CN113234664A - 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用，涉及干细胞分化调控技术领域，该制备方法包括采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞；所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。发明人经研究发现，酪蛋白激酶1抑制剂在胰腺祖细胞的分化过程中起着重要作用，其能够在无血清的诱导环境中，促进获得胰腺祖细胞和/或胰腺β细胞，为有效获取胰腺祖细胞和胰腺β细胞提供了新的途径，同时为胰腺细胞替代疗法以治疗糖尿病或其他胰腺疾病奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞分化调控技术领域，具体而言，涉及一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用。
背景技术
多能干细胞(hPSC)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞，多能干细胞(HSC)具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。
胰腺祖细胞是分泌胰岛素的β细胞的前体，可以在体外经人多能干细胞(hPSC)衍生而来，解决了细胞替代疗法治疗糖尿病过程中的细胞资源短缺的问题。
但是，尚无法阐明胰腺器官发生中分子网络的复杂性，破译胰腺分化的分子机制将有助于产生hPSC向成熟的、功能性的胰腺祖细胞和胰腺β细胞的体外分化方案。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种胰腺祖细胞的制备方法，其包括：采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞；
所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。
第二方面，本发明实施例提供了分化诱导剂在制备胰腺祖细胞中的应用，所述应用包括采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞，所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。
第三方面，本发明实施例提供了一种制备胰腺β细胞的方法，其包括：采用如前述实施例所述的胰腺祖细胞的制备方法获取胰腺祖细胞，然后诱导胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用，该制备方法包括采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞；所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。发明人经研究发现，酪蛋白激酶1抑制剂在胰腺祖细胞的分化过程中起着重要作用，其能够在无血清的诱导环境中，促进获得胰腺祖细胞和/或胰腺β细胞，为有效获取胰腺祖细胞和胰腺β细胞提供了新的途径，同时为胰腺细胞替代疗法以治疗糖尿病或其他胰腺疾病奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中腺细胞标志基因的检测结果；图1中，A为在Mock和D4476条件下，胰腺祖细胞标志基因NKX6.1、PDX1、PTF1A、SOX9、NEUROD1和NGN3的mRNA水平检测结果；B为在Mock和D4476条件下，胰腺祖细胞中PDX1阳性和NKX6.1阳性百分比进行流式细胞术分析的结果：C为在Mock和D4476条件下，胰腺祖细胞中PDX1和NKX6.1免疫染色的结果；
图2为实施例2中CK1抑制剂联合ROCK抑制剂对胰腺祖细胞的影响，其中A为在Mock、Y27632、Y27632+D4476条件下，胰腺祖细胞中PDX1、PTF1A的mRNA水平检测结果；B为在Mock、Y27632、Y27632+D4476条件下，胰腺祖细胞中PDX1阳性和NKX6.1阳性百分比进行流式细胞术分析的结果；C为在Mock、Y27632、Y27632+D4476条件下，胰腺祖细胞中PDX和NKX6.1免疫染色的结果；
图3为实施例3中腺细胞标志基因的检测结果；其中，B为在Mock、D4476、LH 846、PF4800567、PF 5006739条件下，胰腺祖细胞中NKX6.1、PDX1、PTF1A、NEUROD1和NGN3的mRNA水平的检测结果；C为Mock、D4476、LH 846、PF 4800567、PF 5006739条件下，胰腺祖细胞中PDX1阳性百分比进行流式细胞术分析的结果；D为Mock、D4476、LH 846、PF4800567、PF5006739条件下，胰腺祖细胞中PDX1免疫染色的结果；
图4为实施例4中对胰腺祖细胞的制备过程中的全基因组专利分析结果；其中A为胰腺祖细胞的热图和转录谱的层次聚类；B为KEGG途径分析富集的细胞生物途径；
