KR20170092694A

KR20170092694A - 다능성 줄기세포로부터의 각막 상피 세포의 분화 유도 방법

Info

Publication number: KR20170092694A
Application number: KR1020177019320A
Authority: KR
Inventors: 고지 니시다; 류헤이 하야시; 유키 이시카와
Original assignee: 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2015-01-15
Filing date: 2016-01-13
Publication date: 2017-08-11
Also published as: US11066641B2; SG11201705750WA; JP6465898B2; AU2016207513B2; KR102121647B1; EP3246394A4; CA2973187A1; JPWO2016114285A1; EP3246394B1; US20180010093A1; WO2016114285A1; CA2973187C; CN107208052A; US20210371818A1; EP3246394A1; AU2016207513A1

Abstract

본 발명은 다능성 줄기세포로부터의 각막 상피 세포의 분화 유도 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 인간 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를, 피더 세포를 사용하지 않고 무혈청 배지에서 자율적으로 외배엽계 세포종으로 분화시켜, 얻어진 눈 표면 외배엽 계열 세포를 각막 상피 세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

다능성 줄기세포로부터의 각막 상피 세포의 분화 유도 방법{METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF CORNEAL EPITHELIAL CELLS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS}

본 출원은, 일본 특허 출원 제2015-006074호(2015년 1월 15일 출원)에 기초하여 우선권을 주장하고 있고, 그의 내용은 본 명세서에 참조로서 도입된다.

본 발명은 다능성 줄기세포로부터의 각막 상피 세포의 분화 유도 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 다능성 줄기세포(특히, 인공 다능성 줄기세포)를 피더 세포를 사용하지 않고 무혈청 배지에서 자율적으로 외배엽계 세포종으로 분화시켜, 얻어진 눈 표면 외배엽 계열 세포를 각막 상피 세포로 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.

최근 들어, 미분화된 세포(줄기세포)를 분화 유도함으로써, 손상된 조직 기관의 보충을 도모하는 재생 의료(세포 의료)의 연구가 진행되고 있다. 특히 배성 줄기세포(ES 세포)는 태반 이외의 모든 세포로 분화 가능하기 때문에, 각 세포 계보로의 분화 유도나 그 분화 결정 인자의 동정이 주목받고 있지만, 수립할 때의 수정란의 파괴라고 하는 윤리적 문제로부터 그의 연구나 이용에는 제약이 많고, 또한 이식을 받는 환자 유래의 ES 세포의 수립을 할 수 없기 때문에, 거절 반응의 문제도 있다는 점에서, 적용 질환이 한정되어 아직 그의 임상에 있어서의 유용성은 명확하지 않은 것이 현 상황이다.

이에 대해, 체세포나 미분화된 줄기세포에 특정한 인자를 도입함으로써 ES 세포와 동일한 분화 다능성을 갖는 인공 다능성 줄기세포가 수립되었다. 그의 대표적인 것은, 야마나카 등에 의해 수립된 iPS 세포이다. 이들 인공 다능성 줄기세포를 이용한 재생 의료는, 윤리적 문제가 없을 뿐만 아니라, 환자 유래의 세포를 소스로 함으로써 거절 반응의 문제도 회피할 수 있다.

인간 iPS 세포나 ES 세포로부터 상피 세포를 분화 유도할 수 있는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1 내지 2). 유도된 상피 세포의 대부분은 케라틴 14나 p63이라고 하는 중층 상피 세포의 마커를 발현하고 있고, 피부 상피 등 중층 상피 계열 세포로 분화시키는 것도 가능하게 되어 있다. 발명자들은, 중층 상피 중에서도 각막 상피로의 분화에 대하여 보고하고 있지만(특허문헌 2 내지 3, 비특허문헌 3), 시트화 가능하지 않은 것, 증식 능력이 높은 각막 상피 전구 세포를 유도 가능하지 않은 것, 및 피더 세포를 사용하고 있는 것이 임상 응용하는 데 있어서 문제이다.

임상 응용하기 위해서는, 피더 세포를 사용하지 않고 인간 iPS 세포로부터 중층화한 기능적인 조직 구조, 마커 발현(특히 케라틴 12, pax6, MUC16)을 갖는 각막 상피 시트를 제조할 수 있는 것이 바람직하지만, 지금까지 그러한 보고는 되어 있지 않다.

WO2012/073238호 WO2010/134619호 WO2012/144582호

Guenou, H., et al., The Lancet 374, (2009) p1745-1753. Metallo, C.M., et al., Stem cells (2008) 26, 372-380. R. Hayashi et al., Volume 7, Issue 9, e45435, PLOS ONE, 2012

본 발명의 과제는, 다능성 줄기세포(특히, 인공 다능성 줄기세포)를 피더 세포나 혈청을 사용하지 않고 각막 상피나 결막 상피 등의 눈 표면 상피 계열로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것, 및 다능성 줄기세포(특히, 인공 다능성 줄기세포)로부터 중층화한 기능적인 배양 각막 상피 세포 시트를 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토하여, 발명자들은, 혈청이나 피더 세포를 사용하지 않고, KSR 등을 포함하는 분화 배지 중에서 인간 iPS 세포를 배양하면, 4주간 정도에 세포가 자율적으로 분화하여, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 (다층상의) 콜로니를 형성하는 것을 알아내었다. 또한, 얻어진 콜로니로부터, 상피 줄기세포를 포함하는 눈 표면 외배엽 계열 세포를 분리하고, 각막 상피 전구 세포를 분화 유도, 단리하고, 추가로 성숙 배양함으로써 중층화한 각막 상피 세포가 얻어지는 것을 알아내었다. 얻어진 각막 상피 세포는 시트 형상으로 회수되어, 이식하는 것이 가능하고, 체세포 유래의 각막 상피 세포와 마찬가지로 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 각막 상피로서 기능하는 것이 확인되었다.

본 발명은 상기의 지견에 기초하여 완성된 것이고, 이하의 (1) 내지 (15)에 관한 것이다.

(1) 다능성 줄기세포(특히, 인공 다능성 줄기세포)를 무혈청 배지에서 피더 세포를 사용하지 않고 2차원 배양함으로써, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 제조하는 방법;

(2) 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층이 다능성 줄기세포의 자율적 분화에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는, 상기 (1)에 기재된 방법;

(3) 무혈청 배지가 0.5nM 이상의 BMP4[뼈 형성 단백질 (Bone morphogenetic protein 4)], 트랜스포밍 증식 인자 및 액티빈을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 방법;

(4) 무혈청 배지가, 추가로, 고농도 레티노산, BMP 저해제, TGFβ 저해제 및 노긴(Noggin)으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 상기 (3)에 기재된 방법;

(5) 다능성 줄기세포를, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트, 비트로넥틴, 기저막 매트릭스, 젤라틴, 히알루론산, 폴리리신, 비트로넥틴 및 히알루론산으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 코팅된 용기를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 방법;

(6) 콜로니가, 각각 신경 외배엽 계열 세포, 신경능 계열 세포/안배 계열 세포, 눈 표면 외배엽 계열 세포 및 표면 외배엽 계열 세포로 구성되는 층을 포함하는, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 방법;

(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 제조하는 공정,

상기 콜로니로부터 특정한 층에 포함되는 세포를 분리하는 공정,

상기 세포를 눈 관련 세포로 분화 유도하는 공정

을 포함하는, 눈 관련 세포의 제조 방법;

(8) 눈 관련 세포가, 각막 상피 세포, 망막 색소 상피 세포, 신경 망막 세포, 결막 상피 세포, 윤부 상피 세포, 각막 내피 세포, 각막 실질 세포, 홍채 실질 세포, 강막 세포, 홍채 색소 상피 세포, 모양체 상피 세포, 시신경 세포, 윤부하 섬유아세포, 결막하 섬유아세포, 눈물샘, 마이봄샘, 배세포, 렌즈 상피 세포 및 안검 상피 세포로부터 선택되는 어느 것인, 상기 (7)에 기재된 방법;

