JP7055740B2 - 多能性幹細胞由来膵前駆細胞の純化法とその増幅法 - Google Patents

多能性幹細胞由来膵前駆細胞の純化法とその増幅法 Download PDF

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Description

本発明は、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養方法、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞からの膵島細胞の製造方法、及び多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の凍結保存方法に関する。さらに、本発明は、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養用培地に関する。
 発明の背景
糖尿病(特にインスリン依存性糖尿病)の治療手段としては膵臓移植及び膵島移植が有効であるが、臓器提供数の少なさや、免疫拒絶を阻害するための免疫抑制剤を服用する必要がある点などが大きな課題となっている。そのため、このような問題を解決することを目指して、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹(ES)細胞などの多能性幹細胞及び生体から単離した膵前駆細胞から膵島細胞を分化誘導する研究がマウス及びヒトに由来する細胞を用いて広く行われている(例えば、非特許文献１)。
膵島細胞を得る場合は、多能性幹細胞を中内胚葉細胞、胚性内胚葉を経て膵前駆細胞に分化させた後に、内分泌前駆細胞、α細胞、β細胞、δ細胞のような膵島細胞に分化させる。ここで、膵島移植には多くの膵島細胞が必要となるが、分化が進んだ膵島細胞は増殖力が低く、一方で、未分化の多能性幹細胞は増殖力はあるものの分化誘導に長期間必要である上に、移植に用いる膵島細胞に多能性幹細胞が混入すると、移植後腫瘍を形成する心配がある。このため、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の増殖を試みた研究報告が散見される。
それらの研究では、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を増殖させるために、各種のフィーダー細胞を用いて共培養が行われている(例えば、非特許文献２及び３)。しかしながら、このようなフィーダー細胞を使用すること、及び血清を使用することは、成分が明らかではないものを使用することになり、ロット間での成分の差に起因して、均一な性質を持つ膵前駆細胞を安定して調製することが難しいという問題がある。また、異種動物由来のフィーダー細胞及び血清を使用する場合には、異種動物由来の未知病原体の感染源となり得るリスクが存在する。
非特許文献２では、ES細胞由来の前駆細胞を間葉系細胞と共培養することにより前駆細胞を分化させずに増殖させたことが報告されている。
非特許文献３では、ES細胞由来の膵前駆細胞を内皮細胞との共培養又はEGFL7の存在下での培養により分化させずに増殖させたことが報告されているが、増殖能は不十分である。
また、生体から単離した膵前駆細胞を生体外での培養により増殖させる研究についても報告があるが、多能性幹細胞由来でない膵前駆細胞の場合は十分な増殖が得られていない。
例えば、特許文献１では、生体から単離された膵臓の組織断片を特定の細胞培養培地を用いて培養したことが報告されている。しかしながら、特許文献１では、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を使用したことは開示されておらず、また、培養に使用した細胞群は均一な細胞群ではなく、膵臓組織由来の多種類の細胞群を培養しており、均一な膵前駆細胞群の培養についても開示されていない。
特許第5722835号公報
A Rezania et al. Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1121-1133 JB Sneddon et al. Nature. 2012 Nov;491(7426):765-768 DI Kao et al. Stem Cell Reports. 2015 Feb;4(2):181-189
本発明は、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を分化を抑制しながら高効率に増殖させることができる多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養方法を提供することを目的とする。また、当該培養方法により得られた、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞からの膵島細胞の製造方法、及び多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の凍結保存方法を提供することを目的とする。さらに、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を分化を抑制しながら高効率に増殖させることができる培養用培地を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を上皮成長因子(EGF)及びR-スポンジン1を含有する培地、又はFGF-7及びGSK阻害剤(CHIR99021)を様々な組み合わせで含有する培地中で細胞凝集状態で培養することで上記目的を達成することができるという知見を得た。
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養方法、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞からの膵島細胞の製造方法、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の凍結保存方法、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養用培地等を提供するものである。なお、以下では、「(I-1)～」との記載には(I-1-A)、(I-1-B)なども含まれるものとし、その他も同様である。
(I) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養方法
(I-1) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養方法であって、(A)多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を(1)上皮成長因子(EGF)ファミリーに属する因子及び／又は線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーに属する因子、並びに(2)Wntアゴニストを含有する培地中で3次元培養する工程を含む、培養方法。
(I-1-A) 前記Wntアゴニストが、Wntファミリーに属する因子、R-スポンジンファミリーに属する因子、ノリン及び／又はGSK阻害剤である、(I-1)に記載の方法。
(I-1-B) 前記Wntアゴニストが、Wnt-1/Int-1、Wnt-2/Irp、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、Wnt-16、CHIR99021、SB216763、SB415286、A1070722、BIO、BIO-acetoxime、Indirubin-3'-oxime、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TWS 119、siRNA、リチウム、ケンパウロン、R-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、R-スポンジン4、及びノリンからなる群から選択される少なくとも1つの因子を含む、(I-1)に記載の方法。
(I-2) 前記WntアゴニストがR-スポンジンファミリーに属するタンパク質及び／又はGSK阻害剤である、(I-1)に記載の方法。
(I-2-A) 前記(1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子が、ErbB1に結合する因子及び／又はFGFR2IIIbに結合する因子である、(I-1)、（I-1-A）、(I-1-B)又は(I-2)に記載の方法。
(I-2-B) 前記(1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子が、EGF、トランスフォーミング成長因子α(TGF-α)、アンフィレギュリン、ヘパリン結合性EGF様成長因子、シュワノーマ由来成長因子、ベータセルリン、ポックスウイルス成長因子、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF、FGF-1)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、FGF-2)、FGF-3、角質細胞成長因子(KGF、FGF-7)、FGF-10、及びFGF-22からなる群から選択される少なくとも1つの因子を含む、(I-1)、（I-1-A）、(I-1-B)又は(I-2)に記載の方法。
(I-3) 前記(1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子がEGFであり、前記(2)WntアゴニストがR-スポンジン1である、(I-1)に記載の方法。
(I-4) 前記EGFファミリーに属する因子がEGFであり、前記FGFファミリーに属する因子がFGF-7であり、前記R-スポンジンファミリーに属するタンパク質がR-スポンジン1であり、前記GSK阻害剤がCHIR99021である、(I-2)に記載の方法。