图5为实施例5中对经和未经CK1抑制剂处理形成的胰腺祖细胞产生胰腺β细胞的能力的验证，为经和未经CK1抑制剂处理形成的胰腺祖细胞条件下，胰腺β细胞中NKX6.1和INS(胰岛素)双阳性百分比的流式细胞术分析结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种胰腺祖细胞的制备方法，其包括：采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞；
所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。
本文中的“后肠后段细胞”同posterior foregut细胞。
酪蛋白激酶1抑制剂，简称为CK1抑制剂，发明人经研究发现，CK1抑制剂在诱导后场后段细胞分化为胰腺祖细胞的过程中起到关键的作用。在无血清添加(即化学成分确定)的情况下，其能够有效促进后场后段细胞分化为胰腺祖细胞。
在一些实施例中，“采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞”是指在后肠后段细胞的分化培养基中添加分化诱导剂，以实现诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞的功能。
优选地，在诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞时，蛋白激酶1抑制剂的工作浓度为1～10μM，该工作浓度具体可以为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM和10μM中的任意浓度。本文中的“工作浓度”可以理解为在培养基中的“终浓度”。本发明不对具体的CK1抑制剂的种类作具体的限制，可选自现有可获得的具有其功能的CKI抑制剂。优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂包括：D4476、IC261、LH 846、PF 4800567和PF 5006739中的至少一种。
优选地，D4476的工作浓度为5～10μM。
优选地，IC261的工作浓度为1～10μM。
优选地，LH 846的工作浓度为5-～10μM。
优选地，PF 4800567的工作浓度为5～10μM。
优选地，PF 5006739的工作浓度为5～10μM。
优选地，所述分化诱导剂还包括Rho相关蛋白激酶抑制剂。
Rho相关蛋白激酶(ROCK)，作为丝氨酸-苏氨酸激酶可以通过调节细胞骨架来调节细胞的形态和运动。ROCK可以磷酸化MLC(肌球蛋白轻链)，然后引起细胞内Actins细丝的收缩。在本发明提供的胰腺分化过程中，发明人发现酪蛋白激酶1(CK1)和ROCK在胰腺祖细胞的分化过程中起着重要作用。在无血清(化学确定)的诱导分化的过程中，CK1抑制剂与ROCK抑制剂的组合可以更有效地促进胰腺祖细胞和胰腺β细胞的分化。
优选地，在诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞时，Rho相关蛋白激酶抑制剂的工作浓度为1～10μM；该工作浓度具体可以为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM和10μM中的任意浓度。
优选地，所述Rho相关蛋白激酶抑制剂包括：Y-27632、RKI-1447、Y-39983和Thiazovivin中的至少一种。
优选地，Y-27632的工作浓度为1～10μM。
优选地，RKI-1447的工作浓度为1～10μM。
优选地，Y-39983的工作浓度为1～10μM。
优选地，Thiazovivin的工作浓度为1～10μM。
优选地，所述分化诱导剂还包括BMP4信号通路抑制剂和PKC信号通路激活剂中的至少一种。在包含BMP4信号通路抑制剂和PKC信号通路激活剂的情况下，能进一步提高分化诱导剂的分化诱导功能，使后场后段细胞更高效地分化为胰腺祖细胞。
在一些实施例中，所述方法还包括后肠后段细胞的制备：将多能干细胞分化为后肠后段细胞。即完整的分化过程为将多能干细胞诱导分化至胰腺祖细胞。
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞；
优选地，多能干细胞分化为后肠后段细胞的方法如下：
使多能干细胞与WNT通路激活剂和细胞因子Activin A(重组人激活素-A)接触，以诱导多能干细胞分化为原条细胞；在一些实施例中，将多能干细胞培养至细胞密度为20％～80％时，通过WNT通路激活剂打开Wnt/β-catenin通路并联合使用Activin A诱导hPSCs向中内胚层分化。在一些实施例中，细胞密度可为20％、30％、40％、50％、60％、70％和80％中的任意比例。
使所述原条细胞与细胞因子Activin A接触，以诱导原条细胞分化为确定性内胚层细胞；
使确定性内胚层细胞与细胞因子KGF接触，以诱导确定性内胚层细胞分化为原始肠道细胞；
使原始肠道细胞与BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂和维甲酸类物质接触，使原始肠道细胞分化为后肠后段细胞。
本文中的“维甲酸类物质”包括维甲酸和/或维甲酸类似物，维甲酸类似物具体可选自：TTNPB、Tretinoin(维生素A酸)或Fenretinide(4HPR)。
更优选地，多能干细胞分化为胰腺祖细胞及胰腺β细胞的方法如下：
分化第1天，在分化培养基中加入WNT通路激活剂和细胞因子Activin A(10-100ng/ml)，以诱导多能干细胞分化为原条细胞；
