ES2823398B2 - Composición biopolimérica, procedimiento para su preparación y uso de la misma - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
Composición biopolimérica, procedimiento para su preparación v uso de la misma
La presente invención se refiere a una composición basada en biopolímeros que imita a la matriz extracelular natural del epitelio pigmentario de la retina (EPR) y que es útil para cultivo de células pluripotentes, así como de células del epitelio pigmentario de retina. La invención se encuadra, por tanto, en el campo de la medicina, ingeniería de tejidos y oftalmología.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La degeneración macular afecta a la porción de la retina responsable de la visión central y de detalle, por lo que causa una importante discapacidad en las personas que la padecen. La forma más frecuente es la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una enfermedad compleja en la que intervienen tanto la predisposición genética como el estilo de vida y que afecta a un creciente número de pacientes, siendo la principal causa de pérdida de visión de las personas a partir de los 70 años de edad (Bhutto I. et al. Mol Aspects Med. 2012;33(4):295-317). Otra distrofia macular es la enfermedad de Stargardt, también conocida como distrofia macular juvenil, en este caso una enfermedad hereditaria recesiva causada por mutaciones principalmente en el gen ABCA4, aunque hay otros genes que también se asocian a esta enfermedad, y que afecta a los individuos en la segunda década de vida. En ambos casos la degeneración comienza en el epitelio pigmentario de la retina (EPR) y secundariamente afecta a los fotorreceptores, que son las células responsables de la percepción del estímulo visual (Strauss O. Physiol Rev. 2005;85(3):845-81). Cuando la degeneración involucra la región macular se pierde la capacidad de leer, conducir, reconocer caras, etc. Actualmente hay pocas opciones terapéuticas para los pacientes de degeneración macular por lo que la terapia celular de sustitución del EPR se está testando a nivel preclínico y clínico como una posible intervención para proteger los fotorreceptores de la degeneración, con el objetivo de detener la progresión de la enfermedad o incluso proporcionar una mejoría visual a las personas afectadas (Nazari H. et al. Prog Retin Eye Res. 2015;48:1-39). Distintos laboratorios (Schwartz SD. et al. The Lancet.
2015;385(9967):509-16; Liu Y. et al. Cell Discov. 2018;4:50; Tezel TH. Investig Opthalmology Vis Sci. 2004;45(9):3337; da Cruz L. et al. Nat Biotechnol.
2018;36(4):328-37. Mandai M. et al. N Engl J Med. 2017;377(8):792-3) están desarrollando ensayos preclínicos y clínicos de terapia celular utilizando células de EPR. Estas células epiteliales pueden derivarse por diferenciación in vitro a partir de células embrionarias o bien a partir de células de pluripotencia inducida (iPSCs) de los propios pacientes, lo que además permitiría un trasplante autólogo. El EPR se cultiva en el laboratorio sobre un sustrato que imita a la matriz extracelular. La matriz extracelular natural del EPR es la membrana de Bruch, que compone una interfase entre el EPR y la capa vascular que está bajo el epitelio, denominada choriocapillaris. La membrana de Bruch está estructurada en cinco capas y su composición es muy compleja, con distintos tipos de colágeno, que forman una matriz reticular, fibrinas, elastina, lamininas, proteoglicanos, fibronectina, etc. y viene determinada por las aportaciones de fibroblastos, EPR y células endoteliales.
El sustrato óptimo para adherencia y cultivo de EPR debe imitar el comportamiento de la membrana de Bruch. La matriz más ampliamente utilizada hasta ahora para cultivo de EPR humano en el laboratorio tiene por nombre comercial Matrigel, y es una membrana basal solubilizada preparada de un extracto del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm por la compañía Corning. Corning® Matrigel® (en adelante, Matrigel), está compuesta por una mezcla heterogénea y variable de proteínas estructurales y factores de crecimiento. Por otra parte, las iPSCs que se utilizan para diferenciar EPR autólogo también necesitan un sustrato de adhesión y crecimiento, que puede ser proporcionado por una capa de fibroblastos inactivados, denominados “feeders” o bien por una matriz comercial, entre las cuales Matrigel es el sustrato más extendido. Esta matriz comercial Matrigel, siendo muy útil para el cultivo celular, tiene como inconvenientes que su composición no está definida al ser producida por células en cultivo, por lo que cada lote conlleva cierta variabilidad. En el campo de la terapia celular, para su uso en las condiciones de una sala blanca (condiciones estériles), es preferible contar con un material de adhesión y crecimiento celular que mantenga una formulación definida y estandarizada y cuya composición mimetice la mezcla de proteínas estructurales de la matriz extracelular natural del EPR. Matrigel es además un producto costoso económicamente y de manejo complicado ya que es muy sensible a la temperatura, gelificando a partir de los 100C. Por ello, ha de conservarse congelado, descongelarse muy lentamente y mantenerse en frío durante la preparación del recubrimiento de la placa de cultivo para evitar que gelifique. Estos inconvenientes han impulsado a los inventores de la presente invención a desarrollar y testar un sustrato
alternativo tanto para el cultivo de ¡PSCs humanas como del EPR derivado de las mismas con el objetivo de proporcionar un material accesible, económico y útil para el trabajo en laboratorios de investigación y para la terapia celular de sustitución de EPR. En definitiva, en base a la composición de las primeras capas de la membrana de Bruch donde descansa el EPR en el fondo del ojo, se pretende producir una matriz que mimetice dicha membrana con una composición definida, un manejo y almacenamiento sencillo y un coste de fabricación competitivo para su aplicación en cultivos celulares en laboratorios de biología celular y, en un futuro, para su aplicación en sala blanca en experimentación pre-clínica y/o ensayos clínicos de terapia celular para enfermedades que involucren la degeneración del EPR.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención han encontrado que una composición que comprende fibrillas de colágeno estructurado (con escalonamiento-D), gelatina y laminina es sustrato óptimo para adherencia y cultivo de células pluripotentes y del EPR, presentando un comportamiento similar a la membrana de Bruch.
Luego, un primer aspecto de la invención se refiere a la composición que se caracteriza por comprender: fibrillas de colágeno estructurado (con escalonamiento-D), gelatina y laminina.
Se trata de una composición biopolimérica, ya que comprende biopolímeros. Por “biopolímero” en la presente invención se entiende un polímero sintetizado por los seres vivos o que procede de ellos. En la presente invención los biopolímeros son fibrillas de colágeno estructurado (con escalonamiento-D), gelatina y laminina.