(I-5) 前記培地が無血清培地である、(I-1)～(I-4)のいずれか一項に記載の方法。
(I-6) 前記培養がフィーダー細胞の非存在下での培養である、(I-1)～(I-5)のいずれか一項に記載の方法。
(I-7) 前記多能性幹細胞がiPS細胞又はES細胞である、(I-1)～(I-6)のいずれか一項に記載の方法。
(I-8) 前記多能性幹細胞がヒト由来である、(I-1)～(I-7)のいずれか一項に記載の方法。
(I-9) 前記3次元培養が膵前駆細胞の凝集体の浮遊培養である、(I-1)～(I-8)のいずれか一項に記載の方法。
(I-10) (B)工程(A)において得られた膵前駆細胞を更に継代培養する工程を更に含む、(I-1)～(I-9)のいずれか一項に記載の方法。
(I-11) 膵前駆細胞の純化のために用いられる、(I-1)～(I-10)のいずれか一項に記載の方法。
(I-12) (C)iPS細胞を調製する工程を更に含み、工程(A)において該iPS細胞由来の膵前駆細胞を使用する、(I-1)～(I-11)のいずれか一項に記載の方法。
(I-13) (D)多能性幹細胞を膵前駆細胞に分化誘導する工程を更に含み、工程Aにおいて該膵前駆細胞を使用する、(I-1)～(I-12)のいずれか一項に記載の方法。
(II) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞からの膵島細胞の製造方法
(II-1) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞からの膵島細胞の製造方法であって、(E)(I-1)～(I-13)のいずれか一項に記載の方法により培養した膵前駆細胞を膵島細胞に分化誘導する工程を含む、製造方法。
(III) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の凍結保存方法
(III-1) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の凍結保存方法あって、(F)(I-1)～(I-13)のいずれか一項に記載の方法により培養した膵前駆細胞を凍結する工程を含む、凍結保存方法。
(IV) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養用培地
(IV-1) (1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子、並びに(2)Wntアゴニストを含有する多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養用培地。
(IV-1-A) 前記Wntアゴニストが、Wntファミリーに属する因子、R-スポンジンファミリーに属する因子、ノリン及び／又はGSK阻害剤である、(IV-1)に記載の培地。
(IV-1-B) 前記Wntアゴニストが、Wnt-1/Int-1、Wnt-2/Irp、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、Wnt-16、CHIR99021、SB216763、SB415286、A1070722、BIO、BIO-acetoxime、Indirubin-3’-oxime、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TWS 119、siRNA、リチウム、ケンパウロン、R-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、R-スポンジン4、及びノリンからなる群から選択される少なくとも1つの因子を含む、(IV-1)に記載の培地。
(IV-2) 前記WntアゴニストがR-スポンジンファミリーに属するタンパク質及び／又はGSK阻害剤である、(VI-1)に記載の培地。
(IV-2-A) 前記(1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子が、ErbB1に結合する因子及び／又はFGFR2IIIbに結合する因子である、(IV-1)、（IV-1-A）、(IV-1-B)又は(IV-2)に記載の培地。
(IV-2-B) 前記(1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子が、EGF、トランスフォーミング成長因子α(TGF-α)、アンフィレギュリン、ヘパリン結合性EGF様成長因子、シュワノーマ由来成長因子、ベータセルリン、ポックスウイルス成長因子、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF、FGF-1)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、FGF-2)、FGF-3、角質細胞成長因子(KGF、FGF-7)、FGF-10、及びFGF-22からなる群から選択される少なくとも1つの因子を含む、(IV-1)、（IV-1-A）、(IV-1-B)又は(IV-2)に記載の培地。
(IV-3) 前記(1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子がEGFであり、前記(2)WntアゴニストがR-スポンジン1である、(VI-1)に記載の培地。
(IV-4) 前記EGFファミリーに属する因子がEGFであり、前記FGFファミリーに属する因子がFGF-7であり、前記R-スポンジンファミリーに属するタンパク質がR-スポンジン1であり、前記GSK阻害剤がCHIR99021である、(IV-2)に記載の培地。
(IV-5) 血清を含まない、(IV-1)～(IV-4)のいずれか一項に記載の培地。
(IV-6) フィーダー細胞非存在下での培養用である、(IV-1)～(IV-5)のいずれか一項に記載の培地。
(IV-7) 前記多能性幹細胞がiPS細胞又はES細胞である、(IV-1)～(IV-6)のいずれか一項に記載の培地。
(IV-8) 前記多能性幹細胞がヒト由来である、(IV-1)～(IV-7)のいずれか一項に記載の培地。
(IV-9) Sonic Hedgehogシグナル阻害剤、TGF-β受容体阻害剤及びレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも1種を更に含有する、(IV-1)～(IV-8)のいずれか一項に記載の培地。
(IV-10) 膵前駆細胞の純化のために用いられる、(IV-1)～(IV-9)のいずれか一項に記載の培地。
(V) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養用培地における使用
(V-1) 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養用培地における、上記(IV-1)～(IV-4)及び(IV-9)のいずれか一項に記載の成分の使用。
(VI) 医薬
(VI-1) 上記(I-1)～(I-13)のいずれか一項に記載の方法で培養された膵前駆細胞を含む医薬。
(VII)培養物
(VII-1) (1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子、(2)Wntアゴニスト、並びに5質量%以上、10質量%以上、15質量%以上又は20質量%以上の膵前駆細胞を含む、単離された培養物。
本発明の培養方法によれば、無血清且つ無フィーダー細胞の条件下で均一性の高い細胞群である多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を、分化を抑制しながら高効率に増殖させることが可能である。無血清且つ無フィーダー細胞の条件下での培養であるので、培地のロット間の差が低減され、品質の安定した膵前駆細胞を調製できる。
また、本発明の培養方法は、継代培養に利用可能であるので、膵前駆細胞を大量に増殖させることが可能であり、継代培養の過程で膵前駆細胞の純化を行うこともできる。
さらに、本発明の培養方法で増殖させた膵前駆細胞は、インスリン産生細胞(β細胞)を含む膵島細胞へ分化誘導することができる。
本発明の培養方法で増殖させた膵前駆細胞は凍結保存することもでき、解凍後も凍結前と同様に増殖させることができる。
本発明の培養方法によれば、大量の膵前駆細胞の調製が可能であるので、膵前駆細胞の段階で細胞の選別(例えば、未分化細胞又は造腫瘍性細胞の除去)及び安全性の評価を行うことができる、膵前駆細胞の製造期間及び製造コストを低減できる、品質が保証された膵島細胞を短期間に大量供給できるなどの利点を有する。
本発明の培養方法で増殖させた膵前駆細胞又は本発明の培養方法で増殖させた膵前駆細胞を分化誘導して入手した膵島細胞は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、(１型又は２型)糖尿病を治療するための細胞医薬あるいはデバイスとして有用である。