分化第2天至第3天，更换新鲜的培养基，并加入Activin A(10-100ng/ml)，以诱导原条细胞分化为确定性内胚层细胞；
分化第4天至第6天，更换新鲜的培养基，并加入细胞因子KGF(50ng/ml)，以诱导确定性内胚层细胞分化为原始肠道细胞；
分化第7天至第10天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂和维甲酸(或维甲酸类似物)，使原始肠道细胞分化为后肠后段细胞；
分化第11天至第13天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂、PKC信号通路激活剂和蛋白激酶1抑制剂，使后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞。
在需要获取胰腺β细胞的情况下，本发明实施例还包括在：分化第14天至第31天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂(Nogging100ng/ml或LDN 193189 200nM)、Hedgehog信号通路抑制剂(cyclopamine-KAAD 250nM或SANT1 250nM)、维甲酸类物质(TTNPB5nM)、TGF信号通路抑制剂(SB431542 10μM或A 83-01 10μM)、激素T3(500nM)、肝素(10μg/mL)、维生素E类似物(Trolox 10μM)、γ-secretase抑制剂(XXI 1μM)、N-乙酰半胱氨酸(1mM)、酪氨酸蛋白激酶受体UFO(由Axl基因所表达)抑制剂(R428 2μM)，使胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。需要说明的是，括号中的浓度为各组分的工作浓度(即终浓度)。
本文中的“原条细胞”同primitivestreak细胞，发育生物学的概念，原条细胞是中胚层细胞和内胚层细胞的共同祖细胞。
本文中的“确定性内胚层细胞”同Definitive Endoderm,DE；本文中的“原始肠道细胞”同primitive gut tube细胞。
在一些实施例中，“多能干细胞与WNT通路激活剂和细胞因子Activin A接触”是指WNT通路激活剂和细胞因子Activin A添加于多能干细胞的分化培养基中，以实现其诱导分化多能干细胞的功能。
本发明提供的胰腺祖细胞的制备方法中无血清加入，分化过程稳定性高，可重复高效地进行胰腺祖细胞的制备。
优选地，所述WNT通路激活剂包括CHIR99021、Wnt3a配体、Wnt5a配体和BIO中的任意一种。在一些实施例中，CHIR99021的作用浓度可以为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM和10μM中的任意浓度。
优选地，在诱导多能干细胞分化为原条细胞的过程中，细胞因子Activin A的作用浓度为10～100ng/mL；在一些实施例中，细胞因子Activin A的作用浓度可以为10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL和100ng/mL中的任意浓度。
优选地，在诱导原条细胞分化为确定性内胚层细胞的过程中，细胞因子Activin A的作用浓度为10～100ng/mL；在一些实施例中，细胞因子Activin A的作用浓度可以为10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL和100ng/mL中的任意浓度。
优选地，在诱导确定性内胚层细胞分化为原始肠道细胞的过程中，细胞因子KGF的作用浓度为10～100ng/mL。在一些实施例中，细胞因子KGF的作用浓度可以为10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL和100ng/mL中的任意浓度。
优选地，在诱导原始肠道细胞分化为后肠后段细胞的过程中，在后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞过程中，以及在胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞过程中，BMP4信号通路抑制剂的工作浓度为10-100ng/mL(对于Noggin而言)，10-1000nM(对于LDN 193189而言)。
优选地，所述BMP4信号通路抑制剂包括Noggin和LDN 193189中的任意一种。
优选地，Noggin的工作浓度为10-100ng/mL。
优选地，LDN 193189的工作浓度为10-1000nM。
优选地，在诱导原始肠道细胞分化为后肠后段细胞的过程中，Hedgehog信号通路抑制剂的工作浓度为1μM～5mM。该工作浓度具体可以为：1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、1000μM、2000μM、3000μM、40000μM、5000μM中的任意浓度。优选地，所述Hedgehog信号通路抑制剂包括cyclopamine-KAAD、Sonidegib、SANT-1、Vismodegib和PF-5274857中的任意一种。
优选地，cyclopamine-KAAD的工作浓度为0.1-5000μM。