(9) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 제조하는 공정,

성장 인자를 포함하는 배지에서 상기 콜로니를 배양하는 공정,

눈 표면 외배엽 계열 세포로 구성되는 층에 포함되는 세포를 분리하고, KGF, Rock 저해제 및 혈청 대체물을 포함하는 배지에서 배양하여, 각막 상피 전구 세포로 분화 유도하는 공정,

각막 상피 전구 세포를 단리하고, 각막 상피 세포로 분화 유도하는 공정

을 포함하는, 각막 상피 세포의 제조 방법;

(10) ITGβ4, SSEA4, TRA-1-60 및 CD200으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 마커의 발현 유무, 바람직하게는 ITGβ4 양성 및 SSEA4 양성, 보다 바람직하게는 TRA-1-60 또는 CD200 음성으로, 또한 ITGβ4 양성 및 SSEA4 양성, 더욱 바람직하게는 CD200 음성으로, 또한 ITGβ4 양성 및 SSEA4 양성을 지표로 하여 각막 상피 전구 세포를 단리하는 것을 특징으로 하는, 상기 (9)에 기재된 방법;

(11) 상기 (9) 또는 (10)에 기재된 방법으로 제조되는 각막 상피 세포이며, K12, pax6 및 p63 양성인 것을 특징으로 하는 각막 상피 세포;

(12) 상기 (9) 또는 (10)에 기재된 방법으로 각막 상피 세포를 제조하는 공정, 얻어진 각막 상피 세포를 추가로 중층화 배양하는 공정을 포함하는, 각막 세포 시트의 제조 방법;

(13) 다능성 줄기세포(특히, 인공 다능성 줄기세포) 유래의 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니;

(14) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 상기 (13)에 기재된 콜로니;

(15) 다능성 줄기세포(특히, 인공 다능성 줄기세포) 유래의 중층화 각막 상피 세포 시트이며, 각막 상피 세포가 K12, pax6 및 MUC16 양성인 것을 특징으로 하는 중층화 각막 상피 세포 시트;

(16) 상기 (13) 또는 (14)에 기재된 콜로니의 눈 표면 외배엽 계열 세포로 구성되는 층에 포함되는 세포를 분리·배양하여 제조되는 다능성 줄기세포(특히, 인공 다능성 줄기세포) 유래의 각막 상피 세포이며, K12, pax6 및 p63 양성인 것을 특징으로 하는 각막 상피 세포.

지금까지 인간 iPS 세포로부터 상피 세포를 유도하는 방법은 보고되어 있지만, 케라틴 12이나 pax6, MUC16과 같은 각막 상피 세포에 특이적인 마커를 유지하고 있는 중층화한 기능적인 세포가 제조된 적은 없다. 본 발명의 방법으로 얻어진 상피 세포는, 이들의 마커를 발현하고, 이식 가능하고, 또한 체세포 유래의 각막 상피 세포와 마찬가지로 in vitro 및 in vivo에서 각막 상피 세포로서 기능한다. 또한, 본 발명의 방법은, 동물 유래의 피더 세포나 혈청을 사용하지 않기 때문에, 얻어지는 세포는 안전성이 높고, 임상 응용에 적합하다.

또한, 본 발명의 방법으로 얻어진 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니로부터는, 각막 상피 세포뿐만 아니라, 결막 상피 세포, 망막 세포, 눈물샘 세포 등의 눈을 구성하는 여러 가지 세포도 제조할 수 있다.

도 1은, 인간 iPS 세포로부터의 눈 표면 상피·각막 상피 세포로의 분화 유도 방법의 스킴을 나타낸다.
도 2는, 인간 iPS 세포의 눈 표면 상피·각막 상피 세포로의 분화 유도 공정을 나타낸다(A: 좌측 상단으로부터, 제0일, 제5일, 제10일, 제15일, 제20일, 제25일, B: 6주).
도 3은, 인간 iPS 세포로부터 자율적으로 분화 유도된 외배엽계 세포의 각 층에 포함되는 세포의 특징을 나타낸다(A: 제1-3층의 pax6, p63 발현, B: 제2-4층의 pax6, p63 발현, C: 제1-3층의 E-카드헤린(cadherin), p63 발현, D: 제1-3층의 βIII-튜불린(tublin), p63 발현). 이들 결과로부터, 제3층에 있어서만, p63과 pax6이 공양성(共陽性)의 눈 표면 상피 세포가 확인된다.
도 4는, 인간 iPS 세포로부터 자율적으로 분화 유도된 외배엽계 세포의 각 층에 포함되는 세포의 특징을 나타낸다(A: 2층의 내층에는 CHX10 양성의 신경 망막 세포, 외층에는 MITF 양성의 망막 색소 상피 세포가 출현한다. B: 분화 2주째 정도에 있어서, 2층 예정 영역에서 p75, SOX10 공양성의 신경능 세포가 출현한다, C: 분화 4주째에는 2-3층 사이에 렌즈 세포가 출현하고, 분화 유도 과정을 거쳐서 2-3층 부분에 널리 분산됨이 확인된다.
도 5는, 인간 iPS 세포로부터 자율적으로 분화 유도된 외배엽계 세포의 각 층에 있어서의 마커 발현을 나타낸다(제1층(1st): 신경 외배엽 계열(Sox2+, TUBB3+, Sox6+), 제2층(2nd): 신경능/눈 세포 계열(pax6+, Sox10+, Rx+), 제3층(3rd): 눈 표면 외배엽 계열(pax6+, p63+, E-cadherin+, K18), 제4층(4th): 표면 외배엽 계열(p63+, E-cadherin+, K18+).
도 6은, 분화 유도 기간 중(1-12주)에 있어서의 각막 상피 관련 마커 발현을 나타낸다.
도 7은, 마우스 눈 발생(E9.5-18.5)에 있어서의 각막 상피 관련 마커 발현을 나타낸다(PCE: 각막 상피 예정 영역, OSEpi: 눈 표면 상피, CE: 각막 상피, CS: 각막 실질, LV: 수정체포, LE: 렌즈, AC: 전방, EL: 안검, OV: 안포).
도 8은, 제3층 분획 세포의 분화 배양 12주째의 FACS에 의한 각막 상피 전구 세포의 단리를 나타낸다(P1: 제1 분획, P2: 제2 분획, P3: 제3 분획, P4: 제4 분획).
도 9는, 제2 분획(P2)과 제3 분획(P3)에 있어서의 각막 상피 마커의 발현을 나타낸다.
도 10은, 인간 iPS 세포로부터 분화 유도된 각막 상피 세포의 특성을 마커 발현으로 본 결과를 나타낸다. 제3 분획(P3)에는 각막 상피 세포가, 제2 분획(P2)에는 결막 상피와 그 외의 pax6 음성의 중층 상피 세포가 확인된다.
도 11은, 인간 iPS 세포로부터 분화 유도된 각막 상피 세포(제3 분획(P3) 유래)의 성숙 배양 후의 마커 발현을 나타낸다. A: 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포는 부석상(敷石狀) 형태를 나타내고, 3-4층에 중층화한다. B: 성숙 배양 후의 세포는, 각막 배리어 기능에 필수적인 마커 ZO-1, MUC1, MUC4, MUC16을 발현하고 있다. C: 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포에 대하여 K14와 K12의 FACS 해석을 행한 결과, 각각 약 99％, 60％가 양성 세포이다.
도 12는, 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포 시트를 집토끼 눈에 이식한 결과를 나타낸다. 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포 시트는 시트 형상으로 회수 가능하다(왼쪽). 이식 후의 슬릿 관찰 중, 플루오레세인 염색(우측 상단) 및 면역 조직 화학적 해석(우측 하단)으로부터, 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포 시트는 이식 후, 각막 실질면에 생착하여, 각막 배리어 기능을 발휘하는 것을 알 수 있다.
도 13은, 각막 상피 배양용 배지 중에서 장기간 배양 중에 출현한 결막배 세포 모양 세포 및 눈물샘 모양 세포를 나타낸다. A: PAS 양성, PAX6 양성의 세포 집단은, 결막배(고블릿) 세포 마커인 MUC5AC, K7을 발현하고 있다. B: 샘 모양 구조를 나타내는 세포 응집체를 마트리겔(Matrigel) 중에서 3차원 배양하여 얻은 샘 조직은 눈물샘·타액샘의 마커인 AQP5, LTF 및 MUC7을 발현하고 있다.
도 14는, 눈 주위 신경능 세포의 유도를 나타낸다. A: 다층 구조체로부터 유도된 세포 덩어리는, 눈 주위 신경능 세포 마커 PITX2, AP2b를 발현하고 있다. B: RT-PCR의 결과, 초기 신경능 마커 SOX10이 4주간으로 소실한 후, PITX2, FOXC1 등 눈 주위 신경능 마커의 발현이 유도되었다.
도 15는, iPS 세포로부터 유도한 각막 상피 전구 세포의 음성 마커(CD200)를 이용한 단리를 나타낸다. CD200 음성 세포 중, SSEA4 양성 및 ITGβ4 양성 세포(P3 분획)로서 단리한 세포는 중층화하고, K12, p63, PAX6을 발현하고, 분화된 각막 상피 세포의 특징을 나타내었다.

