infecção), cirurgia de tendão, bunionectomia, discectomia, liberação de túnel carpal, liberação da contratura de Dupuytren, cirurgia de tendão maior, cirurgia de tendão menor, retalhos rotacionais pequenos e enxertos de pele, ressecção de carcinoma de célula basal, excisão de lipoma, mamoplastia de redução e outra cirurgia para doença mamária benigna, cirurgia mamária cosmética, broncoscopia, cistoscopia, ureteroscopia, renoscopia para pedra, renoscopia para estenose, renoscopia para biópsia, excisão de hidrocele, excisão de varicocele, vasectomia, circuncisão e/ou excisão de veia varicosa.

[00205] Os procedimentos cirúrgicos orais incluem, mas não são limitados aos vários procedimentos dentários e cirurgias orais, incluindo por exemplo extrações dentárias.

[00206] Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico maior. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico menor. Em algumas modalidades, o procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: A eficácia hemostática e segurança de rVWF

[00207] Este estudo avaliou a eficácia hemostática e segurança de rVWF com ou sem ADVATE (fator anti-hemofílico [recombinante]), Baxalta US Inc., Westlake Village, CA (rFVIII) em pacientes com VWD severa passando pela cirurgia eletiva. Métodos

[00208] Estudo de fase 3, de rótulo aberto, não controlado, não randomizado em 14 sítios em 10 recipientes (NCT02283268) em pacientes ≥

109 / 145 18 anos de idade que tiveram VWD severa e foram programados para passar por cirurgia eletiva. Os pacientes foram monitorados por 14 dias depois da cirurgia. Tratamento

[00209] 12 a 24 horas antes da cirurgia, rVWF 40 a 60 IU/kg de rVWF:RCo foi dado intravenosamente para permitir que os níveis FVIII:C endógenos aumentem até ≥ 30 IU/dL (cirurgia menor/oral) ou ≥ 60 IU/dL (cirurgia maior). Níveis FVIII:C foram avaliados dentro de 3 h do início da cirurgia. Se os níveis alvos de FVIII:C forem alcançados, rVWF sozinho foi administrado 1 h antes da cirurgia para se obter os níveis de pico descritos na Tabela 2. Se os níveis alvos de FVIII:C forem alcançados, rVWF sozinho foi administrado 1 h antes da cirurgia para se obter os níveis de pico descritos na Tabela 2. As dosagens Intraoperatórias pós-operatórias foram individualizas para manter os níveis de depressão alvo de acordo com resultados farmacocinéticos (PK) e farmacodinâmicos (PD) , assim como a intensidade e duração de desafio hemostático. Tabela 2. Níveis Alvo de VWF:RCo e FVIII:C: Recomendações para a Prevenção de Sangramento Excessivo Durante e Depois da Cirurgia Nível Plasmático do Pico Nível Plasmático do Pico Cálculo de Dose Requerido Tipo de Cirurgia Alvo de VWF:RCo (IU/dL) Alvo de FVIII:C * (IU/dL) da rVWF (IU VWF:RCo)† Menor/Oral 50–60 40–50 ΔVWF:RCo × BW (kg)/IR‡ Maior 100 80–100 ΔVWF:RCo × BW (kg)/IR‡ BW = peso corporal; FVIII:C = Atividade do Fator VIII; IR = recuperação Incremental; rVWF = fator de von Willebrand recombinante; VWF:RCo = Atividade do Cofator de Ristocetina de fator de von Willebrand. *rFVIII adicional pode ser requerido para atingir os níveis Plasmáticos recomendados do Pico Alvo de FVIII:C. †Administrado dentro de 1 h antes da cirurgia. ‡Se o IR não estiver disponível, assumir um IR de 2,0 IU/dL por IU/kg. ΔVWF:RCo = pico alvo de VWF:RCo plasmático - linha de base VWF:RCo plasmático.

Avaliação

[00210] A eficácia hemostática global (resultsado primário) foi avaliada pelo pesquisador a 24 h depois da última infusão perioperatória ou na conclusão do estudo, seja qual foi que ocorra primeiro (Tabela 3). A

110 / 145 eficácia hemostática intraoperatória foi avaliada pelo cirurgião (Tabela 3), junto com perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada. As avsaliações de segurançsa incluíram eventos adversos (AEs) e anticorpos para rVWF, rFVIII, Ovário do Hamster Chinês (CHO) proteínas, imunoglobulina G de murino (IgG) e rFurina. Tabela 3. Classificação Global* e Intraoperatória† da Escalas de Eficácia Hemostática Classificação Avaliação Excelente Hemostasia obtida com rVWF com ou sem rFVIII foi tão boa ou melhor do que esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal Boa Hemostasia obtida com rVWF com ou sem rFVIII foi provavelmente tão boa quanto aquela esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal Moderada Hemostasia com rVWF com ou sem rFVIII foi claramente menos do que ótima para o tipo de procedimento realizado mas foi mantida sem necessidade de mudar o concentrado de rVWF Nenhum O paciente experimentou sangramento descontrolado que foi o resultado da resposta terapeuticamente inadequada a despeito da dosagem apropriada, necessitando de uma mudança de concentrado de rVWF rFVIII = Fator VIII recombinante; rVWF = fator de von Willebrand recombinante. *Como avaliada pelo pesquisador. †Como avaliada pelo cirurgião.

Estatísticas

[00211] As análises descritivas incluíram estimativas pontuais e 90% de CIs for o número de pacientes com a eficácia hemostática classificada “excelente/boa” usando um Teste de Clopper Pearson. PK/PD e segurança foram resumidos usando estatísticas descritivas. Resultados Pacientes Tabela 4. Demografia de Linha de Base e Características Clínicas Parâmetro N = 15 Sexo, n (%) Masculino 7 (46,7) Feminino 8 (53,3) Idade média (faixa), anos 40 (20–70) Peso médio(faixa), kg 73,5 (52,0–127,2) BMI Média (faixa), kg/m2 25,6 (17,1–38,0) Tipo de VWD, n (%) 1 3 (20,0) 2A 2 (13,3) 2B 1 (6,7) 2M 1 (6,7) 3 8 (53,3)

111 / 145 Parâmetro N = 15 Classificação da cirurgia, n (%) Maior 10 (66,7) Menor 4 (26,7) Oral 1 (6,7) Média (SD) FVIII:C, IU/dL Totos os tipos de VWD (n = 11) 20,6 (23,7) Tipo VWD3 (n = 5) 1,8 (1,1) Média (SD) VWF:RCo, IU/dL Totos os tipos de VWD (n = 11) 9,7 (11,0) Tipo VWD3 (n = 5) <8 (0,0) BMI = índice de massa corporal; FVIII:C = Atividade do Fator VIII; VWD = Doença de von Willebrand; VWF:RCo = Atividade do Cofator de Ristocetina de fator de von Willebrand.

[00212] A eficácia hemostática global foi classificada como “excelente” ou “boa” para todos os 15 pacientes (90% CI: 81,9-100,0) (Figura 1). Eficácia

[00213] A eficácia hemostática global foi classificada como “excelente” ou “boa” para todos os 15 pacientes (90% CI: 81,9-100,0) (Figura 1).

[00214] A eficácia hemostática intraoperatória foi classificada “excelente” ou “boa” para todos os 15 pacientes (90% CI: 81,9-100,0) (Figura 2). Entre os 8 pacientes com VWD Tipo 3, a eficácia global e a hemostática intraoperatória foram ambas classificadas “excelente” para 7 pacientes e “boa” para 1 paciente. Média ± SD perda de sangue intraoperatória real em relação à perda de sangue prognosticada foi 70% ± 45% e foi classificada “excelente” para 13 pacientes e “boa” para 2 pacientes.

EXPOSIÇÃO

[00215] Os pacientes receberam um total de 104 infusões de rVWF para prevenir ou tratar sangramento cirúrgico; as doses cirúrgicas globais médias de rVWF foram 220,4 IU/kg (faixa, 63,8-648,4 IU/kg) (Tabela 4). 93 (89,4%) infusões de rVWF sozinho: 15 (12-24 h antes da cirurgia), 12 (1 h antes da cirurgia) e 66 (pós-operatoriamente). 11 (10,6%) infusões de rVWF com rFVIII: 3 (1 h antes da cirurgia), 1 (intraoperatoriamente) e 7 (pós-

112 / 145 operatoriamente). 5 pacientes receberam as 11 infusões de rVWF com rFVIII e 6 das 7 infusões pós-operatórias de rVWF com rFVIII foram em 1 paciente.

