JP6465898B2 - 多能性幹細胞からの角膜上皮細胞の分化誘導 - Google Patents
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Description
本出願は,日本特許出願2015−006074(2015年1月15日出願)に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は多能性幹細胞からの角膜上皮細胞の分化誘導方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞(とくに、人工多能性幹細胞)を、フィーダー細胞を用いることなく無血清培地で自律的に外胚葉系細胞種に分化させ、得られた眼表面外胚葉系列細胞を角膜上皮細胞に分化誘導する方法に関する。
(1)多能性幹細胞(とくに、人工多能性幹細胞)を、無血清培地でフィーダー細胞を用いることなく二次元培養することにより、各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーを製造する方法;
(2)異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層が、多能性幹細胞の自律的分化によって形成されることを特徴とする、上記(1)に記載の方法;
(3)無血清培地が、0.5nM以上のBMP4(Bone morphogenetic protein 4)、トランスフォーミング増殖因子、及びアクチビンを含まないことを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の方法;
(4)無血清培地が、さらに高濃度レチノイン酸、BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、及びNogginから選ばれる少なくとも1以上を含まないことを特徴とする、上記(3)に記載の方法;
(5)多能性幹細胞を、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン又はラミニンフラグメント、ビトロネクチン、基底膜マトリックス、ゼラチン、ヒアルロン酸、ポリリジン、ビトロネクチン、及びヒアルロン酸から選ばれるいずれか1以上でコーティングされた容器を用いて培養することを特徴とする、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の方法;
(6)コロニーが、それぞれ神経外胚葉系列細胞、神経堤系列細胞/眼胚系列細胞、眼表面外胚葉系列細胞、及び表面外胚葉系列細胞で構成される層を含む、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法;
(7)上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法で各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーを製造する工程、
前記コロニーから特定の層に含まれる細胞を分離する工程、
前記細胞を眼関連細胞に分化誘導する工程、
を含む、眼関連細胞の製造方法;
(8)眼関連細胞が、角膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、神経網膜細胞、結膜上皮細胞、輪部上皮細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、虹彩実質細胞、強膜細胞、虹彩色素上皮細胞、毛様体上皮細胞、視神経細胞、輪部下繊維芽細胞、結膜下繊維芽細胞、涙腺、マイボーム腺、杯細胞、レンズ上皮細胞、及び眼瞼上皮細胞から選ばれるいずれかである、上記(7)に記載の方法;
(9)上記(1)〜(6)のいずれかに記載の方法で各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーを製造する工程、
成長因子を含む培地で前記コロニーを培養する工程、
眼表面外胚葉系列細胞で構成される層に含まれる細胞を分離し、KGF、Rock阻害剤、及び血清代替物を含む培地で培養して、角膜上皮前駆細胞に分化誘導する工程、
角膜上皮前駆細胞を単離し、角膜上皮細胞に分化誘導する工程、
を含む、角膜上皮細胞の製造方法;
(10)ITGβ4、SSEA4、TRA−1−60、及びCD200から選ばれる1又は2以上のマーカーの発現の有無、好ましくはITGβ4陽性及びSSEA4陽性、より好ましくはTRA−1−60又はCD200陰性で、かつITGβ4陽性及びSSEA4陽性、さらに好ましくはCD200陰性で、かつITGβ4陽性及びSSEA4陽性を指標として角膜上皮前駆細胞を単離することを特徴とする、上記(9)に記載の方法;