1. 정의

이하, 본 발명에서 사용되는 용어의 몇 가지에 대하여 설명한다.

(1) 다능성 줄기세포

본 발명에 따른 「다능성 줄기세포」란, 태반 이외의 모든 세포로 분화 가능한 분화 다능성을 갖는 세포 모두를 포함하고, ES 세포나 ES 세포주 외, iPS 세포 등의 인공 다능성 줄기세포의 양쪽을 포함한다.

「인공 다능성 줄기세포」란, 포유 동물 체세포 또는 미분화 줄기세포에, 특정한 인자를 도입함으로써, ES 세포와 동일한 분화 다능성을 갖도록 재프로그래밍(초기화)된 세포를 말한다.

「인공 다능성 줄기세포」는, 야마나카(Yamanaka) 등에 의해, 마우스 섬유아세포에 Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc의 4인자를 도입함으로써, 처음으로 수립되어 「iPS 세포(induced Pluripotent Stem Cell)」라고 명명되었다(Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006)126: 663-676). 그 후, 동일한 4인자를 인간 섬유아세포에 도입함으로써, 인간 iPS도 수립되고(Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.; Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), 또한 c-Myc를 포함하지 않는 방법 등(Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106), 종양 형성 유도가 낮은 보다 안전성이 높은 iPS 세포를 수립하는 방법의 확립에도 성공했다.

위스콘신(Wisconsin) 대학의 톰슨(Thomson) 등은 OCT3/4, SOX2, NANOG, LIN28의 4 유전자를 인간 섬유아세포에 도입하여 제조한 인공 다능성 줄기세포의 수립에 성공했다(Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920). 또한, 하버드(Harvard) 대학의 달리(Daley) 등은, 피부 세포에 OCT3/4, SOX2, KLF4, C-MYC, hTERT, SV40 large T의 6 유전자를 도입하여 제조한 인공 다능성 줄기세포의 수립에 대하여 보고하고 있다(Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146).

사쿠라다(Sakurada) 등은 체세포가 아닌, 출생 후의 조직에 존재하는 미분화 줄기세포를 세포원으로 하고, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 등을 도입함으로써, 더 효율적으로 유도되는 인공 다능성 줄기세포를 보고하고 있다(일본 특허 공개 제2008-307007호).

이 외에, OCT3/4, KLF4, 저분자 화합물을 마우스 신경 전구 세포 등에 도입하여 제조된 인공 다능성 줄기세포(Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5, 568-574), SOX2, C-MYC를 내인성으로 발현하고 있는 마우스 신경 줄기세포에 OCT3/4, KLF4를 도입하여 제조된 인공 다능성 줄기세포(Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650), C-MYC를 사용하지 않고, Dnmt 저해제나 HDAC 저해제를 이용하여 제조된 인공 다능성 줄기세포(Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797)가 보고되어 있다.

상기를 포함하여, 인공 다능성 줄기세포에 관한 공지된 특허로서는, 일본 특허 공개 제2008-307007호, 일본 특허 공개 제2008-283972호, US2008-2336610, US2009-047263, WO2007-069666, WO2008-118220, WO2008-124133, WO2008-151058, WO2009-006930, WO2009-006997, WO2009-007852 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 「인공 다능성 줄기세포」는, 서두에 기재한 정의를 충족하고, 본 발명의 목적을 손상시키지 않는 한, 공지된 인공 다능성 줄기세포 및 이것과 등가인 인공 다능성 줄기세포의 모두를 포함하고, 세포원, 도입 인자, 도입 방법 등은 특별히 한정되지 않는다.

바람직하게는, 세포원은 인간 유래(인간 인공 다능성 줄기세포)이고, 보다 바람직하게는 당해 세포로부터 분화 유도된 상피계 전구 세포·줄기세포군 또는 각막 상피를 포함하는 상피 세포군, 표피 세포군에 의한 치료를 필요로 하는 환자 자신에게서 유래한다.

(2) 외배엽 계열 세포종

인간의 배는, 발생의 단계에서 3개의 배엽, 즉 내배엽, 중배엽, 외배엽을 형성한다. 즉 내배엽, 중배엽, 외배엽을 형성한다. 이 중 내배엽은, 위나 소장의 점막 상피, 간장, 췌장 등이 되고, 중배엽은 근육, 뼈, 혈관이나 혈액, 피하 조직, 심장, 신장 등이 되고, 외배엽은 신경, 눈, 표피 등을 형성한다. 본 발명에 따른 「외배엽 계열 세포종」은, 외배엽에서 유래되는 세포 계열종, 즉 장래적으로 중추 신경계·감각 기관, 표피, 눈을 형성하는 세포를 의미한다.

「외배엽 계열 세포종」으로서는, 신경 외배엽 계열 세포, 신경능 계열 세포/안배 계열 세포, 눈 표면 외배엽 계열 세포 및 표면 외배엽 계열 세포를 들 수 있다.

「신경 외배엽 계열 세포」는 장래적으로 신경 관련 세포로 분화되는 세포로, Sox2+, TUBB3+, Sox6+ 세포로서 특징지어진다.

「신경능 계열 세포」는 말초 신경 세포, 신경교세포, 색소 세포, 각막 내피세포나 각막 실질 세포 등의 신경능 관련 세포로 분화되는 세포로, sox10 양성, pax6 음성 세포로서 특징지어진다.

「안배 계열 세포」는 망막, 망막 색소 상피, 홍채 색소 상피 등의 안배 관련 세포로 분화되는 세포로, Rx+ 세포로서 특징지어진다.

「눈 표면 외배엽 계열 세포」는, 각막 상피, 결막 상피 등의 눈 표면의 세포로 분화되는 세포로, pax6+, p63+, E-cadherin+ 세포로서 특징지어진다.

(3) 눈 관련 세포

본 발명에 따른 「눈 관련 세포」란, 외배엽에서 유래하는 눈을 형성하는 세포로, 각막 상피 세포, 망막 색소 상피 세포, 신경 망막 세포, 결막 상피 세포, 윤부 상피 세포, 각막 내피 세포, 각막 실질 세포, 홍채 실질 세포, 강막 세포, 홍채 색소 상피 세포, 모양체 상피 세포, 시신경 세포, 윤부하 섬유아세포, 결막하 섬유아세포, 눈물샘, 마이봄샘, 배세포, 렌즈 상피 세포 및 안검 상피 세포 등을 들 수 있다.

(4) 각막 상피 세포 및 각막 상피계 전구 세포

각막은 표면으로부터, 각막 상피층, 각막 실질층, 각막 내피층의 3층 구조를 하고 있다. 「각막 상피 세포」는, 이 각막의 제일 외측의 층을 구성하는 세포로, 4 내지 5층의 각막 상피 세포층으로 구성되어 있다. 「각막 상피 세포」는 표피 외배엽에서 유래되지만, 각막의 실질과 내피는 신경능 유래이고, 각각 개별의 줄기세포가 존재한다고 여겨지고 있다. 본 발명에 있어서 「각막 상피 세포」는, pax6 및 p63에 더하여, 각막 상피 분화 마커인 케라틴 12의 발현에 의해 특징지어진다.