[00216] Dos 10 pacientes passando pela cirurgia maior, 7 (70%) não requereram coadministração de rFVIII. Tabela 5. Exposição Global Média de rVWF e pela Classificação da Cirurgia Classificação da cirurgia Menor (n = 4) Maior (n = 10) Oral (n = 1) Global (N = 15) Número total médio de 3 (2-4) 7,5 (4-15) 5 6 (2-15) infusões* (faixa) Exposição média (faixa), d 3 (2-4) 6,5 (4-15) 4 6 (2-15) Dose média 12-24 h antes da 57,2 (55,0-59,9) 49,3 (37,4-57,6) 36,1 55,0 (36,1-59,9) cirurgia (faixa), IU/kg Dose média 1 h antes da 39,3 (8,0-46,4) 37,6 (15,7-82,7) 18,1 35,8 (8,0-82,7) cirurgia (faixa), IU/kg Dose intraoperatória média 0 0 18,1 18,1 (faixa), IU/kg Dose pós-operatória média 79,3 (42,8-115,9) 214,8 (47,7-533,3) 36,1 189,8 (36,1-533,3) (faixa), IU/kg Dose cirúrgica total média 119,9 (63,8-217,3) 307,6 (125,2-648,4) 108,4 220,4 (63,8-648,4) (faixa), IU/kg rVWF = fator de von Willebrand recombinante. *Número total de infusões preparatórias pré-operatórias, doses de carga inicial pré-operatória, doses de carga suplementar pré-operatória, doses intraoperatórias e doses pós-operatórias.

Segurança

[00217] 6 pacientes relataram 12 AEs emergentes do tratamento; nenhum considerado relacionado com o tratamento. Os pacientes tiveram AEs sérios (diverticulite e trombose de veia profunda [DVT]; cada um ocorrido em 1 paciente); nenhum evento foi considerado relacionado com o tratamento de substituição de fator.

[00218] O DVT sério ocorreu no pós-operatório dia 8 (inicialmente relatado como um DVT não sério no pós-operatório dia 4). O evento foi assintomático e observado depois da varredura dupla de rotina. O evento foi avaliado como improvavelmente relacionado com rVWF e não relacionado com rFVIII ou os procedimentos de estudo; causalmente associados com a cirurgia maior do paciente (substituição de quadril total) e histórico adiantado de obesidade. Os níveis pós-operatórios de FVIII:C nunca excederam 150 IU/dL. O evento resultou na colocação de filtro caval e

113 / 145 subsequentemente resolvido sem sequelas. Nenhuma reação alérgica severa; anticorpos neutralizantes para rFVIII, proteínas CHAs, IgG de murino ou rFurina.

[00219] Um paciente com VWD Tipo 3 que teve uma transfusão intraoperatória de células sanguíneas vermelhas empacotadas durante cirurgia de substituição de joelho total maior testou positivo para Anticorpos de Ligação ao VWF no dia 7 pós-operatório.

[00220] Os parâmetros PK para VWF:RCo para os pacientes que passaram pela análise PK (n = 11) são mostrados na FIG. 4. As concentrações médias do VWF:RCo, VWF:Ag e atividade de colágeno na ligação de VWF (VWF:CB) atingiram níveis de pico em 30 min e gradualmente declinaram em um período de 72 h após a infusão (FIG. 4).

[00221] A administração de rVWF sozinho resultou em estabilização substancial, rápida de Níveis de FVIII:C endógenos 6-12 h depois da infusão, com Níveis de pico de FVIII:C atingidos em 24 h entre todos os pacientes avaliados (n = 11; FIG. 5A), assim como no subconjunto de pacientes com VWD Tipo 3 (n = 5; FIG. 5B). No geral, os pacientes obtiveram FVIII:C médio >60 IU/dL em 6 h após a infusão (FIG. 5A) e pacientes com linha de base de FVIII:C mais alta (por exemplo, com VWD tipo 1 ou tipo 2) foram capazes de obter níveis alvo mais rapidamente. A despeito de ter Níveis Médios de FVIII:C <2 IU/dL na linha de base, a administração de rVWF sozinho permitiu que os pacientes com VWD Tipo 3 obtivessem níveis alvo de VWF:RCo e FVIII:C rapidamente, com FVIII:C >60 IU/dL obtido em 12 h após a infusão (FIG. 5B). Conclusões

[00222] Neste estudo de cirurgia, as eficácias hemmostáticas global e intraoperatória foram classificadas como “excelente” ou “boa” para todos os 15 pacientes. Para cirurgias maiores, a eficácia hemostática global foi “excelente” em 7 pacientes e “boa” em 3 pacientes e a eficácia

114 / 145 intraoperatória foi “excelente” em 8 pacientes e “boa” em 2 pacientes. Quase 90% das infusões para se obter hemostasia intraoperatória e pós-operatória foram com rVWF sozinho; 70% das cirurgias maiores foram conduzidas com rVWF sozinho. rVWF alveja a disfunção primária de VWD e permite que os médicos focalizem na obtenção de eficácia ótima sem preocupação quanto ao acúmulo de FVIII. Estes dados sustentam o uso seguro e eficaz de rVWF em cirurgias maiores e menores. EXEMPLO 2: Fator de von Willebrand recombinante em Sujeitos Com Doença de von Willebrand Severa Passando pela Cirurgia

[00223] Este exemplo provê os resultados de estudo de um estudo examinando o tratamento de sujeitos com doença de von Willebrand severa (VWD) passando pela cirurgia. MEDIDAS DO RESULTADO: Medidas primárias do Resultado:

[00224] A eficácia hemostática global como avaliada pelo pesquisador (Médico de Hemofilia) [Prazo: 24 horas depois da última infusão peri-operatória ou na conclusão na visita do Dia 14 (± 2 dias), qualquer uma que ocorra primeiro]. A eficácia hemostática foi classificada em uma escala de excelente - boa - moderada - nenhuma.

[00225] • Excelente: Hemostasia intra- e pós-operatória obtida com rVWF com ou sem ADVATE foi tão boa ou melhor do que a esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal.

[00226] • Boa: Hemostasia intra- e pós-operatória obtida com rVWF com ou sem ADVATE foi provavelmente tão boa quanto aquela esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal.

[00227] • Moderada: Hemostasia intra- e pós-operatória com rVWF com ou sem ADVATE foi claramente menos do que ótima para o tipo de

115 / 145 procedimento realizado mas foi mantida sem necessidade de mudar o concentrado de rVWF.

[00228] • Nenhuma: O participante experienciou sangramento descontrolado que foi o resultado da resposta terapeuticamente inadequada a despeito da dosagem apropriada, necessitando de uma mudanças de concentrado de rVWF. Medidas de Resultado Secundário: #1: Perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como avaliada pelo cirurgião operador [Prazo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)]. A perda de sangue prognosticada foi estimada pré- operatoriamente pelo cirurgião operador com base em um indivíduo hemostaticamente normal do mesmo sexo, idade, estatura e comorbidezes como o participante. A perda de sangue real foi avaliada consistindo da perda de sangue estimada, incluindo em chumaços, toalhas e sucção durante o procedimento, pelo registro do anestesiologista.

[00229] #2: Perda de sangue intraoperatória real em relação à perda de sangue prognosticada [Prazo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)]. Perda de sangue real em relação à perda de sangue prognosticada foi calculada como [Perda de sangue real (mL)] dividido pela [Perda de sangue prognosticada (mL)] multiplicado por 100.

[00230] #3: Contagem da perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como avaliada pelo cirurgião operador [Prazo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)]

[00231] • A eficácia hemostática foi classificada em uma escala de excelente - boa - moderada - nenhuma.

[00232] • Excelente: A perda de sangue intraoperatória foi menor do que ou igual à perda de sangue máxima esperada para o tipo de procedimento realizado em um sujeito hemostaticamente normal (≤ 100%).

[00233] • Boa: A perda de sangue intraoperatória foi até 50% maior

116 / 145 do que a perda de sangue máxima esperada para o tipo de procedimento realizado em um sujeito hemostaticamente normal (101-150%) Moderada: A perda de sangue intraoperatória foi maior do que 50% da perda de sangue máxima esperada para o tipo de procedimento realizado em um sujeito hemostaticamente normal (>150%).

[00234] • Nenhuma: Hemorragia descontrolada que foi o resultado da resposta terapeuticamente inadequada a despeito da dosagem apropriada, necessitando de uma mudanças regime de reposição de fator de coagulação.

[00235] #4: A contagem da eficácia hemostática intraoperatória como avaliada pelo cirurgião operador [Prazo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)]

[00236] • A eficácia hemostática foi classificada em uma escala de excelente - boa - moderada - nenhuma.

[00237] • Excelente: Hemostasia intraoperatória obtida com rVWF com ou sem ADVATE foi tão boa ou melhor do que a esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal.

[00238] • Boa: Hemostasia intraoperatória obtida com rVWF com ou sem ADVATE foi provavelmente tão boa quanto aquela esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal.

[00239] • Moderada: Hemostasia intraoperatória com rVWF com ou sem ADVATE foi claramente menos do que ótima para o tipo de procedimento realizado mas foi mantida sem necessidade de mudar o concentrado de rVWF.

[00240] • Nenhuma: O participante experienciou sangramento descontrolado que foi o resultado da resposta terapeuticamente inadequada a despeito da dosagem apropriada, necessitando de uma mudanças de concentrado de rVWF.