(11)上記(9)又は(10)に記載の方法で製造される角膜上皮細胞であって、K12、pax6、及びp63陽性であることを特徴とする角膜上皮細胞;
(12)上記(9)又は(10)に記載の方法で角膜上皮細胞を製造する工程、得られた角膜上皮細胞をさらに重層化培養する工程を含む、角膜細胞シートの製造方法;
(13)多能性幹細胞(とくに、人工多能性幹細胞)由来の各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニー;
(14)上記(1)〜(6)のいずれか1項に記載の方法によって製造される、上記(13)記載のコロニー;
(15)多能性幹細胞(とくに、人工多能性幹細胞)由来の重層化角膜上皮細胞シートであって、角膜上皮細胞がK12、pax6、及びMUC16陽性であることを特徴とする重層化角膜上皮細胞シート;
(16)上記(13)又は(14)記載のコロニーの眼表面外胚葉系列細胞で構成される層に含まれる細胞を分離・培養して製造される多能性幹細胞(とくに、人工多能性幹細胞)由来の角膜上皮細胞であって、K12、pax6、及びp63陽性であることを特徴とする角膜上皮細胞。
さらに、本発明の方法で得られた異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーからは、角膜上皮細胞のみならず、結膜上皮細胞、網膜細胞、涙腺細胞などの眼を構成する様々な細胞も作製することができる。
以下、本発明で使用される用語のいくつかについて説明する。
(1)多能性幹細胞
本発明にかかる「多能性幹細胞」とは、胎盤以外のすべての細胞に分化可能な分化多能性を有する細胞すべてを含み、ES細胞やES細胞株のほか、iPS細胞等の人工多能性幹細胞の両方を含む。
ヒトの胚は、発生の段階で3つの胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、外胚葉を形成する。すなわち内胚葉、中胚葉、外胚葉を形成する。このうち内胚葉は、胃や小腸の粘膜上皮、肝臓、膵臓等になり、中胚葉は筋肉、骨、血管や血液、皮下組織、心臓、腎臓等になり、外胚葉は神経、目、表皮等を形成する。本発明にかかる「外胚葉系列細胞種」は、外胚葉に由来する細胞系列種、すなわち、将来的に中枢神経系・感覚器官、表皮、眼を形成する細胞を意味する。
本発明にかかる「眼関連細胞」とは、外胚葉に由来する眼を形成する細胞で、角膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、神経網膜細胞、結膜上皮細胞、輪部上皮細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、虹彩実質細胞、強膜細胞、虹彩色素上皮細胞、毛様体上皮細胞、視神経細胞、輪部下繊維芽細胞、結膜下繊維芽細胞、涙腺、マイボーム腺、杯細胞、レンズ上皮細胞、及び眼瞼上皮細胞等を挙げることができる。
角膜は、表面から、角膜上皮層、角膜実質層、角膜内皮層の3層構造をしている。「角膜上皮細胞」は、この角膜の一番外側の層を構成する細胞で、4〜5層の角膜上皮細胞層から構成されている。「角膜上皮細胞」は表皮外胚葉に由来するが、角膜の実質と内皮は神経堤由来であり、それぞれ個別の幹細胞が存在すると考えられている。本発明において「角膜上皮細胞」は、pax6及びp63に加えて、角膜上皮分化マーカーであるケラチン12の発現によって特徴づけられる。
本発明では、分化誘導された細胞を同定するために、各細胞種に特異的なマーカーを利用する。以下、代表的なものについて説明する。
本発明においては、まず多能性幹細胞を自律的に分化させ、各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーを形成させる。「自律的分化(自律的に分化)」とは、分化誘導剤や分化誘導促進剤等の外部から刺激を受けることなく、細胞が自ら分化することを意味する。
本発明では無血清培地を用いて培養を行う。「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分(例えば、増殖因子)が混入している培地は無血清培地に該当する。
維持用の基本培地としては、動物・ヒト由来成分を含まない多能性幹細胞用の培地がより好ましく、そのような培地としては、mTeSRTM1(日本BD社)、StemFit(登録商標)等の市販の培地を使用することもできる。