「각막 상피 전구 세포」란, 미분화된 각막 상피 세포이고, pax6 및 p63의 발현에 의해 특징지어지고, 분화 마커인 케라틴 12(K12)는 거의 발현하고 있지 않다.

(5) 세포 마커

본 발명에서는, 분화 유도된 세포를 동정하기 위해서, 각 세포종에 특이적인 마커를 이용한다. 이하, 대표적인 것에 대하여 설명한다.

케라틴 14(Cytokeratin 14: K14): 케라틴 14는 기저 상피 세포의 대표적 마커이다.

p63: p63은 p53 유전자 패밀리에 속하는 세포핵 단백질인데, 상피 전구 세포·줄기세포의 대표적 마커로, 정상 인간 표피 및 모낭 기저 세포 등에서 발현이 확인된다.

케라틴 12(Cytokeratin 12: K12): 케라틴 12 및 3은, 각막 상피의 대표적인 특이적 분화 마커이다.

pax6(Paired homeobox-6): pax6은, 전사 조절 인자로 눈의 형성에 관여하고, 각막 상피를 비롯하여 수정체 상피, 망막 세포의 대표적 마커이다.

MUC16(Mucin 16): MUC16은, 막 결합형 뮤신의 일종으로, 각막 상피 세포에 선택적으로 발현하고 있고, 눈 표면의 뮤신층의 유지 및 배리어 기능 발현에 중요한 역할을 갖고 있다.

2. 다능성 줄기세포의 자율적 분화

본 발명에 있어서는, 먼저 다능성 줄기세포를 자율적으로 분화시켜, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 형성시킨다. 「자율적 분화(자율적으로 분화)」란, 분화 유도제나 분화 유도 촉진제 등의 외부로부터 자극을 받는 일 없이, 세포가 스스로 분화되는 것을 의미한다.

(1) 배지

본 발명에서는 무혈청 배지를 사용하여 배양을 행한다. 「무혈청 배지」란, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미하고, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 증식 인자)이 혼입되어 있는 배지는 무혈청 배지에 해당한다.

분화 배지의 기본 배지로서는 DMEM 배지, BME 배지, α MEM 배지, 무혈청 DMEM/F12 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, 글래스고(Glasgow) MEM 배지, 개량 MEM 아연 선택(Improved MEM Zinc Option) 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, 이글(Eagle) MEM 배지, 햄 배지, RPMI 1640 배지, 피셔(Fischer's) 배지, 맥코이(McCoy's) 배지, 윌리암스 E 배지 등, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지라면 모두 사용할 수 있지만, KnockOut^TMDMEM, Medium 154, StemPro(등록 상표) hESC SFM 등의 줄기세포용 배지가 바람직하다.

유지용의 기본 배지로서는, 동물·인간 유래 성분을 포함하지 않는 다능성 줄기세포용의 배지가 보다 바람직하고, 그러한 배지로서는 mTeSR^TM1(일본 BD사), StemFit(등록 상표) 등의 시판의 배지를 사용할 수도 있다.

배지는 「혈청 대체물」을 포함하고 있어도 된다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어 알부민(예를 들어, 지질 풍부 알부민), 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소(예를 들어 아연, 셀레늄), B-27(등록 상표) 서플리먼트(supplement), N2 서플리먼트, 녹아웃 혈청 대체물(KSR: Invitrogen사제), 2-머캅토에탄올, 3' 티올글리세롤 등을 들 수 있다. 배지 중의 농도는, B-27 서플리먼트의 경우, 0.01 내지 10중량％, 바람직하게는 0.5 내지 4중량％이다.

배지에는, 세포의 유지 증식에 필요한 각종 영양원이나 분화 유도에 필요한 각 성분을 적절히 첨가해도 된다. 예를 들어, 영양원으로서는 글리세롤, 글루코오스, 과당, 자당, 유당, 벌꿀, 전분, 덱스트린 등의 탄소원, 또한, 지방산, 유지, 레시틴, 알코올류 등의 탄화수소류, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 요소, 질산나트륨 등의 질소원, 식염, 칼륨염, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등의 무기 염류, 인산1칼륨, 인산2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 몰리브덴산나트륨, 텅스텐산나트륨 및 황산망간, 각종 비타민류, 아미노산류 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서는, 다능성 줄기세포는 외배엽계 세포종으로 자율적으로 분화되기 때문에, 배지는 BMP4(Bone morphogenetic protein 4), 트랜스포밍 증식 인자 및 액티빈과 같은 분화 유도제를 포함할 필요가 없다. 즉, 배지는, 상기 분화 유도제의 1 이상, 바람직하게는 2 이상, 보다 바람직하게는 모두를 실질적으로 포함하지 않는다. BMP4의 경우 0.5nM 미만 정도라면 포함하고 있어도 되지만, 전혀 포함하지 않는 것이 바람직하다.

또한, 배지는 고농도 레티노산, BMP 저해제, TGFβ 저해제 및 Noggin과 같은 분화 유도 촉진제를 포함할 필요도 없다. 또한, 고농도 레티노산이란, 1μM, 특히 10μM 정도의 레티노산을 의미한다. 즉, 상기 분화 유도 촉진제의 1 이상, 바람직하게는 2 이상, 보다 바람직하게는 모두 포함하지 않는다. 또한, 배지는 Wnt, Wnt 시그널 활성화제, 코르딘(Chordin) 등도 포함할 필요가 없다.

상기의 성분을 배합하여 얻어지는 배지의 pH는 5.5 내지 9.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0, 보다 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 범위이다.

(2) 배양 조건

본 발명에서는 피더 세포를 사용하지 않고 다능성 줄기세포를 2차원 배양한다. 용기는, 세포 배양에 사용되는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 보틀을 사용할 수 있다.

용기의 내표면은 세포의 접착이나 신전을 촉진하기 위해서, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트, 비트로넥틴, 기저막 매트릭스, 젤라틴, 히알루론산, 폴리리신, 비트로넥틴 및 히알루론산으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 코팅되어 있는 것이 바람직하다. 그 중에서도, 라미닌, 라미닌 E8 프래그먼트나 라미닌 511E8 프래그먼트와 같은 라미닌 프래그먼트를 사용하는 것이 보다 바람직하다.

배양은 36℃ 내지 38℃, 바람직하게는 36.5℃ 내지 37.5℃에서, 1％ 내지 25％ O₂, 1％ 내지 15％ CO₂의 조건 하에서 행해진다.

자율적 분화를 위한 배양 기간은, 길어야 1주 내지 8주간, 바람직하게는 2주 내지 6주간, 보다 바람직하게는 3주간 내지 5주간이다.

(3) 콜로니 형성

무혈청 배지에서 피더 세포를 사용하지 않고 2차원 배양된 다능성 줄기세포는, 자율적으로 분화되어서 외배엽계 세포종으로 구성되는 층상의 콜로니를 형성한다. 콜로니는, 중심부로부터 주변부를 향하여, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하고, 제1층(신경 외배엽 계열 세포(Sox2+, TUBB3+, Sox6+)), 제2층(신경능 계열 세포/안배 계열 세포(pax6+, Sox10+, Rx+)), 제3층(눈 표면 외배엽 계열 세포(pax6+, p63+, E-cadherin+)) 및 제4층(표면 외배엽 계열 세포(p63+, Ecadherin+))을 포함한다.

3. 콜로니로부터의 눈 관련 세포의 분화 유도

다능성 줄기세포의 자율적 분화에 의해 형성된 콜로니는, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하고, 제1층(신경 외배엽 계열 세포), 제2층(신경능 계열 세포/안배 계열 세포), 제3층(눈 표면 외배엽 계열 세포) 및 제4층(표면 외배엽 계열 세포)으로 구성되는 층상의 세포군으로 구별된다. 콜로니의 각 층에 포함되는 세포종은 다른 계열이기 때문에, 이것을 이용하여, 특정한 층에 포함되는 세포를 분리(단리)하고, 분화 유도함으로써, 목적으로 하는 눈 관련 세포를 얻을 수 있다.

즉, 본 발명은 전항에 기재한 방법으로 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 제조하고, 상기 콜로니로부터 특정한 층에 포함되는 세포를 분리하고, 상기 세포를 눈 관련 세포로 분화 유도하는 것을 포함하는, 눈 관련 세포의 제조 방법도 제공한다.