优选地，SANT-1的工作浓度为0.1～10μM。
优选地，Vismodegib的工作浓度为0.1～10μM。
优选地，PF-5274857的工作浓度为0.1～10μM。
优选地，在诱导原始肠道细胞分化为后肠后段细胞的过程中，在后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞过程中，以及在胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞过程中，维甲酸类物质的工作浓度为1-100nM。
优选地，所述维甲酸类物质包括TTNPB、Tretinoin和Fenretinide中的任意一种。
优选地，TTNPB的工作浓度为1-100nM。
优选地，Tretinoin的工作浓度为1-100nM。
优选地，Fenretinide的工作浓度为1-100nM。本发明不对多能干细胞的分化培养基的组分作具体的限定。优选地，选择无血清添加的分化培养基；更优选地，在分化培养基包括以下组分：DMEM/F12、DMEM高糖培养基、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、胰岛素、FGF2、TGFβ、B27(无胰岛素)补充剂、NaHCO3、化学成分确定的脂质浓缩物(Chemicaldefined lipid concentrate)以及青链霉素。
本发明实施例还提供了分化诱导剂在制备胰腺祖细胞中的应用，所述应用包括采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞，所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。
需要说明的是，分化诱导剂以及胰腺祖细胞的制备方法均可同前述任一实施例所述，在此不再赘述。
此外，本发明实施例还提供了一种制备胰腺β细胞的方法，其包括：采用如前述任一实施例所述的胰腺祖细胞的制备方法获取胰腺祖细胞，然后诱导胰腺祖细胞分化为胰腺胰腺祖细胞。
本发明实施例提供的制备方法能够高效获得功能性的胰腺祖细胞和胰腺β细胞，可用于胰腺细胞替代疗法以治疗糖尿病或其他胰腺疾病。
在一些实施例中，诱导胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞的方法可通过现有手段获得。
优选地，所述方法包括采用BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂、维甲酸类物质、TGF通路抑制剂、激素T3、肝素、维生素E类似物、γ-secretase抑制剂、乙酰半胱氨酸、酪氨酸蛋白激酶受体UFO(由Axl基因所表达)抑制剂诱导胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。
只要是采用前述实施例的制备方法制备胰腺祖细胞从而获得胰腺β细胞的技术方案均包含于本发明的保护范围内。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
验证不同CK1抑制剂在制备胰腺祖细胞中的作用。
本实施例选用D4476、LH 846、PF 4800567和PF 5006739四种CK1抑制剂，在分化的第11天到第13天进行处理，检测其对胰腺祖细胞分化的影响，诱导人胚胎干细胞分化为胰腺祖细胞的方法如下：
将人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％-80％时进行传代；首先用DPBS-EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3-1：6密度铺到预先用基质胶包被好的24孔板里；细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养；待细胞长至40％-50％时开始分化：
分化第一天加入含终浓度为5μM的CHIR99021(WNT通路激活剂)和终浓度为100ng/ml的Activin A的E5分化培养基(E8培养基去除TGFβ，FGF2和胰岛素，并加入化学成分确定的脂质浓缩物(购自Gibco,货号11905)，以人胚胎干细胞分化为原条细胞；
分化第2天至第3天，去除CHIR99021，但维持Activin A以诱导原条细胞分化形成确定性内胚层细胞；
在分化第4天至第6天，更换新鲜的培养基，并加入细胞因子KGF(50ng/ml)诱导确定性内胚层细胞分化形成原始肠道细胞；
在分化第7天至第10天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂(终浓度为100ng/mL的Noggin)、Hedgehog信号通路抑制剂(终浓度为0.25μM的cyclopamine-KAAD)和维甲酸(终浓度为3nM的TTNPB)诱导原始肠道细胞分化形成后肠后段细胞；
在分化第11天至第13天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂(终浓度为100ng/ml的Noggin)、PKC信号通路激活剂(终浓度为500nM的TPB)、CK1抑制剂(终浓度为10μM的D4476)诱导后肠后段细胞分化形成PDX1/NKX1双阳性胰腺祖细胞，期间每天换液。在第13天检测分化细胞的胰腺祖细胞生物标志物水平。
