CN113736735B - 体外诱导类角膜缘干细胞的方法及试剂盒 - Google Patents

体外诱导类角膜缘干细胞的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种体外诱导类角膜缘干细胞的方法及试剂盒。所提供的方法包括(1)利用第一诱导剂对多能干细胞进行第一培养，获得表面外胚层细胞，第一诱导剂包括第一小分子抑制剂和第一蛋白，第一小分子抑制剂包括TGF‑beta/Smad抑制剂，第一蛋白包括bFGF或BMP4；(2)利用第二诱导剂对表面外胚层细胞进行第二培养，以便获得类角膜缘干细胞，第二诱导剂包括第二蛋白，第二蛋白包括BMP4。所提供的试剂盒包括小分子抑制剂、蛋白和培养基，小分子抑制剂包括SB505124或SB431542；蛋白包括bFGF或BMP4。利用该方法或试剂盒能够快速获得类角膜缘干细胞，而且稳定性好。

Description

体外诱导类角膜缘干细胞的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种体外诱导类角膜缘干细胞的方法及试剂盒。
背景技术
角膜缘干细胞位于角膜和巩膜交接处的角膜缘组织，具有很强的增殖能力，能够有效地进行角膜再生和修复。全球视力障碍患者估计有4亿多人，其中4千多万人失明。在这些人当中因为角膜(cornea)功能紊乱造成的失明人数大概有1千多万，每年新增1百多万新的失明患者。此外，由于遗传、化学、烧伤、感染等原因会导致角膜缘功能不能正常行使，造成角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cells deficiency，LSCD)的发生，使正常角膜上皮稳态遭到破坏，是造成视力低下、失明的重要原因之一。目前，LSCD的治疗方式有自体或异体角膜缘移植、体外培养的LSCs移植、体外培养的口腔黏膜细胞等移植、自体或异体结膜移植等。角膜缘移植虽然具有一定疗效，但是供体材料匮乏，慢性炎症和免疫排斥反应常常影响手术的成功率，自体角膜缘组织的获取也存在角膜脱落、感染等风险。并且对于双侧LSCD患者来说，更是无法获取自体的角膜缘组织。
角膜发育自表面外胚层，小分子化合物可以通过调节细胞外的信号通路从而模拟发育过程，诱导多能干细胞向表面外胚层的发育，进一步形成角膜缘干细胞。2014，Mikhailova等人开发了角膜缘干细胞小分子诱导技术，利用小分子抑制剂抑制TGF-b和Wnt信号通路，模拟角膜的早期发育阶段。获得细胞表达典型的角膜标记，能够分成两个清晰的层，只有在顶层表达K12基因。该研究首次描述了小分子物质在无血清、无滋养层条件下进行LSC的有效诱导。近期，该研究团队报道了该方法的改进技术，进一步利用无动物源、无血清的方法进行LSC的诱导。利用小分子化合物诱导多能干细胞分化为LSC，有利于诱导技术的稳定，同时不添加血清和饲养层细胞，提高了安全性，必将成为多能干细胞体外诱导技术研究的主要方向。尽管利用小分子物质进行诱导的方法有了一定的进展，但目前报道的不多，如何利用小分子化合物在体外获得角膜缘干细胞，用于角膜的再生和修复，还需要进一步改进。
发明内容
本发明至少在一定程度上解决现有技术中的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种能够在体外稳定获得类角膜缘干细胞的方法以及试剂盒。
多能干细胞(pluripotent stem cell,PSC)具有多能性和无限扩增能力，能够在体外诱导形成角膜缘干细胞。近年来虽然有多能干细胞向角膜缘干细胞的诱导方法，但是多能干细胞在体外诱导形成角膜缘干细胞时，仍然面临着诸多挑战。例如，诱导方法中涉及需要滋养层细胞、成分不明确的材料或试剂的使用，如条件化培养基、PA6滋养层细胞、Bowman’s膜或羊膜等。滋养层容易引入动物源病原体，同时滋养层的类型、传代次数及生长状态均对诱导效率产生较大影响，而组分不明确的材料或试剂批次间可能会存在较大差异，这些因素影响了诱导技术的稳定性和再现性。此外，有些方法并未报道诱导的细胞是否可以进一步分化为成熟的角膜上皮细胞，或者分化效率非常的低。