예를 들어, 결막 상피 세포의 경우, 각막 상피의 경우와 마찬가지로, 제3층 세포의 눈 표면 상피 세포 계열로부터 분화시킨다. 각막 상피 분화 배지에서 배양 후에, FACS를 사용하여 SSEA4 음성, ITGB4 양성 세포로서 단리되는 세포 중에 pax6 양성, K13 양성, K12 음성 세포로서 결막 상피 세포를 단리하는 것이 가능하다.

망막 색소 상피 세포는 신경 외배엽에서 유래되는 세포이기 때문에, 분화 유도 중에 있어서 1-2층에 색소를 가진 부석 상피 세포로서 관찰하는 것이 가능하다. 색소 세포는 현미경 아래에서 눈으로 보아 단리하는 것이 가능하여, 픽업한 색소 상피 콜로니를, 예를 들어 젤라틴 코팅한 배양 접시 상에 있어서 10％ FBS를 포함하는 DMEM 등의 배지에서 단리 배양하는 것이 가능하다.

신경능 세포의 경우, 분화 유도의 초기(2주간 정도)에 제2층에 출현하고 있기 때문에, 2주 이후에, 세포를 회수하고, FACS에 의해 p75NTR 및 ITGA4와 같은 신경능 세포 마커를 사용하여 단리하는 것이 가능하다. 얻어진 신경능 세포는 각막 내피 세포로 분화 유도하는 것이 가능하다. 또한, 초기 신경능 세포는 배양을 계속함으로써 눈 주위 신경능 세포로 유도된다. 눈 주위 신경능 세포는, PITX2, FOXC1 등의 눈 주위 신경능 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다.

4. 다능성 줄기세포로부터의 각막 상피 세포의 분화 유도

각막 상피로 분화될 수 있는 상피 전구 세포는, 콜로니의 제2층과 제3층에 존재하고, 특히 각막 상피 전구 세포는 제3층(눈 표면 외배엽 계열 세포)에 존재한다. 따라서, 제3층의 눈 표면 외배엽 계열 세포를 각막 상피 전구 세포로 분화 유도하고, 이것을 단리하여, 성숙 배양함으로써 각막 상피 세포를 얻을 수 있다.

구체적으로 말하면, 다능성 줄기세포로부터 자율적 분화에 의해 동심원상의 콜로니를 형성시킨 후, 성장 인자를 포함하는 상피용 분화 배지에 교환하여 배양한다. 이에 의해, 제3층에 pax6+, p63+, E-cadherin+로 특징지어지는 눈 표면 상피 줄기세포가 출현한다.

이 눈 표면 상피 줄기세포를, 피펫팅 등에 의해 분리하고, 또한 각막 상피 배양용 배지에서 배양하고, 각막 상피 전구 세포로 분화 유도한다. 계속해서, 각막 상피 전구 세포를 FACS 등을 사용하여 단리하고, 성숙 배양하여 각막 상피 세포를 얻는다.

분화 유도의 어느 공정에 있어서도, 배양은 무혈청 배지에 의해 피더 세포를 사용하지 않고 행한다. 이하, 배지와 배양 조건에 대하여 설명한다.

(1) 배지

(1-1) 상피용 분화 배지

상피용 분화 배지는, 상피계 줄기세포로의 분화를 촉진하기 위해서, KGF, Rock 저해제, bFGF, 혈청 대체물 등의 성장 인자를 포함한다. 기본 배지는, 자율적 분화에서 사용한 DMEM 배지, BME 배지, α MEM 배지 등, 상피 세포의 배양에 사용할 수 있는 배지(무혈청 배지)이면 모두 사용할 수 있다. 또한, KnockOut^TMDMEM, Medium 154, StemPro(등록 상표) hESC SFM 등의 줄기세포용 배지나 CNT20, Cnt50, CnT-PR, KSFM 등 상피 세포 배양 배지, 또는 이들을 혼합한 배지가 바람직하다. 후술하는 실시예에서는, 50％의 자율 분화용 무혈청 배지와 50％의 Cnt20 또는 CntPR을 혼합하여 사용하였다.

(1-2) 각막 상피 배양용 배지

각막 상피 배양용 배지는, 각막 상피 전구 세포로의 분화 유도를 촉진시키기 위해서, KGF, Rock 저해제 및 혈청 대체물(예를 들어, B27-supplement 등)을 포함할 수 있다. 또한, FGF2, 인슐린, 트랜스페린을 포함하고 있어도 된다. 또한, 「ROCK 저해제」란, Rho 키나아제(ROCK: Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase)를 저해하는 물질을 의미하고, 예를 들면 N-(4-피리디닐)-4β-[(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1α-카르보아미드(Y-27632), Fasudil(HA1077), (2S)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]헥사히드로-1H-1,4-디아제핀(H-1152), 4β-[(1R)-1-아미노에틸]-N-(4-피리딜)벤젠-1젠카르보아미드(Wf-536), N-(1H-피로로[2,3-b]피리딘-4-일)-4PER(R)-1-아미노에틸]시클로헥산-1로헤카르보아미드(Y-30141), N-(3-{[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시}페닐)-4-{[2-(4-모르폴리닐)에틸]-옥시}벤즈아미드(GSK269962A), N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-6-메틸-2-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-3,4-디히드로-1H-피리딘-5-카르복사미드(GSK429286A)를 이용할 수 있다.

기본 배지로서는, 상피용 분화 배지와 동일한 것을 사용할 수 있다.

(1-3) 성숙 배양용 배지

각막 상피는, 상기한 각막 상피 배지를 사용하여 중층화·성숙화할 수 있지만, 최후 1주간 정도, 혈청을 포함하는 성숙 배양용 배지를 사용하여 배양하면 중층화, 성숙화가 보다 촉진된다. 상기 성숙 배양용 배지는 혈청(필요에 따라), KGF, Rock 저해제, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 포함하는 것이 바람직하다. 기본 배지로서는, 각막 상피 배양 배지와 동일한 것을 사용할 수 있다.

어느 배지(상피용 분화 배지, 각막 상피 배양용 배지, 성숙 배양용 배지)는 「혈청 대체물」을 포함하고 있어도 된다. 혈청 대체물로서는, 전항에서 기재한 것과 같은 것, 예를 들어 알부민(예를 들어, 지질 풍부 알부민), 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소(예를 들어 아연, 셀레늄), B-27(등록 상표) 서플리먼트, N2 서플리먼트 등을 들 수 있다. 배지 중의 농도는, B-27 서플리먼트의 경우, 0.01 내지 10중량％, 바람직하게는 0.5 내지 4중량％이다.

또한, 배지에는, 세포의 유지 증식에 필요한 각종 영양원이나 분화 유도에 필요한 각 성분을 적절히 첨가해도 된다. 예를 들어, 영양원으로서는 글리세롤, 글루코오스, 과당, 자당, 유당, 벌꿀, 전분, 덱스트린 등의 탄소원, 또한, 지방산, 유지, 레시틴, 알코올류 등의 탄화수소류, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 요소, 질산나트륨 등의 질소원, 식염, 칼륨염, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등의 무기염류, 인산1칼륨, 인산2칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 몰리브덴산나트륨, 텅스텐산나트륨 및 황산망간, 각종 비타민류, 아미노산류 등을 포함할 수 있다.

(2) 배양 조건

어느 공정도, 피더 세포를 사용하지 않고 배양을 행한다. 용기는, 세포 배양에 사용되는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 보틀을 사용할 수 있다.

배양 기간은, 눈 표면 상피 줄기세포를 분화 유도하기 위한, 상피용 분화 배지에서의 배양은 적어도 1주 내지 8주간, 바람직하게는 2주 내지 6주간, 보다 바람직하게는 3주간 내지 5주간이다.

각막 상피 전구 세포를 분화 유도하기 위한, 각막 상피 배양용 배지에서의 배양은 적어도 1주 내지 12주간, 바람직하게는 1주 내지 8주간, 보다 바람직하게는 2주 내지 6주간이다.