CK1抑制剂促进了PDX1阳性/NKX6.1阳性胰腺祖细胞的生成。在分化的第11天至第13天这一阶段，将只加入Noggin/TPB的条件定义为“Mock”，将Noggin/TPB/D4476条件定义为“D4476”。在Mock和D4476条件下，对胰腺祖细胞进行RT-qPCR分析，以测定NKX6.1、PDX1、PTF1A、SOX9、NEUROD1和NGN3的mRNA水平；结果如图1中A所示。
在Mock和D4476条件下，对胰腺祖细胞中PDX1阳性和NKX6.1阳性百分比进行流式细胞术分析，结果如图1中B所示。
在Mock和D4476条件下，对胰腺祖细胞中PDX1和NKX6.1表达进行免疫染色，结果如图1中C所示。
结果显示D4476、LH 846、PF 4800567和PF 5006739均能不同程度地提高胰腺细胞标志基因NKX6.1、PDX1、PTF1A、SOX9和NGN3的表达水平，其中D4476的作用最为显著。
实施例2
本发明实施例提供了一种胰腺祖细胞的制备方法，其包括以下步骤：
将人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％-80％时进行传代；首先用DPBS-EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3-1：6密度铺到预先用基质胶包被好的24孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至40％-50％时开始分化，分化第一天加入含终浓度为5μM的CHIR99021和终浓度为100ng/ml的Activin A的E5分化培养基(E8培养基去除TGFβ，FGF2和胰岛素，并加入Chemically Defined Lipid Concentrate。分化第2天至第3天，去除CHIR99021，但维持终浓度为100ng/ml的Activin A以诱导形成确定性内胚层细胞。在分化第4天至第6天，更换新鲜的培养基，并加入终浓度为50ng/ml的KGF诱导形成原始肠道细胞；在分化第7天至第10天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂和维甲酸诱导形成后肠后段细胞。在分化第11天至第13天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂(终浓度为100ng/ml的Noggin)、PKC信号通路激活剂(终浓度为500nM的TPB)、CK1抑制剂(终浓度为10μM的D4476)、ROCK抑制剂(终浓度为10μM的Y27632)诱导形成PDX1/NKX1双阳性胰腺祖细胞，期间每天换液。在第13天检测分化细胞的胰腺祖细胞生物标志物水平。
在分化的第11天至第13天这一阶段，仅将Noggin/TPB条件定义为“Mock”，将Noggin/TPB/Y27632条件定义为“Y27632”，将Noggin/TPB/D4476/Y27632条件定义为“Y27632+D4476”。在Mock、Y27632、Y27632+D4476条件下，对胰腺祖细胞进行RT-qPCR分析，以测定PDX1、PTF1A的mRNA水平，结果见图2中A。
在Mock、Y27632、Y27632+D4476条件下，对胰腺祖细胞中PDX1阳性和NKX6.1阳性百分比进行流式细胞术分析，结果见图2中B。
在Mock、Y27632、Y27632+D4476条件下，对胰腺祖细胞中PDX和NKX6.1表达进行免疫染色，结果见图2中C。
结果显示，CK1抑制剂联合ROCK抑制剂可显著提高胰腺细胞标志基因NKX6.1、PDX1的表达水平和蛋白水平。
实施例3
本发明实施例提供了一种胰腺祖细胞的制备方法，其包括以下步骤：
将人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％-80％时进行传代；首先用DPBS-EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按1：3-1：6密度铺到预先用基质胶包被好的24孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至40％-50％时开始分化，分化第一天加入含终浓度为5μM的CHIR99021和终浓度为100ng/ml的Activin A的E5分化培养基(E8培养基去除TGFβ，FGF2和胰岛素，并加入Chemically Defined Lipid Concentrate。分化第2天至第3天，去除CHIR99021，但维持终浓度为100ng/ml的Activin A以诱导形成确定性内胚层细胞。在分化第4天至第6天，更换新鲜的培养基，并加入终浓度为50ng/ml的KGF诱导形成原始肠道细胞；在分化第7天至第10天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂和维甲酸诱导形成后肠后段细胞。在分化第11天至第13天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂(终浓度为100ng/ml的Noggin)、PKC信号通路激活剂(终浓度为500nM的TPB)、CK1抑制剂(见表1)诱导形成PDX1/NKX1双阳性胰腺祖细胞，期间每天换液。在第13天检测分化细胞的胰腺祖细胞生物标志物水平。