[00241] #5: Dose de rVWF Diariamente ajustada com o Peso Intra- e

117 / 145 Pós-Operatório Com ou Sem ADVATE [Prazo: Diariamente, do dia da cirurgia até o Dia 14 pós-operatório (± 2 dias)]

[00242] #6: Ocorrência de Eventos Adversos [Prazo: A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) e eventos adversos sérios emergentes do tratamento (TESAEs) foram avaliados.

[00243] #7: Ocorrência de Eventos Trombóticos [Prazo: A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) e eventos adversos sérios emergentes do tratamento (TESAEs) foram avaliados para eventos trombóticos.

[00244] #8: Ocorrência de Reação alérgica severa (por exemplo, Anafilaxia) [Prazo: A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) e eventos adversos sérios emergentes do tratamento (TESAEs) foram avaliados quanto à reação alérgica severa.

[00245] #9: Número dos Participantes Que desenvolveram Anticorpos de Ligação Inibidora e Total para o Fator de von Willebrand (VWF) e Anticorpos inibidores para o Fator VIII (FVIII) [Prazo: O teste ocorreu por todo o estudo na triagem, antes da infusão PK, pré-cirurgia, após a cirurgia no caso de Sangramento Excessivo ou sangramento inexplicado, no pós- operatório dia 7 e na conclusão da visita do estudo (isto é 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Os participantes foram tratados com Fator de van Willebrand recombinante (rVWF) com ou sem ADVATE.

[00246] #10: Número dos Participantes Que desenvolveram Anticorpos para as Proteínas do Ovário do Hamster Chinês (CHO), Imunoglobulina G (IgG) de Camundongo ou Furina recombinante (rFurina)

118 / 145 [Prazo: O teste ocorreu por todo o estudo na triagem, antes da infusão PK, pré-cirurgia, após a cirurgia no caso de Sangramento Excessivo ou sangramento inesplicado, no pós-operatório dia 7 e na conclusão da visita de estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Os participantes foram tratados com Fator de van Willebrand recombinante (rVWF) com ou sem ADVATE.

[00247] #11: Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo de 0 a 72 Horas Após a Infusão (AUC 0 a 72 h/Dose) [Prazo: as medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pre- infusão e após a infusão a 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Esta avaliação foi apenas requerida para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. A Área Sob a Curva da Concentração Plasmática/Tempo de 0 a 72 horas após a infusão foi computada usando a regra trapezoidal linear. Para o cálculo da AUC(0 a 72h) os níveis a 72 horas foram linearmente interpolados/extrapolados dos pontos de tempo de amostragem mais próximos de 2. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de VWF Ristocetina (VWF:RCo), Atividade de VWF Antígeno (VWF:Ag), Atividade da Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade VWF Medida ensaio INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac), Atividade de Coagulação pelo FVIII (FVIII:C)

[00248] #12: Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo Do Tempo 0 até o infinito (AUC 0 a ∞ /Dose) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Esta avaliação foi apenas requerida para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo

119 / 145 dentro de 42 dias antes da cirurgia. A Área Sob a Curva da Concentração Plasmática/Tempo do Tempo 0 até o infinito e a área sob a curva do primeiro momento do Tempo 0 até o infinito foi calculada como a soma de AUC ou AUMC do Tempo 0 até o tempo da última concentração quantificável mais uma correção de área de cauda calculada como Ct/λz e Ct/λz(t+1/λz), respectivamente, onde Ct foi a última concentração quantificável, t foi o tempo da última concentração quantificável e λz foi o terminal ou constante da taxa de disposição. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de VWF Antígeno (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade de VWF Medida ensaio INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac), Atividade de Coagulação de FVIII (FVIII:C)

[00249] #13: Farmacocinéticas: Tempo de Residência Médio (MRT) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após a infusão a 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Esta avaliação foi apenas requerida para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. O Tempo de Residência Médio foi calculado como a área sob a primeira curva de momento do Tempo 0 até o infinito dividida pela area sob a curva tempo 0 ao infinito menos T/2 onde T foi a duração da infusão. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de VWF Antígeno (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF Colágeno (VWF:CB), Atividade VWF Medida Ensaio INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

[00250] #14: Farmacocinéticas: Depuração (CL) [Prazo: as medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e pós infusão a 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (±

120 / 145 2) horas e 72 (± 2) horas]. Esta avaliação foi apenas requerida para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. A depuração foi calculada como dose (IU/kg) dividida pela área sob a curva tempo 0 até o infinito. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de VWF Antígeno (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade de VWF Medida ensaio INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

[00251] #15: Farmacocinéticas: Recuperação Incremental (IR) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Esta avaliação foi apenas requerida para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. A Recuperação Incremental foi calculada como (Cmax menos Cpré-infusão) dividida pela dose (IU/kg) onde kg refere-se ao peso corporal no tempo de dosagem e Cmax foi a concentração máxima observada antes da correção para valores pré-infusão. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de VWF Antígeno (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade de VWF Medida Ensaio INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

[00252] #16: Farmacocinéticas: Meia Vida da Fase de Eliminação (T1/2) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro 30 minutos pré-infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Esta avaliação é requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo

121 / 145 dentro de 42 dias antes da cirurgia. A meia-vida terminal ou de disposição (T1/2) foi calculada como ln2/λz onde λz foi a constante da taxa de eliminação de terminal como calculada em WinNonlin NCA usando pelo menos três concentrações quantificáveis. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de VWF Antígeno (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade de VWF Medida Ensaio INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

[00253] #17: Farmacocinéticas: Volume de Distribuição no Estado Constante (Vss) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro 30 minutos pré- infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Esta avaliação é requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. Vss foi calculado como a depuração multiplicada com o Tempo de Residência Médio. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de VWF Antígeno (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade de VWF Medida Ensaio INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac) Critérios de elegibilidade:

[00254] Idades Elegíveis para o Estudo: 18 Anos e mais velho; Sexos Elegíveis para o Estudo: todos Critérios de Inclusão:

[00255] Diagnóstico de doença de von Willebrand severa (VWD) como listado abaixo e procedimento cirúrgico elective planejado: • 1. Tipo 1 (Fator de von Willebrand: Atividade do Cofator de Ristocetina (VWF:RCo) <20 IU/dL), ou • 2. Tipo 2A (como verificado pelo padrão de multímero),

122 / 145 Tipo 2B (como diagnosticado pelo genótipo), Tipo 2N (FVIII:C<10% e genética historicamente documentada), Tipo 2M, ou • 3. Tipo 3 (Antígeno do Fator de von Willebrand (VWF:Ag) ≤ 3 IU/dL)

[00256] VWD com um histórico de requerer terapia de substituição com concentrado de fator de von Willebrand (VWF) para controlar sangramento.

[00257] Se VWD Tipo 3 (VWF Antígeno/VWF:Ag ≤ 3 IU/dL), õ participante tem um histórico médico de pelo menos 20 dias de exposição aos concentrados de fator de coagulação VWF/FVIII (incluindo plasma criprecipitado ou recém congelado).

[00258] Se VWD tipo 1 ou tipo 2, o participante tem um histórico médico de 5 dias de exposição ou uma cirurgia maior pasada requerendo concentrados de fator de coagulação VWF/FVIII (incluindo plasma criprecipitado ou recém congelado).

[00259] O participante teve pelo menos 18 anos de idade.

[00260] Se do sexo feminino de potencial para gravidez, o participante se apresenta com um teste de gravidez negativo.

[00261] Se aplicável, a participante concorda em utilizar medidas de controle de natalidade adequadas duprante a duração do estudo.

[00262] O participante está disposto e é capaz de obedecer as exigências do protocolo. Critérios de Exclusão Selecionados:

[00263] Diagnóstico de pseudo VWD ou um outro distúrbio de coagulação hereditário ou adquirido (por exemplo, distúrbios de plaqueta qualitativos e quantitativos ou tempo de protrombina elevado [PT] / razão internacional normalizada [INR] > 1,4).

[00264] History ou presença de um inibidor de VWF na triagem.

[00265] História ou presença de um inibidor do Fator VIII (FVIII)

123 / 145 com um título ≥ 0,4 BU (ensaio de Betesda modificado de Nijmegen) ou ≥ 0,6 BU (pelo ensaio de Betesda).

[00266] Hipersensibilidade conhecida a qualquer um dos componentes dos fármacos de estudo, tais como às proteínas de camundongo ou hamster.

[00267] Histórico médico de distúrbios imunológicos, excluindo rinite alérgica sazonal/conjuntivite, asma branda, alergias alimentares ou alergias de animal.

[00268] Histórico médico de um evento tromboembólico.

[00269] Positivo para HIV com uma contagem de CD4 absoluta < 200/mm3.

[00270] Contagem de plaqueta < 100.000/mL.