각막 상피 전구 세포를 단리 후의 각막 상피 배양용 배지에 있어서의 중층화·성숙 배양에는 적어도 4일간, 바람직하게는 1주간 이상, 보다 바람직하게는 2주간 내지 3주간이다.

(3) 각막 상피 전구 세포의 단리

각막 상피 전구 세포는, 통상의 방법에 따라 각 마커에 특이적인 항체를 사용하여 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 항체로 표지된 자기 비즈, 항체를 고상화한 칼럼, 형광 표지된 항체를 사용한 셀 소터(FACS)에 의한 분리를 사용하여 단리하면 된다. 항체는, 시판하는 것을 이용해도 되고, 통상의 방법에 따라 제조해도 된다.

예를 들어, 각막 상피 전구 세포는 ITGβ4 및/또는 SSEA4의 발현을 지표로 하여, FACS 등에 의해 간편하게 단리할 수 있다. 바람직하게는 ITGβ4, SSEA4에 의한 양성 선택 전에, TRA-1-60 또는 CD200에 의한 음성 선택을 행하는 것이 바람직하다. 또한, SSEA4 및 CD200을 각막 상피 전구 세포의 단리에 이용할 수 있는 것은, 본 발명에서 처음으로 알아내었다. SSEA4(Stage-Specific Embryonic Antigen-4)는 기형종, 인간의 배성 생식 세포(EG), 인간 ES 세포 외, 간엽계 줄기세포, 적혈구 등에 발현하는 것이 알려져 있다. SSEA4는 분화에 따라서 인간 ES 세포 상의 발현이 낮아지므로, 인간 ES 세포 분화 모니터링에 의한 평가에 폭넓게 사용되고 있다. CD200은, 지금까지 다능성 줄기세포에 발현하고 있는 것이나, 각막 상피에 발현하고 있지 않은 것 등은 알려져 있지 않고, 기지의 TRA-1-60보다 폭넓게 불순물을 제거할 수 있는 매우 우수한 마커이다.

각막 상피 전구 세포를 각막 상피 배양용 배지 중에서 배양을 계속하면, 결막배 세포 및 눈물샘 세포로 분화될 수 있다. 결막배 세포는, 결막배 세포 마커인 MUC5AC나 K7의 발현에 의해 확인할 수 있다. 눈물샘 세포는, 눈물샘·타액샘의 마커인 AQP5, LTF, MUC7의 발현에 의해 확인할 수 있고, 3차원 배양을 행함으로써 샘 조직을 구축할 수 있다.

(4) 각막 상피 세포의 특성

각막 상피 전구 세포를 성숙 배양함으로써, 이식 가능한 중층화한 각막 상피 세포가 얻어진다. 얻어진 각막 상피 세포는 K12, pax6 및 p63 양성이며, 체세포 유래의 각막 상피 세포와 마찬가지로 in vitro 및 in vivo에서 각막 상피로서 기능한다. 본 발명은 이 K12, pax6 및 p63으로 특징지어지는, 다능성 줄기세포, 특히 인공 다능성 줄기세포 유래의 기능적인 각막 상피 세포도 제공한다.

5. 재생 의료로의 이용

5.1 세포 제제

본 발명의 방법에 의해 얻어진 신경 외배엽 계열 세포, 신경능 계열 세포/안배 계열 세포, 눈 표면 외배엽 계열 세포 및 표면 외배엽 계열 세포, 또는, 상기 세포로부터 분화 유도된 눈 관련 세포는 그 자체, 연구, 재생 의료 또는 후술하는 세포 제제의 원료로서 이용할 수 있다.

본 발명의 세포 제제는, 세포의 유지·증식, 환부로의 투여를 보조하는 기판 재료나 성분, 다른 의약적으로 허용할 수 있는 담체를 포함하고 있어도 된다. 세포의 유지·증식에 필요한 성분으로서는 탄소원, 질소원, 비타민, 미네랄, 염류, 각종 사이토카인 등의 배지 성분, 또는 마트리겔 TM 등의 세포외 매트릭스 제조품을 들 수 있다.

환부로의 투여를 보조하는 기판 재료나 성분으로서는, 생분해성 중합체; 예를 들어, 콜라겐, 폴리락트산, 히알루론산, 셀룰로오스 및 이들의 유도체, 및 그 중 2종 이상을 포함하는 복합체, 주사용 수용액; 예를 들어 생리 식염수, 배지, PBS 등의 생리 완충액, 포도당이나 그 외의 보조제를 포함하는 등장액(예를 들어 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨) 등을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면 활성제, 예를 들어 폴리소르베이트 80, HCO-50 등과 병용해도 된다.

그 외, 필요에 따라, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 크산탄검, 아라비아 고무, 카제인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약 첨가물로서 허용되는 계면 활성제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제 등을 포함하고 있어도 된다.

실제의 첨가물은, 본 발명의 치료제의 제형에 따라서 상기 중에서 단독으로 또는 적절히 조합하여 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 항체를 용제, 예를 들어 생리 식염수, 완충액, 포도당 용액 등에 용해하고, 이것에 흡착 방지제, 예를 들어 Tween80, Tween20, 젤라틴 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 세포 제제의 대상이 될 수 있는 질환으로서는, 예를 들어 스티븐슨-존슨(Stevens-Johnson) 증후군, 안류 천포창, 열·화학 외상, 무홍채증, 잘츠만(Salzmann) 각막 변성증, 특발성 각결막 상피증, 트라코마 후 반흔, 각막 천공, 각막 주변부 궤양, 엑시머 레이저 치료 후의 각막 상피 박리를 들 수 있다.

5.2 배양 각막 세포 시트

본 발명의 방법으로 얻어진 상피계 전구 세포군, 및/또는 상기 세포군에서 분화 유도된 각막 상피 세포군을 중층화하여 배양 각막 상피 세포 시트를 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 피더 세포를 사용하지 않고, 무혈청 배지를 사용하여, 중층화한 시트 형상의 각막 상피 세포를 간편하게 얻을 수 있다. 얻어진 세포는, 케라틴 12나 pax6, MUC16과 같은 각막 상피 세포에 특이적인 마커를 유지하고, 체세포 유래의 각막 상피 세포와 동일한 기능을 갖는다. 또한, 동물 유래의 피더 세포나 혈청을 사용하지 않고 제조되기 때문에, 안전성이 높고, 임상 응용에 적합하다. 본 발명은 이 K12, pax6 및 MUC16 양성으로 특징지어지는, 다능성 줄기세포, 특히 인공 다능성 줄기세포 유래의 기능적인 중층화 각막 상피 세포 시트와 그의 제법도 제공한다.

실시예

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간 iPS 세포로부터의 눈 표면 상피·각막 상피 세포로의 분화 유도

인간 iPS 세포로부터, 무혈청 배지에서 피더 세포를 사용하지 않고 눈 표면 상피·각막 상피 세포를 분화 유도하였다. 분화 유도 방법의 스킴을 도 1에 도시한다.

인간 iPS 세포는 201B7 세포주(섬유아세포에 Oct3/4, OX2, c-Myc, Klf4를 도입하여 제조된 iPS 세포주)를 사용하고, StemFit(아지노모또사제)를 사용하여, 라미닌 511E8 프래그먼트로 코팅한 6 웰 플레이트(well plate) 상에, 200-1500cells/㎠, 300-1000 cells/㎠, 450-700 cells/㎠의 파종 밀도로 세포를 파종하고, 7-13일간 배양하였다.

배지를 분화 배지(10％ KSR, 1 mM 피루브산나트륨(sodium pyruvate), 0.1 mM 비-필수 아미노산(non-essential amino acids), 55㎛ 모노티오글리세롤(Monothioglycerol)을 포함하는 GMEM)로 교환하고, 그 후 2, 3일에 1회 신선한 분화 배지로 교환하여, 약 4주간 배양하였다.