Las fibrillas de colágeno estructurado (con escalonamiento-D), también denominadas “fibrillas de colágeno D-estructuradas”, son nanofibras de unos 100-150 nm de diámetro formadas por moléculas de atelocolágeno autoensambladas o asociadas entre sí en forma paralela pero escalonada. Este escalonamiento, característico de los tejidos de colágeno nativo, da lugar a un patrón de contraste que se observa por técnicas de microscopía electrónica como consecuencia de la periodicidad en la organización de las moléculas formadoras (de atelocolágeno en este caso). El patrón de escalonamiento-D típico es una constante de periodicidad 67 nm lo que significa que, en toda su longitud, las fibrillas muestran estriaciones transversales en intervalos de 67 nm.
Como es conocido para el experto en la materia, por atelocolágeno se entiende colágeno obtenido a partir de fibras de tropocolágeno por ruptura de sus extremos o telopéptidos, que son los extremos no helicoidales que existen en las moléculas de tropocolágeno, por el tratamiento con enzimas proteasas o peptidasas. El atelocolágeno está desprovisto, por tanto, de telopéptidos, ya que son eliminados con el tratamiento enzimático y es soluble en medio acuoso ácido.
Una propiedad importante del atelocolágeno es que puede volver a conformarse en las estructuras fibrilares ordenadas que se encuentran en las fibrillas de colágeno nativas. Este proceso de formación de fibrillas tiene lugar a pesar de haberse eliminado los telopéptidos. El proceso puede usarse como una ventaja para la síntesis de biomateriales sintéticos de colágeno ya que el material precursor soluble purificado, cuya inmunogenicidad esta reducida sustancialmente, puede conformarse en fibrillas, que adquieren el empaquetamiento nativo que es necesario para muchos procesos moleculares esenciales para las interacciones célula-biomaterial
Tropocolágeno es la unidad básica de una fibra de colágeno, es una hélice triple de tres cadenas polipeptídicas iguales, de unos 1.400 aminoácidos cada una, que se encuentran formando una hélice levógira cada una.
En una realización preferida, la composición además comprende agua, siendo dicha composición líquida. La proporción de agua (% en peso) en la composición puede variar entre 94 y 97%. El resto hasta el 100% del peso estaría compuesto de gelatina, fibrillas de colágeno estructurado y laminina.
En otra realización preferida, la composición consiste en gelatina, fibrillas de colágeno estructurado y laminina. En este caso, la composición sería sólida.
La composición sólida (tipo esponja) de biopolímero presenta una estructura porosa que presenta cavidades o poros entre 1-2 p,m de diámetro (medido por microscopía electrónica de barrido con un equipo de emisión de campo, FEG-SEM, por sus siglas en inglés Field Emission Gun-Scanning Electron Microscopy).
En una realización preferida, la proporción de cada componente (biopolímero) respecto a la suma total de los tres biopolímeros (% en peso) en la composición está entre:
95,8 y 99, 5 de gelatina,
0,33 y 3,50 de fibrillas de colágeno (con escalonamiento-D),
0,16 y 0,65 de laminina,
siendo 100% la suma total de los porcentajes de los tres biopolímeros
Luego si la composición consiste en gelatina, fibrillas de colágeno con escalonamiento D y laminina, la composición en peso preferida es la anteriormente descrita. Si la composición comprende además agua, los porcentajes anteriores están referidos al total de los biopolímeros en la composición (sin tener en cuenta el agua, % en seco).
Por tanto, de manera preferida, la gelatina es el componente mayoritario en el que se integran las fibrillas de colágeno y la laminina.
En una realización más preferida, la proporción de cada componente respecto al total de biopolímeros (% en peso) en la composición es:
97,2 de gelatina,
2,6 de fibrillas de colágeno (con escalonamiento-D),
0,2 de laminina.
La composición así descrita mimetiza la matriz extracelular natural del EPR, lo que la hace especialmente útil para el cultivo de células del EPR, así como células pluripotentes a partir de las que se generan las células del EPR. A diferencia de las composiciones convencionales existentes para este fin, la composición de la invención tiene una composición definida por lo que no está sujeta a variabilidad, que daría lugar a una falta de reproducibilidad debido a la existencia de parámetros composicionales no controlados. Además, presenta un manejo y almacenamiento sencillo y un coste de fabricación competitivo para su aplicación en cultivos celulares
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de la composición biopolimérica descrita en el primer aspecto que comprende las siguientes etapas: i.
i. preparación de fibrillas de colágeno con escalonamiento D y
¡i. preparación de una solución en agua o en una mezcla de agua y etanol de las fibrillas de colágeno con escalonamiento D obtenidas en la etapa anterior, laminina y gelatina.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, la preparación de las fibrillas de colágeno con escalonamiento D comprende las siguientes etapas:
a) mezcla de atelocolágeno con una solución salina hasta alcanzar una concentración de atelocolágeno en la solución de entre 0,50 y 2,48 mg m L1;
b) ajuste del pH de la solución de atelocolágeno obtenida en la etapa a) hasta un valor comprendido entre 7,0 y 8,0;
c) incubación de la solución de la etapa b) de atelocolágeno a una temperatura comprendida entre 250C y 340C durante un periodo de tiempo comprendido entre 4 h y 48 h;
d) lavado de la suspensión de fibrillas de colágeno con escalonamiento D obtenidas en la etapa c).
La realización de las etapas a)-c) da lugar al autoensamblado de las moléculas de atelocolágeno, formando fibrillas de colágeno D-estructuradas.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, la preparación de la solución en agua o en una mezcla de agua y etanol de las fibrillas de colágeno con escalonamiento D, laminina y gelatina, se prepara con la siguiente concentración de cada componente biopolimérico:
entre 30 y 60 mg mL'1 de gelatina
entre 0,20 y 1,10mg mL'1 de fibrillas de colágeno (con escalonamiento-D)
entre 0,10 y 0,20 mg mL'1de laminina.
Las etapas del procedimiento se llevan a cabo en condiciones de esterilidad.
El procedimiento según se ha descrito daría lugar a una composición líquida debido a la presencia de agua o agua y etanol.
El atelocolágeno es comercialmente accesible, por ejemplo, en forma de viales de la molécula solubilizada en medio ácido.
El atelocolágeno es preferiblemente de origen bovino, aunque cualquier atelocolágeno, como el de origen porcino, podría utilizarse en el procedimiento de la invención.
La gelatina es preferiblemente de origen porcino, aunque cualquier gelatina podría utilizarse en el procedimiento de la invención. Se puede adquirir comercialmente.
Las lamininas, como es bien conocido, son glucoproteinas de elevada masa molecular (aproximadamente de entre 140 a 400 kDa). Cualquier laminina podría utilizarse en el procedimiento de la invención. Se pueden adquirir comercialmente. Las lamininas también podrían sintetizarse, por ejemplo, de la manera descrita en: Aisenbrey S, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006 Dec;47(12):5537-44 (por ejemplo, las lamininas nombradas como laminina 1,5, 10y11 que se describen en dicho artículo).