[00271] Diagnóstico de doença hepática significante, como evidenciado por, mas não limitado a, qualquer um dos seguintes: alanina aminotransferase sérica (ALT) 5 vezes o limite superior de normal; hipoalbuminemia; hipertensão da veia portal (por exemplo, a presença de por exemplo esplenomegalia não explicada, histórico de varizes esofágicas) ou cirrose hepática classificada como Child B ou C.

[00272] Diagnóstico de doença renal, com um nível de creatinina sérica ≥ 2,5 mg/dL.

[00273] O participante foi tratado com um fármaco imunomodulatório, excluindo tratamento tópico (por exemplo, pomadas, pulverizações nasais), dentro de30 dias antes da assinatura do consentimento informado.

[00274] A participante estava grávida ou amamentando no momento da obtenção do consentimento informado.

[00275] O participante participou em um outro estudo clínico envolvendo um produto investigacional (IP), outro que não rVWF com ou sem ADVATE ou dispositivo investigacional dentro de 30 dias antes do

124 / 145 alistamento ou foi programado para participar em um outro estudo clínico envolvendo um IP ou dispositivo investigacional durante o curso deste estudo. Entretanto, pacientes elegíveis participando no Estudo de Profilaxia com rVWF (071301) pode ser alistado.

[00276] Doença fatal progressiva e/ou expectativa de vida de menos do que 3 meses. RESULTADOS:

[00277] O alistamento foi conduzido em 14 sítios de estudo em 10 receptores (USA, Austrália, Taiwan, Alemanha, Rússia, Espanha, Ucrânia, Reino Unido, Itália, Turquia). Tabela 6: Grupos de Relatório Descrição Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Tabela 6: Participante: Estudo Global Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) COMEÇOU 15 COMPLETOU 14 NÃO COMPLETOU 1 Retirada pelo sujeito 1 Tabela 7: Medidas De Linha de Base Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Globais Analisados 15 [Unidades: Os participantes] Idade 40,0 [Unidades: Anos] (20,0 a 70,0) Média (Faixa completa) Sexo: Feminino, Masculino [Unidades: Os participantes] Contagem dos Participantes Feminino 8 53,3% Masculino 7 46,7% Resultados primários: Resultado #1 Tabela 8: Medidas do Resultado

[00278] 1. Primária: A eficácia hemostática global como Avaliada pelo pesquisador (Médico de hemofilia) [Prazo: 24 horas depois da última peri-operatória infusão ou na conclusão da Dia 14 (± 2 dias) visit, seja qual

125 / 145 foi que ocorra primeiro]. Tabela 9: Resultsado primário #1 Tipo de Primária Medida Título da A eficácia hemostática global como avaliada pelo pesquisador (médico de hemofilia) Medida Descrição da A eficácia hemostática foi classificada em uma escala de excelente - boa - moderada - Medida nenhuma. Excelente: Hemostasia intra- e pós-operatória obtida com rVWF com ou sem ADVATE foi tão boa ou melhor do que esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal. Boa: Hemostasia intra- e pós-operatória obtida com rVWF com ou sem ADVATE foi provavelmente tão boa quanto aquela esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal. Moderada: Hemostasia intra- e pós-operatória com rVWF com ou sem ADVATE foi claramente menos do que ótima para o tipo de procedimento realizado mas foi mantida sem necessidade de mudar o concentrado de rVWF. Nenhuma: O participante experienciou sangramento descontrolado que foi o resultado da resposta terapeuticamente inadequada a despeito da dosagem apropriada, necessitando de uma mudanças de concentrado de rVWF. 24 horas depois da última infusão peri-operatória ou na conclusão da visita do Dia 14 (± Prazo 2 dias), qualquer uma que ocorra primeiro Descrição da População Resultado #1

[00279] O número de participantes com cirurgia maior, menor e oral e número de participante com Von Willebrand Tipo 1, 2A, 2B, 2M e 3 da soma até o número global de participantes analisados. Os dados do conjunto de dados de análise, incluindo todos os participantes que receberam produto investigacional e têm pelo menos 1 avaliação hemostática, foram usados para análise. Tabela 10: Resultado de Grupos de Relatório #1 Descrição Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Cirurgia menor todos os participantes que passaram por cirurgia menor. Cirurgia maior todos os participantes que passaram por cirurgia maior. Cirurgia oral todos os participantes que passaram por cirurgia oral. Doença de von Willebrand Tipo 1 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 1. Doença de von Willebrand Tipo 2A todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2A. Doença de von Willebrand Tipo 2B todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2B. Doença de von Willebrand Tipo 2M todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2M. Doença de von Willebrand Tipo 3 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 3.

126 / 145 Tabela 11: Valores Medidos Resultado #1 Fator de von Doença de Doença de Doença de Doença de Doença de Willebrand Cirurgia Cirurgia Cirurgia von von von von von recombinant menor maior oral Willebran Willebran Willebran Willebran Willebran e (rVWF) d Tipo 1 d Tipo 2A d Tipo 2B d Tipo 2M d Tipo 3 Participantes 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Analisados A eficácia hemostática global como Avaliada pelo pesquisador (Médico de hemofilia) [Unidades: Os participantes] Contagem dos Participantes 4 100,0 7 70,0 0 0,0 Excelente 11 73,3% 2 66,7% 1 50,0% 1 100,0% 0 0,0% 7 87,5% % % % 0 0,0 3 30,0 1 100,0 Boa 4 26,7% 1 33,3% 1 50,0% 0 0,0% 1 100,0% 1 12,5% % % % 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Moderada 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% % % % 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Nenhuma 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% % % % Resultado Secundário: Resultado #2

[00280] 2. Secundário: Perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como Avaliada pelo Cirurgião operador [Prazo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)] Tabela 12: Resultado primário #2 Tipo de Medida Secundário Perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como Avaliada pelo Título da Medida Cirurgião operador Descrição da Medida A perda de sangue prognosticada foi estimada pré-operatoriamente pelo cirurgião operador com base em um indivíduo hemostaticamente normal do mesmo sexo, idade, estatura e comorbidezes como o participante. A perda de sangue real foi avaliada consistindo da perda de sangue real estimada, incluindo nos chumaços, toalhas e sucção durante o procedimento, pelos registros do anestesiologista. Prazo Dia 0 (na conclusão da cirurgia) Resultado da Descrição de População #2

[00281] Para a perda de sangue prognosticada o número de participantes analisados foi 14 como para um participante (incluídos no grupo de relato de cirurgia maior) a perda de sangue prognosticada não foi coletada. O conjunto de dados de análise completa, incluindo todos os participantes que receberam produto investigacional e tiveram pelo menos 1 avaliação hemostática, foi usado para análise.

127 / 145 Tabela 13: Resultado de Grupos de Relatório #2 Descrição Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Cirurgia menor todos os participantes que passaram por cirurgia menor. Cirurgia maior todos os participantes que passaram por cirurgia maior. Cirurgia oral todos os participantes que passaram por cirurgia oral. Doença de von Willebrand Tipo 1 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 1. Doença de von Willebrand Tipo 2A todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2A. Doença de von Willebrand Tipo 2B todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2B. Doença de von Willebrand Tipo 2M todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2M. Doença de von Willebrand Tipo 3 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 3.

Tabela 26: Valores Medidos Resultado #2 Fator de von Doença de Doença de Doença de Doença de Doença de Willebrand von von von von von recombinante Cirurgia Cirurgia Cirurgia Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand (rVWF) menor maior oral Tipo 1 Tipo 2A Tipo 2B Tipo 2M Tipo 3 Participantes 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Analisados Perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como avaliada pelo Cirurgião operador [Unidades: mL] Média (Deviação Padrão) Perda de sangue real Participantes 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Analisados Perda de 127,0 115,0 110,6 94,3 (177,88) 0,0 (0,00) 145,0 [1] 42,5 (53,03) 50,0 [1] 50,0 [1] sangue real (209,27) (103,32) (240,87) Perda de sangue prognosticada Participantes 14 4 9 1 3 1 1 1 8 Analisados Perda de 152,8 100,0 134,4 sangue 106,1 (161,82) 2,5 (5,00) 100,0 [1] 10,0 [1] 50,0 [1] 50,0 [1] (186,33) (100,00) (206,46) prognosticada

[1] Nenhum desvio padrão possível visto que apenas um participante foi analisado. Nenhuma análise estatística provida para Perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como Avaliada pelo Cirurgião Operador Resultado Secundário: Resultado #3

[00282] 3. Secundário: Perda de sangue intraoperatória real em relação à perda de sangue prognosticada [Prazo: Dia 0 (na conclusão da

128 / 145 cirurgia)] Tabela 14: Resultado #3 Tipo de Medida Secundário Perda de sangue intraoperatória real Em relação à Perda de sangue Título da Medida prognosticada Descrição da Medida Perda de sangue real em relação à perda de sangue prognosticada foi calculada como [Perda de sangue real (mL)] dividido pela [Perda de sangue prognosticada (mL) multiplicado por 100. Prazo Dia 0 (na conclusão da cirurgia) Resultado da Descrição de População #3

[00283] O número de participantes analisados foi 11, como para 3 participantes a perda de sangue real e a prognosticada foi zero e para 1 participante a perda de sangue prognosticada não foi coletada. Portanto ‘perda de sangue real em relação à perda de sangue prognosticada' não pôde ser calculada. O conjunto de dados de análise completa foi usado para a análise desta medida de resultado. Tabela 15: Resultado de Grupos de Relatório #3 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Cirurgia menor todos os participantes que passaram por cirurgia menor. Cirurgia maior todos os participantes que passaram por cirurgia maior. Cirurgia oral todos os participantes que passaram por cirurgia oral. Doença de von Willebrand Tipo 1 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 1. Doença de von Willebrand Tipo 2A todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2A. Doença de von Willebrand Tipo 2B todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2B. Doença de von Willebrand Tipo 2M todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2M. Doença de von Willebrand Tipo 3 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 3.