4주째 이후, 배지를, 성장 인자를 포함하는 상피용 분화 배지로 교환하고, 또한 4주간 배양하였다. 상피용 분화 배지(20ng/ml KGF, 5 ng/ml FGF2, 10μM Y27632를 포함하는 50％ 분화 배지와 50％ Cnt20(또는 CntPR; EGF/FGF2 프리(free)(CELLnTEC사))로 교환 후 2-3주간 정도의 시점에서, 피펫팅 작업에 의해 비상피성 세포를 제거함으로써, 제3층의 눈 표면 상피 세포만을 선택적으로 배양하였다. 4주간의 배양 후, 각막 상피 배양 배지로 교환하여 4주간 배양한 후, FACS에 의해 각막 상피 전구 세포를 단리하였다. 단리된 각막 상피 전구 세포는 추가로 각막 상피 배양 배지(20 ng/ml KGF, 10μM Y27632, 2％ B27-supplement를 포함하는 DMEM/F12(2:1))에서 2-3주간 배양을 행하여 중층화한 배양 각막 상피 세포 시트를 제조하였다. 또한, 필요에 따라, 1-2주간의 각막 상피 배양 배지에서의 배양 후, 혈청을 포함하는 성숙 배양용 배지(20 ng/ml KGF, 10μM Y27632, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 및 5％ FBS를 포함하는 DMEM/F12(3:1))로 교환하여 1주간 정도의 배양을 행하고, 동일한 배양 각막 상피 세포 시트를 제조하는 것도 가능하였다.

분화 배양 4주간 정도에서, 다층 형상으로 관찰되는 외배엽 계열의 세포가 유도되어, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니가 형성되었다(도 2).

콜로니를 구성하는 각 층의 세포 특성을 조사하였다(도 3). 콜로니는 층상으로 동심원상으로 분화되고, 각 층에는 다른 계열의 세포가 존재하고 있었다. 즉, 1-3층은 pax6 양성, 3-4층은 p63, E-cadherin 양성, TUBB3은 1-2층에서 양성이었다.

제2층의 내층에 CHX10 양성의 신경 망막이, 외층으로부터는 MITF 양성의 망막 색소 상피 세포가 출현하여, 픽업하여 배양함으로써 색소를 갖는 부석상 세포로서 단리 가능하였다. 신경능 세포는 분화 초기(2주째)에 있어서 p75, SOX10 공양성 세포로서, 2층 부분에 출현하고 있었다(도 4). 2-3층의 사이에는 α크리스탈린을 발현하는 렌즈 세포가 출현하는(4주, 6주) 것이 확인되었다(도 4).

각 층에 있어서의 마커 발현을 RT-PCR에 의해 조사하였다(도 5). 제3층으로부터 각막 상피의 기원이 되는 눈 표면 상피 외배엽(pax6+, p63+, Ecad+)이 출현하고 있었다.

또한, 분화 유도 기간 중에 있어서의 각막 상피 관련 마커(K12, K14, p63, pax6)의 발현 패턴(분화 1-12주)을 면역 염색으로 확인한 바(도 6), 마우스 눈 발생(E9.5-18.5)에 있어서의 각막 상피 관련 마커 발현(도 7)과 매우 유사하여, iPS 세포로부터의 눈 표면 상피·각막 상피의 유도는, 실제의 각막 발생 과정과 동일한 프로세스를 거쳐서 일어나고 있는 것이 확인되었다.

이상에서, 본 배양 방법에 의해, 인간 다능성 줄기세포로부터 눈 표면 상피 세포를 포함하여 눈에 관련하는 세포군(망막, 렌즈, 신경능 세포 등)이 생리적인 발생 과정을 모방한 형태로 유도하는 것이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 인간 iPS 세포로부터의 각막 상피 전구 세포의 분화 유도

실시예 1에 따라서 인간 iPS 세포의 자율적 분화(4주간)에 의해 형성된 동심원상의 콜로니를, 4주째 이후 성장 인자를 포함하는 상피용 분화 배지로 교환하고, 제3층에 출현하는 눈 표면 상피 줄기세포를 피펫팅에 의해 비상피성 세포를 제거함으로써 단리하였다. 또한, 8주째 이후, 각막 상피 배양 배지로 교환하여, 각막 상피 전구 세포로의 분화 유도를 행하였다.

분화 유도 약 12주째, TRA-1-60, SSEA4 및 ITGB4 등의 세포 표면 마커를 사용하여 FACS를 행하였다(도 8). 각막 상피 전구 세포는 TRA-1-60, SSEA4 및 ITGB4 발현에 의해 단리 가능한 것, 또한, TRA-1-60 음성 세포 중, ITGB4 양성, SSEA4 양성(P3 분획) 및 ITGB4 양성, SSEA4 음성(P2 분획)으로 선택적으로 확인되는 것이 확인되었다(도 8 우측).

또한, 면역 염색의 결과, P3 분획의 세포는, 각막 상피 특이적 마커를 발현하고, 한편, 점막 상피, 피부 상피 마커의 발현은 낮은 것을 알 수 있었다(도 9). 이것으로부터, P3 분획에는 각막 상피 세포가 단리되어 있고, P2 분획에는 결막 상피나 그 외의 중층 상피 세포가 포함되는 것이 확인되었다(도 10).

P3 분획으로부터 단리한 세포를, 각막 상피 배양 배지를 사용하여 성숙 배양 2 내지 3주간 행함으로써, 중층화한 각막 상피 세포가 얻어졌다. 면역 염색의 결과, 얻어진 세포는 각막 배리어 기능에 필수적인 마커 ZO-1, MUC1, MUC4, MUC16을 발현하고 있었다(도 11의 B). 또한, FACS 해석의 결과, K14 양성 세포 순도는 약 99％, 각막 상피 분화 마커 K12의 양성률은 약 60％를 나타내었다(도 11의 C).

실시예 3: 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포 시트의 집토끼 눈으로의 이식

집토끼의 각막 윤부 전체 둘레의 상피 세포층을 각막 절제 방법에 의해 제거하여, 집토끼 각막 상피 줄기세포 피폐증 모델을 제조하였다. 그 후, 시트 형상으로 회수한 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포 시트를 이식하였다.

(1) 눈 표면 관찰상

이식 후 7일째에는, 시트 이식군에 있어서는 각막 투명성이 유지되고 있고, 플루오레세인 염색에 의해 배리어 기능이 회복되어 있는 것이 나타났다. 한편, 대조 눈에서는 대부분이 플루오레세인으로 염색되고, 배리어 기능 부전의 상태 그대로였다(도 12 중).

(2) 이식 후의 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포 시트

수술 후 7일째에 안락사시켜, 안구 적출 후 10％ 중성 완충 포르말린액으로 화학 고정을 행하였다. 그 후 헤마톡실린 & 에오신 염색에 의해 각막 조직을 관찰하였다. 인간 iPS 세포 유래 각막 상피 세포 시트는 동물 눈에 이식 후도, 각막 실질면에 생착하고 있었다. 동결 절편을 사용한 면역 염색 해석에 있어서는, 항인간(H2B) 항체에 의해, 집토끼 눈에 생착하고 있는 상피층이 인간 iPS 세포 유래인 것이 확인되고, K12, pax6, p63, MUC16을 발현하고 있고, 각막 상피의 성질을 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 12 우측).

실시예 4: 인간 iPS 세포로부터의 결막배 세포 모양 세포 및 눈물샘 모양 세포의 분화 유도

각막 상피 전구 세포의 분화 유도 후, 또한 2-3일마다 배지를 교환하면서, 각막 상피 배양 배지 중에서 배양을 계속하였다. 분화 유도로부터 약 12주째, 각막 상피 배양용 배지 중에 PAS 양성, PAX6 양성의 세포 집단이 상피 모양 세포 집단 중에 출현하였다. PAS 염색 및 면역 염색의 결과, 이들 세포는 결막배(고블릿) 세포 마커인 MUC5AC, K7을 발현하고 있는 것이 확인되었다(도 13의 A).

마찬가지로, 각막 상피 세포의 분화 유도 후, 배지를 교환하면서 각막 상피 배양 배지 중에서 배양을 계속하였다. 분화 유도로부터 약 12주째, 각막 상피 배양용 배지 중에 샘 모양 구조를 나타내는 세포 응집체가 출현하였다. 이 샘 모양 조직을 현미경 하에서 채취하고, 5％ FBS, EGF 및 Wnt3awp를 포함하는 KCM 배지 또는 2％ B27 함유 DMEM/F12 배지를 사용하여, 마트리겔(등록 상표) 중에서 3차원 배양을 행한 바, 약 25일간에 샘 조직으로 성장하였다. 이 샘 조직을 면역 염색에 의해, 눈물샘·타액샘의 마커인 AQP5, LTF, MUC7, PAX6 및 SOX9의 발현이 확인되었다(도 13의 B).