膵前駆細胞への分化誘導後のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。 膵前駆細胞への分化誘導後に各因子又はその組み合わせの存在下で6日間培養した細胞の位相差顕微鏡像を示す写真である。 膵前駆細胞への分化誘導後に各因子又はその組み合わせの存在下で培養した時の細胞数の経時変化を示すグラフである。縦軸は培養開始時を1とした場合の細胞数の相対値を表す。 膵前駆細胞への分化誘導後に各因子又はその組み合わせの存在下で6日間培養した細胞(継代は行っていない)のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。 膵前駆細胞への分化誘導後に接着培養した時の細胞数の経時変化を示すグラフである。縦軸は培養開始時を1とした場合の細胞数の相対値を表す。 各継代におけるSOX9且つBrdU陽性細胞の割合(%)を示すグラフである。 各継代における細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。 各継代におけるSOX9且つPDX1陽性細胞の割合(%)を示すグラフである。 5継代後の細胞凝集体の位相差顕微鏡像を示す写真である。 膵前駆細胞への分化誘導後に6日おきに継代して培養した時の細胞数の経時変化を示すグラフである。縦軸は培養開始時を1とした場合の細胞数の相対値を表す。 9継代後の細胞の免疫染色像を示す写真である。 9継代後の細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。 膵島細胞への分化誘導を行った細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。 膵島細胞への分化誘導を行った細胞のグルコース負荷試験の結果を示すグラフである。縦軸はC-peptideの分泌量(pM/256 aggregates, 0.5 mL, 0.5h)を表す。 膵島細胞への分化誘導を行った細胞の免疫染色像を示す写真である。 各種凍結保存液を用いて膵前駆細胞を凍結し-196℃で保存した後、解凍した時の細胞生存率(%)を示すグラフである。 凍結保存した細胞の解凍後の細胞及び凍結保存していない細胞を膵前駆細胞増殖用培地中で培養した時の細胞数の経時変化を示すグラフである。縦軸は培養開始時を1とした場合の細胞数の相対値を表す。 4因子(EGF＋RSPD1＋FGF-7＋CHIR99021)を添加して培養した時のRPChiPS771-2株由来の膵前駆細胞の細胞数の経時変化を示すグラフである。縦軸は培養開始時を1とした場合の細胞数の相対値を表す。 各ヒトiPS細胞株由来の膵前駆細胞を4因子(EGF＋RSPD1＋FGF-7＋CHIR99021)を添加して培養した時のフローサイトメトリーによる分析結果を示す図である。 各ヒトiPS細胞株由来の膵前駆細胞を2～4因子を添加して培養した時の細胞数変化を示すグラフである。縦軸は培養開始時を1とした場合の細胞数の相対値を表す。 各ヒトiPS細胞株由来の膵前駆細胞を2～4因子を添加して培養した時のKi67及びPDX1陽性細胞の割合(%)を示すグラフである。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願2016-091116 (2016年4月28日出願)の明細書に記載された内容を包含する。
 発明の詳細な説明
以下、本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書において「含む、含有する(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「からなる(consist of)」という意味をも包含する。
本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、又は／及び増殖させることを指す。「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、又は／及び増殖させることを意味する。
(多能性幹細胞)
多能性幹細胞とは、三胚葉(内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)のいずれにも分化できる能力(多能性：pluripotency)を有し且つ自己複製可能な幹細胞である。多能性幹細胞としては、特に限定されず、例えば、胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、多能性生殖幹細胞(「mGS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞等が挙げられる。また、多能性幹細胞の由来生物としては、特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物が挙げられる。中でもヒト由来の多能性幹細胞が好ましい。多能性幹細胞は、市販されているもの若しくは所定の機関により分譲されているもの、又は公知の方法に従い製造したものを使用することができる。多能性幹細胞としては、好ましくはES細胞及びiPS細胞を使用できる。
ES細胞は、公知の方法により製造され得る。ES細胞は、母体から取り出した受精卵を材料として作製されたもの以外、例えば、体外受精による受精卵を材料として作製されたものであってもよい。
iPS細胞は、公知の方法、例えば、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子としては、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等の遺伝子又は遺伝子産物を挙げることができ、これらの初期化因子は、単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。ここで、初期化因子の組み合わせとしては、例えば、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D et al., Nat. Biotechnol., 26:795-797(2008)、Shi Y et al., Cell Stem Cell, 2:525-528(2008)、Eminli S et al., Stem Cells. 26:2467-2474(2008)、Huangfu D et al., Nat. Biotechnol. 26:1269-1275(2008)、Shi Y et al., Cell Stem Cell, 3:568-574(2008)、Zhao Y et al., Cell Stem Cell, 3:475-479(2008)、Marson A, Cell Stem Cell, 3:132-135(2008)、Feng B et al., Nat. Cell Biol. 11:197-203(2009)、Judson RL et al., Nat. Biotechnol., 27:459-461(2009)、Lyssiotis CA et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917(2009)、Kim JB et al., Nature. 461:649-643(2009)、Ichida JK et al., Cell Stem Cell. 5:491-503(2009)、Heng JC et al., Cell Stem Cell. 6:167-174(2010)、Han J et al., Nature. 463:1096-1100(2010)、Mali P et al., Stem Cells. 28:713-720(2010)、Maekawa M et al., Nature. 474:225-229(2011)等に記載のものが使用できる。
上記体細胞としては、特に制限されず、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、並びに成熟した健全な及び疾患性の体細胞が含まれ、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞も含まれる。体細胞としては、例えば、(1)神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)、(2)組織前駆細胞、(3)血液細胞(末梢血細胞、臍帯血細胞等)、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞(皮膚細胞等)、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞、脂肪細胞等の分化した細胞等が挙げられる。
(膵前駆細胞)
本発明における膵前駆細胞(pancreatic progenitor)は、その後、膵島細胞へと分化していく細胞をいう。膵前駆細胞は、例えば、PDX1 (pancreas duodenal homeobox gene 1)陽性(及びSOX9陽性)であることを指標とすることができる。
また、本発明における膵前駆細胞は、NKX6.1、NGN3 (Nerurogenin 3)等が陰性であることを更なる指標として追加することもできるが、NKX6.1及び／又はNGN3は陽性であってもよい。
その他、HNF6、HLXB9、PAX4及び／又はNKX2-2などのマーカーも膵前駆細胞の指標として使用することができる。
一例として、PDX1、HNF6、HLXB9などのマーカーが陽性である細胞、又は、NKX6.1、NGN3、PAX4、NKX2-2などのマーカーが陽性である細胞は、本発明の膵前駆細胞に含まれる。
本発明の膵前駆細胞は、好ましくはPDX1陽性であり、より好ましくはPDX1陽性及びSOX9陽性である。
本発明の膵前駆細胞は、特に好ましくはPDX1陽性、SOX9陽性、並びにNKX6.1陰性及び／又はNGN3陰性である。
別の態様として、本発明の膵前駆細胞は、特に好ましくはPDX1陽性、SOX9陽性、並びにNKX6.1陽性及び／又はNGN3陽性である。
(膵島細胞)
本発明における膵島(ランゲルハンス氏島)細胞は、グルカゴンを分泌するα細胞、インスリンを分泌するβ細胞、及びソマトスタチンを分泌するδ細胞の少なくとも1種を含むものであり、好ましくは少なくともβ細胞を含むものである。膵島細胞にα細胞、β細胞、及びδ細胞が含まれることは、例えば、それぞれ、グルカゴン、インスリン又はCペプチド、及びソマトスタチンに対する抗体を用いる免疫染色で確認することができる。β細胞は、Cペプチドに対する抗体を用いた免疫染色で検出することも可能である。β細胞は、ジチゾン染色によっても検出し得る。膵島細胞には、更に、膵臓ポリペプチドを分泌するF細胞及び膵島前駆細胞が含まれていてもよい。
(膵前駆細胞の培養方法(A工程))