En una realización preferida, en la etapa a) la mezcla del atelocolágeno con una solución salina tiene una concentración de atelocolágeno de 2,48 mg mL'1 y el pH se ajusta en la etapa b) a 7,4.
La disolución salina utilizada en la etapa a) es una disolución acuosa que comprende preferiblemente sales de fosfato, más preferiblemente comprende una mezcla de Na2HP04 y KH2PO4, aún más preferiblemente, una mezcla equimolecular de Na2HP04 y KH2PO4 y aún más preferiblemente, una mezcla Na2HP04 IM/KH2PO4 1M. A fin de aumentar la fuerza iónica en la disolución salina, se puede añadir otra sal, como por ejemplo cloruro sódico, en cantidades entre 20 y 35 mg mL'1, más preferiblemente 35 mg mL'1. La fuerza iónica favorece en el proceso de autoensamblado de las moléculas de atelocolágeno.
El ajuste de pH de la etapa b) se puede llevar a cabo mediante la adición de la cantidad de ácido (por ejemplo, HCI) o base (por ejemplo, NaOH, KOH, etc) necesaria.
El lavado de la etapa d) comprende preferiblemente la adición de agua a la solución resultante de la etapa c) seguido de centrifugación y posterior eliminación del sobrenadante.
En una realización preferida, la solución de los tres biopolímeros se prepara con la siguiente concentración de cada componente:
40 mg mL'1 de gelatina,
1,07 mg mL'1 de fibrillas de colágeno (con escalonamiento-D),
0,10 mg mL'1de laminina.
En una realización de la invención, la solución de los tres biopolímeros se prepara en agua, dando lugar a una composición líquida (en la presente invención, esta composición líquida se denomina Colamigel-L).
En otra realización de la invención, la solución de los tres biopolímeros se prepara en una mezcla agua y etanol, con proporciones agua/alcohol (v/v) comprendidas entre 45/55 y 65/35. En una realización preferida, la proporción agua:etanol (v/v) es de 60/40.
En otra realización más preferida de la invención, en caso de que la solución se prepare en una mezcla de agua y etanol, el procedimiento adicionalmente comprende las siguientes etapas:
- Proceso de enfriamiento de la solución de los biopolímeros en la mezcla de agua y etanol a -80oC durante un periodo de entre 5 y 24 h ,
- Tratamiento de lavado con etanol a -20°C entre 10y 24h,
- Liofilización de la solución lavada con etanol obtenida en la etapa anterior, donde la liofilización se lleva a cabo a una presión de 0,02-0,04 mbares durante 10-24h de manera que se elimina el agua y el etanol,
-Tratamiento térmico a vacío del sólido resultante en la etapa de liofilización a 5 10 mbary 140-160°C durante 20-48h.
En la etapa de enfriamiento de la solución a -80oC los biopolímeros preferiblemente se disponen en el agua, de manera que se crean microdominios de etanol en los que preferiblemente no hay biopolímeros o se éstos se disponen en menor proporción que con respecto al agua. Al liofilizarse esta solución, los disolventes se van evaporando y las zonas o microdominios de etanol darán lugar a cavidades o poros, formándose así una estructura tipo esponja.
Tras el tratamiento térmico se obtiene una composición en estado sólido, tipo esponja
(denominada en la presente invención, Colamigel-S) formada por una matriz de gelatina que es el componente mayoritario, fibrillas de colágeno y laminina.
En una realización preferida, el tratamiento de lavado con etanol a -20°C se lleva a cabo durante 20 h.
En una realización preferida, la liofilización se lleva a cabo a una temperatura entre -30oC y 20°C. En una realización preferida, la liofilización se lleva a cabo a una presión de 0,04 mbares durante 10h.
En otra realización preferida, el tratamiento térmico se lleva a cabo a 10mbar y 150°C durante 20 h.
La presente invención también se refiere a la composición obtenida mediante el procedimiento descrito en el segundo aspecto de la invención. La composición obtenida por el procedimiento descrito presenta las características definidas en el primer aspecto de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición definida anteriormente para el cultivo y mantenimiento de células pluripotentes y/o para el cultivo y mantenimiento de células del epitelio pigmentario de la retina (EPR).
Las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) son células que se derivan, a su vez, de células pluripotentes.
Dentro de las células pluripotentes se incluyen las células pluripotentes inducidas (iPSCs).
Para el cultivo y mantenimiento de dichas células, la composición de la invención se deposita sobre placas de cultivo y se lleva a cabo el acondicionamiento de la misma con el medio de cultivo adecuado. En el caso de utilizar la composición en estado sólido, ésta previamente se sumerge en etanol absoluto, seguida de lavado con una disolución tampón salina (por ejemplo, una disolución de Na2HP04/KH2P04) y posterior hidratación de la misma.
La composición de la invención ha resultado de utilidad en el cultivo de células iPSCs humanas cultivadas sobre Colamigel L y S (composición de la invención). Se sembraron fragmentos de colonias de iPSCs sobre los sustratos y se estudió su crecimiento y mantenimiento de la pluripotencia mediante el estudio de su morfología, marcadores por inmunotinción in situ y tinción con fosfatasa alcalina. En todos los casos se apreció un crecimiento similar de las colonias de iPSCs sobre el nuevo material en comparación al sustrato control (Matrigel), manteniendo las células todas las características que les son propias en cuanto a morfología y expresión adecuada de marcadores de pluripotencia, por lo que Colamigel puede ser considerado un material sustitutivo de Matrigel para el cultivo y mantenimiento de iPSC humanas, aportando como ventajas principales el que presenta una composición definida y estable, es más económico y de manejo más cómodo para el usuario.
Células EPR derivadas de iPSCs humanas fueron cultivadas sobre Colamigel-L y tras un mes de cultivo se evaluó la morfología celular madura mediante microscopio óptico y mareaje con faloidina y DAPI para la observación de los filamentos de F-actina y los núcleos celulares respectivamente. En todos los casos se apreció un crecimiento similar de las células EPR derivadas de iPSCs humanas sobre el nuevo material en comparación al sustrato control (Matrigel), manteniendo todas las características que les son propias en cuanto a morfología y expresión adecuada de marcadores específicos de EPR, por lo que Colamigel-L puede considerarse un material sustitutivo de Matrigel, apropiado como sustrato basal para el cultivo y mantenimiento de EPR derivado de iPSCs humanas, aportando como ventajas principales el que presenta una composición definida y estable, es más económico y de manejo más cómodo para el usuario.