小分子诱导技术是利用小分子诱导剂调节细胞外信号通路，模拟细胞的发育过程，高效的诱导了多能干细胞向心肌细胞、神经细胞等细胞类型的分化，是无动物源、体外诱导技术建立的重要基础。本发明的发明人结合现有角膜缘干细胞(imbal stem cells，LSC)发育和体外诱导技术基础，结合LSC发育途径，建立稳定、高效的LSC诱导技术，并在体外证实可以通过多能干细胞获得类角膜缘干细胞。为此，本发明提供了一种体外诱导类角膜缘干细胞的方法。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种体外诱导类角膜缘干细胞的方法，包括：(1)利用第一诱导剂对多能干细胞进行第一培养，以便获得表面外胚层细胞，所述第一诱导剂包括第一小分子抑制剂和第一蛋白，所述第一小分子抑制剂包括TGF-beta/Smad抑制剂，所述第一蛋白包括选自bFGF或BMP4中的至少一种；(2)利用第二诱导剂对所述表面外胚层细胞进行第二培养，以便获得类角膜缘干细胞，所述第二诱导剂包括第二蛋白，所述第二蛋白包括BMP4。
本发明通过两步诱导，即表面外胚层细胞的诱导以及类角膜缘干细胞的诱导，能够获得性能稳定的类角膜缘干细胞，例如，所获得的类角膜缘干细胞的p63基因表达稳定。
根据本发明的实施例，以上所述体外诱导类角膜缘干细胞的方法可以进一步包括如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述多能干细胞在第一小分子抑制剂的作用下，TGF-beta信号被抑制，促进多能干细胞向特定细胞类型-表面外胚层细胞分化。根据本发明的具体实施例，所述TGF-beta/Smad抑制剂包括选自SB505124或SB431542中的至少一种。
根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：
(1-1)利用含有第一小分子抑制剂和bFGF的第一表面外胚层诱导培养基对所述多能干细胞进行第一诱导培养；
(1-2)更换含有第一小分子抑制剂和BMP4的第二表面外胚层诱导培养基对步骤(1-1)的产物进行第二诱导培养，以便获得所述表面外胚层细胞。
根据本发明实施例的第一培养中，在第一诱导培养阶段采用bFGF，刺激FGF信号通路的激活，在第二诱导培养阶段采用BMP4，刺激骨形态发生蛋白(Bone MorphogeneticProtein(BMP))信号通路的激活，进而在多能干细胞不同的发育阶段采用特异性的蛋白，以刺激相应不同信号通路的激活，实现表面外胚层细胞高效获得。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：
(2-1)利用含有BMP4的第一角膜缘干细胞诱导培养基对所述表面外胚层细胞进行第三诱导培养；
(2-2)更换不含有BMP4的第二角膜缘干细胞诱导培养基对步骤(2-1)的产物进行第四诱导培养，以便获得所述类角膜缘干细胞。
根据本发明实施例的第二培养中，在第三诱导培养阶段采用BMP4，在第四诱导培养阶段更换不含有BMP4的培养基，以减弱对BMP4信号通路的刺激。
根据本发明的实施例，所述第一表面外胚层诱导培养基包括选自DMEM/F12培养基或E6培养基中的至少一种，进一步包括选自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一种。需要说明的是，本申请所述的DMEM/F12培养基是指DMEM和F12培养基按照1：1的比例混合配置的培养基，其可通过直接购买获得，也可通过将DMEM培养基与F12培养基自行混合配置获得。
根据本发明的实施例，所述第二表面外胚层诱导培养基包括选自DMEM/F12培养基或E6培养基中的至少一种，进一步包括选自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述第一角膜缘干细胞诱导培养基包括选自DMEM/F12培养基或角膜上皮培养基中的至少一种，进一步包括选自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一种；