表1为不同CK1 isotype的抑制剂的生物学功能
不同CK1 isotype的抑制剂的生物学功能见表1。
在分化的第11天至第13天这一阶段，将Noggin/TPB条件定义为“Mock”，将Noggin/TPB/D4476条件定义为“D4476”，将Noggin/TPB/LH846条件定义为“LH 846”，将Noggin/TPB/PF 4800567条件定义为“PF4800567”，将Noggin/TPB/PF 5006739条件定义为“PF5006739”。
在Mock、D4476、LH 846、PF 4800567、PF 5006739条件下，对胰腺祖细胞进行RT-qPCR分析，以测定NKX6.1、PDX1、PTF1A、NEUROD1和NGN3的mRNA水平，结果见图3中B。在Mock、D4476、LH 846、PF 4800567、PF 5006739条件下，对胰腺祖细胞中PDX1阳性百分比进行流式细胞术分析，结果见图3中C。
在Mock、D4476、LH 846、PF 4800567、PF 5006739条件下，对胰腺祖细胞中PDX表达进行免疫染色，结果见图3中D。
实施例4
本发明实施例提供了一种胰腺祖细胞的制备方法，其包括以下步骤：
将人胚胎干细胞H1培养于E8培养基中，每天换新鲜培养基，待细胞密度至70％-80％时进行传代；首先用DPBS-EDTA清洗2次，第三次室温孵育5分钟，吸取DPBS-EDTA，加入含有5μM ROCK抑制剂的E8培养基，重悬细胞后，按(1：3)-(1：6)密度铺到预先用基质胶包被好的24孔板里。细胞贴壁1天后换E8培养基继续培养。待细胞长至40％-50％时开始分化，分化第一天加入含终浓度为5μM的CHIR99021和终浓度为100ng/ml的Activin A的E5分化培养基(E8培养基去除TGFβ，FGF2和胰岛素，并加入Chemically Defined Lipid Concentrate。分化第2天至第3天，去除CHIR99021，但维持终浓度为100ng/ml的Activin A以诱导形成确定性内胚层细胞。在分化第4天至第6天，更换新鲜的培养基，并加入终浓度为50ng/ml的KGF诱导形成原始肠道细胞；在分化第7天至第10天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂和维甲酸诱导形成后肠后段细胞。在分化第11天至第13天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂(终浓度为100ng/ml的Noggin)、PKC信号通路激活剂(终浓度为500nM的TPB)、CK1抑制剂(终浓度为10μM的D4476)、CK1抑制剂(终浓度为10μM的D4476)+ROCK抑制剂(终浓度为5μM的Y27632)诱导形成PDX1/NKX1双阳性胰腺祖细胞，期间每天换液。在第13天使用RNA-seq测序，检测胰腺标志基因在不同处理组下的水平。结果参照图4。由图4可知，CK1抑制剂(终浓度为10μM的D4476)+ROCK抑制剂(终浓度为5μM的Y27632)显著提高了胰腺β细胞基因的表达水平。
实施例5
在得到胰腺祖细胞(经和未经CK1抑制剂D4476处理得到的胰腺祖细胞)后，在第14天至第31天，更换新鲜的培养基，并加入BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂、维甲酸类物质、TGF通路抑制剂、激素T3、肝素、维生素E类似物、γ-secretase抑制剂、乙酰半胱氨酸、酪氨酸蛋白激酶受体UFO(由Axl基因所表达)抑制剂，将胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。
结果参照图5。由图5可知，与未经CK1抑制剂处理的胰腺祖细胞相比，经CK1抑制剂处理的胰腺祖细胞分化形成的胰腺β细胞具有更高百分比的NKX6.1和INS(胰岛素)双阳性细胞，即CK1抑制剂有助于胰腺β细胞的生成。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，其包括：采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞；
所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。
2.根据权利要求1所述的胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，在诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞时，蛋白激酶1抑制剂的工作浓度为1～10μM；
优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂包括：D4476、IC261、LH 846、PF 4800567和PF5006739中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，所述分化诱导剂还包括Rho相关蛋白激酶抑制剂；
优选地，在诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞时，Rho相关蛋白激酶抑制剂的工作浓度为1～10μM；