Un último aspecto de la invención se refiere a un cultivo celular que comprende células pluripotentes o células del EPR y la composición de la presente invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1: (a) Representación de la ruta de síntesis de Colamigel-L, consistente en la mezcla de fibrillas con estructura escalonada D de periodicidad 67 nm, formadas previamente mediante el proceso de autoensamblado molecular a partir de una solución precursora de atelocolágeno, y su mezcla con las soluciones de gelatina y laminina . (b) Imagen de un tubo Eppendorf conteniendo el producto final Colamigel-L y (c) imagen de la caracterización de la nanoestructura D de las fibrillas del componente de colágeno obtenida mediante microscopía electrónica de barrido en modo de transmisión (STEM) previa preparación de la muestra utilizando una tinción negativa.
FIG. 2: (a) Esquema de la síntesis de las piezas de Colamigel-S, consistente en el conformado de la mezcla de gelatina, fibrillas de colágeno con estructura D, laminina, agua y etanol; enfriamiento de la mezcla; liofilización y tratamiento térmico, también denominado tratamiento dehidrotermal (DHT). (b y c) Imágenes de caracterización de Colamigel-S mediante microscopía electrónica de barrido FEG-SEM. (d) Gráfica de fisisorción de nitrógeno, isoterma y (e) estimación de los parámetros de superficie especifica y volumen de mesoporo. (f) Análisis de difracción de rayos X y (g) de espectroscopia infrarroja en comparación con muestras control preparadas por el mismo procedimiento (a) pero constituidas por un único componente, solución de gelatina (NfGel) ó dispersión de fibrillas de colágeno con estructura D (DCol).
FIG. 3: Caracterización del crecimiento y mantenimiento del estado pluripotente de ¡PSCs humanas cultivadas sobre los distintos sustratos. En la fila superior se presenta la inmunotinción in situ para TRA 1-60, que es un antígeno celular de superficie específico y característico de células pluripotentes; en la fila inferior, actividad de la fosfatasa alcalina.
FIG. 4: Caracterización detallada del mantenimiento del estado pluripotente de ¡PSCs humanas cultivadas sobre Colamigel-L y Matrigel, mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de marcadores específicos y característicos de células pluripotentes; como son los antígenos de superficie TRA 1-81 y SSEA4 y los factores de transcripción de localización nuclear NANOG y OCT4. En la figura se puede apreciar mareaje positivo y localización adecuada en todos los casos.
FIG. 5: Caracterización detallada del mantenimiento del estado pluripotente de iPSCs humanas cultivadas sobre Colamigel-S y Matrigel, mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de marcadores específicos y característicos de células pluripotentes; como son los antígenos de superficie TRA 1-81 y SSEA4 y los factores de transcripción de localización nuclear NANOG y OCT4. En la figura se puede apreciar mareaje positivo y localización adecuada en todos los casos.
FIG. 6: Morfología de EPR derivado de iPSCs humanas cultivado durante 30 días sobre Colamigel-L en comparación con las condiciones estándar sobre Matrigel.
FIG. 7: Caracterización del crecimiento y diferenciación de EPR procedente de iPSCs humanas cultivadas durante 60 días sobre Colamigel-L y el material de referencia Matrigel, mediante inmunofluorescencia. Faloidina (Phalloidin), se utilizó para el mareaje de los filamentos de actina del citoesqueleto, lo que permitió observar la característica morfología poligonal de las células de EPR maduras. También se detectó la presencia y correcta localización subcelular para dos proteínas características de EPR: RPE65, que corresponde a una enzima del ciclo de regeneración de los pigmentos visuales, localizada en el citoplasma y bestrofina (BEST1), que corresponde con un canal de cloro transmembrana localizada en la porción baso-lateral de las células EPR, una de cuyas principales características es la marcada polaridad apico-basal.
EJEMPLOS
A continuación, se describen las composiciones preparadas y se muestra su utilidad en el cultivo celular tanto de EPR como de iPSCs humanas y su capacidad para sostener el crecimiento y mantenimiento de las características celulares propias de ambos tipos celulares, lo que permitirá desarrollar todo el proceso de cultivo y diferenciación de EPR autólogo sobre el mismo material.
Ejemplo 1: Composición de la invención con consistencia líquida (Colamigel-L): Preparación v caracterización
La matriz Colamigel está compuesta por fibrillas de colágeno con estructura de escalonamiento D autoensambladas a partir de un precursor de atelocolágeno que se mezcla con una solución de gelatina y otra de laminina. De esta forma se consigue una matriz de biopolímero de composición definida, barata y segura, con un componente
mayoritario de cadenas de gelatina, con baja organización, pero que incorpora la organización necesaria para el reconocimiento celular mediante funcionalización con las fibrillas de colágeno provistas con los dominios supramoleculares que le proporciona la estructura cuaternaria formada por el autoensamblado de las moléculas de colágeno solubles. La fabricación de Colamigel-L se llevó a cabo en condiciones de esterilidad, por tanto, cada uno de los pasos aquí descritos se ha realizado en cabina de flujo laminar y utilizando material estéril.
La primera etapa para la síntesis de Colamigel consiste en el proceso de fibrilogénesis o autoensamblado de los monómeros de atelocolágeno para obtener un gel que contiene fibrillas con estructura de escalonamiento D. Se utilizó una solución de concentración de 3,1 mg mL'1 de atelocolágeno tipo I de piel bovina en ácido clorhídrico, HCI 0,01M (BD Biosciences, 354231). Para ello, 500 pL de esta solución ácida precursora de colágeno se pipetearon a un tubo de plástico (Eppendorf) que se mantuvo a 4°C en un termobloque (CH-100, Biosan). A continuación, se añadieron 125 pL de la solución tampón Na2HP04 (1M) 6,23 mL/KH2P04(1M) 1,26 mL con una fuerza iónica de 1000 mM (1,75 g de NaCI) y una concentración de fosfatos de 150 mM que había sido previamente enfriada. La concentración final de reacción de las moléculas de colágeno fue de 2,48 mg mL'1. La solución mezcla fue agitada intensamente durante 20 segundos utilizando un agitador vórtex. El pH de la solución se ajustó a 7,4 adicionando 1,7 pL de NaOH 0,1 g mL'1. En este punto, la solución era clara e incolora. El siguiente paso consistió en transferir la solución neutralizada a un termobloque (AccuBlockTM Digital Dry Baths, 20 Labnet) a la temperatura adecuada 34 °C ó temperatura ambiente (25°C) para su reacción a los tiempos diferentes de 4 ó 24 h. Tras la incubación se obtuvo un gel turbio que se sometió a un tratamiento de lavado para la eliminación de las sales provenientes de la disolución tampón. El protocolo consistió en dispersar las fibrillas con agitación vórtex durante 2 minutos seguido de centrifugación a 5000 r.p.m. durante 60 segundos. Después del centrifugado, se eliminaron 200 pL del sobrenadante y se añadió 1 mL de dH2Ü (agua desionizada), se agitó con vórtex 1 minuto, se volvió a centrifugar y a retirar 1 mL de sobrenadante. Se repitió el proceso con otro 1 mL de dH20. Finalmente, se agitó en vórtex durante otros 2 minutos. La posible pérdida de fibrillas de colágeno fue determinada mediante ensayo Bradford en el agua sobrante del lavado. Este análisis determinó una concentración final de colágeno fibrilar en la dispersión precursora de 3,57 mg mL'1. Para comprobar la estructuración de las fibrillas, el gel obtenido fue observado por microscopía electrónica de barrido en el modo de trasmisión STEM. La Figura 1 muestra una micrografía donde se observan las bandas
con contrate claro-oscuro con el patrón característico de 67 nm (escalonamiento D). Después del protocolo de lavado, la suspensión de colágeno con estructura se pasó del tubo Eppendorf a un recipiente de vidrio con tapadera y se pre-acondicionó (agitó) durante 1 hora utilizando un agitador magnético a 1300 rpm y 34°C.