根据本发明的实施例，所述第二角膜缘干细胞诱导培养基包括选自DMEM/F12培养基或角膜上皮培养基中的至少一种，进一步包括选自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一种。
根据本发明的实施例，在所述第一诱导培养中，所述第一小分子诱导剂的使用浓度为5～15μM，在所述第二诱导培养中，所述第一小分子诱导剂的使用浓度为0～15μM。
根据本发明的实施例，所述第一蛋白的使用浓度为5～50ng/mL。进而进一步提高表面外胚层细胞的诱导效率。
根据本发明的实施例，所述第二蛋白的使用浓度为5～15ng/mL。进而进一步提高类角膜缘干细胞的诱导效率。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将多能干细胞培养至60％～80％的汇合度时，利用含有第一小分子抑制剂和bFGF的第一表面外胚层诱导培养基对所述多能干细胞进行第一诱导培养，培养时间为1～2天。
根据本发明的实施例，所述第二诱导培养的培养时间为1～3天。
根据本发明的实施例，所述多能干细胞采用无饲养层细胞培养基进行培养，所述无饲养层培养基包括选自mTeSR培养基、E8培养基中的至少一种。
根据本发明的实施例，在利用第一诱导剂对所述多能干细胞进行第一培养之前，进一步包括：采用第一基质胶对培养皿进行包被，所述第一基质胶包括选自Matrigel基质胶、Vitronectin基质胶中的至少一种。进而营造一个适宜多能干细胞向特定细胞-表面外胚层细胞分化的微环境。
根据本发明的具体实施例，所述Matrigel基质胶的浓度为8～12mg/mL。
根据本发明的具体实施例，所述Vitronectin基质胶的浓度为0.35-0.75μg/mL。
根据本发明的实施例，在利用第二诱导剂对所述表面外胚层细胞进行第二培养之前，进一步包括：采用第二基质胶对培养皿进行包被，所述第二基质胶包括选自IV型胶原、层连蛋白中的至少一种。发明人发现，采用第二基质胶包被的培养基，可有效促进表面外胚层细胞的贴壁和生长，同时也为表面外胚层细胞提供了进一步诱导发育的微环境，进一步提高了表面外胚层细胞诱导成类角膜缘干细胞的效率。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种体外诱导角膜缘干细胞的试剂盒，包括：
小分子抑制剂，所述小分子抑制剂包括TGF-beta/Smad抑制剂；
蛋白，所述蛋白包括选自bFGF、BMP4中的至少一种；和
培养基。
根据本发明的实施例，以上所述的试剂盒可以进一步包括如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述TGF-beta/Smad抑制剂包括选自SB505124或SB431542中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述培养基包括选自DMEM/F12培养基、E6培养基、角膜上皮培养基中的至少一种，进一步包括选自胎牛血清、血小板裂解物或替代物中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：包被有基质胶的培养皿，所述基质胶包括选自Matrigel基质胶、Vitronectin基质胶、IV型胶原、层连蛋白中的至少一种。
本发明所取得的有益效果为：利用本发明所提供的方法或者试剂盒，来进行类角膜缘干细胞的体外诱导，通过两步诱导法，在不同多能干细胞系间，均能获得性能优异的类角膜缘干细胞，而且显示了效率高、稳定性好的优点。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的胚胎干细胞H9的显微镜观察结果。
图2是根据本发明的实施例提供的表明外胚层细胞TFAP2A、SOX1、PAX6基因的表达分布。
图3是根据本发明的实施例提供的多能干细胞分化得到的类角膜缘干细胞显微镜观察结果。
图4是根据本发明的实施例提供的利用H9细胞所分化获得的类角膜缘干细胞p63流式分析结果。
图5是根据本发明实施例提供的KRT3、KRT12基因qRT-PCR结果。