Tabela 16: Valores Medidos Fator de von Doença de Doença de Doença de Doença de Doença de Willebrand Cirurgia Cirurgia Cirurgia von von von von von recombinante menor maior oral Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand (rVWF) Tipo 1 Tipo 2A Tipo 2B Tipo 2M Tipo 3 Participantes 11 1 9 1 2 1 1 1 6 Analisados Perda de sangue intraoperatória real Em relação à Perda de sangue 68,9 122,5 prognosticada 69,6 (44,77) 0,0 [1] 145,0 [1] 50,0 [1] 100,0 [1] 100,0 [1] 45,0 (38,92) (34,48) (31,82) [Unidades: Porcentagem] Média (Desvio Padrão)

[1] Nenhum desvio padrão possível visto que apenas um participante foi analisado. Nenhuma análise estatística provida para Perda de sangue intraoperatória real Em relação à Perda de sangue prognosticada Resultado Secundário: Resultado #4

129 / 145

[00284] 4. Secundário: Contagem da perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como Avaliada pelo Cirurgião operador [Prazo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia) ] Tabela 17: Resultado #4 Tipo de Medida Secundário Contagem da perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como Título da Medida avaliada pelo cirurgião operador Descrição da Medida A eficácia hemostática foi classificada em uma escala de excelente - boa - moderada - nenhuma. Excelente: A perda de sangue intraoperatória foi menor do que ou igual ao perda de sangue máxima esperada para o tipo de procedimento realizado em um sujeito hemostaticamente normal (≤ 100%). Boa: A perda de sangue intraoperatória foi até 50% maior do que a perda de sangue máxima esperada para o tipo de procedimento realizado em um sujeito hemostaticamente normal (101-150%) Moderada: A perda de sangue intraoperatória foi maior do que 50% da perda de sangue máxima esperada para o tipo de procedimento realizado em um sujeito hemostaticamente normal (>150%). Nenhuma: Hemorragia descontrolada que foi o resultado da resposta terapeuticamente inadequada a despeito da dosagem apropriada, necessitando de mudanças no regime de reposição do fator de coagulação. Prazo Dia 0 (na conclusão da cirurgia) Tabela 18: População Descrição Resultado #4 Número de participantes com cirurgia maior, menor e oral e número de participante com Von Willebrand Tipo 1, 2A, 2B, 2M e 3 da soma até o número global de participantes analisados. O conjunto de dados de análise completo, incluindo todos os participantes que receberam produto investigacional e têm pelo menos 1 avaliação hemostática, foi usado para análise.

Tabela 19: Resultado de Grupos de Relatório #4 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Cirurgia menor todos os participantes que passaram por cirurgia menor. Cirurgia maior todos os participantes que passaram por cirurgia maior. Cirurgia oral todos os participantes que passaram por cirurgia oral. Doença de von Willebrand Tipo 1 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 1. Doença de von Willebrand Tipo 2A todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2A. Doença de von Willebrand Tipo 2B todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2B. Doença de von Willebrand Tipo 2M todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2M. Doença de von Willebrand Tipo 3 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 3.

Tabela 20: Valores Medidos Resultado #4 Fator de von Doença de Doença de Doença de Doença de Doença de Willebrand Cirurgia Cirurgia Cirurgia von von von von von recombinante menor maior oral Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand (rVWF) Tipo 1 Tipo 2A Tipo 2B Tipo 2M Tipo 3 Participantes 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Analisados Contagem da perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como avaliada pelo Cirurgião operador

130 / 145 [Unidades: Os participantes] contagem dos Participantes 4 100,0 8 80,0 1 100,0 Excelente 13 86,7% 3 100,0% 1 50,0% 1 100,0% 1 100,0% 7 87,5% % % % 0 0,0 2 20,0 0 0,0 Boa 2 13,3% 0 0,0% 1 50,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 12,5% % % % 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Moderada 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% % % % 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Nenhuma 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% % % % Nenhuma análise estatística provida para Contagem da perda de sangue intraoperatória real versus prognosticada como avaliada pelo Cirurgião operador Resultado Secundário: Resultado #5

[00285] 5. Secundário: A contagem da eficácia hemostática intraoperatória como avaliada pelo Cirurgião operador [Prazo: Dia 0 (na conclusão da cirurgia)] Tabela 21: Resultado #5 Tipo de Medida Secundário A contagem da eficácia hemostática intraoperatória como avaliada pelo Título da Medida Cirurgião operador Descrição da Medida A eficácia hemostática foi classificados em uma escala de excelente - boa - moderada - nenhuma. Excelente: Hemostasia intraoperatória obtida com rVWF com our sem ADVATE foi tão boa ou melhor do que esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal. Boa: Hemostasia intraoperatória obtida com rVWF com ou sem ADVATE foi provavelmente tão boa quanto aquela esperada para o tipo de procedimento cirúrgico realizado em um sujeito hemostaticamente normal. Moderada: Hemostasia intraoperatória com rVWF com ou sem ADVATE foi claramente menos do que ótima para o tipo de procedimento realizado mas foi mantida sem necessidade de mudar o concentrado de rVWF. Nenhum: O participante experienciou sangramento descontrolado que foi o resultado da resposta terapeuticamente inadequada a despeito da dosagem apropriada, necessitando de uma mudanças de concentrado de rVWF. Prazo Dia 0 (na conclusão da cirurgia) Tabela 22: População Descrição Resultado #5 Número de participantes com cirurgia maior, menor e oral e número de participante com Von Willebrand Tipo 1, 2A, 2B, 2M e 3 da soma até o número global de participantes analisados. o conjunto de dados de análise completa, incluindo todos os participantes que receberam produto investigacional e tiveram pelo menos 1 avaliação hemostática, foi usado para análise.

Tabela 23: Resultado de Grupos de Relatório #5 Descrição Fator de von Willebrand recombinante Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand (rVWF) recombinante (rVWF) Cirurgia menor todos os participantes que passaram por cirurgia menor. Cirurgia maior todos os participantes que passaram por cirurgia maior. Cirurgia oral todos os participantes que passaram por cirurgia oral. Doença de von Willebrand Tipo 1 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 1. Doença de von Willebrand Tipo 2A todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2A. Doença de von Willebrand Tipo 2B todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2B.

131 / 145 Doença de von Willebrand Tipo 2M todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 2M. Doença de von Willebrand Tipo 3 todos os participantes com Doença de von Willebrand Tipo 3. Tabela 24: Valores Medidos Resultado #5 Fator de von Doença de Doença de Doença de Doença de Doença de Willebrand Cirurgia Cirurgia Cirurgia von von von von von recombinante menor maior oral Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand Willebrand (rVWF) Tipo 1 Tipo 2A Tipo 2B Tipo 2M Tipo 3 Participantes 15 4 10 1 3 2 1 1 8 Analisados A contagem da eficácia hemostática intraoperatória como avaliada pelo Cirurgião operador [Unidades: Os participantes] contagem dos Participantes 4 100, 8 80,0 1 100,0 Excelente 13 86,7% 3 100,0% 1 50,0% 1 100,0% 1 100,0% 7 87,5% 0% % % 0 0, 2 20,0 0 0,0 Boa 2 13,3% 0 0,0% 1 50,0% 0 0,0% 0 0,0% 1 12,5% 0% % % 0 0, 0 0,0 0 0,0 Moderada 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0% % % 0 0, 0 0,0 0 0,0 Nenhuma 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0% 0% % % Nenhuma análise estatística provida para a contagem da eficácia hemostática intraoperatória como avaliada pelo Cirurgião operador Resultado Secundário: Resultado #6

[00286] 6. Secundário: Dose diária ajustada com o peso Intra- e Pós- operatória de rVWF Com ou Sem ADVATE [Prazo: Diariamente, do dia da cirurgia até o pós-operatório Dia 14 (± 2 dias)] Tabela 25: Resultado #6 Tipo de Medida Secundário Dose Ajustada no Peso Intra- e Dia pós-operatório de rVWF Com ou Sem Título da Medida

ADVATE Descrição da Medida Nenhum texto introduzido. Prazo Diariamente, do dia da cirurgia até o Dia 14 pós-operatório (± 2 dias) Tabela 25: Resultado da Descrição de População #6 O número de participantes analisados foi diferente para os pontos de tempo de acordo com tratamento individual. O conjunto de dados de análise completa, incluindo todos os participantes que receberam produto investigacional e tiveram pelo menos 1 avaliação hemostática, foi usado para análise.