Para llevar a cabo la siguiente etapa, se necesitó una solución de gelatina (Sigma-Aldrich, N0 CAS 9000-70-8) en agua al 66,7 mg mL'1 que se esterilizó en autoclave y se mantuvo a 40C. Para esta preparación, se calentó la solución de gelatina en una estufa a 50oC hasta obtener una solución homogénea. 0,6 mL se incorporaron a un recipiente de cristal de 2 mL de capacidad a 350C y agitación de 1100 r.p.m.. A continuación, se incorporó 0,1 mL de la solución de laminina (Sigma, L2020) (1 mg mL'1). La mezcla se agitó durante 10 minutos y seguidamente se añadieron 0,3 mL de la dispersión de las fibrillas de colágeno (con concentración de 3,57 mg mL'1), obteniendo un gel de composición gelatina/colágenoD/laminina = 97,2/2,6/0,2; expresada como la suma total de los tres biopolímeros (porcentaje en peso). Para su mantenimiento, el gel se conservó a -20°C hasta su utilización.
Ejemplo 2: Matriz Colamiqel con consistencia sólida, Colamiqel-S: Procesado v caracterización
Para la obtención de matrices Colamigel-S (Figura 2a) se preparó una mezcla de la misma composición final gelatina/colágenoD/laminina que para Colamigel-L pero en la que se incorporó etanol para llevar a cabo el proceso de separación de fases inducida térmicamente para la obtención de matrices microporosas. Se procedió mezclando 0,04 g de gelatina en 200 pL dH2Ü en un recipiente de vidrio de 2 mL y agitación a 500 rpm a 45 °C durante 45 minutos. A continuación, fueron añadidos a la mezcla de gelatina 200 pL de etanol (UN1170, AnalaR Normapur) y se agitaron durante otros 30 minutos. Después de este tiempo, la temperatura se bajó a 34°C y se añadió 100 pL de laminina (Sigma, L2020) y se agitó durante 10 minutos. 300 pL de la dispersión pre acondicionada de fibrillas D-estructuradas de atelocolágeno y 200 pL de etanol se añadieron a la mezcla que se mantuvo en agitación magnética durante 45 min a 500 rpm. Considerando como agua el volumen de los 300 pL de la dispersión preacondicionada de fibrillas de colágeno y la solución de laminina, se estimó una relación agua/etanol (v/v) final de 60/40. Finalmente, 100 pL de la mezcla fueron conformados en los pocilios de una placa de poliestireno de 96 pocilios (655161, Greiner Bio-one) ó 300 pL para placa de 24 pocilios, colocada y precalentada en un termobloque
a 36 °C. A continuación, la mezcla conformada en los pocilios fue sometida a un proceso de separación de fases inducida térmicamente a -80 °C durante 5 h.A continuación, se añadieron 200 pL de etanol a cada pocilio y las placas se mantuvieron durante 20 h en un congelador a -20 °C. El siguiente paso consistió en escurrir el etanol de las placas y la liofilización de las piezas utilizando el programa que se detalla en la Tabla 1.
Tabla 1. Programa del tratamiento de liofilización.
EL1 EL2 EL3 EL4 EL5 EL6 EL7 EL8 EL9 Temperatura (°C) -30 -30 -30 -20 -20 0 0 20 20 Presión (mbar) 0,120 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 Tiempo (hh:mm) 3:20 0:20 10:00 1:00 4:00 0:20 0:30 0:20 0:30 a EL: Etapa de Liofilización
Finalmente, los materiales ya secos fueron sometidos a un proceso de entrecruzamiento utilizando un tratamiento térmico a vacío (DeHydroThermal, DHT treatment) consistente en el programa que se presenta en la Tabla 2.
Tabla 2. Programa de tratamiento DHT.____________________________________
Tiempo Temperatura Presión (hh:mm) (°C) (mbar) Etapa 1 00:05 Ta. ambiente (20-24) 10
Etapa 2 02:00 150 10
Etapa 3 20:00 150 10
Etapa 4 03:00 43 10
Etapa 5 00:05 43 1000
La Figura 2 b-g presenta la caracterización de las matrices Colamigel-S mediante las técnicas de microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (Field Emission Gun Scanning Electron Microscopy, FEG-SEM), fisisorción de nitrógeno, difracción de rayos X y espectroscopia infrarroja. Las micrografías FEG-SEM (Figura 2 b-c) muestran la microestructura porosa del material en la que se aprecian cavidades interconectadas de entre 1 y 2 pm, que se forman por entramado de las fibras de biopolímero con diámetro entre 70 y 100 nm. El ajuste BET a partir de la isoterma de adsorción de nitrógeno mide una superficie específica de17± 2 m2g-1 (Figura 2 d).