优选地，所述Rho相关蛋白激酶抑制剂包括：Y-27632、RKI-1447、Y-39983和Thiazovivin中的至少一种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，所述分化诱导剂还包括BMP4信号通路抑制剂和PKC信号通路激活剂中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，所述方法还包括后肠后段细胞的制备：将多能干细胞分化为后肠后段细胞；
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞；
优选地，多能干细胞分化为后肠后段细胞的方法如下：
使多能干细胞与WNT通路激活剂和细胞因子Activin A接触，以诱导多能干细胞分化为原条细胞；
使所述原条细胞与细胞因子Activin A接触，以诱导原条细胞分化为确定性内胚层细胞；
使确定性内胚层细胞与细胞因子KGF接触，以诱导确定性内胚层细胞分化为原始肠道细胞；
使原始肠道细胞与BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂和维甲酸类物质接触，以诱导原始肠道细胞分化为后肠后段细胞。
6.根据权利要求5所述的胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，在诱导多能干细胞分化为原条细胞的过程中，细胞因子Activin A的作用浓度为10～100ng/mL；
优选地，在诱导原条细胞分化为确定性内胚层细胞的过程中，细胞因子Activin A的作用浓度为10～100ng/mL；
优选地，在诱导确定性内胚层细胞分化为原始肠道细胞的过程中，细胞因子KGF的作用浓度为10～100ng/mL；
优选地，在诱导原始肠道细胞分化为后肠后段细胞的过程中，BMP4信号通路抑制剂的工作浓度为10～100ng/mL；
优选地，在诱导原始肠道细胞分化为后肠后段细胞的过程中，Hedgehog信号通路抑制剂的工作浓度为0.1μM～10μM；
优选地，在诱导原始肠道细胞分化为后肠后段细胞的过程中，维甲酸类物质的工作浓度为1-100nM；
优选地，在诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞的过程中，BMP4信号通路抑制剂的工作浓度为10～100ng/mL；
优选地，在诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞的过程中，PKC信号通路激活剂的工作浓度为100-1000nM；
优选地，在诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞的过程中，酪蛋白激酶1的工作浓度为1-10μM。
7.根据权利要求5所述的胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，所述WNT通路激活剂包括CHIR99021、Wnt3a配体、Wnt5a配体和BIO中的任意一种；
优选地，所述BMP4信号通路抑制剂包括Noggin、LDN 193189中的任意一种；
优选地，所述Hedgehog信号通路抑制剂包括cyclopamine-KAAD、Sonidegib、SANT-1、Vismodegib和PF-5274857中的任意一种；
优选地，所述维甲酸类似物包括TTNPB、Tretinoin和Fenretinide中的任意一种；
优选地，所述PKC信号通路激活剂包括TPB、TPA、Bryostatin 1中的任意一种；
优选地，所述酪蛋白激酶1抑制剂包括D4476、IC261、LH 846、PF 4800567和PF 5006739中的任意一种；
优选地，所述Rho相关蛋白激酶抑制剂包括Y-27632、RKI-1447、Y-39983和Thiazovivin中的任意一种。
8.根据权利要求5所述的胰腺祖细胞的制备方法，其特征在于，在诱导分化多能干细胞分化的过程中采用的分化培养基包括以下组分：DMEM/F12、DMEM高糖培养基、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、胰岛素、FGF2、TGFβ、B27补充剂、NaHCO3、化学成分确定的脂质浓缩物以及青链霉素。
9.分化诱导剂在制备胰腺祖细胞中的应用，其特征在于，所述应用包括采用分化诱导剂诱导后肠后段细胞分化为胰腺祖细胞，所述分化诱导剂包括酪蛋白激酶1抑制剂。
10.一种制备胰腺β细胞的方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求1～8任一项所述的胰腺祖细胞的制备方法获取胰腺祖细胞，然后诱导胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞；
优选地，所述方法包括采用BMP4信号通路抑制剂、Hedgehog信号通路抑制剂、维甲酸类物质、TGF信号通路抑制剂、激素T3、肝素、维生素E类似物、γ-secretase抑制剂、乙酰半胱氨酸、酪氨酸蛋白激酶受体UFO抑制剂诱导胰腺祖细胞分化为胰腺β细胞。
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