图6是根据本发明的实施例提供的不同多能干细胞的显微镜观察结果图。
图7是根据本发明的实施例提供的利用不同多能干细胞所分化获得的类角膜缘干细胞的流式分析结果。
图8是根据本发明的实施例提供的不同基质胶及组合分化获得类角膜缘干细胞p63流式分析结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。同时对本文中的一些术语进行解释和说明，以方便本领域技术人员的理解，需要说明的是，这些解释和说明仅用于方便理解，而不应看做是对本发明保护范围的限制。
本文中，所提到的多能干细胞是指具有多能性和无限扩增能力的干细胞。多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell,iPSC)。
本文中，所提到的“类角膜缘干细胞”是指具有角膜缘干细胞特征的一类细胞，是通过人工干预的方式在体外获得的类似角膜缘干细胞的细胞，例如它能够表达p63基因，具有向角膜细胞分化的功能。本申请所获得的角膜缘干细胞与人类自身在未进行任何干预条件下所产生的角膜缘干细胞相区分，称为类角膜缘干细胞。
本发明利用多能干细胞的多能性，建立了体外诱导类角膜缘干细胞的方法，可以作为角膜缘干细胞来源的途径之一，从而为临床级角膜缘干细胞的诱导分化提供技术基础。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种体外诱导类角膜缘干细胞的方法。根据本发明的实施例，所提供的方法包括：
(1)利用第一诱导剂对多能干细胞进行第一培养，以便获得表面外胚层细胞，所述第一诱导剂包括第一小分子抑制剂和第一蛋白，所述第一小分子抑制剂包括TGF-beta/Smad抑制剂，所述第一蛋白包括选自bFGF或BMP4中的至少一种；
(2)利用第二诱导剂对所述表面外胚层细胞进行第二培养，以便获得类角膜缘干细胞，所述第二诱导剂包括第二蛋白，所述第二蛋白包括BMP4。
本发明所提供的体外诱导类角膜缘干细胞的方法，是通过两步诱导，分别包括表面外胚层细胞的诱导和类角膜缘干细胞的诱导，来获得性能优异的类角膜缘干细胞。
根据本发明的实施例，所述TGF-beta/Smad抑制剂包括选自SB505124或SB431542中的至少一种。进而可选择性的抑制TGF-βⅠ型受体，以及激活素受体样激酶(ALK)4、5和7。
在本发明的至少一些实施方式中，步骤(1)进一步包括：(1-1)利用含有第一小分子抑制剂和bFGF的第一表面外胚层诱导培养基对所述多能干细胞进行第一诱导培养；(1-2)更换含有第一小分子抑制剂和BMP4的第二表面外胚层诱导培养基对步骤(1-1)的产物进行第二诱导培养，以便获得所述表面外胚层细胞。
所述的第一表面外胚层诱导培养基包括但不限于：基础培养基为含10％的胎牛血清、血小板裂解物或血清替代物的DMEM/F12培养基(购自KnockOutTM Serum Replacement或购自ThermoFisherScientic)或组分明确的E6培养基。
第一小分子抑制剂可以调整为合适的使用浓度。在本发明的至少一些实施方式中，所述SB505124或SB431542的使用浓度为5～15μM，bFGF的使用浓度为5～50ng/mL。
所述的第二表面外胚层诱导培养基包括但不限于：基础培养基为含10％的胎牛血清、血小板裂解物或血清替代物的DMEM/F12培养基(购自KnockOutTM Serum Replacement或购自ThermoFisherScientic)或组分明确的E6培养基。
所述BMP4的使用浓度为5～50ng/mL，所述SB505124或SB431542的使用浓度为0～15μM。
在诱导获得表面外胚层细胞的过程中，首先要进行多能干细胞的培养，例如可以采用无饲养层培养基培养。可用的无饲养层培养基包括但不限于：基础培养基为商业可用的mTeSR培养基或组分明确的E8培养基。在利用培养皿培养多能干细胞时，可以采用Matrigel基质胶或Vitronectin基质胶预先对培养皿进行覆盖，进而营造一个适宜多能干细胞向特定细胞-表面外胚层细胞分化的微环境。根据本发明的实施例，培养皿可以覆盖浓度为8～12mg/mL的Matrigel基质胶或浓度为0.35-0.75μg/mL的Vitronectin基质胶。