Tabela 40: Resultado de Grupos de Relatório #6 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 26: Valores Medidos Resultado #6

132 / 145

Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 15 Dose Ajustada no Peso Intra- e Dia pós-operatório de rVWF Com ou Sem ADVATE [Unidades: IU/kg] Média (Faixa Inter-Quartil) intraoperatória Participantes Analisados 1 intraoperatória 18,1 (18,1 a 18,1) dia pós-operatório 1 Participantes Analisados 3 dia pós-operatório 1 23,5 (16,9 a 47,2) dia pós-operatório 2 Participantes Analisados 11 dia pós-operatório 2 42,3 (23,2 a 50,6) dia pós-operatório 3 Participantes Analisados 12 dia pós-operatório 3 28,6 (20,6 a 48,9) dia pós-operatório 4 Participantes Analisados 9 dia pós-operatório 4 33,9 (23,2 a 44,3) dia pós-operatório 5 Participantes Analisados 7 dia pós-operatório 5 31,5 (18,8 a 47,2) dia pós-operatório 6 Participantes Analisados 5 dia pós-operatório 6 23,2 (18,8 a 23,6) dia pós-operatório 7 Participantes Analisados 5 dia pós-operatório 7 23,8 (23,6 a 50,8) dia pós-operatório 8 Participantes Analisados 7 dia pós-operatório 8 33,9 (23,6 a 53,6) dia pós-operatório 9 Participantes Analisados 3 dia pós-operatório 9 23,6 (16,3 a 53,6) dia pós-operatório 10 Participantes Analisados 3 dia pós-operatório 10 23,6 (16,3 a 34,8) dia pós-operatório 11 Participantes Analisados 3 dia pós-operatório 11 23,6 (16,3 a 53,6) dia pós-operatório 12 Participantes Analisados 4 dia pós-operatório 12 29,3 (20,1 a 44,2) dia pós-operatório 13 Participantes Analisados 1 dia pós-operatório 13 16,3 (16,3 a 16,3) dia pós-operatório 14 Participantes Analisados 2 dia pós-operatório 14 25,5 (16,3 a 34,8) dia pós-operatório 15 Participantes Analisados 1 dia pós-operatório 15 16,3 (16,3 a 16,3) Nenhuma análise estatística provida para Dose Ajustada no Peso Intra- e Dia pós-operatório de rVWF Com ou Sem ADVATE

Resultado Secundário: Resultado #7

133 / 145

[00287] 7. Secundário: Ocorrência de Eventos adversos [Prazo: A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Tabela 27: Resultado #7 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Ocorrência de Eventos adversos Descrição da Medida Eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) e eventos adversos sérios emergentes do tratamento (TESAEs) foi avaliada. A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da Prazo conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia) Tabela 28: Resultado da Descrição de População #7 O conjunto de análise de segurança, incluindo todos os participantes que receberam qualquer quantidade de produto investigacional, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 29: Resultado de Grupos de Relatório #7 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 30: Valores Medidos Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 15 Ocorrência de Eventos adversos [Unidades: Eventos adversos] Eventos adversos emergentes do tratamento 12 (TEAEs) TEAEs Severos 1 TEAEs relacionados com rVWF 0 TEAEs relacionados com ADVATE 0 TEAEs relacionados tanto com rVWF quanto 0 com ADVATE Eventos adversos sérios emergentes do 2 tratamento (TESAEs) TESAEs relacionadas com rVWF 0 TESAEs relacionadas com ADVATE 0 TESAEs relacionadas tanto com both rVWF 0 quanto com ADVATE TEAEs levando á descontinuação de rVWF 0 TEAEs levando à descontinuação de ADVATE 0 TEAEs levando à descontinuação de estudo 0 TEAEs levando à morte 0 TEAEs relacionados com o procedimento de 0 estudo TESAEs relacionadas com o procedimento de 0 estudo Nenhuma análise estatística provida para ocorrência de eventos adversos Resultado Secundário: Resultado #8

[00288] 8. Secundário: Ocorrência de Eventos Trombóticos [Prazo: A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da conclusão

134 / 145 do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)] Tabela 31: Resultado #8 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Ocorrência de Eventos Trombóticos Descrição da Medida Eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) e eventos adversos sérios emergentes do tratamento (TESAEs) foram avaliados quanto aos eventos trombóticos. A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da Prazo conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia) Tabela 32: Resultado da Descrição de População #8 O conjunto de análise de segurança, incluindo todos os participantes que receberam qualquer quantidade de produto investigacional, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 33: Grupos de Relatório Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 34: Valores Medidos Resultado #8 Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 15 Ocorrência de Eventos Trombóticos [Unidades: Eventos adversos] TEAEs Trombóticos 2 TEAEs Trombóticos 1 Nenhuma análise estatística provida para a Ocorrência de Eventos Trombóticos Resultado Secundário: Resultado #9

[00289] 9. Secundário: Ocorrência de Reação alérgica severa (por exemplo, Anafilaxia) [Prazo: A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia) ] Tabela 35: Resultado #9 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Ocorrência de Reação alérgica severa (por exemplo, Anafilaxia) Descrição da Medida Eventos adversos emergentes do tratamento (TEAEs) e eventos adversos sérios emergentes do tratamento (TESAEs) foram avaliados quanto à reação alérgica severa. A partir da primeira infusão de produto investigacional até o fim da Prazo conclusão do estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia) Tabela 36: Resultado da Descrição de População #9 O conjunto de análise de segurança, incluindo todos os participantes que receberam qualquer quantidade de produto investigacional, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 37: Resultado de Grupos de Relatório #9 Descrição

135 / 145 Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 38: Valores Medidos Resultado #9 Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 15 Ocorrência de Reação alérgica Severa (por exemplo, anafilaxia) [Unidades: Eventos adversos] Reação alérgica severa TEAEs 0 Reação alérgica severa 0 TESAEs Nenhuma análise estatística provida para Ocorrência de Reação Alérgica Severa (por exemplo, Anafilaxia) Resultado Secundário: Resultado #10

[00290] 10. Secundário: Número dos Participantes Que desenvolveram Anticorpos Inibidores de Ligação Totais ao Fator de von Willebrand (VWF) e Anticorpos inibidores para o Fator VIII (FVIII) [Prazo: O teste ocorreu por todo o estudo na triagem, antes da infusão PK, pré- cirurgia, após a cirurgia no caso de Sangramento Excessivo ou sangramento inesplicado, no dia pós-operatório 7 e na conclusão da visita de estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Tabela 39: Resultado da Descrição de População #10 Tipo de Medida Secundário Número dos Participantes Que desenvolveram Anticorpos Inibidores e de Título da Medida Ligação Total ao Fator de von Willebrand (VWF) e Anticorpos Inibidores para Fator VIII (FVIII) Descrição da Medida Os participantes foram tratado com Fator de van Willebrand recombinante (rVWF) com ou sem ADVATE. O teste ocorreu por todo o estudo na triagem, antes da infusão PK, pré- cirurgia, após a cirurgia no caso de Sangramento Excessivo ou Prazo sangramento inexplicado, no dia pós-operatório 7 e na conclussão da visita de estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia).

Tabela 40: Resultado da Descrição de População #10 O conjunto de análise de segurança, incluindo todos os participantes que receberam qualquer quantidade de produto investigacional, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 41: Resultado de Grupos de Relatório #10 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF)

136 / 145 Tabela 55: Valores Medidos Resultado #10 Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 15 Número dos Participantes Que desenvolveram Anticorpos Inibidores e de Ligação Total para o Fator de von Willebrand (VWF) e Anticorpos Inibidores para o Fator VIII (FVIII) [Unidades: Os participantes] contagem dos Participantes Desenvolvimento de anticorpos inibidores para 0

VWF Desenvolvimento de Anticorpos de Ligação Total 1 para VWF Desenvolvimento de anticorpos inibidores para 0

FVIII Nenhuma análise estatística provida para Número dos Participantes Que desenvolveram Anticorpos Inibidores e de Ligação Total para o Fator de von Willebrand (VWF) e Anticorpos inibidores para o Fator VIII (FVIII) Resultado Secundário: Resultado #11

[00291] 11. Secundário: Número dos Participantes Que Desenvolveram Anticorpos para as Proteínas do Ovário do Hamster Chinês (CHO), Imunoglobulina G (IgG) de Camundongo ou Furina recombinante (rFurina) [Prazo: O teste ocorreu por todo o estudo na triagem, antes da infusão PK, pré-cirurgia, após a cirurgia no caso de Sangramento Excessivo ou sangramento inexplicado, no dia pós-operatório 7 e na conclussão da visita de estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia)]. Tabela 42: Resultado #11 Tipo de Medida Secundário Número dos Participantes Que Desenvolveram Anticorpos para as Título da Medida Proteínas do Ovário do Hamster Chinês (CHO), Imunoglobulina G (IgG) de Camundongo ou Furina recombinante (rFurina) Descrição da Medida Os participantes foram tratados com fator de von Willebrand recombinante (rVWF) com ou sem ADVATE. O teste ocorreu por todo o estudo na triagem, antes da infusão PK, pré- cirurgia, após a cirurgia no caso de Sangramento Excessivo ou Prazo sangramento inexplicado, no dia pós-operatório 7 e na conclussão da visita de estudo (isto é, 14 (± 2) dias após a cirurgia).