本発明の多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養方法は、多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を(1)上皮成長因子(EGF)ファミリーに属する因子及び／又は線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーに属する因子(以下、成分(1)と称することがある)、並びに(2)Wntアゴニスト(以下、成分(2)と称することがある)を含有する培地中で3次元培養する工程を含むことを特徴とする。
本発明の培養方法で使用する膵前駆細胞は、多能性幹細胞由来、すなわち多能性幹細胞から分化誘導されたものである。
本発明の培養方法で用いる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として、少なくとも、(1)EGFファミリーに属する因子及び／又はFGFファミリーに属する因子、並びに(2)Wntアゴニストを含むものである。基礎培地としては、動物細胞の培養に使用できるものであれば特に限定されず、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、MCDB 131 培地、これらの混合培地等が挙げられる。このように、成分(1)と成分(2)とを組み合わせて使用することで膵前駆細胞を高効率に増殖させることが可能となる。
EGFファミリーに属する因子としては、EGF受容体と結合し、その活性を上昇させることができるものであれば特に制限されず、好ましくはEGF受容体であるErbB1に結合する因子であり、例えば、EGF、トランスフォーミング成長因子α(TGF-α)、アンフィレギュリン、ヘパリン結合性EGF様成長因子、シュワノーマ由来成長因子、ベータセルリン、ポックスウイルス成長因子などが挙げられ、より好ましくはEGFである。
上皮成長因子(EGF)は、各種の表皮及び線維芽細胞の増殖を促進する53個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、3つの分子内ジスルフィド結合を有している。また、上皮成長因子受容体に結合する。上皮成長因子は、上皮増殖因子、上皮細胞増殖因子、表皮増殖因子、及び表皮成長因子と称される場合もある。本発明における上皮成長因子には、本来の活性を有している限り天然に存在する上皮成長因子の改変体も広く包含される。上皮成長因子は、市販されているもの又は公知の方法に従い製造したものを使用することができる。
FGFファミリーに属する因子としては、ヒト及びマウスでは22種類のFGFが存在している。FGFは、線維芽細胞成長因子、及びヘパリン結合性増殖因子と称される場合もある。FGFファミリーに属する因子としては、例えば、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF、FGF-1)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、FGF-2)、FGF-3、角質細胞成長因子(KGF、FGF-7)、FGF-10、FGF-22などが挙げられ、好ましくはFGF受容体であるFGFR2IIIbに結合する因子であり、より好ましくはFGF-3、FGF-7、FGF-10及びFGF-22である。
Wntアゴニストは、Wntシグナル伝達を活性化し、細胞中でTCF/LEF介在性の転写を活性化する物質であり、Frizzled受容体に結合して活性化する物質、細胞内β-カテニン分解の阻害剤、TCF/LEFの活性化物質などが含まれる。具体的には、Wntファミリーに属する因子(例えば、Wntファミリーに属するタンパク質、Wntファミリーと同様の作用を示す低分子化合物)、R-スポンジンファミリーに属する因子(例えば、R-スポンジンファミリーに属するタンパク質(R-スポンジン1～4など)、R-スポンジンファミリーと同様の作用を示す低分子化合物)、ノリン(Norrin)、GSK阻害剤などが挙げられ、好ましくはR-スポンジンファミリーに属する因子及び／又はGSK阻害剤であり、より好ましくはR-スポンジンファミリーに属するタンパク質及び／又はGSK阻害剤である。
Wntファミリーに属するタンパク質としては、特に制限されず、例えば、Wnt-1/Int-1、Wnt-2/Irp、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、Wnt-11、Wnt-16などが挙げられ、特にWnt-3aである。
GSK阻害剤は、GSK-3β(Glycogen Synthase Kinase 3β)を阻害する因子であれば特に制限されず、例えば、CHIR99021、SB216763、SB415286、A1070722、BIO、BIO-acetoxime、Indirubin-3'-oxime、NSC 693868、TC-G 24、TCS 2002、TWS 119、siRNA、リチウム、ケンパウロンなどが挙げられ、好ましくはCHIR99021である。
R-スポンジンファミリーに属するタンパク質としては、好ましくはR-スポンジン1である。R-スポンジン1は、WntモジュレーターのRSPO (RSPO1-4)ファミリーに属し、Wnt/β-カテニンシグナル伝達を調節する分泌タンパク質である。本発明におけるR-スポンジン1には、本来の活性を有している限り天然に存在するR-スポンジン1の改変体も広く包含される。R-スポンジン1は、市販されているもの又は公知の方法に従い製造したものを使用することができる。
培地中には、EGFファミリーに属する因子、FGFファミリーに属する因子、R-スポンジンファミリーに属する因子(例えば、タンパク質、R-スポンジンファミリーと同様の作用を示す低分子化合物)、及びGSK阻害剤のうち、少なくとも2種が含まれる。培地中には、EGFファミリーに属する因子、FGFファミリーに属する因子、R-スポンジンファミリーに属する因子(例えば、タンパク質、R-スポンジンファミリーと同様の作用を示す低分子化合物)、及びGSK阻害剤のうち3種以上が含まれていてもよく、4種以上含まれていてもよい。
培地中における成分(1)の各濃度は、膵前駆細胞が増殖可能であれば特に限定されず、例えば、1～1000 ng/mLが好ましく、20～100 ng/mLがより好ましい。また、培地中における成分(2)の各濃度は、膵前駆細胞が増殖可能であれば特に限定されず、例えば、10～2000 ng/mL又は0.1～50μMが好ましく、200～1000 ng/mL又は1～10μMがより好ましい。培地中にGSK阻害剤としてCHIR99021が含まれる場合、CHIR99021の濃度は、好ましくは1～20μM、より好ましくは3～10μMである。
培地中における上皮成長因子の濃度は、膵前駆細胞が増殖可能であれば特に限定されず、例えば、1～1000 ng/mLが好ましく、20～100 ng/mLがより好ましい。また、培地中におけるR-スポンジン-1の濃度は、膵前駆細胞が増殖可能であれば特に限定されず、例えば、10～2000 ng/mLが好ましく、200～1000 ng/mLがより好ましい。
本発明で使用する培地には、Sonic Hedgehogシグナル阻害剤、TGF-β受容体阻害剤及びレチノイン酸からなる群から選択される少なくとも1種が更に含まれることが好ましい。
Sonic Hedgehogシグナル阻害剤としては、Sonic Hedgehogシグナルを阻害できる因子であれば特に限定されず、具体的には、SANT-1、ジェルビン(Jervine)、シクロパミン(Cyclopamine)-KAAD等が挙げられる。
TGF-β受容体阻害剤としては、TGF-β受容体の機能を阻害できる因子であれば特に限定されず、具体的には、LDN193189、D4476、LY2157299、LY364947、SB525334、SB431542、SD208等が挙げられる。また、TGF-β受容体阻害剤に替えてdorsomorphin、NogginなどのBMPシグナル阻害剤も使用可能である。継代を繰り返し、長期培養を行う場合には、培地中にTGF-β受容体阻害剤及び／又はBMPシグナル阻害剤を添加することが望ましい。
レチノイン酸としては、オールトランスレチノイン酸が特に好ましく使用される。
さらに、本発明で使用する培地には、ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ)阻害剤が含まれ得る。ROCK阻害剤は、継代後1～2日間のみ培地に添加されることが望ましい。
ROCK阻害剤としては、ROCKの機能を阻害できる因子であれば特に限定されず、具体的には、Y-27632、Fasudil (又はHA1077)、H-1152、Wf-536、Y-30141などが挙げられる。
本発明で使用する培地は、血清を含有していてもよいし、無血清でもよく、中でも好ましくは、無血清培地である。
本発明で使用する培地はまた、血清代替物(例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement (KSR)、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール、ITS－サプリメント等)を含有していてもよい。血清代替物としては、1種又は2種以上が使用され得る。
さらに、本発明で使用する培地は、B27-サプリメント、N2-サプリメント、脂質、グルコース、アミノ酸(非必須アミノ酸等)、L-グルタミン、Glutamax (Thermo Fisher Scientific)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。
本発明で使用する培地としては、血清等の成分が明らかでないものを含まない既知組成(chemically-defined)の培地を使用することが、培地のロット間の差が低減され、品質の安定した膵前駆細胞を調製できるため望ましい。
本発明で使用する培地のpHは、通常7.0～7.8、好ましくは7.2～7.6である。培地は、使用前にはコンタミネーションを防止するため、濾過、紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射等の方法により好ましくは滅菌される。