이상으로부터, 인간 다능성 줄기세포로부터 유도한 눈 표면 상피 줄기·전구 세포는, 각막 상피뿐만 아니라, 각막 상피와 발생 기원이 같다고 생각되는, 결막 상피 세포, 결막배 세포 및 눈물샘 세포로의 분화가 가능한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 인간 iPS 세포로부터의 눈 주위 신경능 세포의 분화 유도

실시예 1에 따라서 인간 iPS 세포를 분화 배지에서 자율적으로 분화시켜(4주간), 동심원상의 콜로니(다층 구조체)를 분화 유도하였다. 분화 유도로부터 3주째에 있어서, PITX2 양성, AP2b 양성의 세포 덩어리(눈 주위 신경능 세포)가 2층째를 중심으로 유도되었다.

세포 덩어리는, 분화 배지에 EGF, FGF2(1-3주간), 저농도(0.5μM)의 레티노산(2-3주간)을 첨가한 배지에서 배양한 경우에도 유도 가능하였다.

RT-PCR에 의해, 마커 유전자의 발현을 분화 배양 개시로부터 9일째, 14일째, 21일째, 28일째, 35일째에 있어서 확인하였다. 그 결과, 초기 신경능 마커 SOX10이 4주간에 소실한 후, PITX2, FOXC1 등 눈 주위 신경능 마커의 발현이 유도되고 있는 것이 확인되었다. 따라서, 인간 iPS 세포 유래의 초기 신경능 세포는 눈 주위 신경능 세포로 유도되는 것이 나타났다.

이상으로부터, 본 발명에 의해 유도되는 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 사용하여, 신경능 세포, 나아가 각막 내피나 홍채 실질 세포의 발생 기원이 되는 눈 주위 신경능 세포를 유도 가능하였다. 또한, EGF, FGF 또한 저농도(0.5μM)의 레티노산을 분화 배지 중에 첨가함으로써, 제2층의 망막 세포의 성장이 촉진되고, 또한 레티노산 시그널이 가해짐으로써, 눈 주위 신경능 세포의 유도가 촉진되었다고 생각된다. 눈 주위 신경능의 발생에는, 망막 세포에서 유래되는 레티노산 시그널이 중요하다고 생각되고 있고, 본 배양계가 그 발생을 모방하고 있다고 생각되었다.

실시예 6: 인간 iPS 세포로부터 유도한 각막 상피 전구 세포의 단리

실시예 1에 따라서 인간 iPS 세포를 분화 배지에서 자율적으로 분화시켜, 동심원상의 콜로니(다층 구조체)를 분화 유도하였다. 분화 유도로부터 14주째에 있어서, CD200, SSEA4, ITGβ4를 세포 표면 마커로서 FACS를 행하였다.

CD200 양성 세포를 게이팅에 의해 제외하고, CD200 음성 세포 중에서 SSEA4 양성, ITGβ4 양성 세포(P3 분획)를 각막 상피 전구 세포로서 단리하는 것이 가능하였다. 단리한 세포는 중층화하여, K12, p63, PAX6을 발현하고, 분화된 각막 상피 세포의 특징을 나타내었다(도 15).

이상으로부터, iPS 세포로부터 유도한 각막 상피 전구 세포는 CD200, SSEA4, ITGβ4를 사용하여 순화할 수 있는 것이 확인되었다. CD200은, 지금까지 다능성 줄기세포에 발현하고 있는 것이나, 각막 상피에 발현하고 있지 않은 것 등은 알려져 있지 않고, 기지의 TRA-1-60보다 폭넓게 불순물을 제거할 수 있는, 매우 우수한 마커라고 생각된다.

본 발명에 따르면, 이식 가능하고, 중층화한 기능적이고 또한 고순도의 각막 상피 세포가 얻어진다. 본 발명의 방법은, 동물 유래의 피더 세포나 혈청을 사용하지 않기 때문에, 얻어지는 세포는 안전성이 높고, 임상 응용에 적합하다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 각막 상피뿐만 아니라, 결막 상피 등의 눈 표면을 구성하는 여러 가지 세포도 인간 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포로부터 제조할 수 있다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 도입하는 것으로 한다.

Claims

다능성 줄기세포를, 무혈청 배지에서 피더 세포를 사용하지 않고 2차원 배양함으로써, 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층이 다능성 줄기세포의 자율적 분화에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 무혈청 배지가, 0.5nM 이상의 BMP4[뼈 형성 단백질(Bone morphogenetic protein 4)], 트랜스포밍 증식 인자 및 액티빈을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 무혈청 배지가, 추가로, 고농도 레티노산, BMP 저해제, TGFβ 저해제 및 노긴(Noggin)으로부터 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기세포를, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 또는 라미닌 프래그먼트, 비트로넥틴, 기저막 매트릭스, 젤라틴, 히알루론산, 폴리리신, 비트로넥틴 및 히알루론산으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로 코팅된 용기를 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 콜로니가, 각각 신경 외배엽 계열 세포, 신경능 계열 세포/안배 계열 세포, 눈 표면 외배엽 계열 세포 및 표면 외배엽 계열 세포로 구성되는 층을 포함하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 제조하는 공정,
상기 콜로니로부터 특정한 층에 포함되는 세포를 분리하는 공정,
상기 세포를 눈 관련 세포로 분화 유도하는 공정
을 포함하는, 눈 관련 세포의 제조 방법.
제7항에 있어서, 눈 관련 세포가, 각막 상피 세포, 망막 색소 상피 세포, 신경 망막 세포, 결막 상피 세포, 윤부 상피 세포, 각막 내피 세포, 각막 실질 세포, 홍채 실질 세포, 강막 세포, 홍채 색소 상피 세포, 모양체 상피 세포, 시신경 세포, 윤부하 섬유아세포, 결막하 섬유아세포, 눈물샘, 마이봄샘, 배세포, 렌즈 상피 세포 및 안검 상피 세포로부터 선택되는 어느 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니를 제조하는 공정,
성장 인자를 포함하는 배지에서 상기 콜로니를 배양하는 공정,
눈 표면 외배엽 계열 세포로 구성되는 층에 포함되는 세포를 분리하고, KGF, Rock 저해제 및 혈청 대체물을 포함하는 배지에서 배양하여, 각막 상피 전구 세포로 분화 유도하는 공정,
각막 상피 전구 세포를 단리하고, 각막 상피 세포로 분화 유도하는 공정
을 포함하는, 각막 상피 세포의 제조 방법.
제9항에 있어서, ITGβ4, SSEA4, TRA-1-60 및 CD200으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 마커의 발현 유무를 지표로 하여 각막 상피 전구 세포를 단리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항 또는 제10항에 기재된 방법으로 제조되는 각막 상피 세포이며, K12, pax6 및 p63 양성인 것을 특징으로 하는 각막 상피 세포.
제9항 또는 제10항에 기재된 방법으로 각막 상피 세포를 제조하는 공정, 얻어진 각막 상피 세포를 추가로 중층화 배양하는 공정을 포함하는, 각막 세포 시트의 제조 방법.
다능성 줄기세포 유래의 각각 다른 외배엽계 세포종으로 구성되는 동심원상의 층을 포함하는 콜로니.
제13항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는, 콜로니.
다능성 줄기세포 유래의 중층화 각막 상피 세포 시트이며, 각막 상피 세포가 K12, pax6 및 MUC16 양성인 것을 특징으로 하는 중층화 각막 상피 세포 시트.
제13항 또는 제14항에 기재된 콜로니의 눈 표면 외배엽 계열 세포로 구성되는 층에 포함되는 세포를 분리·배양하여 제조되는 다능성 줄기세포 유래의 각막 상피 세포이며, K12, pax6 및 p63 양성인 것을 특징으로 하는 각막 상피 세포.