然后利用培养的多能干细胞诱导获得表面外胚层细胞。根据本发明的实施例，可以将多能干细胞培养至60～80％的汇合度时，添加第一表面外胚层诱导培养基培养1-2天，之后更换为第二表面外胚层诱导培养基继续培养1-3天。
利用所获得的表面外胚层细胞可以经过诱导获得类角膜缘干细胞。在诱导之前，可以进行培养皿基质胶包被处理。在进行培养皿基质胶包被处理时，可以采用本领域常用的方法。例如可以使用基质胶覆盖培养皿，接种前室温放置2小时以上。可用的基质胶包括但不限于：IV型胶原、层连蛋白或这些基质胶的组合。根据本发明的实施例，所述IV型胶原的使用浓度为3～10μg/cm2，层连蛋白的使用浓度为0.5～10μg/cm2。
然后将之前获得的表面外胚层细胞进行消化，并接种至上述经过基质胶包被的培养皿中。例如，可以使用商业可用的Accutase(INNOVATIVE CELL,AT104-500)或TrypLETM细胞消化液在37℃对诱导的表面外胚层细胞进行消化，形成单细胞悬液，离心收集细胞，接种到前述基质胶包被的培养皿，然后继续添加含10μM Y27632的第二表面外胚层诱导培养基培养12小时。发明人发现，Y27632作为ROCK抑制剂，能促进细胞传代后的活率。
然后诱导获得类角膜缘干细胞。根据本发明的实施例，首先更换为第一角膜缘干细胞诱导培养基，培养2～3天，每天换液，之后更换为第二角膜缘干细胞诱导培养基，每2～3天换液。
所述的第一类角膜缘干细胞诱导培养基，其基础培养基为添加0～10％的胎牛血清、血小板裂解物或血清替代物的DMEM/F12培养基或商业可用的角膜上皮培养基(CornealEpithelium Medium，购自CELLNTEC，货号为：CnT-30)，同时含有诱导剂BMP4。所述的BMP4诱导剂的浓度为5～15ng/mL。
所述的第二角膜缘干细胞诱导培养基，其基础培养基为添加0～10％的胎牛血清、血小板裂解物或血清替代物的角膜上皮培养基。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 H9胚胎干细胞向角膜缘干细胞的诱导
(1)H9细胞的培养
H9细胞系培养于培养皿覆盖10mg/mL的Matrigel基质胶的培养皿中(如图1)，培养基为mTeSR培养基。其中，Matrigel基质胶购自BD公司(货号为：354234)，mTeSR培养基购自Stemcell Technologies(货号为：05850)。
(2)表面外胚层细胞的诱导
H9培养至70％左右的汇合度时，更换培养基为第一表面外胚层诱导培养基，第一表面外胚层诱导培养基的成分为含10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基(购自ThermoFisherScientic，货号为：10565-018)，添加10μM SB431542和20ng/mL的bFGF，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养1天。
随后更换培养基为第二表面外胚层诱导培养基，第二表面外胚层诱导培养基的成分为含10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加5μM SB431542和25ng/mL的BMP4，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养2天。SB431542购买自ABCAM(货号为：ab120163)，bFGF购买自ThermoFisher(货号为：13256-029)，BMP4购买自R&D(货号为：314-BP-050)。
(3)培养皿包被
IV型胶原干粉加入含0.25％冰乙酸的DPBS溶液(杜氏磷酸缓冲液，Dulbecco'sPhosphate Buffered Saline)中，配制成浓度为1mg/mL的溶液；在2～8℃中溶解，偶尔摇晃；根据底面积浓度计算合适稀释浓度，形成5μg/cm2覆盖浓度。IV型胶原购买自Sigma(货号为：C5533-5MG)。