La Figura 2f presenta los diagramas de difracción en condiciones de rutina (Wide Angle
X-ray Diffraction, WAXRD), para la matriz Colamigel-S en comparación con dos materiales control preparados de forma similar al procedimiento descrito pero constituidas por un único componente, solución de gelatina (NfGel) ó dispersión de fibrillas de colágeno con estructura D (DCol). El difractograma de Colamigel-S presenta, al igual que DCol, el pico característico de colágeno de más bajo ángulo a 20 = 5,5 y varios más con distinta intensidad superpuestos a la banda ancha entre 20 = 12-27, única señal observada en materiales amorfos como la gelatina. Este análisis confirma por tanto, que el procedimiento descrito para la preparación de Colamigel-S preserva la estructura supramolecular correspondiente a las fibrillas de colágeno con estructura D. Aunque el espectro de infrarrojo para Colamigel-S de la Figura 2g, es menos determinante que el análisis WAXRD sobre las características estructurales del material, la comparación con el espectro de gelatina NfGel, componente mayoritario en Colamigel-S, permite la identificación de variaciones en las componentes de las bandas correspondientes a los grupos funcionales Amida A (~ 3300 cm_1) y Amida I (intensidad relativa de las banda a 1660 y 1630 cm_1) que sugieren la identificación de colágeno en el material.
Ejemplo 3: Acondicionamiento de Colamiqel-L v Colamigel-S para cultivo celular con células humanas pluripotentes inducidas (¡PSCs) v de epitelio pigmentario de la retina (EPR)
Colamigel-L previamente esterilizado en autoclave se mantiene a -20°C y se descongela a temperatura ambiente para su uso. Para obtener un gel homogéneo se calentó a 37°C durante 2 min. Se preparó una dilución 1:10 en medio de cultivo DMEM-F12 y se depositaron 0,5 mL de dicha dilución por pocilio en una placa de 24 pocilios. Después de una hora a temperatura ambiente, se realizó un lavado con medio de cultivo DMEM-F12, se retiró y se sustituyó por el medio de cultivo apropiado para el tipo celular. Como control positivo se prepararon pocilios en una placa de 24 pocilios con el material comercial de referencia Matrigel Corning (cat n0 356277, Life Sciences), diluido conforme a las instrucciones del proveedor y se mantuvo durante 1 hora a temperatura ambiente. Antes de su uso, se lavó con DMEM-F12 (GIBCO, 11330057) dos veces y se dejó en el medio de cultivo apropiado para el tipo celular hasta su uso. Como control negativo se utilizaron pocilios sin sustrato de adherencia, sólo con medio de cultivo.
Las matrices Colamigel-S necesitan ser esterilizadas. Para ello, se introdujeron en
etanol absoluto durante 3 horas y, a continuación, permanecieron 16 h en etanol al 70%. Al día siguiente se realizaron 3 lavados con PBS (GIBCO, 10010023) de 1 hora de duración cada uno. Una vez preparadas y esterilizadas, las matrices Colamigel-S se depositaron en el fondo de los pocilios de cultivo y se hidrataron en medio apropiado para el cultivo celular durante 1h antes de depositar las células.
Medios de cultivo:
- Para células ¡PSCs humanas se utiliza medio mTeSR™1 (Stemcell Technologies). - Para cultivo de células EPR derivadas de ¡PSC humanas se utiliza medio HESC-15% (KO DMEM; KSR 15%; Glutamax 2mM; aminoácidos no esenciales 0,1 mM; pmercaptoetanol 0,23mM; Penicilina/streptomicina, todo de GIBCO).
Ejemplo 4: Aplicación de Colamiqel-L v Colamiqel-S en el cultivo v mantenimiento del crecimiento en forma de colonias v del estado pluripotente de células ¡PSCs humanas
Células ¡PSCs humanas fueron cultivadas sobre Colamigel-L y Colamigel-S. Se sembraron fragmentos de colonias de ¡PSCs sobre los sustratos, el control positivo (Matrigel) y el negativo (únicamente medio de cultivo). Se siguió la evolución comparada del crecimiento de colonias de ¡PSCs sobre las matrices de la invención a lo largo de 7 días de cultivo en medio sin suero (mTeSR™1). Se observó un crecimiento similar en los tres tipos de matrices ensayadas. En los pocilios de control negativo en los que no se dispuso matriz de adhesión no hubo crecimiento de ¡PSCs.
La Figura 3 muestra imágenes tomadas a microscopio de fluorescencia de las colonias que crecieron sobre los distintos sustratos, teñidas con un anticuerpo específico de superficie que se utiliza como marcador de pluripotencia (TRA 1-60). Las imágenes se tomaron directamente de la placa de cultivos después de incubar las células en cultivo con un anticuerpo conjugado para mareaje “in situ” (Mouse anti-human TRA 1-60, Stemgent, cat n0: 09-0010) según la siguiente metodología: Las células se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2 hasta que las colonias tuvieron un tamaño adecuado para tomar imágenes. Se retiró el medio de cultivo del pocilio y se sustituyó por una dilución del anticuerpo primario a una concentración final de 2,5 pg/ml en medio de cultivo fresco, que se mantuvo en contacto con las células durante 30 minutos a 37 °C y 5% de CO2. El medio con el anticuerpo se aspiró y el cultivo se lavó dos veces con medio de cultivo
fresco. Inmediatamente se tomaron imágenes en un microscopio de fluorescencia Olimpus Ix7l y una cámara DP72 directamente desde la placa de cutivo. Se aprecia que tanto en Colamigel-L como en Colamigel-S las células iPSCs forman colonias planas y compactas de células con un alto ratio núcleo/citoplasma y que presentan mareaje positivo para TRA 1-60 (marcador de pluripotencia). La especificidad del mareaje de superficie se aprecia en la magnificación en el cuadrante superior izquierdo de cada imagen. Adicionalmente se presenta el resultado de la reacción de detección de actividad fosfatasa alcalina (coloración rojiza), que está específicamente elevada en células pluripotentes. Para revelar dicha actividad se utilizó el kit Alkaline Phosphatase II, Stemgent Cat N0: 00-0055, siguiendo las instrucciones del fabricante; en concreto: Se aspiró el medio de cultivo y se lavó dos veces con PBST (PBS 0,05% Tween-20). Se incubaron las células con solución de fijación durante cinco minutos, se aspiró la solución de fijación y de nuevo se realizaron dos lavados con PBST. Inmediatamente se cubrieron las células con solución “AP Substrate Solution” recién preparada (0,5 mL solución A 0,5 mL solución B, incubados por 2 min a temperatura ambiente 0,5 mL solución C) y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente entre 5 y 15 minutos. Se observaron las células periódicamente y se detuvo la reacción una vez apareció la coloración rojiza, aspirando el sustrato y lavando dos veces con PBS para detener la reacción y evitar señal inespecífica. Se tomaron imágenes en microscopio óptico Zeiss Axiovert 40C con una cámara Axiocam ERc5c directamente de las placas de cultivo. Todas las colonias de iPSCs humanas cultivadas tanto en Colamigel-L como en colamigel-S fueron positivas para fosfatasa alcalina.