本発明ではフィーダー細胞を用いることなく多能性幹細胞を二次元培養する。容器は、細胞培養に使用されるものであれば特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルを使用することができる。
自律的分化のための培養期間は、長くとも1週〜8週間、好ましくは2週〜6週間、より好ましくは3週間〜5週間である。
無血清培地でフィーダー細胞を用いることなく二次元培養された多能性幹細胞は、自律的に分化して外胚葉系細胞種で構成される層状のコロニーを形成する。コロニーは、中心部から周辺部に向けて、各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなり、第1層(神経外胚葉系列細胞(Sox2+, TUBB3+, Sox6+))、第2層(神経堤系列細胞/眼胚系列細胞(pax6+, Sox10+, Rx+))、第3層(眼表面外胚葉系列細胞(pax6+, p63+, E-cadherin+,))、及び第4層(表面外胚葉系列細胞(p63+, Ecadherin+))を含む。
多能性幹細胞の自律的分化によって形成されたコロニーは、各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなり、第1層(神経外胚葉系列細胞)、第2層(神経堤系列細胞/眼胚系列細胞)、第3層(眼表面外胚葉系列細胞)、及び第4層(表面外胚葉系列細胞)で構成される層状の細胞群に区別される。コロニーの各層に含まれる細胞種は異なる系列であるため、これを利用して、特定の層に含まれる細胞を分離(単離)し、分化誘導することで、目的とする眼関連細胞を得ることができる。
角膜上皮に分化し得る上皮前駆細胞は、コロニーの第2層と第3層に存在し、とくに角膜上皮前駆細胞は第3層(眼表面外胚葉系列細胞)に存在する。よって、第3層の眼表面外胚葉系列細胞を角膜上皮前駆細胞に分化誘導し、これを単離し、成熟培養することで角膜上皮細胞を得ることができる。
この眼表面上皮幹細胞を、ピペッティング等により分離し、さらに角膜上皮培養用培地で培養し、角膜上皮前駆細胞に分化誘導する。次いで、角膜上皮前駆細胞をFACS等を用いて単離し、成熟培養して角膜上皮細胞を得る。
分化誘導のいずれの工程においても、培養は、無血清培地によりフィーダー細胞を用いることなく行う。以下、培地と培養条件について説明する。
(1−1)上皮用分化培地
上皮用分化培地は、上皮系幹細胞への分化を促すために、KGF、Rock阻害剤、bFGF、血清代替物等の成長因子を含む。基本培地は、自律的分化で使用した、DMEM培地、BME培地、α MEM培地など、上皮細胞の培養に用いることのできる培地(無血清培地)あればいずれも用いることができる。また、KnockOutTMDMEM、Medium 154、StemPro(登録商標)hESC SFM等の幹細胞用培地やCNT20、Cnt50、CnT−PR、KSFMなど上皮細胞培養培地、又はこれらを混合した培地が望ましい。後述する実施例では、50%の自律分化用無血清培地と50%のCnt20 あるいは CntPRを混合して使用した。
角膜上皮培養用培地は、角膜上皮前駆細胞への分化誘導を促すために、KGF、Rock阻害剤、及び血清代替物(例えば、B27−supplement等)を含むことができる。さらに、FGF2、インスリン、トランスフェリンを含んでいてもよい。なお、「ROCK阻害剤」とは、Rhoキナーゼ(ROCK: Rho-associated,coiled-oil containing protein kinase)を阻害する物質を意味し、例えば、N-(4-ピリジニル)-4β-[(R)-1-アミノエチル]シクロヘキサン-1α-カルボアミド(Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル)スルホニル]ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン(H-1152)、4β-[(1R)-1-アミノエチル]-N-(4-ピリジル)ベンゼン-1α-カルボアミド(Wf-536)、N-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4PER(R)-1-アミノエチル]シクロヘキサン-1α-カルボアミド(Y-30141)、N-(3-[[2-(4-アミノ-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-1-エチル-1H-イミダゾ[4, 5-c]ピリジン-6-イル]オキシ]フェニル)-4-[[2-(4-モルホリニル)エチル]-オキシ]ベンズアミド(GSK269962A)、N-(6-フルオロ-1H-インダゾール-5-イル)-6-メチル-2-オキソ-4-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-3,4-ジヒドロ-1H-ピリジン-5-カルボキサミド(GSK429286A)を利用できる。