Tabela 43: Resultado da Descrição de População #11 O conjunto de análise de segurança, incluindo todos os participantes que receberam qualquer quantidade de produto investigacional, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 44: Resultado de Grupos de Relatório #11 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF)

137 / 145 Tabela 59: Valores Medidos Resultado #11 Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 15 Número dos Participantes Que Desenvolveram Anticorpos para as Proteínas do Ovário do Hamster Chinês (CHO), Imunoglobulina G (IgG) de Camundongo ou Furina recombinante 0 (rFurina) [Unidades: Os participantes] contagem dos Participantes Nenhuma análise estatística provida para o Número dos Participantes Que Desenvolveram Anticorpos para as Proteínas do Ovário do Hamster Chinês (CHO), Imunoglobulina G de Camundongo (IgG) ou Furina recombinante (rFurina) Resultado Secundário: Resultado #12

[00292] 12. Secundário: Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo de 0 a 72 Horas Após a infusão (AUC 0 a 72 h/Dose) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos da pré-infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Tabela 45: Resultado #12 Tipo de Medida Secundário Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo Título da Medida de 0 a 72 Horas Após a infusão (AUC 0 a 72 h/Dose) Descrição da Medida Esta avaliação foi apenas requerida para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. A Área Sob a Curva da Concentração Plasmática/Tempo de 0 a 72 horas após a infusão foi computada usando a regra trapezoidal linear. Para o cálculo da AUC(0 a 72h) os níveis em 72 horas foram linearmente interpolados/extrapolados a partir dos pontos de tempo de amostragem mais próximo a 2. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de Antígeno VWF (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Ensaio da Medida de Atividade de VWF INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac), FVIII Atividade de Coagulação (FVIII:C) As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após a infusão Prazo em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas.

Tabela 46: Descrição da População Resultado #12 A análise do conjunto de dados PK, incluindo todos os participantes que passaram pela avaliação de PK com dados coletados nos pontos de tempo relevantes, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 47: Resultado de Grupos de Relatório #12 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF)

138 / 145 Tabela 48: Valores Medidos Resultado #12 Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 11 Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo de 0 a 72 Horas Após a infusão (AUC 0 a 72 h/Dose) [Unidades: horas*IU/dL] Média Geométrica (Coeficiente Geométrico de Variação) VWF:RCo Participantes Analisados 11 31,91 VWF:RCo (37,5%) VWF:Ag Participantes Analisados 11 57,08 VWF:Ag (25,6%) VWF:CB Participantes Analisados 11 63,91 VWF:CB (29,4%) VWF:Ac Participantes Analisados 11 54,61 VWF:Ac (28,1%) FVIII:C Participantes Analisados 5 67,49 FVIII:C (31,1%) Nenhuma análise estatística provida para Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo de 0 a 72 Horas Após a infusão (AUC 0 a 72 h/Dose) Resultado Secundário: Resultado #13

[00293] 13. Secundário: Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo Do Tempo 0 até o infinito (AUC 0 a ∞ /Dose) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré- infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Tabela 49: Resultado #13 Tipo de Medida Secundário Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Título da Medida Tempo Do Tempo 0 até o infinito (AUC 0 a ∞ /Dose) Descrição da Medida Esta avaliação foi requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. A Área Sob a Curva da Concentração Plasmática/Tempo do Tempo 0 até o infinito e a área sob a primeira curva de momento do Tempo 0 até o infinito foram calculadas como a soma de AUC ou AUMC do Tempo 0 até o tempo da última concentração quantificável mais uma correção de área de cauda calculada como Ct/λz e Ct/λz(t+1/λz), respectivamente, onde Ct foi a última concentração quantificável, t foi o tempo da última concentração quantificável e λz foi a

139 / 145 constante da taxa terminal ou de disposição. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de Antígeno de VWF (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade do Ensaio Medido de VWF INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac), Atividade de Coagulação de FVIII (FVIII:C) As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos da pré-infusão e após a Prazo infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas.

Tabela 50: Resultado da Descrição de População #13 O conjunto de dados PK de análise, incluindo todos os participantes que passaram pela avaliação de PK com dados coletados nos pontos de tempo relevantes, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 51: Resultado de Grupos de Relatório #13 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 52: Valores Medidos Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 11 Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo Do Tempo 0 até o infinito (AUC 0 a ∞ /Dose) [Unidades: horas*IU/dL] Média Geométrica (Coeficiente Geométrico de Variação) VWF:RCo Participantes Analisados 11 VWF:RCo 34,43 (43,3%) VWF:Ag Participantes Analisados 11 VWF:Ag 68,87 (31,5%) VWF:CB Participantes Analisados 11 VWF:CB 71,82 (34,1%) VWF:Ac Participantes Analisados 11 VWF:Ac 61,90 (32,2%) FVIII:C Participantes Analisados 3 FVIII:C 75,00 (30,9%) Nenhuma análise estatística provida para Farmacocinéticas: Área Sob a Curva da Concentração Plasmática Versus Tempo Do Tempo 0 até o infinito (AUC 0 a ∞ /Dose) Resultado Secundário: Resultado #14

[00294] 14. Secundário: Farmacocinéticas: Tempo de Residência Médio (MRT) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro 30 minutos pré- infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas].

140 / 145 Tabela 53: Resultado #14 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Farmacocinéticas: Tempo de Residência Médio (MRT) Descrição da Medida Esta avaliação foi requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro 42 dias antes da cirurgia. O Tempo de Residência Médio foi calculado como a área sob a primeira curva de momento do Tempo 0 até o infinito dividido pela área sob a curva tempo 0 até infinito menos T/2 onde T foi a duração da infusão. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de Antígeno de VWF (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade do Ensaio Medido de VWF INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac) As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos da pré-infusão e após a Prazo infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas.

Tabela 54: Resultado da Descrição de População #14 O conjunto de dados PK de análise, incluindo todos os participantes que passaram pela avaliação de PK com dados coletados nos pontos de tempo relevantes, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 55: Resultado de Grupos de Relatório #14 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 56: Valores Medidos Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 11 Farmacocinéticas: Tempo de Residência Médio (MRT) [Unidades: Horas] Média Geométrica (Coeficiente Geométrico de Variação) VWF:RCo 22,69 (41,3%) VWF:Ag 37,92 (28,4%) VWF:CB 29,35 (31,1%) VWF:Ac 29,75 (28,6%) Nenhuma análise estatística provida para Farmacocinéticas: Tempo de Residência Médio (MRT) Resultado Secundário: Resultado #15

[00295] 15. Secundário: Farmacocinéticas: Depuração (CL) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após a infusão wem 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Tabela 57: Resultado #15 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Farmacocinéticas: Depuração (CL) Descrição da Medida Esta avaliação foi requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro 42 dias antes da cirurgia. A depuração foi

141 / 145 calculada como dose (IU/kg) dividida pela área sob a curva tempo 0 até infinito. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de Antígeno de VWF (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade do Ensaio Medido de VWF INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac) As medições de PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após Prazo a infusão a 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas.

Tabela 58: Resultado da Descrição de População #15 O conjunto de dados PK de análise, incluindo todos os participantes que passaram pela avaliação de PK com dados coletados nos pontos de tempo relevantes, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 59: Resultado de Grupos de Relatório #15 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 60: Valores Medidos Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 11 Farmacocinéticas: Depuração (CL) [Unidades: dL/hora/kg] Média Geométrica (Coeficiente Geométrico de Variação) VWF:RCo 0,02904 (43,3%) VWF:Ag 0,01452 (31,5%) VWF:CB 0,01392 (34,1%) VWF:Ac 0,01616 (32,2%) Nenhuma análise estatística provida para Farmacocinéticas: Depuração (CL) Resultado Secundário: Resultado #16

[00296] 16. Secundário: Farmacocinéticas: Recuperação Incremental (IR) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas. ] Tabela 61: Resultado #16 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Farmacocinéticas: Recuperação Incremental (IR) Descrição da Medida Esta avaliação foi requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. A Recuperação Incremental foi calculada como (Cmax menos Cpré-infusão) dividido pela dose (IU/kg) onde kg refere-se ao peso corporal no tempo de dosagem e Cmax foi a concentração máxima observada antes da correção para valores pré-infusão. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de Antígeno de VWF (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade do Ensaio Medido de VWF INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac)

142 / 145 As medições de PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após Prazo a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas.