本発明で使用する培地は、溶液形態、乾燥形態、又は濃縮形態(例えば、2x～1000x)として調製され得る。濃縮形態の場合は、適切な濃度に適宜希釈して使用することができる。乾燥形態又は濃縮形態の培地を希釈するのに使用する液体は、水、緩衝水溶液、生理食塩水溶液等から適宜選択される。
本発明の膵前駆細胞の培養は、3次元培養にて行われる。ここで、3次元培養とは、単層培養する2次元培養ではなく、縦方向に厚みを持たせた状態で行う培養方法である。このような3次元培養を行うことで膵前駆細胞を高効率に増殖させることが可能となる。3次元培養の方法としては、膵前駆細胞を増殖させることができる限り特に制限無く公知の手法を広く使用することができる。中でも、膵前駆細胞の細胞凝集体による浮遊培養が好ましい。
このような膵前駆細胞の細胞凝集体を形成させる培養方法について以下説明する。
まず、膵前駆細胞を分散細胞(単一細胞又は数個の細胞の塊)に解離させる。分散細胞への解離は、トリプシン、コラーゲナーゼ等の酵素、及びEDTA等のキレート剤による処理、ピペッティング等の機械的な操作などにより行うことができる。分散細胞に解離させられた膵前駆細胞を培地に懸濁し、好ましくは10～10000個/well、より好ましくは300～3000個/wellの細胞濃度になるように培養器へ播種する。そして、この状態で一定期間、例えば、12～36時間静置することで、凝集体を形成させることができる。凝集体の大きさ(直径)は、通常50～500μm程度、好ましくは100～200μm程度であり、一個の凝集体中の細胞数は、通常100～5000個程度、好ましくは500～2000個程度である。
膵前駆細胞の細胞凝集体を形成させる培養方法では、例えば、0.001～10μl/well、0.001～1μl/well、0.005～0.5μl/well、0.01～0.5μl/well、0.01～0.1μl/well等の容積の培養ウェルを有する培養器を使用し得る。また、細胞が底部に沈んで凝集体を形成しやすい形状、例えば、底部が底に向かって膨らんだ半球状の培養ウェル、円柱状で底部が半球状になっている形状を有する培養ウェル等を有する培養器が望ましい。培養器の培養ウェルの直径は、例えば、200～800μm、400～800μm等を挙げることができる。また、このような培養ウェルの深さは、例えば、400～1000μm、400～800μm等である。上記のような形状のウェルを複数有するマルチウェルの培養器を用いることで、多数の膵前駆細胞を得ることができる。
膵前駆細胞の細胞凝集体を形成させるための培養器は、非接着培養を行うため、培養器表面が細胞の非接着処理されているもの(例えば、細胞非接着処理をしたプラスチック製(例えば、ポリスチレン製)の培養器)でもよいが、細胞を非接着状態で培養できるような素材でできていることが望ましい。そのような素材としては、三次元構造を有する細胞毒性のない親水性素材が望ましく、更には、培養状態を観察しやすくするために透明の素材であることが望ましい。また、細胞の非接着処理に用いる親水性高分子からなるハイドロゲルも好ましい。
ハイドロゲルを作製するのに用いる材料としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリ－２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ－２－ヒドロキシエチルアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸等の合成高分子の物理的又は化学的架橋体及び放射線照射による架橋体、更に、上記高分子を構成するモノマーの共重合体の架橋体など、ハイドロゲルを形成することのできる各種合成高分子材料を挙げることができる。また、天然高分子であるアガロース、アルギン酸、デキストラン、セルロース等の多糖及びその誘導体、更には、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質及びその誘導体の架橋体等も使用することができる。ハイドロゲルを作製するのに用いる材料としては、中でもアガロースゲルが好ましい。
細胞を非接着状態で培養できるように処理を施すのに用いる材料としては、上記ハイドロゲルの作製に用いる素材、主成分として2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)を含む高分子材料などが挙げられる。
本発明の培養方法の培養条件は通常の細胞培養と同様の条件でよいが、培養温度は35～39℃が好ましく、37℃がより好ましい。また、O2濃度は通常約5～20%、CO2濃度は通常約1～10%、好ましくは約5%である。このような培養は、公知のCO2インキュベーターを使用して行うことができる。
培養時間は特に制限されず、例えば、3～10日間が好ましく、5～7日間がより好ましい。また、培養中は、1～3日毎に培地を交換することが好ましい。
本発明の培養方法は、フィーダー細胞の非存在下で実施されることが望ましい。本発明の培養方法は、フィーダー細胞の非存在下での培養が可能であるため、成分が明らかではないものが混入することがなく、均一な性質を持つ膵前駆細胞を安定して増殖させることが可能となる。
本発明の培養方法は、膵島細胞、及び肝臓細胞、神経細胞、膵外分泌細胞などの他の機能細胞へと分化した細胞と比べて増殖力が高い膵前駆細胞を効率的に増殖させることができるため、膵前駆細胞の純化のために好適に用いられる。
(継代培養(B工程))
本発明の培養方法の好ましい実施態様では、工程Aにおいて得られた膵前駆細胞を継代培養する工程を更に含む。
継代培養は、前述する方法により培養した膵前駆細胞の凝集塊を回収し、これを分散細胞に解離させた後、新しい培地に播種し培養することにより行うことができる。ここでの分散細胞への解離、細胞の播種、培地、培養方法等は前述するものと同様である。
継代回数は、例えば、1～10回、1～5回、2～3回であり、好ましくは3回以上である。なお、本明細書において、最初の培養を0継代目とする。
本発明の培養方法では、継代培養を行っても膵前駆細胞の増殖力が維持されるため、大量の膵前駆細胞の調製が可能である。さらに、継代回数が増えるに従って、膵前駆細胞の純化も向上する。
(iPS細胞の調製工程(C工程))
本発明の培養方法は、iPS細胞を調製する工程を更に含み得る。
iPS細胞を調製する方法としては、上記の「多能性幹細胞」の項で記載されている方法が挙げられる。ここで調製されたiPS細胞を膵前駆細胞に分化誘導し、当該膵前駆細胞をA工程の培養に使用することができる。
なお、本発明において、iPS細胞以外の多能性幹細胞を使用する場合は、当該工程においてiPS細胞に替えて他の多能性幹細胞を調製し得る。
(膵前駆細胞への分化誘導工程(D工程))
本発明の培養方法は、多能性幹細胞を膵前駆細胞に分化誘導する工程を更に含み得る。
ここで分化誘導された膵前駆細胞をA工程の培養に使用することができる。
多能性幹細胞を膵前駆細胞に分化させる工程では、生体内での膵発生の過程を模倣するように、培養液の組成を経時的に変化させるとよい。また、当該分化誘導工程は、前述する細胞凝集体による浮遊培養又は接着培養により行い得る。
このような方法としては、例えば、以下の文献に記載された方法、及びこれを適宜修正した方法を用いることができる。参考文献２に記載の方法であればStage 4までの段階を実施することで、膵前駆細胞まで分化誘導させることができる。
[参考文献１] Rezania A, Bruin JE, Riedel MJ, Mojibian M, Asadi A, Xu J, Gauvin R, Narayan K, Karanu F, O'Neil JJ, Ao Z, Warnock GL, Kieffer TJ. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes 2012;61:2016-2029.
[参考文献２] Rezania A, Bruin JE, Arora P, Rubin A, Batushansky I, Asadi A, O'Dwyer S, Quiskamp N, Mojibian M, Albrecht T, Yang YH, Johnson JD, Kieffer TJ. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2014;32:1121-1133.
[参考文献３] Hrvatin S, O'Donnell CW, Deng F, Millman JR, Pagliuca FW, DiIorio P, Rezania A, Gifford DK, Melton DA. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:3038-3043
[参考文献４] Pagliuca FW, Millman JR, Gurtler M, Segel M, Van Dervort A, Ryu JH, Peterson QP, Greiner D, Melton DA. Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell. 2014;159:428-439.
例えば、初期の段階で、Activin A及びWnt3aを加えることが好ましく、その後レチノイン酸、ヘッジホッグシグナル阻害剤(例えば、SANT-1及びCyclopamine-KAAD)、線維芽細胞増殖因子等を加えることも好ましい。
また、分化の過程では、生体内での膵発生の過程を模倣して、膵前駆細胞を得るために、未分化性を維持して増殖を促進する物質、増殖を抑制して分化を促進する物質、生体内の膵臓で発現するタンパク質等を、適切な時期に加えてもよい。かかる物質としては、GSK-3β (Glycogen Synthase Kinase 3β)阻害剤(例えば、CHIR99021)、ALK阻害剤(例えば、SB431542)、Notchシグナル阻害剤(例えば、DAPT)、TGFβ阻害剤(例えば、LDN193189)、AMPK及びBMPシグナル阻害剤(例えば、Dorsomorphin)、PKC活性化剤(例えば、Pdbu)、インスリン様増殖因子-1、上皮成長因子、肝細胞成長因子、グルカゴン様ペプチド-1、市販のサプリメント等が挙げられる。