基本培地としては、上皮用分化培地と同様のものを使用することができる。
角膜上皮は、上記した角膜上皮培地を用いて重層化・成熟化することができるが、最後1週間程度、血清を含む成熟培養用培地を用いて培養すると重層化、成熟化がより促進される。前記成熟培養用培地は、血清(必要に応じて)、KGF、Rock阻害剤、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを含むことが好ましい。基本培地としては、角膜上皮培養培地と同様のものを使用することができる。
いずれの工程も、フィーダー細胞を用いることなく培養を行う。容器は、細胞培養に使用されるものであれば特に限定されず、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルを使用することができる。
角膜上皮前駆細胞を分化誘導するための、角膜上皮培養用培地での培養は、少なくとも1週〜12週間、好ましくは1週〜8週間、より好ましくは2週〜6週間である。
角膜上皮前駆細胞を単離後の角膜上皮培養用培地における重層化・成熟培養には、少なくとも4日間、好ましくは1週間以上、より好ましくは2週間〜3週間である。
角膜上皮前駆細胞は、常法にしたがい各マーカーに特異的な抗体を用いて容易に実施できる。たとえば、抗体で標識された磁気ビーズ、抗体を固相化したカラム、蛍光標識された抗体を用いたセルソーター(FACS)による分離を用いて単離すればよい。抗体は、市販のものを利用してもよいし、常法にしたがい作製してもよい。
角膜上皮前駆細胞を成熟培養することで、移植可能な、重層化した角膜上皮細胞が得られる。得られた角膜上皮細胞は、K12、pax6、及びp63陽性で、体細胞由来の角膜上皮細胞と同様にin vitro及びin vivoで角膜上皮として機能する。本発明は、このK12、pax6、及びp63で特徴づけられる、多能性幹細胞、とくに人工多能性幹細胞由来の機能的な角膜上皮細胞も提供する。
5.1 細胞製剤
本発明の方法によって得られた神経外胚葉系列細胞、神経堤系列細胞/眼胚系列細胞、眼表面外胚葉系列細胞、及び表面外胚葉系列細胞、あるいは、前記細胞から分化誘導された眼関連細胞は、それ自体、研究、再生医療あるいは後述する細胞製剤の原料として利用することができる。
本発明の方法で得られた上皮系前駆細胞群、及び/又は前記細胞群から分化誘導された角膜上皮細胞群を重層化して培養角膜上皮細胞シートを作製することができる。
ヒトiPS細胞より、無血清培地でフィーダー細胞を用いることなく眼表面上皮・角膜上皮細胞を分化誘導した。分化誘導方法のスキームを図1に示す。
培地を分化培地(10%KSR、1 mM sodium pyruvate、0.1 mM non-essential amino acids、55 μm Monothioglycerolを含むGMEM)に交換し、その後2、3日に1回新鮮な分化培地に交換し、約4週間培養した。
実施例1にしたがってヒトiPS細胞の自律的分化(4週間)によって形成された同心円状のコロニーを、4週目以降成長因子を含む上皮用分化培地に交換し、第3層に出現する眼表面上皮幹細胞をピペッティングにより非上皮性細胞を除去することにより単離した。さらに、8週目以降、角膜上皮培養培地に交換し、角膜上皮前駆細胞への分化誘導を行った。
家兎の角膜輪部全周の上皮細胞層を角膜切除術により除去し、家兎角膜上皮幹細胞疲弊症モデルを作製した。その後、シート状に回収したヒトiPS細胞由来角膜上皮細胞シートを移植した。
移植後7日目では、シート移植群においては角膜透明性が保たれており、フルオレセイン染色によりバリア機能が回復していることが示された。一方、コントロール眼では大部分がフルオレセインで染色され、バリア機能不全の状態のままであった(図12中)。
術後7日目にて安楽死させ、眼球摘出後10%中性緩衝ホルマリン液にて化学固定を行った。その後ヘマトキシリン&エオジン染色により角膜組織を観察した。ヒトiPS細胞由来角膜上皮細胞シートは動物眼へ移植後も、角膜実質面に生着していた。凍結切片を用いた免疫染色解析においては、抗ヒト(H2B)抗体により、家兎眼に生着している上皮層がヒトiPS細胞由来であることが確認され、K12、pax6、p63、MUC16を発現しており、角膜上皮の性質を保持していることが確認できた(図12右)。