Tabela 77: Resultado da Descrição de População #16 O conjunto de dados PK de análise, incluindo todos os participantes que passaram pela avaliação de PK com dados coletados nos pontos de tempo relevantes, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 62: Resultado de Grupos de Relatório #16 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Tabela 63: Valores Medidos Resultado #16 Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 11 Farmacocinéticas: Recuperação Incremental (IR) [Unidades: IU/dL] Média (desvio padrão) VWF:RCo 1,961 (0,45445) VWF:Ag 1,991 (0,38395) VWF:CB 2,780 (0,56640) VWF:Ac 2,635 (0,38050) Nenhuma análise estatística provida para Farmacocinéticas: Recuperação Incremental (IR) Resultado Secundário: Resultado #17

[00297] 17. Secundário: Farmacocinéticas: Meia Vida da Fase de Eliminação (T1/2) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos da pré-infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Tabela 64: Resultado #17 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Farmacocinéticas: Meia Vida da Fase de Eliminação (T1/2) Descrição da Medida Esta avaliação foi requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão de PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. A meia-vida terminal ou de disposição (T1/2) foi calculada como ln2/λz onde λz foi a constante da taxa de eliminação de terminal como calculado em WinNonlin NCA usando pelo menos três concentrações quantificáveis. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de Antígeno de VWF (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade do Ensaio Medido de VWF INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac) As medições de PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após Prazo a infusão a 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas.

Tabela 65: Resultado da Descrição de População #17

143 / 145 O conjunto de dados PK de análise, incluindo todos os participantes que passaram pela avaliação de PK com dados coletados nos pontos de tempo relevantes, foi usado para a análise desta medida de resultado.

Tabela 66: Resultado de Grupos de Relatório #17 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Valores Medidos Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 11 Farmacocinéticas: Meia Vida da Fase de Eliminação (T1/2) [Unidades: Horas] Média Geométrica (Coeficiente Geométrico de Variação) VWF:RCo 16,52 (42,7%) VWF:Ag 26,88 (26,5%) VWF:CB 21,07 (33,2%) VWF:Ac 22,19 (28,5%) Nenhuma análise estatística provida para Farmacocinéticas: Meia Vida da Fase de Eliminação (T1/2) Resultado Secundário: Resultado #18

[00298] 18. Secundário: Farmacocinéticas: Volume de Distribuição no Estado Constante (Vss) [Prazo: As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos da pré-infusão e após a infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas]. Tabela 67: Resultado #18 Tipo de Medida Secundário Título da Medida Farmacocinéticas: Volume de Distribuição no Estado Constante (Vss) Descrição da Medida Esta avaliação foi requerida apenas para sujeitos passando pela cirurgia maior. Os sujeitos receberam uma infusão PK em uma dose de 50±5 IU/kg de rVWF:RCo dentro de 42 dias antes da cirurgia. Vss foi calculado como a depuração multiplicada com o Tempo de Residência Médio. A análise PK foi realizada para os seguintes análitos: Atividade do Cofator de Ristocetina de VWF (VWF:RCo), Atividade de Antígeno de VWF (VWF:Ag), Atividade de Ligação de VWF colágeno (VWF:CB), Atividade do Ensaio Medido de VWF INNOVANCE VWF Ac (VWF:Ac) As medições PK foram feitas dentro de 30 minutos pré-infusão e após a Prazo infusão em 30 (± 5) minutos, 60 (± 5) minutos, 6 (± 1) horas, 12 (± 1) horas, 24 (± 2) horas, 48 (± 2) horas e 72 (± 2) horas.

Tabela 68: Resultado da Descrição de População #18 O conjunto de dados PK de análise, incluíram todos os participantes que passaram pela avaliação de PK com dados coletados nos pontos de tempo relevantes, foi usado para a análise desta medida de resultado.

144 / 145 Tabela 69: Resultado de Grupos de Relatório #18 Descrição Fator de von Willebrand Participantes de cirurgia tratados com Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) recombinante (rVWF) Valores Medidos Resultado #18 Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) Participantes Analisados 11 Farmacocinéticas: Volume de Distribuição no Estado Constante (Vss) [Unidades: dL/kg] Média Geométrica (Coeficiente Geométrico de Variação) VWF:RCo 0,6591 (28,8%) VWF:Ag 0,5506 (18,4%) VWF:CB 0,4086 (24,0%) VWF:Ac 0,4806 (21,5%) Nenhuma análise estatística provida para Farmacocinéticas: Volume de Distribuição no Estado Constante (Vss)

[00299] Os exemplos apresentados acima são providos para fornecer aqueles de competência ordinária na técnica uma divulgação e descrição completa de como fazer uso das modalidades das composições, sistemas e métodos da invenção e não são intencionados limitar o escopo ao qual os inventores consideram como sua invenção. As modificações dos modos acima descritos para realizar a invenção que são óbvias àqueles de competência na técnica são intencionadas estar dentro do escopo das seguintes reivindicações. Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativos dos níveis de competência daqueles versados na técnica ao qual a invenção pertence. Todas as referências citadas nesta divulgação são incorporadas por referência no mesmo grau como se cada referência fosse incorporada por referência na sua totalidade individualmente.

[00300] todos os títulos e indicações de seção são usados para clareza e propósitos de referência apenas e não são considerados limitantes de qualquer maneira. Por exemplo, aqueles de competência na técnica apreciarão a utilidade de combinar vários aspectos de diferentes títulos e seções como apropriado de acordo com o espírito e escopo da invenção aqui descritos.

145 / 145

[00301] Todas as referências aqui citadas são por meio destas aqui incorporadas por referência nas suas totalidades e para todos os propósitos ao mesmo grau como se cada publicação ou patente ou pedido de patente individuais fossem especificamente e individualmente indicados ser incorporados por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

[00302] Muitas modificações e variações deste pedido podem ser feitas sem romper com seu espírito e escopo, como será evidente para aqueles versados na técnica. As modalidades específicas e exemplos aqui descrito são oferecidos a título de exemplo apenas e o pedido de ser limitado apenas pelos termos das reivindicações anexas, junto com o escopo total dos equivalentes aos quais as reivindicações são designadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de fator de von Willebrand recombinante (rVWF), caracterizado pelo fato de que é para manufatura de um medicamento para pré-tratamento de um sujeito com doença de von Willebrand (VWD) grave antes da cirurgia, em que o dito pré-tratamento compreende administrar 20-60 IU/kg de fator de von Willebrand recombinante (rVWF) ao dito sujeito entre 12 horas e 24 horas antes do procedimento cirúrgico e em que o fator VIII (FVIII) não é administrado com o VWF antes do procedimento cirúrgico.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito pré-tratamento compreende adicionalmente administrar 5- 90 IU/kg de rVWF ao dito sujeito 1 hora antes do dito procedimento cirúrgico.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o FVIII não é administrado após o dito procedimento cirúrgico.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito procedimento cirúrgico é selecionado a partir do grupo que consiste em cirurgia de grande porte, cirurgia de pequeno porte e cirurgia oral.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 5060 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de pequeno porte.

6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 35-60 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de grande porte.

7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 20-40 IU/kg de rVWF entre 12 horas e 24 horas antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

8. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 5-50 IU/kg de rVWF 1 hora antes do procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de pequeno porte.

9. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 15-90 IU/kg de rVWF 1 hora antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de grande porte.

10. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 20-50 IU/kg de rVWF 1 hora antes do dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

11. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 10-50 IU/kg de rVWF durante o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

12. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 70-220 IU/kg de rVWF após o dito procedimento cirúrgico.

13. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 70-150 IU/kg de rVWF após o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de pequeno porte.

14. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 150-220 IU/kg de rVWF após o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de grande porte.

15. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito 20-50 IU/kg de rVWF após o dito procedimento cirúrgico e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

16. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito uma dose total de 100-220 IU/kg de rVWF e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de pequeno porte.

17. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito uma dose total de 220-320 IU/kg de rVWF e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de grande porte.

18. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se administra ao dito sujeito uma dose total de 70-190 IU/kg de rVWF e o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral.

19. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de grande porte e o dito pré-tratamento compreende administrar pelo menos duas doses aproximadamente iguais de rVWF antes do procedimento cirúrgico.

20. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico de pequeno porte e o dito pré-tratamento compreende administrar pelo menos duas doses de rVWF antes do procedimento cirúrgico, em que a primeira dose é maior do que a segunda dose.

21. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito procedimento cirúrgico é um procedimento cirúrgico oral e o dito pré-tratamento compreende administrar pelo menos duas doses aproximadamente iguais de rVWF antes do procedimento cirúrgico.