(4)表面外胚层细胞的消化及接种
使用TrypLETM对步骤(2)诱导的外胚层细胞进行消化，37℃消化10分钟，轻轻吹打细胞，形成单细胞悬液，离心收集细胞，细胞重新悬浮在含10μM Y27632的第二表面外胚层诱导培养基中，以2×105细胞/cm2的浓度接种到(3)所述包被的培养皿中，添加第二表面外胚层诱导培养基继续培养12小时。其中TrypLETM购买自ThermoFisher，货号为12604013，Y27632购买自Sigma，货号为Y0503-5MG。
同时利用单细胞测序进行检测，单细胞测序结果表明，大多细胞均不表达人多能干细胞核心转录因子POU5F1、SOX2和NANOG，同时符合表面外胚层细胞表达特征(TFAP2A+SOX1-PAX6-SOX10-)(如图2所示，其中图2中横坐标代表基因的身份，每个点表示的是一个细胞，纵坐标代表基因在每个细胞中的表达量(单位：UMI))。
(5)角膜缘干细胞的诱导
继续更换培养基为第一角膜缘干细胞诱导培养基，第一角膜缘干细胞诱导培养基的成分为添加10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加诱导剂10ng/mL的BMP4，培养2天，每天换液。之后更换为第二角膜缘干细胞诱导培养基，第二角膜缘干细胞诱导培养基为角膜上皮培养基，每2-3天换液，培养15天，收集细胞进行流式分析，细胞形成明显的多边形形态(如图3所示)。其中角膜上皮培养基购买自Cellntec公司。
(6)流式分析
P63蛋白作为类角膜缘干细胞的标志物，可以用来指示类角膜缘干细胞。利用抗p63抗体对诱导细胞进行流式分析。p63抗体购买自abcam(货号为：ab124762)。其结果如图4所示。
(7)向角膜上皮细胞的分化
上皮细胞分层实验用以确定向角膜上皮细胞的分化效果，图5的qRT-PCR结果表明，分化的细胞KRT3、KRT12表达水平显著提升。
实施例2不同多能干细胞系向角膜缘干细胞的诱导
实施例2研究了不同多能干细胞向角膜缘干细胞的诱导，其中所用到的多能干细胞分别为胚胎干细胞系H1、H7和诱导多能细胞系201B7(购自ATCC，货号为ACS-1023)，培养方法按照实施例1作了稍微的调整，其中在对多能干细胞进行培养时，所用到的培养基由mTeSR培养基更改为E8培养基(购自STEMCELL,货号05940)，采用Vitronectin(玻连蛋白，购自ThermoFisherScientic，货号为：A14700)进行培养皿的包被。另外，无论是第一表面外胚层诱导培养基、第二表面外胚层诱导培养基、第一角膜缘干细胞诱导培养基还是第二角膜缘单细胞培养基中的基础培养基成分均改为E6培养基(购自ThermoFisherScientic，货号为：A1517001)，诱导剂由SB431542替换为SB505124(购自SIGMA，货号为：S4696-5MG)，其他不变。
其中利用E8培养基培养不同的多能干细胞的显微镜观察结果如图6所示。
流式分析表明这几个细胞系所诱导的p63细胞，并与实施例1相比无明显差异，细胞获得率均显示了较好的一致性如图(7所示)。
实施例3不同基质胶及组合向角膜缘干细胞的诱导比较
实施例3研究了在由表面外胚层细胞向角膜缘干细胞诱导之前，培养皿中基质胶的类别对于角膜缘干细胞诱导的影响。所用细胞系为H9，具体实施方法同实施例1相同，设立三组不同的基质胶实验，分别为：
IV型胶原(Col IV)，使用浓度分别为IV型胶原5μg/mL，
层连蛋白(LN521)，层连蛋白浓度为2μg/mL，
IV型胶原(Col IV)和层连蛋白(LN521)组合，IV型胶原(Col IV)和层连蛋白(LN521)浓度分别为2.5μg/mL和1μg/mL。
三组不同的基质胶实验获得的p63细胞如图8所示。实验结果表明，无论是采用IV型胶原、层连蛋白还是二者的混合物作为基质胶，对于所获得的P63细胞均没有明显影响。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.一种体外诱导类角膜缘干细胞的方法，其特征在于，包括：