La Figura 4 presenta una caracterización más completa del estado pluripotente de las células iPSCs cultivadas sobre Colamigel-L comparadas con el crecimiento sobre Matrigel como control. Se ha realizado inmunofluorescencia para marcadores específicos de células pluripotentes. Estas imágenes tienen mayor definición que las de la Figura 3 al estar tomadas de reparaciones de células cultivadas sobre láminas de vidrio (Microscope cover Glasses High Precisión, Paul Marienfeld GmbH cat N0 01117530) sobre las que se depositaron las matrices de adherencia del mismo modo que se hizo sobre el fondo de los pocilios de cultivo antes de poner a crecer las células. El método comienza con la fijación de las células, retirando el medio de cultivo, lavando dos veces con PBS, incubando 15 minutos en paraformaldehido al 4%, (Aldrich 16005) y volviendo a lavar dos veces con PBS. Una vez fijadas, las preparaciones se incubaron con solución de permeabilización y bloqueo (PBS sero albúmina bovina 1% (Milliopre
12659) TRITON X-100 0,2% (Sigma T-9284)) durante 1h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 0C siendo diluidos en solución de bloqueo en las siguientes proporciones (rabbit anti-OCT4 (Cell Signalling C30A3) 1:400; rabbit anti-NANOG (Cell Signalling D73G4) 1:400; mouse anti-TRA 1-81 (Stemgent 09-0068) 1:100 y mouse anti-SSEA4 (BD Pharmingen 560073) 1:100). Se realizaron 3 lavados de 10 minutos a temperatura ambiente con PBS y se incubaron por 2 h a temperatura ambiente y protegidos de la luz con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo diluidos en PBS 1:500 (goat anti-rabbit 594 (Invitrogen A11001) y goat anti-mouse 488 (Invitrogen A11012)). Después de 3 lavados de 10 minutos con PBS se terminó la preparación colocando las láminas de vidrio sobre un portaobjetos de vidrio para microscopía sobre una gota de medio de montaje “anti-fade” con DAPI (Diamidino-2-Phenylindoline) para marcar los núcleos de las células (Vectashield Mounting Médium, Vector Lab H-1200). Se tomaron imágenes con un microscopio confocal de fluorescencia Leica TCS SP5.
Se aprecia claramente que las colonias iPSCs presentan una morfología característica de este tipo de cultivo, con colonias planas formadas por una masa compacta de células pequeñas con mareaje positivo y específico para los marcadores de pluripotencia TRA 1-81, NANOG, SSEA4 y OCT4, que componen un panel estándar de caracterización de células pluripotentes.
Del mismo modo, se realizó una caracterización completa de la pluripotencia de células iPSCs cultivadas sobre Colamigel-S siguiendo la misma metodología y utilizando los mismos materiales explicados para la figura 4. El resultado se presenta en la Figura 5. Se puede apreciar que, en todos los casos, las células iPSCs expresan marcadores de pluripotencia nucleares y citosólicos en la correcta localización celular, confirmando la capacidad del sustrato Colamigel-S de proporcionar las condiciones para el crecimiento indiferenciado de células iPSCs humanas y el mantenimiento de sus características de pluripotencia.
Como conclusión, podemos decir que Colamigel-L y Colamigel-S han demostrado promover el crecimiento de iPSCs humanas en condiciones feeder-free, así como el mantenimiento de la pluripotencia de las células.
Ejemplo 5: Aplicación de Colamigel-L en el cultivo v mantenimiento del estado diferenciado de células de EPR derivadas de iPSCs humanas
A partir de las iPSCs humanas, se obtuvieron por técnicas estándar de diferenciación in vitro, células de EPR. Se sembraron 60.000 células por pocilio de placa de 24-well después de aplicar como sustrato de cultivo Matrigel como material control de referencia y Colamigel-L según preparación y acondicionamiento ya explicados en el Ejemplo 3 de este documento. Se siguió la evolución del crecimiento y de re-adquisición de la morfología característica del EPR, para ello se cultivaron las células durante 60 días sobre los diferentes sustratos. Las células de EPR al ser un epitelio monoestratificado, poseen una morfología muy característica como el “empedrado” de una calzada. La función de estas células y la salud del tejido que componen están directamente relacionadas con el mantenimiento de esta morfología, ya que tapizan el fondo de la retina y son el principal componente de la barrera hemato-retinaiana.
Para el cultivo de estas células en el laboratorio en condiciones estándar, se siembran sobre Matrigel y se dejan alcanzar la confluencia durante dos a tres semanas. Antes de alcanzar la confluencia, las células de EPR presentan una morfología fusiforme parecida a la de los fibroblastos. Una vez alcanzada la confluencia comienza la re-adquisición de las características morfológicas del EPR, lo que va asociado a la re-adquisición de sus características fisiológicas. A partir de ahí, el cultivo se puede extender por varios meses en los que se alcanza un mayor grado de madurez y pigmentación. En nuestro caso, para probar si las matrices desarrolladas sirven para soportar el crecimiento y diferenciación hacia la morfología madura del EPR derivado de iPSCs humanas, hemos evaluado la morfología después de 30 días de cultivo tomando imágnes con microscopio óptico Zeiss axiovert 40C con una cámara Axiocam ERc5c directamente de las placas de cultivo.
En la Figura 6 se aprecia como la morfología del EPR después de un mes en cultivo sobre sustrato Colamigel-L no difiere del control sobre Matrigel. Presentando un aspecto de epitelio monoestratificado con células que, a medida que van madurando adquieren una morfología cuboidal.
El cultivo de EPR se dejó madurar y, a los 60 días, se realizó una inmunotinción con marcadores específicos de EPR para verificar que el epitelio mantiene sus características fisiológicas específicas. Esta inmunotinción se realizó con céulas que se habían cultivado sobre láminas de vidrio (Microscope cover Glasses High Precisión,
Paul Marienfeld GmbH cat N001117530). El método comienza con la fijación de las células, retirando el medio de cultivo, lavando dos veces con PBS, incubando 15 minutos en paraformaldehido al 4%, (Aldrich 16005) y volviendo a lavar dos veces con PBS. Una vez fijadas, las preparaciones se incubaron con solución de permeabilización y bloqueo (PBS seroalbúmina bovina 1% (Milliopre 12659) TRITON X-100 0,2% (Sigma T-9284)) durante 1h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 0C siendo diluidos en solución de bloqueo en las siguientes proporciones (rabbit anti-BEST1 (Novus biological NB300-164) 1:100; rabbit anti-RPE65 (Bioss, bs-9575R) 1:100). Se realizaron 3 lavados de 10 minutos a temperatura ambiente con PBS y se incubaron por 2 h a temperatura ambiente y protegidos de la luz, con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo, diluido en PBS 1:500 (goat anti-rabbit 594 (Invitrogen A11001)).