(膵島細胞への分化誘導工程(E工程))
本発明の多能性幹細胞由来の膵前駆細胞からの膵島細胞の製造方法は、上記の方法により培養した膵前駆細胞を膵島細胞に分化誘導する工程を含むことを特徴とする。
膵前駆細胞を膵島細胞に分化させる工程では、生体内での膵発生の過程を模倣するように、培養液の組成を経時的に変化させるとよい。また、当該分化誘導工程は、前述する細胞凝集体による浮遊培養により行い得る。
このような方法としては、例えば、上記の参考文献１－４に記載された方法、及びこれを適宜修正した方法を用いることができる。参考文献２に記載の方法であればStage 5からStage 7までの段階を実施することで、膵島細胞まで分化誘導させることができる。
(膵前駆細胞の凍結工程(F工程))
本発明の多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の凍結保存方法は、上記の方法により培養した膵前駆細胞を凍結する工程を含むことを特徴とする。
膵前駆細胞としては、上記の培養方法により培養された細胞、及び更に継代培養された細胞のいずれも使用することができる。また、凍結保存する膵前駆細胞は、分散細胞に解離させることが望ましい。分散細胞に解離させる方法は、前述するものと同様である。
凍結保存液としては、特に限定されず、市販の凍結保存液(例えば、cell banker (登録商標) 2 (日本全薬工業(株))、stem cell banker (登録商標) (日本全薬工業(株))、StemSure (登録商標) Freezing Medium(和光純薬工業(株))等)、ジメチルスルホキシドが5～20容量%程度添加された培養液(例えば、上記の培養方法で使用される培地)などを挙げることができる。
凍結保存は、通常-70～-196℃程度、好ましくは-100℃以下で凍結させて行うことができる。長期保存を行う場合は、液体窒素細胞保存容器の液体窒素中又は液体窒素上部の気相で保存を行うことができる。
凍結保存された細胞の解凍は、通常20～40℃程度、好ましくは35～38℃程度の水浴中で急速に加温することにより行うことができる。
本発明の培養方法で増殖させた膵前駆細胞は、凍結保存後も凍結保存前と同程度の増殖力を維持している。そのため、この技術の膵前駆細胞の細胞バンクへの適用も期待される。
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
なお、以下の実施例において特にiPS細胞株の名前を記述しなかった場合は253G1株を用いた実験結果である。
[アガロースマイクロウェルの準備]
マイクロティシューズ社の3D Petri Dishを用い、メーカーのプロトコル(http://www.funakoshi.co.jp/contents/5556)を参考にしてアガロースマイクロウェルを作製した。ウェル直径400μm、256 well/gel-plateの鋳型を使用した。具体的には、以下の手順でアガロースマイクロウェルを作製した。
まず、鋳型に加温したアガロース溶液(Lonza社製アガロース、2.5%アガロース/生理食塩水)を流し込んだ。次に、室温で冷却し、アガロースがゲル化したら、アガロースマイクロウェルを鋳型から取り外した。アガロースマイクロウェルを細胞培養用のポリスチレン製の12 well plateに移し、周囲から培地(DMEM/F12)を添加し、アガロースマイクロウェルプレートを培地の中に浸漬させた。一晩以上インキュベーター(37℃、5%CO2)に入れ、アガロースマイクロウェルプレートを周りの培地と平衡化させた。これにより、直径400μmの円柱部と、半球状の底部を有するウェルを256個有するアガロースマイクロウェルが得られた。以上の操作をクリーンベンチ内で無菌の状態で行った。
[凝集体形成及び膵前駆細胞への分化誘導]
iPS細胞(253G1、Riken Cell Bankより入手)をGeltrex (Thermo Fisher Scientific)でコートされた培養容器を用い、E8培地(Thermo Fisher Scientific)で3～4日間培養した。70～80%コンフルエントの状態でTrypLE (Thermo Fisher Scientific)を用いて処理し細胞を単一細胞の状態で回収した。細胞を10μMのY-27632 (ROCK阻害剤：和光純薬工業(株))を含むE8培地に懸濁し、上記で調製したポリスチレン製12 well plateのウェルの一つに設置した256ウェルのアガロースマイクロウェルプレートに、平均2500細胞/wellになるように播種した。
10分間静置して細胞をマイクロウェルの底に沈ませた後、アガロースマイクロウェルプレートの周りに培地(E8培地＋ROCK阻害剤)を添加し、プレートごと培地の中に浸漬させた。37℃、5%CO2の条件で24時間培養(5%CO2、37℃)して細胞を凝集させた後、所定の期間培養することで分化誘導を行った。具体的には、下記のごとく、培地を毎日吸い出し、新たな培地を入れることで交換し、また所定の日に培地組成を変化させた。培地の組成及びそれぞれの培地中での培養日数は、A Rezania et al. Reversal of diabetes with insulin producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1121-33.の記載に従った。
第１段階(3日間)
MCDB131 (Thermo Fisher Scientific)＋1.5 g/L NaHCO3 (ナカライテスク(株))＋0.5% fat-free BSA (和光純薬工業(株))＋2 mM GlutaMax (Thermo Fisher Scientific)＋10 mM D-グルコース(ナカライテスク(株))＋3μM CHIR99021 (Tocris Bioscience)＋100 ng/mL Activin A (R&D Systems)(CHIR99021は初日の培地にのみ加えた)
第２段階(2日間)
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋2 mM GlutaMax＋10 mM D-グルコース＋50 ng/mL線維芽細胞増殖因子７(FGF-7, PeproTech)＋0.25 mM アスコルビン酸 (Sigma-Aldrich)
第３段階(2日間)
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5%脂肪酸不含ウシ血清アルブミン(fat-free BSA)＋1/200 ITS supplement (Thermo Fisher Scientific)＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋50 ng/mL FGF-7＋0.25μM SANT-1 (和光純薬工業(株))＋0.1μM LDN193189 (和光純薬工業(株))＋1μMレチノイン酸 (Sigma-Aldrich)＋0.2μM TBP (PKC activator; Catalog No. 565740; EMD Chemicals Inc.)＋0.25 mM アスコルビン酸
第４段階(2日間)
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋50 ng/mL FGF-7＋0.25μM SANT-1＋0.2μM LDN193189＋0.1μMレチノイン酸＋0.1μM TBP＋0.25 mM アスコルビン酸
TBP: (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam
上記第１段階から第４段階の培養で得られた細胞のフローサイトメトリーによる分析結果を図１に示す。図１中、SOX9は膵前駆細胞マーカー、BrdUは細胞増殖マーカー(増殖能のある細胞の核に目印をつけるための核酸類似体)、PDX1は膵前駆細胞及び膵島細胞マーカーである。BrdUを培養液に添加し、24時間培養した後に染色及びフローサイトメトリー分析を行った。一次抗体として、ヤギ抗PDX1抗体(R&D systems)、ウサギ抗SOX9抗体(Merck Millipore)、マウス抗BrdU抗体(Dako)、二次抗体として、FITC標識抗マウスIgG抗体(Thermo Fisher Scientific)、PE標識抗ヤギIgG抗体(Thermo Fisher Scientific)、FITC標識抗ウサギIgG抗体(BD Biosciences)、PE標識抗マウスIgG抗体(BD Biosciences)を用いた。測定にはGuava (登録商標) easyCyte (Merck Millipore)を使用した。
図１から、6割程度の細胞がPDX1陽性の膵細胞へ分化し、増殖中のSOX9/BrdU陽性の膵前駆細胞は3割程度含まれていた。結果として、不均一な細胞集団となっており、未分化な細胞、膵前駆細胞(SOX9及びPDX1陽性且つNKX6.1陰性細胞)、内分泌細胞へ成熟が進んでしまった細胞が含まれていると推察された。
[膵前駆細胞の増幅]
上記第１段階から第４段階の培養で得られた細胞の凝集塊を細胞分散用酵素液TrypLE (Thermo Fisher Scientific)を用いて、単一細胞に分散した。細胞を10μMのY-27632 (ROCK阻害剤：和光純薬工業(株))を含む下記の培地に懸濁し、12 well plateのウェル上に設置した256ウェルのアガロースマイクロウェルプレートに、1000細胞/ウェルで播種した(1000×256 = 2.56×105/plate)。10分間静置して細胞を底に沈ませた後、アガロースマイクロウェルプレートの周りから下記の培地を添加し、プレートごと培地の中に浸漬させた。その後、37℃、5%CO2の条件で6日間培養した。培地交換は一日おきに行った。