実施例1にしたがってヒトiPS細胞の自律的分化(4週間)によって形成された同心円状のコロニーを、4週目以降成長因子を含む上皮用分化培地に交換し、第3層に出現する眼表面上皮幹細胞をピペッティングにより非上皮性細胞を除去することにより単離した。さらに、8週目以降、角膜上皮培養培地に交換し、角膜上皮前駆細胞への分化誘導を行った。
実施例1にしたがってヒトiPS細胞を分化培地で自律的に分化させ(4週間)、同心円状のコロニー(多層構造体)を分化誘導した。分化誘導から3週目において、PITX2陽性、AP2b陽性の細胞塊(眼周囲神経堤細胞)が2層目を中心に誘導された。
実施例1にしたがってヒトiPS細胞を分化培地で自律的に分化させ、同心円状のコロニー(多層構造体)を分化誘導した。分化誘導から14週目において、CD200、SSEA4、ITGβ4を細胞表面マーカーとしてFACSを行った。
Claims (10)
- 多能性幹細胞を、無血清培地でフィーダー細胞を用いることなく二次元培養することにより、多能性幹細胞の自律的分化によって各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーを製造する方法であって、
前記コロニーが、それぞれ神経外胚葉系列細胞、神経堤系列細胞/眼胚系列細胞、眼表面外胚葉系列細胞、及び表面外胚葉系列細胞で構成される層を含む、方法。 - 無血清培地が、0.5nM以上のBMP4(Bone morphogenetic protein 4)、トランスフォーミング増殖因子、及びアクチビンを含まないことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 無血清培地が、さらに高濃度レチノイン酸、BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、及びNogginから選ばれる少なくとも1以上を含まないことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 多能性幹細胞を、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン又はラミニンフラグメント、ビトロネクチン、基底膜マトリックス、ゼラチン、ヒアルロン酸、及びポリリジンから選ばれるいずれか1以上でコーティングされた容器を用いて培養することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法で各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーを製造する工程、
前記コロニーから特定の層に含まれる細胞を分離する工程、
前記細胞を眼関連細胞に分化誘導する工程、
を含む、眼関連細胞の製造方法。 - 眼関連細胞が、角膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、神経網膜細胞、結膜上皮細胞、輪部上皮細胞、角膜内皮細胞、角膜実質細胞、虹彩実質細胞、強膜細胞、虹彩色素上皮細胞、毛様体上皮細胞、視神経細胞、輪部下繊維芽細胞、結膜下繊維芽細胞、涙腺、マイボーム腺、杯細胞、レンズ上皮細胞、及び眼瞼上皮細胞から選ばれるいずれかである、請求項5に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法で各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーを製造する工程、
成長因子を含む培地で前記コロニーを培養する工程、
眼表面外胚葉系列細胞で構成される層に含まれる細胞を分離し、KGF、Rock阻害剤、及び血清代替物を含む培地で培養して、角膜上皮前駆細胞に分化誘導する工程、
角膜上皮前駆細胞を単離し、角膜上皮細胞に分化誘導する工程、
を含む、角膜上皮細胞の製造方法。 - ITGβ4、SSEA4、TRA−1−60、及びCD200から選ばれる1又は2以上のマーカーの発現の有無を指標として角膜上皮前駆細胞を単離することを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 請求項7又は8に記載の方法で角膜上皮細胞を製造する工程、得られた角膜上皮細胞をさらに重層化培養する工程を含む、角膜細胞シートの製造方法。
- 多能性幹細胞由来の各々異なる外胚葉系細胞種で構成される同心円状の層からなるコロニーであって、前記コロニーが、それぞれ神経外胚葉系列細胞、神経堤系列細胞/眼胚系列細胞、眼表面外胚葉系列細胞、及び表面外胚葉系列細胞で構成される層を含むコロニー。
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