(1)H9细胞的培养；
H9细胞培养于培养皿覆盖10mg/mL的Matrigel基质胶的培养皿中，培养基为mTeSR培养基；
(2)表面外胚层细胞的诱导；
H9细胞培养至70％左右的汇合度时，更换培养基为第一表面外胚层诱导培养基，第一表面外胚层诱导培养基的成分为含10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加10μMSB431542和20ng/mL的bFGF，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养1天；
随后更换培养基为第二表面外胚层诱导培养基，第二表面外胚层诱导培养基的成分为含10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加5μM SB431542和25ng/mL的BMP4，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养2天；
(3)培养皿包被；
IV型胶原干粉加入含0.25％冰乙酸的DPBS溶液中，配制成浓度为1mg/mL的溶液；在2～8℃中溶解，偶尔摇晃；
(4)表面外胚层细胞的消化及接种；
使用TrypLETM对步骤(2)诱导的外胚层细胞进行消化，37℃消化10分钟，轻轻吹打细胞，形成单细胞悬液，离心收集细胞，细胞重新悬浮在含10μM Y27632的第二表面外胚层诱导培养基中，以2×105细胞/cm2的浓度接种到(3)所述包被的培养皿中，添加第二表面外胚层诱导培养基继续培养12小时；
(5)角膜缘干细胞的诱导；
继续更换培养基为第一角膜缘干细胞诱导培养基，第一角膜缘干细胞诱导培养基的成分为添加10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加诱导剂10ng/mL的BMP4，培养2天，每天换液；之后更换为第二角膜缘干细胞诱导培养基，第二角膜缘干细胞诱导培养基为角膜上皮培养基，每2-3天换液，培养15天，收集细胞进行流式分析，细胞形成明显的多边形形态。
2.一种体外诱导类角膜缘干细胞的方法，其特征在于，包括：
(1)多能干细胞的培养；
多能干细胞培养于培养皿覆盖10mg/mL的Matrigel基质胶的培养皿中，培养基为E8培养基；
(2)表面外胚层细胞的诱导；
多能干细胞培养至70％左右的汇合度时，更换培养基为第一表面外胚层诱导培养基，第一表面外胚层诱导培养基的成分为E6培养基，添加10μM SB505124和20ng/mL的bFGF，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养1天；
随后更换培养基为第二表面外胚层诱导培养基，第二表面外胚层诱导培养基的成分为E6培养基，添加5μM SB505124和25ng/mL的BMP4，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养2天；
(3)培养皿包被；
采用Vitronectin进行培养皿的包被；
(4)表面外胚层细胞的消化及接种；
使用TrypLETM对步骤(2)诱导的外胚层细胞进行消化，37℃消化10分钟，轻轻吹打细胞，形成单细胞悬液，离心收集细胞，细胞重新悬浮在含10μM Y27632的第二表面外胚层诱导培养基中，以2×105细胞/cm2的浓度接种到(3)所述包被的培养皿中，添加第二表面外胚层诱导培养基继续培养12小时；
(5)角膜缘干细胞的诱导；
继续更换培养基为第一角膜缘干细胞诱导培养基，第一角膜缘干细胞诱导培养基为E6培养基，添加诱导剂10ng/mL的BMP4，培养2天，每天换液；之后更换为第二角膜缘干细胞诱导培养基，第二角膜缘干细胞诱导培养基为角膜上皮培养基，每2-3天换液，培养15天，收集细胞进行流式分析，细胞形成明显的多边形形态；
所述多能干细胞为胚胎干细胞系H1、H7或诱导多能细胞系201B7。
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