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋50 ng/mL 上皮成長因子(EGF, 和光純薬工業(株))＋200 ng/mL r-スポンジン1 (RSPD1, R&D Systems)＋0.25μM SANT-1 (和光純薬工業(株))＋0.2μM LDN193189(和光純薬工業(株))＋0.1μM レチノイン酸(Sigma-Aldrich)
結果を図２－４に示す。図３では、6日後に一度継代した。図４では、BrdUを培養液に添加し、24時間培養した後に染色及びフローサイトメトリー分析を行った。ここで、24時間培養中に増殖した細胞はBrdUでラベルされる。なお、図４中、SOX9は膵前駆細胞マーカーである。図２及び３から、r-スポンジン1とEGFとを共添加した場合に良好に細胞が増殖していた。また、図４から、r-スポンジン1とEGFとを共添加した場合、SOX9/BrdU陽性細胞の割合が最も多かった。培養前と比べても、SOX9及びPDX1陽性の膵前駆細胞が増加しており(26.3%→57.5%)、膵前駆細胞へ選別が進んでいた。
Geltrexをコートした6ウェルプレート上に、上記第１段階から第４段階の培養で得られた細胞を20000又は40000細胞/cm2の密度でプレート基材に接着させ、上記の膵前駆細胞の増幅と同様の培養方法で接着培養を行った。37℃、5%CO2の条件で12日間培養した。培養6日後に、継代した。培地交換は一日おきに行った。結果を図５に示す。図５から、接着培養を行った場合には、多くの細胞は外分泌細胞へ分化してしまい(データは示されていない)、継代を繰り返す途中で細胞の増殖性は減退し、細胞数の減少に転じていた。
[膵前駆細胞の純化]
6日おきにアガロースマイクロウェルプレートより細胞凝集体を回収し、単一細胞に分散した後、新たなアガロースマイクロウェルプレートへ播種した。細胞の分散方法、培地組成及び培養条件は上記の[膵前駆細胞の増幅]と同様とした。
図６に各継代におけるSOX9及びBrdU陽性細胞の割合を計測した結果を示した。なお、図６中、Pは継代数を意味する。図６から継代を経るごとにSOX9/BrdU陽性細胞の割合は増加し、1継代後には60%まで上昇した。図７－８に各継代におけるSOX9及びPDX1陽性細胞の割合を計測した結果を示した。継代を経るごとにSOX9及びPDX1陽性の膵前駆細胞の割合は増加し、3継代後には90%まで上昇した。これらの結果から、成熟細胞に比べ増殖能が高い前駆細胞の純度が増加したと考えられる。
[膵前駆細胞の長期培養]
6日おきにアガロースマイクロウェルプレートより細胞凝集体を回収し、SOX9及びPDX1陽性の膵前駆細胞を含む単一細胞に分散した後、新たなアガロースマイクロウェルプレートへ播種した。細胞の分散方法、培地組成、及び培養条件は、上記の[膵前駆細胞の増幅]と同様とした。
結果を図９－１２に示す。図９の左図はアガロースマイクロウェル上で培養時の細胞凝集体の、右図はアガロースマイクロウェルプレートから取り出した後の細胞凝集体の位相差顕微鏡像を示す。図１１及び図１２において、BrdUは細胞増殖マーカー、PDX1は膵前駆細胞及び膵島細胞マーカー、SOX9は膵前駆細胞マーカー、C-peptideはβ細胞マーカー、NKX6.1は内分泌細胞マーカーである。雑多な細胞が含まれる細胞集団では凝集体の形態が歪であるが、図９から球形に近い細胞凝集体が得られていることより、凝集体内の細胞は均一な膵前駆細胞であると推察される。図１０から、細胞増殖能が落ちることなく長期間(48日)の増幅が可能であり、1継代毎すなわち6日間の培養により細胞数が3倍に増加した。図１１及び１２から、長期間増幅した細胞は膵前駆細胞マーカーSOX9及びPDX1が陽性であった。また、BrdUを培養液に添加し24時間培養した後に染色を行うと、BrdUが陽性の増殖中の細胞も多数観察された。しかし、β細胞マーカーのC-peptide陽性、及び内分泌細胞マーカーのNKX6.1陽性の成熟が進んだ細胞は稀であった。
[内分泌細胞への成熟]
上記の[膵前駆細胞の増幅]と同様に、6継代増幅培養した後の膵前駆細胞をアガロースウェルプレートへ播種した。播種密度は3000細胞/ウェルとした。下記第１段階～第３段階に示した手順で内分泌細胞への成熟を行った。具体的には、下記のごとく、経時的に培地組成を変化させた。1日おきに培地を吸い出し、新しい培地に交換し、また所定の日に培地組成を変化させた。培地の組成及びそれぞれの培地中での培養日数は、A Rezania et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1121-33.の記載に従った。
第１段階(3日間)
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋0.25μM SANT-1＋0.2μM LDN193189＋0.05μMレチノイン酸＋1μM T3 (Thyroid hormone, triiodothyronine, Sigma-Aldrich)＋10μM Alk5i II (activin receptor-like kinase receptors 5 阻害剤 II, Enzo Life Sciences, Inc.)＋10μg/mLヘパリン(ナカライテスク(株))＋10μM Zinc Sulfate (Sigma-Aldrich)
第２段階(7日間)
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋0.2μM LDN193189＋1μM T3＋10μM Alk5i II＋10μg/mL ヘパリン＋10μM Zinc Sulfate＋0.1μM GSi XX (gamma-secretase inhibitor XX, Merck Millipore)
第３段階(7-14日間)
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋1μM T3＋10μM Alk5i II＋10μg/mL ヘパリン＋10μM Zinc Sulfate＋1 mM N-Cys (N-acetylcysteine, Sigma-Aldrich)＋2μM R428 (Axl阻害剤, Selleckchem)＋10μM Trolox (Merck Millipore)
分化誘導効率を調べる目的で、膵島細胞へ分化誘導した細胞凝集体中のC-peptide陽性膵β細胞を調べた。結果を図１３に示す。図１３中、NKX6.1は内分泌細胞マーカー、C-peptideはβ細胞マーカーである。図１３から、6継代増幅培養した膵前駆細胞を用いた場合においても、増幅無しの膵前駆細胞と同程度の比率でC-peptide/NKX6.1陽性のβ細胞へ分化した。
膵島細胞へ分化誘導した細胞凝集体について、糖負荷試験を行った。すなわち、凝集体を2.5 mM、22.5 mM、2.5 mM、22.5 mMグルコースを含むクレブス・リンゲル液に30分ずつ浸漬し、クレブス・リンゲル液に分泌されたC-peptideをELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法により定量した。結果を図１４に示す。図１４から、膵前駆細胞から成熟させた細胞は、グルコース濃度に応じてC-peptideの分泌量が変化することが分かる。結果として、増幅した膵前駆細胞は、β細胞を含む膵内分泌細胞へ分化誘導させることができ、グルコース濃度に応答してインスリン分泌量を変化させる能力を有していることを示した。
膵島細胞へ分化誘導した細胞凝集体について、免疫染色を行った結果を図１５に示す。なお、図１５中、グルカゴンはα細胞マーカー、ソマトスタチンはδ細胞マーカー、インスリンはβ細胞マーカーである。図１５から、膵島細胞への分化誘導した細胞凝集体中にはグルカゴン陽性のα細胞、ソマトスタチン陽性のδ細胞も含まれていた。
[膵前駆細胞の凍結保存]
・凍結
上記の[膵前駆細胞の増幅]と同様にして5継代した後、膵前駆細胞を単一細胞に分散させた。市販の凍結保存液(cell banker 2 (日本全薬工業(株))若しくはstem cell banker (日本全薬工業(株)))又は増殖に用いた培養液に10%ジメチルスルホキシドを添加した溶液を用い、緩慢凍結法により細胞を凍結した。具体的には、500μLの凍結保存液に5×105細胞を懸濁し、凍結バイアルに注入した。凍結処理容器(バイセル、日本フリーザー(株))にバイアルを入れ、-80℃で一晩保存した。長期保存の際は、バイアルを液体窒素タンクに移し保存した。
・解凍方法
-80℃で1日間、液体窒素の保存タンクに6時間保存した凍結バイアルを37℃の水浴で加温し、急速に解凍した。解凍された細胞懸濁液を10 mLの培養液(MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース)に添加した。遠心分離により上澄みを除去した後、細胞を10μMのY-27632を含む培地(MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋50 ng/mL EGF＋200 ng/mL r-スポンジン1＋0.25μM SANT-1＋0.2μM LDN193189＋0.1μM レチノイン酸＋10μM Y-27632)に懸濁し、これにトリパンブルー染色液を添加して解凍後の細胞生存率を算出した。
結果を図１６に示す。なお、図１６中、CB2はcell banker 2、SCBはstem cell banker、DMSOは培地+10% DMSO (自作凍結保存液)を凍結保存液として用いた結果を示す。図１６から、いずれの凍結保存液を用いた場合においても、70-80%の生存率であった。