Para la tinción con faloidina conjugada a fluoróforo rodamina (Phalloidin Sigma P1951) se incubaron las células fijadas y permeabilizadas con una solución de faloidina diluida 1:500 (6.6pg/mL) durante 30 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad, sin necesidad de usar anticuerpo secundario.
Después de 3 lavados de 10 minutos con PBS se terminó la preparación colocando las láminas de vidrio sobre un portaobjetos de vidrio para microscopía sobre una gota de medio de montaje “anti-fade” con DAPI (Diamidino-2-Phenylindoline) para marcar los núcleos de las células (Vectashield Mounting Médium, Vector Lab H-1200). Se tomaron imágenes con un microscopio de fluorescencia Leica AF6000 y una cámara cámara Leica DFC350 FX.
En la Figura 7 se aprecia el correcto mareaje y localización celular de la enzima RPE65, proteína citosólica específica del EPR y participante en el ciclo de regeneración de los pigmentos visuales y de la bestrofina (BEST1), un canal de membrana de localización basolateral en EPR. Por otra parte, la faloidina se une a los filamentos de actina y permite visualizar el citoesqueleto que se coloca en estas células de acuerdo a su morfología poligonal. Por tanto, se ha podido mostrar la maduración de las células epiteliales de EPR con su característica forma de “empedrado” de células cuboidales estrechamente unidas entre sí formando una monocapa, tanto en las imágenes de microscopía con luz visible como en las imágenes de microscopía de fluorescencia. Adicionalmente, el mareaje positivo y la correcta localización celular de las proteínas RPE65 y BEST1 confirman el mantenimiento de la identidad funcional del EPR cultivado sobre Colamigel-L.
En conclusión, el estudio histológico del EPR cultivado sobre Colamigel-L permite definir esta matriz como sustrato adecuado para el cultivo y el mantenimiento de las características de diferenciación del EPR obtenido a partir de iPSCs humanas.
Claims (19)
1. Composición caracterizada por comprender los siguientes biopolímeros: fibrillas de colágeno D-estructuradas, gelatina y laminina donde la proporción de cada biopolímero respecto al total de los tres biopolímeros en la composición está entre:
95,8% y 99, 5% en peso de gelatina,
0,33 y 3,50% en peso de fibrillas de colágeno D-estructuradas
0,16-0,65% en peso de laminina,
siendo 100% la suma total de los porcentajes de los tres biopolímeros.
2. Composición, según reivindicación 1 donde las fibrillas de colágeno D-estructuradas presentan una periodicidad de 67 nm.
3. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicha composición consiste en fibrillas de colágeno D-estructuradas, gelatina y laminina.
4. Composición, según reivindicación 3, que tiene una estructura sólida en forma de esponja con un tamaño de poro de entre 1-2 .^m de diámetro.
5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicha composición comprende además agua.
6. Composición, según reivindicación 5, donde el porcentaje en peso de agua en la composición varía entre 94 y 97%.
7. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde, la proporción de cada componente respecto al total de biopolímeros en la composición es la siguiente:
97,2% en peso de gelatina,
2,6% en peso de fibrillas de colágeno D-estructuradas,
0,2% en peso de laminina.
8. Procedimiento para la preparación de una composición descrita en cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7 que comprende o las siguientes etapas: i)
i) preparación de fibrillas de colágeno D-estructuradas y
ii) preparación de una solución en agua o en una mezcla de agua y etanol de los siguientes biopolímeros: fibrillas de colágeno con escalonamiento D obtenidas en la etapa anterior, laminina y gelatina.
9. Procedimiento, según reivindicación 8, donde la preparación de fibrillas de colágeno D-estructuradas comprende las siguientes etapas:
a) mezcla de atelocolágeno con una solución salina hasta alcanzar una concentración de atelocolágeno en la solución de entre 0,50 y 2,48 mg mL-1,
b) ajuste del pH de la solución de atelocolágeno obtenida en la etapa a) hasta un valor comprendido entre 7,0 y 8,0,
c) incubación de la solución de la etapa b) de atelocolágeno a una temperatura comprendida entre 25 °C y 34 °C durante un periodo de tiempo comprendido entre 4 h y 48 h,
d) lavado de la suspensión de fibrillas de colágeno con escalonamiento D obtenidas en la etapa c).
10. Procedimiento, según reivindicación 8 o 9, donde la solución de biopolímeros en agua o en una mezcla de agua y etanol se prepara con la siguiente concentración de cada biopolímero:
entre 30 y 60 mg mL-1 de gelatina,
entre 0,20 y 1,10 mg mL-1 de fibrillas de colágeno D-estructuradas,
entre 0,10 y 0,20 mg mL-1de laminina.
11. Procedimiento, según reivindicación 9 u 10, donde, en la etapa a), la mezcla del atelocolágeno con una solución salina tiene una concentración de atelocolágeno de 2,48 mg mL-1 y el pH se ajusta en la etapa b) a 7,4.
12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el lavado de la etapa d) comprende la adición de agua a la solución resultante de la etapa c), seguido de centrifugación y posterior eliminación del sobrenadante.
13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la solución de biopolímeros en agua o en una mezcla de agua y etanol se prepara con la siguiente concentración de cada componente
40 mg mL-1 de gelatina,
1,07 mg mL-1 de fibrillas de colágeno D-estructuradas,
0,10 mg mL-1de laminina.
14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde la solución de biopolímeros se prepara en agua.
15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde la solución de biopolímeros se prepara en una mezcla de agua y etanol.
16. Procedimiento, según reivindicación 15 donde la mezcla de agua y etanol se prepara con proporciones agua/alcohol (v/v) comprendidas entre 45/55 y 65/35.
17. Procedimiento, según reivindicación 15 o 16, que incluye además las siguientes etapas:
- Proceso de enfriamiento de la solución de los biopolímeros en la mezcla de agua y etanol a -80°C durante un periodo de entre 5 y 24 h,
- Tratamiento de lavado con etanol a -20°C entre 10 y 24h,
- Liofilización de la solución lavada con etanol obtenida en la etapa anterior donde la liofilización se lleva a cabo a una presión de 0,02-0,04 mbares durante 10-24h de manera que se elimina el agua y el etanol,
- Tratamiento térmico a vacío del sólido resultante en la etapa de liofilización a 5 10 mbar y 140-160°C durante 20-48h.
18. Uso de la composición descrita en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el cultivo y diferenciación in vitro de células pluripotentes inducidas y/o de células del epitelio pigmentario de la retina.
19. Cultivo celular que comprende células pluripotentes o células del epitelio pigmentario de la retina y la composición definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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