また、解凍後の細胞を上記の[膵前駆細胞の増幅]と同様にして3次元培養により6日ごとに継代を行った時の細胞数の変化を図１７に示す。図１７は、cell banker 2により凍結保存を行った細胞の結果である。図１７に示す結果から、凍結保存を行った細胞は、凍結保存無しの細胞と同程度の増殖能を備えることが明らかである。
[他のiPS細胞株由来の膵前駆細胞への分化誘導]
ヒト由来のiPS細胞として454E2株(Riken Cell Bankより入手)、RPChiPS771-2株((株)リプロセル)、及びP11025株(タカラバイオ(株))を使用した。
454E2株は、Geltrex (Thermo Fisher Scientific)でコートされた培養容器を用い、E8培地(Thermo Fisher Scientific)で3～4日間培養した。70～80%コンフルエントの状態で、TrypLE (Thermo Fisher Scientific)を用いて処理し細胞を単一細胞の状態で回収した。細胞を10μMのY-27632 (ROCK阻害剤：和光純薬工業(株))を含むE8培地に懸濁し、Geltrex (Thermo Fisher Scientific)でコートされた培養容器に1.2～1.5×105 cells/cm2で播種した。454E2株は接着培養により膵前駆細胞への分化誘導を行った。第4段階目の培養を3日間行った以外は上記と同様の培養液及び培養期間で分化誘導を行った。
771-2株は、Geltrex (Thermo Fisher Scientific)でコートされた培養容器を用い、StemFit AK02N培地(味の素(株))で3～4日間培養した。TrypLE (Thermo Fisher Scientific)を用いて処理し細胞を単一細胞の状態で回収した後、細胞を10μMのY-27632 (ROCK阻害剤：和光純薬工業(株))を含むStemFit AK02培地(味の素(株))に懸濁し、Geltrex (Thermo Fisher Scientific)でコートされた培養容器に1.2～1.5 ×105 cells/cm2で播種した。771-2株は接着培養により膵前駆細胞への分化誘導を行った。第4段階目の培養を3日間行った以外は上記と同様の培養液及び培養期間で分化誘導を行った。
P11025株は、DEF-CS Culture System (タカラバイオ(株))で3～4日間培養した。TrypLE (Thermo Fisher Scientific)を用いて処理し細胞を単一細胞の状態で回収した後、細胞を10μMのY-27632 (ROCK阻害剤：和光純薬工業(株))を含むDEF-CS培地(タカラバイオ(株))に懸濁し、DEF-CS coat (タカラバイオ(株))でコートされた培養容器に1.2～1.5×105 cells/cm2で播種した。P11025株は接着培養により膵前駆細胞への分化誘導を行った。第4段階目の培養を3日間行った以外は上記と同様の培養液及び培養期間で分化誘導を行った。
[他のiPS細胞株由来の膵前駆細胞の増幅]
上記で得られた膵前駆細胞を253G1株と同様に細胞分散用酵素液TrypLE (Thermo Fisher Scientific)を用いて、単一細胞に分散した。細胞を10μMのY-27632 (ROCK阻害剤：和光純薬工業(株))を含む下記の培地に懸濁し、12 well plateのウェル上に設置した256ウェルのアガロースマイクロウェルプレートに、1000細胞/ウェルで播種した(1000×256 = 2.56×105/plate)。10分間静置して細胞を底に沈ませた後、アガロースマイクロウェルプレートの周りから下記の培地を添加し、プレートごと培地の中に浸漬させた。その後、37℃、5%CO2の条件で4日間培養した。培地交換は一日おきに行った。なお、4因子(EGF＋RSPD1＋FGF-7＋CHIR99021)を含む培地に代えて、3因子(EGF＋RSPD1＋CHIR99021若しくはEGF＋RSPD1＋FGF-7)又は2因子(FGF-7＋CHIR99021)を含む培地を使用した培養も行った。
MCDB131＋1.5 g/L NaHCO3＋0.5% fat-free BSA＋1/200 ITS supplement＋2 mM GlutaMax＋20 mM D-グルコース＋50 ng/mL上皮成長因子(EGF, 和光純薬工業(株))＋200 ng/mL r-スポンジン1 (RSPD1, R&D Systems)＋0.25μM SANT-1 (和光純薬工業(株))＋0.2μM LDN193189 (和光純薬工業(株))＋0.1μM レチノイン酸(Sigma-Aldrich)＋4.5μM CHIR99021 (Tocris Bioscience)＋50 ng/mL線維芽細胞成長因子7(FGF-7, PeproTech)
結果を図１８－２１に示す。図１８は、4因子(EGF＋RSPD1＋FGF-7＋CHIR99021)添加時の771-2株由来の膵前駆細胞の細胞数変化を示す(8日間培養)。771-2株由来の膵前駆細胞は、4因子を添加することにより、4日間の培養により膵前駆細胞が約2倍に増殖した。また、図１９から、3種の細胞株において、4因子添加時に70%程度の細胞は膵細胞マーカーPDX1及び細胞分裂マーカーKi67が陽性であった。図２０－２１は2～4因子添加時の結果を示す。この結果から、3因子(EGF＋RSPD1＋CHIR99021又はEGF＋RSPD1＋FGF-7)及び2因子(FGF-7＋CHIR99021)添加時においても、2倍程度に細胞増殖し、50%以上の割合でPDX1及びKi67陽性であり、膵前駆細胞の増殖が可能であった。
P11025株由来の膵前駆細胞を4因子(EGF＋RSPD1＋FGF-7＋CHIR99021)を添加した増殖培地により2継代した後に、内分泌細胞への成熟を行った。成熟培養の方法は、253G1株由来の膵前駆細胞の場合と同様であった。分化誘導した細胞について、免疫染色を行った結果、膵島細胞への分化誘導した細胞凝集体中にはインスリン陽性のβ細胞、グルカゴン陽性のα細胞、ソマトスタチン陽性のδ細胞も含まれていた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (11)

  1. 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の培養方法であって、(A)多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を(1)上皮成長因子(EGF)ファミリーに属する因子及び／又は線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーに属する因子、並びに(2)Wntアゴニストを含有する培地中で3次元培養する工程であって、前記3次元培養が膵前駆細胞の凝集体の浮遊培養であり、前記EGFファミリーに属する因子としてEGFを、前記FGFファミリーに属する因子としてFGF-7を、前記WntアゴニストとしてR-スポンジン1及びCHIR99021を含有する、工程を含む、培養方法。
  2. 前記培地が無血清培地である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記培養がフィーダー細胞の非存在下での培養である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記多能性幹細胞がiPS細胞又はES細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. (B)工程Aにおいて得られた膵前駆細胞を継代培養する工程を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 膵前駆細胞の純化のために用いられる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. (C)iPS細胞を調製する工程を更に含み、工程Aにおいて該iPS細胞由来の膵前駆細胞を使用する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. (D)多能性幹細胞を膵前駆細胞に分化誘導する工程を更に含み、工程Aにおいて該膵前駆細胞を使用する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞からの膵島細胞の製造方法であって、
    (A)多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を(1)上皮成長因子(EGF)ファミリーに属する因子及び／又は線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーに属する因子、並びに(2)Wntアゴニストを含有する培地中で3次元培養する工程であって、前記3次元培養が膵前駆細胞の凝集体の浮遊培養であり、前記EGFファミリーに属する因子としてEGFを、前記FGFファミリーに属する因子としてFGF-7を、前記WntアゴニストとしてR-スポンジン1及びCHIR99021を含有する、工程、及び
    (E)前記工程により培養した膵前駆細胞を膵島細胞に分化誘導する工程を含む、製造方法。
  11. 多能性幹細胞由来の膵前駆細胞の凍結保存方法あって、
    (A)多能性幹細胞由来の膵前駆細胞を(1)上皮成長因子(EGF)ファミリーに属する因子及び／又は線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーに属する因子、並びに(2)Wntアゴニストを含有する培地中で3次元培養する工程であって、前記3次元培養が膵前駆細胞の凝集体の浮遊培養であり、前記EGFファミリーに属する因子としてEGFを、前記FGFファミリーに属する因子としてFGF-7を、前記WntアゴニストとしてR-スポンジン1及びCHIR99021を含有する、工程、及び
    (F)前記工程により培養した膵前駆細胞を凍結する工程を含む、凍結保存方法。
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